ES2887474T3

ES2887474T3 - Factores y células que proporcionan inducción de hueso, médula ósea y cartílago

Info

Publication number: ES2887474T3
Application number: ES16735360T
Authority: ES
Inventors: Charles K F Chan; Irving L Weissman; Michael T Longaker
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2016-01-06
Publication date: 2021-12-22
Anticipated expiration: 2036-01-06
Also published as: US20170360838A1; AU2022203141A1; JP7041515B2; HK1247955A1; US11083755B2; US20210393699A1; AU2016205311B2; JP2022033886A; EP3242934A4; AU2016205311A1; CA2972592A1; EP3242934B1; JP2018507177A; WO2016112111A1; EP3242934A1; HK1245828A1; CN107517589A

Abstract

Una célula madre esquelética humana para su uso en un método para regenerar cartílago o hueso, comprendiendo el método: administrar a un individuo una dosis eficaz de la célula madre esquelética humana, en donde la célula se selecciona del tejido humano para el fenotipo negativo para la expresión de CD45, CD235, Tie2 y CD31 y positivo para la expresión de podoplanina (PDPN), en un sitio donde se desea la regeneración de hueso o cartílago.

Description

DESCRIPCIÓN

Factores y células que proporcionan inducción de hueso, médula ósea y cartílago

Antecedentes de la invención

Casi cada familia en los Estados Unidos está afectada por enfermedades que implican al esqueleto. Innumerables etiologías, entre las que se incluyen patología degenerativa, neoplásica, postraumática y postoperatoria, afectan al esqueleto. Estas afecciones afectan a personas de todas las edades, razas, etnias y estatus económico. El "U.S. Health Cost & Utilization Project" recientemente publicó que la carga biomédica atribuida a las enfermedades del sistema musculoesquelético supera los 47 billones de dólares anuales, y esta cifra ha continuado incrementándose en los últimos años a una tasa estimada de 8,5 % anualmente. Asimismo, a medida que envejecen tanto las poblaciones norteamericanas como las poblaciones globales, se espera un incremento concomitante en la incidencia de la enfermedad musculoesquelética. Este cambio generacional es la fuerza más poderosa que actualmente opera en el sistema sanitario. Se deben desarrollar planteamientos alternativos para el tratamiento de la enfermedad esquelética para aumentar y/o reemplazar las actuales medidas.

El hueso es único en el sentido que tiene una capacidad innata de regeneración dentro de límites específicos. Además, el esqueleto humano se reemplaza anualmente en infantes y aproximadamente cada cinco a seis años en adultos, lo que respalda la existencia de células madre o progenitoras activas en tejido óseo que se utilizan como fuentes de nuevas células osteogénicas requeridas para el crecimiento, homeostasis y regeneración de tejidos esqueléticos postnatales. Los problemas clínicos esqueléticos pueden abordarse mediante un exhaustivo entendimiento de cómo el esqueleto desarrolla y se mantiene desde un punto de vista de la célula madre.

Las células madre adultas específicas de tejido habitan la mayoría de los sistemas orgánicos principales y definitivamente se han identificado en un hospedador de tejidos. La regulación de la célula madre en el sistema esquelético, en comparación con el sistema hematopoyético, permanece relativamente inexplorado. Los estudios pioneros de Friedenstein et al. establecieron la presencia de células esqueletogénicas, formadoras de colonia en el tejido óseo, pero únicamente recientemente se han comenzado esfuerzos para identificar y aislar progenitores de hueso, cartílago, y estroma para rigurosa caracterización funcional. Además, la médula ósea también es un sitio favorecido de metástasis de cáncer de próstata y mama y el origen y la identidad del estroma óseo que soporta los nichos de la célula madre metastásica en gran parte no están caracterizados. Las propiedades de los progenitores esqueléticos identificados por varios grupos varían dependiendo de los métodos de aislamiento y los tipos de ensayos funcionales que se usaron. Otro reto importante en la regeneración de tejido es la capacidad limitada en la naturaleza y en el laboratorio para (re)generar el cartílago, la cual es deficiente en muchas enfermedades (por ejemplo, osteoartritis, trastornos del tejido conectivo).

La identificación de células y factores que influyen tanto en el desarrollo esquelético como condrogénico son de gran interés para las aplicaciones clínicas y de investigación. La presente invención aborda este problema.

Publicaciones

Las publicaciones de interés incluyen Tevlin et al. (2014) J. Vis. Exp. (93), "Osteoclast derivation from mouse bone marrow"; McCardle et al. (2014) Tissue Eng. Part A. 20(21-22):3031-40, "Positive Selection for Bone Morphogenetic Protein Receptor Type-IB Promotes Differentiation and Specification of Human Adipose-Derived Stromal Cells Toward an Osteogenic Lineage"; Chan et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci U S A.110(31):12643-8, "Clonal precursor of bone, cartilage, and hematopoietic niche stromal cells"; Levi et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci U S A. 109(50):20379-84, "In vivo directed differentiation of pluripotent stem cells for skeletal regeneration"; Chan et al. (2009) Nature Jan 22;457(7228):490-4. "Endochondral ossification is required for hematopoietic stem cell niche formation"; US2011/0104230; WO2014/093836; Dragoo et al. (2003) J Orthop. Med 21(4)622-9. "Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fat".

Sumario de la invención

Se describen métodos, composiciones y kits para producir condrocitos, células esqueléticas, células estromales de médula ósea y células progenitoras de los mismos funcionales. Estos métodos, composiciones y kits encuentran uso en la producción de condrocitos, osteoblastos, células estromales y células progenitoras de los mismos para trasplante, para evaluación experimental, como una fuente de productos específicos a linaje y célula, y similares, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de trastornos humanos del cartílago, el hueso y el sistema hematopoyético, y en la regeneración de cartílago y hueso envejecidos o de otro modo dañados. La invención se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos se proporcionan para dirigir la diferenciación de células madre esqueléticas humanas, que incluye la diferenciación en linajes osteogénicos, condrogénicos y estromales. En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos se proporcionan para dirigir la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), en células madre esqueléticas.

Para sus usos in vivo, se pueden proporcionar sistémicamente un factor o factores de reprogramación o como un implante localizado, por ejemplo, en un matrigel u otra matriz adecuada, y se proporcionan opcionalmente con una dosis eficaz de células, por ejemplo, ASC, SSC, MSC, células progenitoras de cartílago comprometidas (CCP), y similares. También se proporcionan sistemas de cultivo celular para tales métodos. Las células encuentran uso en los métodos terapéuticos, por ejemplo, para proporcionar células para la terapia de reemplazo esquelético o condrogénico; en métodos de cribado, y similares. Las células son células humanas.

En algunas realizaciones una dosis eficaz de ASC humana se administra in vivo con una dosis eficaz de BMP2, a un sitio en el que se desea la regeneración de hueso y/o cartílago. Las ASC opcionalmente se aíslan del individuo que es tratado. En otras realizaciones las ASC son alogénicas, por ejemplo, pueden estar crioconservadas en un banco. También se proporciona un paquete (por ejemplo, una caja, una botella o una botella y caja) que incluye una dosis eficaz de tales factores de reprogramación y un folleto o etiqueta que indica que los factores se han de administrar junto con una dosis eficaz de ASC humanas a un paciente para la regeneración de hueso y/o cartílago. El paquete opcionalmente incluye además reactivos adecuados para el aislamiento de ASC humanas. Las hASC se pueden aislar en el momento de la liposucción, y opcionalmente se proveen de anticuerpos específicos para las células hematopoyéticas, por ejemplo, CD45, CD235, etc. hasta reducir las células hematopoyéticas presentes en la liposucción.

En otras realizaciones se aísla una dosis eficaz de SSC humana de hueso humano adulto, incluido, sin limitación, hueso de la cabeza femoral, dichas SSC se pueden usar en trasplante y otros fines terapéuticos como se describe en el presente documento.

En alguna divulgación, se identifican combinaciones específicas de factores proteicos para la reprogramación de células no esqueléticas en huesos, estroma hematopoyético y condrocitos, que se pueden proporcionar in vitro o in vivo. BMP2 puede expandir las células SSC, incluyendo la expansión del cultivo in vitro. Altas concentraciones localizadas de BMP2 desencadenan activación de una vía esqueletogénica dominante, que da como resultado la especificación de tejidos no esqueléticos en SSC. Estas SSC reprogramadas son funcionalmente idénticas a las SSC aisladas de hueso y son capaces de diferenciación en hueso, cartílago y estroma.

En alguna divulgación, los métodos se proporcionan para tratar un sujeto en necesidad de terapia de trasplante celular de tejidos esqueléticos o condrogénicos. En algunas de tales divulgaciones, el sujeto se pone en contacto con factores y células que usan los métodos y las composiciones descritas. En determinada divulgación, las células se derivan del sujeto.

En alguna divulgación de trasplante celular, se proporcionan factores y cócteles de factores para dirigir células madre esqueléticas a un destino condrogénico, dicho o dichos factores pueden proporcionarse in vitro o in vivo. Se muestra que la inhibición de la señalización de VEGF conduce a las SSC a someterse a diferenciación en tejidos de cartílago. También se muestra que la inhibición de la señalización de TGF-p puede conducir a las SSC a someterse a diferenciación en tejidos de cartílago. En algunas realizaciones se proporciona una dosis eficaz de un inhibidor de VEGF a un individuo junto con una dosis eficaz de SSC para la regeneración de cartílago. En otras realizaciones, se proporciona una dosis eficaz de un inhibidor de VEGF a un individuo junto con una dosis eficaz de células madre adiposas y BMP2 para la regeneración de cartílago.

En otras realizaciones de trasplante celular, se proporcionan factores y cócteles de factores para dirigir células madre esqueléticas a un destino osteogénico, dicho o dichos factores pueden proporcionarse in vitro o in vivo. La exposición a proteínas Wnt, que incluyen, sin limitación, proteínas Wnt3 y Wnt5, pueden aumentar la diferenciación de SSC en hueso. En algunas realizaciones, se proporciona una dosis eficaz de una proteína Wnt 3 o Wnt 5, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, las proteínas Wnt3 humana, Wnt3a humana, Wnt5a humana, Wnt5b humana, o miméticos y derivados de los mismos, a un individuo junto con una dosis eficaz de SSC para la regeneración de hueso. En otras realizaciones, se proporciona una dosis eficaz de una proteína Wnt a un individuo junto con una dosis eficaz de células madre adiposas y BMP2 para la regeneración de hueso.

En algunas realizaciones, se proporciona una dosis eficaz de un inhibidor de VEGF y/o TGFp a un individuo para la inducción de cartílago en un sitio deseado. En algunas de tales realizaciones, se proporciona la dosis eficaz en una forma localizada, por ejemplo, como un implante, incluido un implante biodegradable, una microaguja, un depósito ("depot") u otra forma farmacéutica como se conoce en la técnica para la administración localizada de un principio activo. En algunas realizaciones, se coadministra una dosis eficaz de un agente BMP2, dicha dosis es eficaz en conducir las células no esqueléticas, incluidas, sin limitación, las células madre mesenquimales, en un destino esquelético. La formulación combinada permite la regeneración de cartílago a partir de células no esqueléticas endógenas. La combinación de factores puede administrarse con una dosis eficaz de células, por ejemplo, ASC, SSC, etc. Los factores de interés también incluyen factores que conducen a la formación de hueso, por ejemplo, proteínas Wnt. Los factores de interés también incluyen VEGF.

En realizaciones adicionales, también se proporciona una dosis eficaz de una población celular regenerativa, incluidas las MSC derivadas de tejido adiposo, como fuente de células para la condrogénesis o esqueletogénesis. Tales realizaciones incluyen, sin limitación, implante en una matriz que sirve para localizar células y factores. En algunas de tales realizaciones la matriz está comprendida de una matriz o entramado biocompatible y opcionalmente biodegradable, por ejemplo, formada a partir de matrigel, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, Poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA); colágeno, alginato, y similares capaces de soportar la condrogénesis en una configuración tridimensional.

En algunas de tales realizaciones, los factores, opcionalmente junto con células regenerativas, se introducen en un tejido en necesidad de reparación del cartílago. Tales sitios incluyen, sin limitación, enfermedades relacionadas con células diferenciadas y lesiones traumáticas que incluyen, pero sin limitación: desgarros del ligamento cruzado anterior, defectos del cartílago articular de grosor completo, defectos del cartílago articular de grosor parcial.

En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos relacionados con las células esqueléticas (SSC) humanas. En algunas realizaciones de la invención, se proporcionan composiciones de células madre esqueléticas humanas. En otras realizaciones, se proporcionan composiciones de células comprometidas con linaje esquelético, incluidas las células comprometidas con cartílago.

Las células madre esqueléticas de la invención pueden identificarse, y aislarse de poblaciones celulares mediante análisis fenotípico de marcadores de superficie celular, o inducirse a partir de células no esqueléticas. Las poblaciones celulares de interés para el aislamiento de SSC incluyen muestras de hueso, que en general incluyen médula ósea, y que incluyen, sin limitación, hueso adulto, por ejemplo, el hueso de la cabeza femoral; y fuentes de células madre y progenitoras mesenquimales que se han inducido para diferenciarse en progenitores de hueso, por ejemplo, poniéndose en contacto con una dosis eficaz de BMP2. Las fuentes de tales anteriores células progenitoras incluyen sangre, tejido adiposo, médula ósea y similares.

Las células progenitoras para su uso en la invención se han caracterizado en un linaje, como se muestra en la Figura 2G. Se proporcionan métodos y composiciones para la separación y caracterización de tales células de linaje esquelético. Las células pueden separarse de otras células mediante la expresión de estos marcadores de superficie celular específicos. Las células son útiles en trasplante, para la evaluación experimental, y como fuente de productos específicos a linaje y célula, incluyendo las especies de ARNm útiles en la identificación de genes específicamente expresados en estas células, y como dianas para la investigación de factores o moléculas que pueden afectarlas. Las poblaciones de célula SSC humana generalmente son negativas para la expresión de CD45, CD235, Tie2 y CD31; y expresan positivamente podoplanina (PDPN). Una población de células, por ejemplo, células aisladas de tejido óseo, que tienen esta combinación de marcadores pueden denominarse células [PDPN+/146‘. La población [PDPN+/146'] además puede subdividirse en tres poblaciones: un subconjunto unipotente capaz de condrogénesis [PDPN+CD146' CD73'CD i 64‘], una subpoblación celular unipotente de osteogénesis [PDp N+CD146'CD73'CD164+] y una célula multipotente [pDPN+CD146'CD73+CD164+] capaz de osificación endocondral (hueso y cartílago).

En tejidos de ratón, el linaje esquelético se caracteriza como CD45', Ter119‘, Tie2‘, av integrina+. SSC se caracteriza también como Thy1‘ 6C3' CDl05‘ CD200+. El progenitor de condrocito comprometido se caracteriza también como Thy1 6C3- CD105+ CD200+.

Se describen sistemas in vitro e in vivo para el crecimiento y el análisis, incluido el análisis clonal, de células de linaje esquelético. En particular, se encuentra que en un modelo in vivo, se pueden localizar las células de linaje esquelético, por ejemplo, incrustándolas en una matriz, y formarán estructuras óseas. Cuando los progenitores osteocondrales están presentes el hueso formará nichos de médula ósea funcionales que soporten la función de la célula hematopoyética.

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. El hueso y el cartílago se derivan de progenitores restringidos a linaje, clonales. (A) Micrografías de tejido de un fémur de ratón Rainbow Actina-Cre-ERT de 6 semanas de vida, tras inducción con tamoxifeno el día 3 postnatal. Izquierda: Microscopía fluorescente con mayor aumento del rectángulo oblicuamente ladeado mostrado por el inserto indicado por el cuadrado blanco en el centro del panel que muestra clones presentes en la placa de crecimiento del fémur. Centro: Imagen de campo brillante de fémur de ratón teñido con pentacromo con inserto de mayor aumento del rectángulo oblicuamente ladeado mostrado por el inserto indicado por el cuadrado blanco en el centro del panel que muestra la placa de crecimiento del fémur. Derecha: Fotografía de un fémur de ratón de sección coronal. Cabe destacar que, la línea amarilla discontinua representa la placa de crecimiento femoral, la línea púrpura discontinua representa la matriz ósea, y la línea verde discontinua representa la médula ósea. La barra de escala en todas las figuras es equivalente a 50o pM. (B) Gráficos de FACS que muestran la distribución de las células suspendidas aisladas por digestión mecánica y enzimática de la placa de crecimiento femoral (el panel horizontal de más arriba), hueso extraído ("flushed") (panel central) y médula ósea (panel horizontal inferior). De las tres diferentes partes del fémur, la población [AlfaV+] es la más dominante en la placa de crecimiento (el panel horizontal de más arriba en el centro). DN = doble negativa, es decir, negativa para tinción con Thy y 6C3; [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-]. (C) Esquema del experimento: El ratón transgénico Actina-Cre-ERT se cruzó con ratón de gen indicador Rainbow. La recombinación de Cre de la descendencia se indujo por inyección de tamoxifeno el día 15 embrionario (E15), día 3 postnatal (P3) y la semana 6 postnatal. El tejido femoral se extrajo 6 semanas después de la inyección. (D) Representación gráfica de los resultados que ilustran diferentes números de clones presentes, que abarcan el hueso y el cartílago. Después de un período de seguimiento de seis semanas, se pudieron determinar las regiones clonales como regiones uniformemente marcadas de un único color (se observaron 7 clones coloreados con un color, indicados por "Color 1-7" en el eje x). No observamos distintas regiones clonales que capturen células de hueso, cartílago y estromales con tejido hematopoyético, adiposo o muscular y, por tanto, estas no se han representado gráficamente. (E) Estrategia de separación ("gating") por FACS para el aislamiento de ocho subpoblaciones distintas de tejido esquelético obtenidas del subconjunto [AlfaV+] obtenido de los huesos largos, las costillas y el esternón de ratones C57BI6 tipo silvestre el día 3 postnatal basándose en la expresión diferencial de cuatro marcadores de superficie celular: Thy, 6C3, CD105 y CD200. Las poblaciones celulares (a-h) representadas en los gráficos de FACS corresponden a las ocho subpoblaciones distintas de tejido esquelético obtenidas del subconjunto [AlfaV+]: a=BCSP, b=BLSP, c=6C3, d=HEC, e=mSSC, f=pre-BCSP, g=CCP, h=Thy. (F) (Parte superior) Análisis histológico de un fémur de ratón el día P3 teñido con pentacromo de Movat, que contiene hueso (teñido en amarillo), cartílago (teñido en azul/verde) y médula ósea (teñido en rojo). Barra de escala equivalente a 200 pM. (Parte inferior) Secciones histológicas teñidas con pentacromo de injertos de tejido tras el trasplante de la subpoblación celular debajo de la cápsula renal: 20.000 células altamente purificadas de las ocho subpoblaciones del tejido esquelético en el día P3 se inyectaron debajo de la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos y se extrajeron 30 días después del trasplante (los paneles "a" hasta "h" representan las ocho subpoblaciones celulares en el subconjunto [AlfaV+], como se ilustra en el gráfico de FACS en la Figura 1E). Las secciones transversales teñidas con pentacromo de cada injerto demuestran los destinos celulares restringidos a hueso, cartílago y estroma de médula ósea de cada subpoblación celular progenitora. Las poblaciones e [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC), f [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+CD105-Thy-6C3-CD200-], (pre-BCSP) y a [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105+], (BCSP) pueden reconstruir ambientes óseos enteros, que consisten en hueso, cartílago y una cavidad de médula ósea funcional. Las poblaciones b (BLSP), c (6C3), d (HEC), y h (Thy) formaron únicamente hueso. La población g (CCP) formó cartílago, además de una pequeña cantidad de hueso. Barra de escala equivalente a 200 pM. (G) La gráfica representa la composición de tejido en porcentaje de cada uno de los injertos explantados ("a" hacia "h" representan las ocho subpoblaciones celulares en el subconjunto [AlfaV+], que corresponden al gráfico de FACS en la Figura 1E y el tejido trasplantado en la Figura 1F): el porcentaje de hueso se representa en amarillo, el porcentaje en médula ósea se representa en rojo y el porcentaje de cartílago se representa en azul en un gráfico de columnas apiladas. (H) Esquema del experimento: Se aislaron 20.000 células de las ocho subpoblaciones en el subconjunto [AlfaV+] de los huesos largos de ratones GFP marcados el día P3, tras la disociación mecánica y enzimática. Las células se fraccionaron posteriormente por FACS en las ocho subpoblaciones celulares, como se ha detallado anteriormente. A continuación, se trasplantaron las células GFP+ purificadas debajo de las cápsulas renales de los ratones receptores. Un mes después del trasplante, se explantaron los injertos para análisis.

Figura 2. Identificación de la mSSC (Célula Madre Esquelética de ratón). (A) Esquema del experimento: Se aislaron células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (indicadas c D200+TN en el esquema, es decir CD200+ Triple Negativas) de fémures de ratones GFP+ el día P3, tras la disociación mecánica y enzimática, la tinción con anticuerpo y el fraccionamiento por FACS. (i) Se sembraron células purificadas [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) en una placa de cultivo que contenía medio MEMa con suero fetal de ternero al 10 %. Los días 0, 11 y 25 de cultivo, se extrajeron las células cultivadas para el análisis por FACS y se clasificaron para determinar las células constituyentes de la subpoblación celular [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-cD200+] (mSSC) después de la expansión en cultivo. El día 25 tras el refraccionamiento de las células por FACS, se trasplantaron 20.000 células de cada subconjunto (mSSC, BCSP, Thy, 6C3) debajo de las cápsulas renales de los ratones receptores. Un mes después del trasplante, se explantaron los injertos para análisis. (ii) También se trasplantaron células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) Gf P marcadas purificadas debajo de las cápsulas renales de ratones receptores (sin preceder la expansión en cultivo). Un mes después del trasplante, los injertos se explantaron para, o bien, análisis por FACS o histología. (B) Análisis por FACS de [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) cultivada los día 0, 11 y 25 de cultivo (i, ii). El día 25, los cultivos in vitro se clasificaron por FACS y cuatro subpoblaciones (mSSC [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+], BCSP [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105+], Thy+ [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy+6C3-CD105-] y 6C3+ [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3+CD105+]) se trasplantaron debajo de la cápsula renal para determinar su potencial intrínseco. (iii) mSSC formó hueso, cartílago y una cavidad de médula ósea (recuadro rojo). Las células BCSP (recuadro verde), Thy (recuadro azul) y las células 6C3 (recuadro naranja) únicamente formaron hueso, sin una cavidad de médula ósea. Barra de escala equivalente a (iii, panel superior) 500 pm, (iii, panel inferior) 200 pm. (C) Análisis por FACS de injertos de cápsula renal explantados, un mes tras el implante, en el que poblaciones altamente purificadas de células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) GFP marcadas se trasplantaron debajo de la cápsula renal. (i), (ii) el análisis por FACS de los injertos explantados reveló que el injerto explantado consistía en 7 subpoblaciones posteriores (recuadros azul, rojo y naranja). La micrografía de campo brillante del explante teñido con pentacromo ((iii) panel inferior, extremo izquierdo demuestra que la subpoblación [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) es capaz de generar hueso, cartílago y médula ósea. Dentro del recuadro púrpura que se extiende a la derecha de la figura se muestra una imagen fluorescente de mayor aumento del panel teñido con pentacromo en el extremo izquierdo del panel inferior. Los paneles dentro del recuadro púrpura muestran que mSSC es capaz de generar células que expresen Thy y 6C3 como se observa en la inmunohistoquímica ((iii) paneles del centro; en estos Thy = rojo, 6C3 = blanco). El panel combinado está en el extremo inferior derecho (iii, paneles derechos inferiores). La imagen fluorescente del injerto GFP+ se muestra en la imagen del aumento inferior en el panel del extremo superior izquierdo d (iii). Barra de escala equivalente a: (iii, panel superior) 500 |jm, (iii, panel inferior) 100 jm , (iii, imágenes fluorescentes) 50 jm . (D) Esquema del experimento: Se aislaron células de los huesos largos de ratones RFP+ P3 tras la disociación mecánica y enzimática. Estas células no se fraccionaron por FACS y sirvieron como células alimentadoras. Se aislaron células de los huesos largo de ratones GFP+ P3 tras la disociación mecánica y enzimática y se obtuvieron células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) tras FACS. (i) Se trasplantó una única célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) GFP marcada conjuntamente con 5.000 células alimentadoras RFP(+) debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes (ii). Se sembró en placa una única célula [CD45-Ter1l9-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) GFP marcada purificada por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Después de 14 días en cultivo, se contaron las colonias formadas, se extrajeron, se reclasificaron usando FACS y de nuevo se sembró en placa una única célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) GFp marcada purificada por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos y se repitió el ensayo. (E) In vitro, se realizaron ensayos de formación de colonia sembrando en placa una única célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. (i): Se representa una imagen de microscopía de fases representativa de una colonia primaria a los 14 días después de la siembra en placa. (ii): El paso de las colonias primarias dio como resultado la formación de colonias secundarias con morfología similar a las colonias primarias (microscopia de fases). (iii) Colonias primarias teñidas positivas para anticolágeno tipo 2 (púrpura), antiosteocalcina (verde), y DAPI (azul) tras tinción imunofluorescente (microscopía fluorescente). (iv) El panel vertical en el extremo derecho representa análisis por FACS de células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) iniciales aisladas (parte superior), y colonia primaria posterior (centro), y célula colonia secundaria (parte inferior). Barra de escala equivalente a (i,ii): 500 jm (iii), 100 jm (F) Microscopía de injertos explantados debajo de la cápsula renal (según la Figura 2D (i)). El alcance de la formación de colonia in vivo de mSSC [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] GFP marcada se perfila por una línea discontinua amarilla en (i), (iii), (v) y línea discontinua negra en (ii), (iv), (vi). Las células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC) clonalmente expandidas, GFP marcadas, eran evidentes como células verdes usando microscopía fluorescente en (i), (iii), (iv). Las correspondientes micrografías de campo brillante están representadas en los paneles (ii), (iv), (vi). La generación de imágenes fluorescentes de secciones transversales de injertos se representa en el panel (iii) y (v). Las correspondientes micrografías de campo brillante de secciones teñidas con pentacromo demuestran que las células clonalmente expandidas están destinadas a hueso (amarillo) y cartílago (azul) (iv y vi). La gráfica en (vii) es representativa de la contribución por las células GFP o RFP (por célula trasplantada) a la formación de hueso o cartílago. Barra de escala equivalente a (i-iv): 200 jm . (G) Representación esquemática del árbol de linaje de la célula madre esquelética. La mSSC ocupa la cima del este árbol jerárquico y es multipotente, capaz de auto renovación, y diferenciación en más células progenitoras restringidas a linaje (pre-BCSP y BCSP). Las mSSC, pre-BCSP y BCSP son capaces de dar lugar a hueso, cartílago y estroma de soporte hematopoyético. El imunofenotipo de cada célula se muestra junto a la célula. Tomar nota que, observamos que el antagonismo de VEGF da como resultado la promoción de un destino cartilaginoso (mostrado en rojo) mientras que el agonismo de Wnt puede fomentar un destino óseo (mostrado en verde).

Figura 3. El nicho de mSSC está compuesto de otras células de linaje esquelético. (A) Esquema del experimento: Se extrajeron huesos largos de ratones P3 y se aislaron las células por disociación mecánica y enzimática. La suspensión celular se clasificó por FACS para obtener mSSC; BCSP; Thy (+), que abarca los subconjuntos CCP, Thy y BLSP; y 6C3 (+), que abarca 6C3 y HEC. A continuación, se prepararon subpoblaciones celulares para la secuenciación de ARN de célula individual y análisis posterior. (B) El agrupamiento jerárquico de los datos de secuenciación de ARN de célula individual de cuatro subpoblaciones madre/progenitoras esqueléticas demuestra cuatro patrones molecularmente distintos de expresión transcripcional de célula sencilla entre mSSC, BCSP, Thy(+) y 6C3(+). (C) Expresión transcripcional en porcentaje de morfógeno, receptor o ambos en la secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones: (orden de las células desde la izquierda a la derecha) mSSC, BCSP, Thy(+), 6C3(+). Orden de morfógenos y receptores cognados desde la parte superior a la inferior en cada fila: BMP2/BMPR1a, WNT/FRZ, TGFp3/TGFpR2. Los diagramas de Venn muestran la expresión en porcentaje de morfógenos (círculo izquierdo en cada diagrama de Venn) y la expresión en porcentaje de los receptores cognados (círculo derecho en cada diagrama de Venn). La coexpresión en porcentaje del morfógeno y el ligando se muestra en la parte central que solapa del diagrama de Venn. Tomar nota que el porcentaje significa el porcentaje de células dentro de cada subconjunto ensayado (mSSC, BCSP, Thy(+) y 6C3(+)) que expresa la secuencia génica relevante. Los patrones presentados muestran el potencial para la señalización autocrina (esquema inferior a la izquierda) y paracrina (esquema inferior a la derecha). (D) Los niveles de expresión génica de los genes asociados a Wnt en poblaciones esqueléticas determinados usando la plataforma de análisis "Gene Expression Commons" (GEXC) (mostradas en el siguiente orden desde la parte superior a la inferior: mSSC, BCSP, Thy, 6C3, BLSP y HEC). Estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/-y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. El intervalo de la expresión transcripcional, calculada usando GEXC, se ilustra por un cambio de color como se representa en el extremo derecho de la figura (es decir, el púrpura oscuro se correlaciona con una expresión muy alta, mientras que el azul oscuro se correlaciona con la expresión mínima). Este mapa de calor muestra alta expresión de tanto los ligandos asociados a Wnt (Wnt3a, Wnt4, Wnt5a) como los receptores (Fzd5-9), lo que demuestra que la vía de señalización de Wnt puede estar implicada activamente en la función progenitora esquelética. También vemos alta expresión de SFRP-2 (proteína 2 relacionada con Fzd secretada) por todas la poblaciones celulares. Fzd = receptor frizzled. (E) Mapas de interacción ligando-receptor. Análisis de la expresión génica de datos de micromatriz extraídos de subconjuntos estromales esqueléticos (mostrados en el siguiente orden desde la parte superior a la inferior: mSSC, BCSP, Thy, 6C3, BLSP y HEC) que ilustran ligandos en la columna izquierda y receptores cognados en la columna derecha. Ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. Los dos mapas de interacción ligando-receptor superiores demuestran que BMP-2 y BMP-7, genes esqueletogénicos importantes, y sus receptores cognados se expresan altamente en poblaciones estromales esqueléticas. Los tres mapas de interacción ligando-receptor inferiores detallan la expresión génica de TGFp3, GDF5 y VCAM-1 y los correspondientes receptores. Los mapas de interacción ligando-receptor demuestran que las células estromales esqueléticas pueden actuar como su propio nicho y señalizarse entre sí para fomentar la esqueletogénesis. Las flechas de conexión indican posibles vías de interacción ligando-receptor. Nota: GDF = factor de crecimiento y diferenciación, VCAM-1 = molécula de adhesión a células vasculares-1. (F) Diagrama que ilustra las vías de señalización potenciales que influyen en la actividad de células madre/progenitoras esqueléticas. Proponemos que la señalización autocrina y paracrina puede ocurrir en el nicho de la célula madre esquelética y puede regular la actividad y el mantenimiento celular. (G) Se cocultivaron 5.000 mSSC recién aisladas (obtenidas de ratones GFP marcados) con diferentes morfógenos (BMP2, TGFp, TNFa). Las micrografías fluorescentes a la derecha ilustran la morfología de colonia después del cultivo con suplemento de morfógeno, la gráfica de la izquierda muestra el número de mSSC presentes tras el cultivo durante 14 días bajo las diferentes condiciones (control o suplemento con BMP2/TGFp/TNFa). En este caso, vemos que el cultivo de mSSC con suplemento de rhBMP-2 estaba asociado con la amplificación significativa de las poblaciones de mSSC in vitro (panel izquierdo inferior de las micrografías fluorescentes) en comparación con el control, medios no suplementados (panel izquierdo superior de las micrografías fluorescentes) (p<0,01, ANOVA). El suplemento con TGFp o TNFa dio como resultado una alteración en la morfología de colonia (como se muestra en el panel superior e inferior derecho de las micrografías fluorescentes). Estos resultados muestran que la señalización de nicho influye en la proliferación de mSSC. Barra de escala equivalente a 200 pm. (H) La gráfica de la izquierda de la figura ilustra el efecto de la titulación del factor de crecimiento recombinante BMP2 sobre la proliferación de mSSC en cultivo. En este caso, vemos que el efecto proliferativo máximo se observa a una concentración de 50 ng/ml. El efecto de BMP-2 era significativamente mayor que el control a cada una de las siguientes concentraciones: 50 ng/ml (p<0,001, ANOVA), 500 ng/ml (p<0,01 ANOVA). Las imágenes de fases de la derecha ilustran las colonias de las células derivadas de la mSSC (indicadas por punta de flecha en control, 50 pg/ml, 500 pg/ml, 5 ng/ml y por una línea discontinua en 50 ng/ml y 500 ng/ml). Barra de escala equivalente a 500 pM. (I) El mapa de calor de la expresión génica de Foxa2 ilustra que el gen de Foxa2 se regula al alza en la mSSC. Ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población de *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (J) La micrografía de fluorescencia de la placa de crecimiento femoral próxima teñida para anticuerpo anti-Foxa2 (rojo) visualiza la localización de mSSC en la placa de crecimiento, que está demarcada por la línea discontinua blanca. DAPI = azul. Barra de escala equivalente a 500 pM. (K) Señal de FACS intracelular que ilustra que Foxa2 está presente en la mSSC a un nivel proteico. Pico negro = señal de mSSC, Pico rojo = señal de isotipo. (L) (Izquierda) Micrografías de fluorescencia del fémur proximal de ratones P3 teñidos para anticuerpo anti-Foxa2 (rojo) ilustrando la presencia de mSSC. Anticuerpo anti-6C3 (blanco) y anticuerpo anti-Thyl (verde) que ilustran la presencia de células 6C3 y Thy respectivamente; y DAPI (azul), que ilustra el nicho de mSSC. La imagen combinada a la derecha ilustra que mSSC reside en su mayoría en la placa de crecimiento, con células de nicho evidentes, células 6C3 (blancas) y células Thy (verdes), rodeando a las mSSC. Barra de escala equivalente a 200 pM (extremo izquierdo), 500 um (extremo derecho).

Figura 4. Los linajes de condrocitos pueden inducirse por linajes de osteoblastos para someterse a osteogénesis. (A) Esquema del experimento: Se aislaron BCSP de fémures de ratones GFP+ el día P3 y se aislaron células CCP (progenitor de cartílago comprometido) de orejas/esternón de ratones adultos RFP+ tras la digestión mecánica y enzimática, y fraccionamiento posterior por FACS. Se trasplantaron conjuntamente GFP+ BCSP y RFP+ CCP purificados debajo de las cápsulas renales de ratones receptores inmunocomprometidos con y sin receptor frizzled 2 secretado, SFRP-2. El trasplante de RFP+ CCP solo servía como control. Un mes después del trasplante, se extirparon todos los injertos para análisis. (B) Microscopía de injertos explantados en la que 20.000 células RFP marcadas de la subpoblación progenitora CCP se trasplantaron en cápsulas renales y se explantaron un mes después (como se detalla en la Figura 4A). La línea de puntos blanca perfila la extensión del injerto formado. Micrografía de fluorescencia del injerto explantado que demuestra la presencia de un injerto RFP+ (parte superior izquierda). La correspondiente micrografía de campo brillante se muestra en el panel derecho superior. La sección transversal teñida con pentacromo de Movat (que tiñe el hueso de amarillo, el cartílago de azul, y la médula ósea de rojo) demuestra que las células CCP RFP marcadas forman cartílago, indicado por colorante azul. (Micrografía fluorescente: parte inferior izquierda, Micrografía de campo brillante: parte inferior derecha) Barra de escala equivalente a (panel superior): 500 pm, (panel inferior) 200 pm. (C) Microscopía de injertos explantados en la que 20.000 células CCP RFP marcadas se trasplantaron conjuntamente con 20.000 BCSP GFP marcadas debajo de las cápsulas renales y se explantaron un mes después (como se detalla en la Figura 4A). Los injertos, los cuales se formaron posteriormente, están perfilados por una línea de puntos blanca (que indica la parte RFP+ del injerto) y una línea sólida amarilla (que indica la parte GFP+ del injerto) (parte superior izquierda). Una micrografía de campo brillante correspondiente se muestra en el panel derecho superior. Una sección transversal con colorante de pentacromo de Movat demuestra que tanto las CCP RFP marcadas como las BCSP GFP marcadas forman hueso, como se indica mediante el colorante amarillo. (Micrografía fluorescente: parte inferior izquierda, Micrografía de campo brillante: parte inferior Barra de escala equivalente a (panel superior): 500 |jm, (panel inferior) 200 |jm. (D) Microscopía de injertos explantados en la que 20.000 CCP RFP marcadas se trasplantaron conjuntamente con 20.000 BCSP GFP marcadas tratadas previamente con 108/109 unidades de vectores adenovíricos que codifican la expresión de proteína relacionada con frizzled 2 soluble (SFRP-2) debajo de la cápsula renal (como se detalla en la Figura 4A). Se muestran los injertos resultantes, recogidos después de un mes. La micrografía fluorescente (parte superior izquierda) perfila la población de GFP+ (dentro de la línea continua amarilla) y la población de RFP+ (dentro de la línea de puntos blanca). Se muestra la correspondiente micrografía de campo brillante (parte superior derecha). En el panel inferior se muestran las micrografías de secciones transversales. Se muestra la micrografía de fluorescencia de la sección transversal del injerto (parte inferior izquierda) y la micrografía de campo brillante que muestra la tinción de esta sección con pentacromo de Movat (parte inferior derecha) demuestra que las células CCP RFP marcadas forman cartílago, como se indica por el colorante azul pero las BCSP GFP marcadas forman hueso, como se indica mediante el colorante amarillo. Barra de escala equivalente a (panel superior): 500 jm , (panel inferior) 200 jm .

Figura 5. El destino de cartílago en mSSC se fomenta en ausencia de señalización de VEGF/PIGF en el microambiente. (A) Esquema del experimento: Se aislaron mSSC de ratones P3 por disociación mecánica y enzimática y fraccionamiento posterior por fAc S. A continuación, se trasplantaron o bien fémures preosteogénicos intactos aislados de ratones E14.5 o 20.000 mSSC debajo de la cápsula renal de ratones receptores inmunodeficientes con y sin inhibición sistémica de la señalización de VEGf/PIGF. Para estudiar la inhibición de la señalización de VEGF/PIGF, se administraron intravenosamente vectores adenovíricos que codificaban ectodominio de VEGFR1 (Ad sVEGFRI) a los ratones receptores designados 24 horas antes del trasplante celular en la cápsula renal, que conduce a la liberación sistémica de este fuerte antagonista de la señalización de VEGF/PIGF en la circulación. Para un control negativo, se usó Ad Fc que codifica un fragmento Fc de inmunoglobulina. (B) La inhibición sistémica de la señalización de VEGF/PIGF conduce a la diferenciación condrogénica de huesos fetales preosteogénicos intactos o mSSC in vivo. Se trasplantaron hueso fetal intacto o mSSC debajo de la cápsula renal de ratones inmunocomprometidos que se habían tratado previamente con Ad sVEGFRI. Los injertos se explantaron después de un mes. Las micrografías de campo brillante de los injertos explantados se muestran en la primera y tercera fila de la parte superior del panel (control, Ad Fc en el panel izquierdo y tratados, Ad sVEGFRI en el panel derecho). Las secciones representativas teñidas con colorante de pentacromo de Movat se muestran en las filas segunda y cuarta de la parte superior del panel. (dos filas superiores: hueso fetal intacto, dos filas inferiores: mSSC). La inhibición de la señalización de VEGF/PIGF dio como resultado la formación de cartílago (azul) (derecha), con el grupo Ad Fc que forma hueso (amarillo) (izquierda). Barra de escala equivalente a: (Hueso fetal intacto, panel superior): 500 jm ; (Hueso fetal intacto, panel inferior): 100 jm ; (mSSC, panel superior): 500 jm ; (mSSC, panel inferior): 200 jm . (C) Representación gráfica del destino de los trasplantes de mSSC/hueso fetal en presencia de Ad sVEGFRI (antagonismo de la señalización de VEGF) o Ad Fc control. En este caso, vemos la promoción del destino cartilaginoso en presencia de antagonismo de VEGF sistémico. (D) Usando GEXC, se determinaron las vías de señalización de VEGF en seis de las subpoblaciones progenitoras esqueléticas (como se enumera desde la parte superior a la parte inferior: mSSC, BCSP, Thy, 6C3, BLSP y HEC). El análisis de la expresión génica de mSSC y su progenie posterior revela poca expresión de los receptores de VEGF tradicionales tales como Flt1, Kdr, y Flt4 pero, por el contrario, alta expresión de homólogos del receptor de VEGF/PIGF, Nrp1 y Nrp2. Las células madre/progenitores esqueléticas no expresan ni VEGFA ni VEGFB pero expresan VEGFC y PIGF. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (E) Esquema del experimento: Se aislaron mSSC de huesos largos de ratones tipo silvestre C57BL6 P3. Estas células se cultivaron en presencia de proteínas recombinantes. Había 4 grupos experimentales y uno control. Los grupos experimentales se trataron con las siguientes proteínas recombinantes solubles durante una semana antes del trasplante dentro de la grasa subcutánea de la almohadilla de grasa inguinal: (I) NRP1, (II) PIGF, (III) VEGF y (IV) VEGFR1. Los injertos se explantaron posteriormente a las tres semanas para el análisis histológico. (F) Tres semanas tras el trasplante, los injertos como se describe en la leyenda de la Figura 5E se explantaron para el análisis histológico. Muestras enumeradas de izquierda a derecha: control (no tratamiento), PIGF, sNRP1, VEGFA, sVEGFR1. Las fotografías de la apariencia macroscópica de cada uno de los injertos se muestran en el panel superior: tomar nota que, cada uno de estos injertos tienen una apariencia rojiza (De nuevo: muestras enumeradas de izquierda a derecha: control, PIGF, sNRP1, VEGF, sVEGFR1). Imágenes de campo brillante de los injertos explantados teñidos con pentacromo de Movat (De nuevo: muestras enumeradas de izquierda a derecha: control, PIGF, sNRP1, VEGF, sVEGFR1). En este caso vemos que todos los injertos dan lugar predominantemente a hueso y médula ósea. Las mSSC pretratadas con PIGF, sNRP1, VEGF, sVEGFR1 dan lugar a hueso y médula ósea, con una cantidad pequeña de cartílago. Barra de escala equivalente a: (panel superior) 1 mm; (panel inferior) 200 jm .

Figura 6. La manipulación de la vía de BMP puede inducir a la formación de novo de las mSSC en las regiones extraesqueléticas. (A) Se dispusieron esponjas de colágeno que contenían 3 ug de BMP2 recombinante liofilizado en sitios extraesqueléticos en ratones C57BL6 tipo silvestre, o bien debajo de la cápsula renal o subcutáneamente dentro de la almohadilla de grasa inguinal. Un mes después, se explantó el injerto para análisis. (Paneles izquierdos) Imágenes de campo brillante de explantes, con el trasplante de cápsula renal mostrado anteriormente y el trasplante subcutáneo mostrado a continuación. (Paneles derechos) Las secciones transversales teñidas con pentacromo de Movat demuestra que los osteoides óseos inducidos estaban repletos de una cavidad de médula ósea (indicado por la tinción en rojo). Barra de escala equivalente a: (panel izquierdo) 500 |jm; (panel derecho) 200 |jm. (B) El análisis por FACS de células presentes dentro de los osteoides (panel horizontal inferior), formados por inducción de BMP2 en sitios esqueléticos, revela altos niveles de injerto por circulación de HSC SlamFI positivas (representado por la población verde sobre el gráfico de FACS en el extremo derecho), iguales a la frecuencia normal de injerto de HSC en un fémur adulto "normal" en un ratón (representado por la población verde en el gráfico de FACS en el extremo derecho) (panel horizontal superior). (C) (Paneles izquierdos) Tras el explante de esponjas de colágeno con BMP2 el día 10 después de la colocación en sitios esqueléticos, El análisis por FACS de las poblaciones celulares constituyentes presentes dentro del injerto reveló que mSSC (representadas por el recuadro rojo en el gráfico de FACS) y BCSP (representadas por el recuadro verde en el gráfico de FACS) son fácilmente detectables en los explantes tratados con BMP2. (Paneles derechos) Por el contrario, el análisis por FACS del tejido adiposo en ausencia de BMP2 no detecta ni mSSC (representado por el recuadro rojo en el gráfico de FACS) ni BCSP (representado por el recuadro verde en el gráfico de FACS. Barra de escala equivalente a 500 jm . (D) Para determinar si se formaban los progenitores esqueléticos ectópicos por compromiso esquelético inducido por BMP2 in situ o si BMP2 fomentaba la migración de los progenitores esqueléticos circulantes reclutados de tejido óseo, implementamos un modelo parabionte para determinar el origen de los progenitores esqueléticos en los implantes de BMP2. Se emparejó un ratón GFP marcado con un ratón tipo silvestre no fluorescente y posteriormente se fusionaron quirúrgicamente. Dos semanas después de la cirugía, se verificó el quimerismo fisiológico midiendo la parte de células sanguíneas periféricas GFP marcadas presentes en la sangre circulante del ratón tipo silvestre. Se trasplantó una esponja de colágeno que contenía 3 ug de BMP2 recombinante liofilizada en la almohadilla de grasa inguinal del ratón tipo silvestre para inducir la formación ectópica de hueso. Diez días después del implante, explantamos el tejido y realizamos disociación mecánica y química para aislar las poblaciones celulares constituyentes del tejido óseo ectópico. A continuación, ensayamos la contribución de las células GFP marcadas para la formación de hueso ectópico en el ratón no GFP mediante análisis por FACS como se muestra en el panel superior horizontal que representa el gráfico del análisis por FACS (es decir, GFP+ = células circulantes, y no fluorescentes = células locales). Aunque detectamos abundantes células GFP marcadas en el implante en la extracción, las células GFP marcadas que contribuían al injerto eran únicamente células hematopoyéticas CD45(+) (panel del extremo izquierdo, superior e inferior) y no consisten en población progenitora esquelética (panel superior horizontal, población de mSSC mostrada en el recuadro rojo en el extremo derecho). La población progenitora esquelética presente en el tejido explantado en la extracción era enteramente GFP negativa lo que sugiere que las células progenitoras esqueléticas circulantes no contribuían a los huesos ectópicos inducidos por BMP2. [la células verdes presentes en el gráfico de FACS del extremo derecho no representan las células GFP marcadas.] (E) (Panel izquierdo) El diagrama del modelo de ratón del gen indicador muestra que la expresión de Tie2 conduce a la expresión de GFP. En consecuencia, las células Tie2+ se vuelven verdes pero las células Tie2- permanecen rojas. (Panel derecho) Esquema del experimento: Para determinar los tipos de células, que podrían someterse a reprogramación mediada por BMP-2 a mSSC en sitios esqueléticos, implementamos un ratón indicador Tie2Cre x MTMG y se dispuso una esponja de colágeno que contenía 3 jg de b MP2 recombinante liofilizada en la grasa subcutánea en la almohadilla de grasa inguinal. El osículo se explantó un mes después para el análisis histológico. (F) La micrografía de fluorescencia del tejido seccionado ilustra que los osículos derivados por BMP-2 (representados por la línea discontinua amarilla) incorporan claramente tanto osteocitos derivados GFP+ Tie2+ con canalículos visibles como osteocitos RFP marcados Tie2 negativos, sugiriendo de este modo que tanto los linajes Tie2 positivos como los Tie2 negativos podrían ambos someterse a reprogramación esquelética inducida por BMP2. Se indican con una línea blanca y se muestran a aumento mayor en el recuadro del extremo derecho, lo que muestra la presencia de canalículos Tie2+ (GFP+) en presencia de células Tie2- (RFP+). Barra de escala equivalente a 500 jm (izquierda) 50 um (derecha).

Figura 7. La coadministración de BMP2 e inhibidor de VEGF es suficiente para inducir la formación de novo de cartílago en tejido adiposo. (A) Esquema del experimento: coadministración de BMP2 y VEGFR1 soluble a adipocitos in situ. BMP2 además de la inhibición de la señalización de VEGF/PIGF conduce a la diferenciación condrogénica del tejido adiposo. BMP2 sola (es decir, sin inhibición de VEGF/PIGF) conduce a la diferenciación osteogénica. (B) Destino de los implantes subcutáneos de esponja con colágeno que contenían BMP2 sin bloqueo de VEGFR (paneles izquierdos) o con bloqueo de VEGF (paneles derechos). Un mes después de la disposición de la esponja de colágeno que contenía 3 ug de BMP2 recombinante liofilizada con/sin bloqueo de VEGFR sistémico/local, se explantaron los injertos para análisis. Las imágenes de campo brillante de los injertos (izquierda) se muestran al lado de las secciones representativas teñidas con pentacromo de Movat (derecha). La coadministración de BMP2 y VEGFR dio como resultado la formación de cartílago teñido de azul (paneles del extremo derecho, superiores e inferiores). El resultado tras el bloqueo de VEGF sistémico se muestra en las series superiores de la derecha, mientras que el resultado del bloqueo de VEGF se muestra en las series inferiores a la derecha. Barra de escala equivalente a (paneles que se mueven de derecha a izquierda): (extremo derecho) 1 mm; (interior derecha) 200 jm ; (interior izquierda) 1 mm; (extremo izquierdo) 200 jm . (C) El análisis del gráfico de FACS de las células constituyentes del cartílago inducido (panel horizontal superior) (esquema experimental como se muestra en la Figura 7A) frente a aquellos de las células recién aisladas de cartílago de oreja de ratones emparejados por edad (panel horizontal inferior) demuestra que la mayoría de tanto el tejido de cartílago inducido como natural están dentro de la subpoblación de CCP (progenitor de cartílago comprometido). (D) Expresión génica para ligandos y receptores asociados con la vía de señalización de BMP2 y VEGF/PIGF en poblaciones adipogénicas (parte superior: ligandos, parte inferior: receptores). (T+P+: CD45(-)Tie2(+)PDGFR<(+), T-P+: CD45(-)Tie2(-)PDGFR<(+)) (E) Expresión génica para Sox9 (factor de transcripción de condrogénesis inducida por la proteína morfogénica de hueso-2), Runx2 (un factor de transcripción clave para la osteoblastogénesis), Sp7 (factor de transcripción específica a hueso requerida para la diferenciación osteoblástica y la formación de hueso) y genes de Foxa2 en las poblaciones adipogénicas (derecha). (T+P+: CD45(-)Tie2(+)PDGFR((+), T-P+: CD45(-)Tie2(-)PDGFR<(+)).

Figura 8: Las expansiones clonales postnatales se restringen a destinos de hueso, cartílago y estromales. (A) Esquema de cuantificación de Rainbow: imagen fluorescente mostrada de la placa de crecimiento femoral de un ratón P3. Los clones (>/= 5 células congruentes de un único color) se muestran por la línea discontinua blanca. Se muestran 5 combinaciones de color, enumeradas de 1-5 en la imagen. La definición de clon se muestra abajo a la derecha. Barra de escala equivalente a 100 pM. (B) Esquema del experimento: El ratón transgénico Actina-Cre-ERT se cruzó con ratón de gen indicador Rainbow. La recombinación de Cre de la descendencia se indujo por inyección de tamoxifeno el día 15 embrionario (E15), día 3 postnatal (P3) y la semana 6 postnatal. El tejido femoral se extrajo 6 semanas después de la inyección. (C) Micrografías fluorescentes de la placa de crecimiento femoral tras la inducción en diferentes momentos (panel vertical a la izquierda (i), (ii): inducción en el día E15; panel central (iii), (iv): inducción en el día P3; panel vertical a la derecha (v), (vi): inducción a las 6 semanas). Las puntas de flecha demuestran los clones presentes. Tomar nota de la reducción leve en las regiones clonales tras la inducción a las 6 semanas. En los insertos de la correspondiente figura se muestran los insertos de gran aumento representados del área mostrada por un rectángulo blanco discontinuo: (ii), (vi) y (iv) como se ilustran. Barra de escala equivalente a 500 pm. (D) Un ratón Actina-Cre rainbow de 6 semanas de vida, inducido con tamoxifeno el día 3 postnatal (P3) y sacrificado la semana 6. (i) Vista de baja energía del segmento proximal de un fémur, con áreas que corresponden a (a) placa de crecimiento, (b) médula ósea, (c) grasa y (d) vasculatura. Los paneles de mayor aumento representativos representan la placa de crecimiento femoral (ii), (iii); médula ósea (iv), (v), (vi); grasa (vii), (viii), (ix); y vaso sanguíneo (x), (xi), (xii). Las micrografías fluorescentes demuestran las regiones clonales de células en únicamente un sitio - la placa de crecimiento (ii) - con cada clon que aparece como un montón de células del mismo color. No hay regiones clonales significativas (las cuales se representarían como un montón de células del mismo color) mostradas en el estroma de la médula ósea (iv), la grasa (vii), y la vasculatura (x). Las HSC, los vasos sanguíneos y la grasa en las secciones de tejido se inmunotiñeron con anti-CD45, anti-CD31 y anti-perilipina-A, respectivamente, como se muestra en los paneles (vi), (xii) y (ix). Nota: imágenes (ii), (iv), (vii) y (x): microscopia de fluorescencia; imágenes (iii), (v), (viii), (xi): microscopía de campo brillante de secciones tras la tinción con pentacromo. Barra de escala equivalente a (i) 500 pm; (ii-ix) 50 pm, (x, xi, xii) 200 pm. (E) Ratón Actina Cre/Rainbow inducido el día P3 y extraído 6 semanas después. (i) Imagen de campo brillante de esternón (ii) Las micrografías fluorescentes muestran el esternón con clones ilustrados de nuevo por un montón de células del mismo color. (iii) Inserto de gran aumento indicado por el recuadro blanco. Barra de escala equivalente a: (i, ii) 500 pm, (iii-v) 200 pm. (F) Ratón Actina Cre/Rainbow inducido el día P3 y extraído 6 semanas después. (i) Imagen de campo brillante de costillas (ii) Las micrografías fluorescentes muestran las costillas con clones ilustrados de nuevo por un montón de células del mismo color. (iii) Inserto de gran aumento indicado por el recuadro blanco. Barra de escala equivalente a: (i, ii) 500 pm, (iii) 50 pm. (G) Ratón Actina Cre/Rainbow inducido el día P3 y extraído 6 semanas después. (i) Imagen de campo brillante de toda la pata (ii) Las micrografías fluorescentes muestran la pata con clones ilustrados de nuevo por un montón de células del mismo color. (iii) Inserto de gran aumento de la falange indicado por el recuadro blanco. Barra de escala equivalente a (i-ii) 1 mm; (iii) 200 pm.

Figura 9: La lesión induce a expansión local de mSSC. (A) Esquema del experimento: Se crearon fracturas femorales de diáfisis media transversales estabilizadas en la extremidad inferior derecha de ratones tipo silvestre de 8 semanas de vida. Los callos femorales se extrajeron posteriormente el día 3/ la semana 1/ la semana 3 y las células constituyentes se aislaron por disociación mecánica y enzimática. A continuación, las células se tiñeron y se fraccionaron por FACS. Los fémures del lado izquierdo no se lesionaron y en su lugar, actuaron como control no fracturado. A continuación, las mSSC de los fémures ilesos y los fémures lesionados se trasplantaron debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes y el tejido se explantó 1 mes después para el análisis histológico. (B) Gráficos de barras que ilustran el número de mSSC presentes en el fémur intacto ileso y los callos femorales en diferentes momentos. Esto muestra un incremento significativo en el número de las mSSC vistas la semana 1, con posterior retorno al número de mSSC de referencia en los callos de fractura en las fases posteriores de la curación de la fractura (semana 3). Esta observación respalda la proliferación vigorosa de mSSC que ocurre en respuesta a la lesión ósea (p<0,01, prueba de la t). Número de mSSC por 100.000 células analizadas de cada muestra indicado por debajo del eje x. (C) (Panelizquierdo) Se aislaron en el momento 20.000 mSSC de un callo a una semana después de la fractura (parte superior) y de un fémur ileso (parte inferior). Las células se cultivaron en presencia de medios de diferenciación osteogénica durante 2 semanas y, a continuación, se sometieron a tinción en rojo Alizarina. En este caso, vemos significativamente mayor tinción con rojo Alizarina de las mSSC obtenidas del microambiente de la fractura en comparación con las aisladas del fémur ileso, lo que sugiere potencial osteogénico aumentado de mSSC después de la lesión (p<;0,01, prueba de la t). (Panel derecho) Imagen de campo brillante de los injertos explantados: (parte superior) tejido obtenido del trasplante de mSSC aisladas de los callos de la fractura, (parte inferior) tejido obtenido del trasplante de mSSC aisladas del fémur ileso. Barra de escala equivalente a: (panel izquierdo, in vitro) 500 pm; (panel derecho, in vivo) 1 mm. (D) Gráficos de barras que ilustran el número de mSSC presentes en las siguientes muestras: (i) fémur no irradiado una semana después de la fractura, (ii) fémur irradiado una semana después de la fractura, (iii) fémur ileso, no irradiado, (iv) fémur ileso, irradiado. Esto muestra una disminución significativa en el número de las mSSC vistas a la semana 1 después de fractura tras la irradiación en comparación con el control no irradiado (p<0,01, prueba de la t). Esto también muestra una disminución significativa en el número de mSSC en un fémur ileso tras la irradiación en comparación con el control no irradiado (p<0,01, prueba de la t). Esto muestra que la irradiación reduce la expansión de las mSSC.

Figura 10: La progenie de mSSC traduce las señales sistémicas para las mSSC parentales. (A) Mapas de interacción ligando-receptor que muestran los niveles de expresión génica de los antagonistas de BMP gremlin-2 y Nogina (parte superior e inferior derecha respectivamente), que se encuentra que se expresan en las subpoblaciones progenitoras posteriores de la mSSC, específicamente las subpoblaciones Thy y BLSP. También notamos que hay expresión génica incrementada de los receptores para las hormonas sistémicas leptina y la hormona estimulante tiroidea (TSH) en las mismas subpoblaciones de progenitores posteriores, Thy y BLSP (paneles izquierdos de la parte superior e inferior), que se ven que expresan antagonistas de la vía de BMP2. Observando los paneles izquierdos y derechos al unísono, la gráfica de la interacción ligando-receptor cognado demuestra que la señalización a través de los receptores de las hormonas sistémicas leptina y TSH pueden producir señales inhibidoras para la expansión de mSSC por antagonismo de BMP2 (vía gremlin 2, nogina) y osteogénesis posterior en poblaciones estromales esqueléticas. Las flechas ilustran las interacciones potenciales receptor-ligando. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (B) Se cultivaron 10.000 mSSC en un número de diferentes condiciones: medios regulares (control), medios acondicionados (CM) de subpoblaciones Thy tratadas con o sin proteína leptina recombinante (Thy CM leptina / Thy CM - leptina) y CM de poblaciones BLSP tratadas con o sin proteína leptina recombinante (BLSP CM leptina / BLSp CM - leptina). En este caso, notamos que CM de tanto Thy como BLSP cultivados sin leptina reducen la expansión de mSSC en comparación con el control. Sin embargo, CM de tanto Thy como BLSP cultivadas con leptina reducen además la expansión de mSSC en comparación con el control o CM de la subpoblación Thy/BLSP de células no tratadas con leptina. Por tanto, la señalización de leptina reduce el crecimiento potencial de mSSC in vitro. (C) Niveles de expresión génica de leptina (izquierda) y su receptor (derecha) en poblaciones estromales esqueléticas. La expresión negativa del ligando pero la alta expresión del receptor implica que la leptina se proporciona extrínsecamente. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (D) Se cultivaron 10.000 células Thy recién aisladas en medios sin suero suplementados con o sin leptina recombinante (1 pg/ml) in vitro y posteriormente se extrajeron las células para qRTPCR a los 14 días después de la siembra en placa. Los niveles de expresión génica relativos para Nogina, Gremlin 2 y receptor de Leptina en el subconjunto de Thy tratado con o sin leptina recombinante se muestran en la gráfica. La gráfica demuestra que el subconjunto Thy cultivado en presencia de leptina da como resultado la regulación al alza de la expresión transcripcional de Nogina, Gremlin2 y receptor de Leptina, reforzando de este modo nuestra hipótesis de que puede existir una conexión entre la circulación sistémica y las subpoblaciones progenitoras esqueléticas. (ii) Inmunohistoquímica de células Thy cultivadas sin suplemento de leptina. El colorante rojo ilustra la expresión de Gremlin 2. (iii) Inmunohistoquímica de células Thy cultivadas con suplemento de leptina. El colorante rojo ilustra la expresión de Gremlin 2. En este caso, podemos ver la expresión incrementada de Gremlin 2 tras el suplemento del medio de cultivo con leptina (1 pg/ml). Barra de escala equivalente a 100 pm. (E) Esquema de las vías propuestas que influyen en la función de mSSC. La leptina, un factor sistémico circulante, activa el receptor de leptina presente en las células Thy y BLSP, que conduce a la expresión de Gremlin 2 y Nogina por células Thy y BLSP (véase la Figura 3D), que antagoniza la señalización de BMP-2 y la posterior proliferación de mSSC inducida por BMP2. Por el contrario, la proliferación de mSSC se fomenta a través de BMP-2.

Figura 11: El antagonismo de Tgfp fomentó la formación de cartílago en mSSC. (A) Esquema del experimento: Se aislaron mSSC de huesos largos de ratones tipo silvestre C57BL6 P3. Estas células se cultivaron en presencia de proteínas recombinantes. Había 2 grupos experimentales y uno control. Los grupos experimentales se trataron con las siguientes proteínas recombinantes solubles durante una semana antes del trasplante dentro de la grasa subcutánea de la almohadilla de grasa inguinal: (I) TGF p, (II) TGF pR. Los injertos se explantaron posteriormente a las tres semanas para el análisis histológico. (B) (Paneles izquierdos) mSSC pretratadas con TGFp. Por encima, vemos la fotografía del injerto en el explante. Por debajo: vemos el espécimen histológico teñido con pentacromo, que no muestra la formación bruta de hueso y cartílago. (Paneles derechos) mSSC pretratadas con TGFpR. Por encima, vemos la fotografía del injerto en el explante. Por debajo: vemos las imágenes de campo brillante de tejido explantado teñido con pentacromo, que muestra el injerto explantado consistente en su mayor parte en cartílago (azul) con poca formación de hueso. Barra de escala equivalente a: (paneles superiores) 1 mm; (paneles inferiores) 200 pm.

Figura 12: Mapa de calor de la expresión génica en subconjuntos esqueléticos. (A) Ligandos de C-Kit, IL-3 y IL-9, que son esenciales para soportar la hematopoyesis, se expresan en los subconjuntos estromales esqueléticos. La gráfica demuestra la interacción ligando-receptor cognado entre las células estromales y hematopoyéticas esqueléticas. (Nota MEP = progenitor eritroide de megacariocitos, GMP = progenitor macrófagos y granulocitos, CLP = progenitor linfoide común). Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (B) El diagrama de la interacción propuesta entre el nicho esquelético y el nicho hematopoyético ilustra que las células estromales esqueléticas secretan moléculas reguladoras y citocinas al nicho local y al nicho hematopoyético, respectivamente. Esas moléculas de señalización están implicadas en la proliferación y diferenciación de tanto mSSC como HSC.

Figura 13: Las células Mx1 Cre marcadas abarcan la población de mSSC (A) Esquema del experimento: Los ratones Mx1-Cre-ERT se indujeron el día E15. El día P3, se extrajeron los fémures y se aislaron las células tras la disociación mecánica y enzimática y el posterior fraccionamiento por FACS. (B) La estrategia de separación por FACS ilustra que mSSC están presentes en las células que expresan Mx1-Cre. Esto demuestra que las células Mx1 marcadas son un marcador no específico para las células progenitoras mesenquimales. Las células que expresan Mx1 (GFP+) se identifican dentro de los subconjuntos CD45+, Tie2+, y [AlfaV+]. 12,6 % de las células de la población [CD45(-)Ter119(-)Tie2(-)AlfaV(+)Thy(-)6C3(-)] (que incluye las mSSC) eran Mx1-CRE positivas, lo cual se demuestra en el panel inferior en el segundo gráfico de FACS del extremo derecho de la figura.

Figura 14: La heterogeneidad de mSSC refleja la diferencia en la estructura esquelética. (A) El diagrama de la anatomía esquelética de ratón ilustra las diferentes formas y tamaños en los huesos. Se extrajeron cada uno de los huesos enumerados, se disociaron mecánicamente y enzimáticamente y se tiñeron para el análisis por FACS para identificar el número de mSSC presentes en 1 millón de células aisladas de cada subconjunto de hueso. (B) Los gráficos de barra demuestran los números de mSSC presentes en 1 millón de células de cada hueso aislado. Los números relativos de mSSC no son uniformes a través de todos los subtipos de hueso y son más probables de incrementarse en los componentes distales del esqueleto apendicular. (C) La tabla muestra el recuento de la unidad formadora de colonia (UFC) de mSSC aisladas de diferentes huesos de ratón. Se sembraron 500 mSSC de clasificación doble de cada subconjunto de hueso en una placa de cultivo de tejido de 10 cm que contenía medio MEMa con FBS al 10 % y se contaron las UFC a los 14 días después. En este caso, de nuevo vemos la capacidad heterogénea para la formación de colonia a través de diferentes subtipos de hueso. (D) Imágenes de microscopia de fases de colonias formadas mostradas a 40x después de 14 días de cultivo. Hay una evidente heterogeneidad bruta en la morfología de las colonias formadas por diferentes huesos. Barra de escala equivalente a 200 pm. (E) Después se contaron las UFC a los 14 días después de la siembra en placa, las células se tiñeron y se analizaron por FACS para determinar las células constituyentes presentes en las colonias. El análisis de las colonias formadas de cada subconjunto de hueso demuestra la heterogeneidad en diferentes potenciales para las mSSC, dependiente del tipo de hueso del que se aisló. (F) Los recuentos celulares de cuatro subpoblaciones (AlfaV+, Thy, 6C3 y doble negativa (DN) = Thy-6C3-) de cada subconjunto de hueso en dos momentos implican que la velocidad de proliferación de cada subpoblación también varía dependiendo del origen de las células.

Figura 15: Vías de señalización propuestas que afectan a mSSC y la progenie (A) Imágenes de microscopía de fases de mSSC una semana después del cultivo (10.000 mSSC inicialmente sembradas en placa después de FACS), bajo tres condiciones experimentales diferentes (suplemento con BMP2 (0,1 pg/ml)/Nogina (1 pg/ml)/Gremlin 2 (1 pg/ml) de medios normales) o control (medios normales: MEM, FBS al 10%, Penicilina-Estreptomicina al 1 %). En estas condiciones, notamos lo siguiente: el suplemento de Nogina y Gremlin 2 de los medios de cultivo da como resultado la proliferación disminuida de condrocitos hipertrópicos (flecha blanca) típicos de cultivos mSSC no tratados in vitro en comparación con el control o el suplemento de b MP2 (expansión de regiones de condrocitos hipertrópicas). Barra de escala equivalente a 500 pm. (B) (i) Se clasificaron en el momento 10.000 mSSC y se cultivaron en medios regulares (fila superior de los gráficos de FACS) o en medios regulares con suplemento (2 pg/ml) de Wnt3a (fila inferior de los gráficos de FACS). Una semana después, las células se volvieron a aislar, se tiñeron con anticuerpos y se sometieron a fraccionamiento por FACS. En este caso, notamos un incremento en la subpoblación Thy (mostrado en el recuadro rojo), que es proosteogénico. (ii) Secciones teñidas con pentacromo de osículos formados a partir de 5.000 células SSC tratadas con wnt frente a no tratadas con wnt trasplantadas a la cápsula renal durante un mes. El tratamiento con Wnt parecía inhibir la osificación endocronal por SSC como se evidencia por la reducida formación de la cavidad de médula ósea en las muestras tratadas con wnt. Barra de escala equivalente a 200 pm. (C) Datos de expresión génica de la expresión de Axin1 por las mSSC y los progenitores posteriores (BCSP, Thy, 6C3, BLSP, CCP). En este caso, vemos expresión reducida de Axin 1 por CCP en comparación con otras células madre/progenitoras. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (D) Para asegurar que las subpoblaciones de [CD45+Ter 119+] o [Tie2+] no contenían subpoblaciones de alta frecuencia de células esqueletogénicas, aislamos las poblaciones celulares [CD45+Ter 119+] y [Tie2+] (que habíamos excluido previamente en el fraccionamiento por FACS) de los huesos largos de ratones GFP marcados P3 por digestión mecánica y enzimática y posterior fraccionamiento por FACS. A continuación, trasplantamos 20.000 células de cada uno de los subconjuntos debajo de la cápsula renal de ratones RAG-2/gamma(c)KO inmunodeficientes para evaluar el potencial esqueletogénico intrínseco. A diferencia de las ocho subpoblaciones de la fracción [AlfaV+], no se encontró que los subconjuntos CD45/Ter119+ y Tie2+ formaran hueso, cartílago o estroma cuatro semanas después del trasplante. En el panel de la izquierda se muestran las micrografías de campo brillante del tejido presente 4 semanas después del trasplante, con imágenes fluorescentes mostradas a la derecha. Las poblaciones trasplantadas se muestran en el siguiente orden (desde la parte superior a la parte inferior) en ambas filas: parte superior [CD45+Ter119+AlfaV-], centro [Tie2-AlfaV+], parte inferior [Tie2+AlfaV-]. La línea discontinua amarilla representa el armazón de esponja auto fluorescente, la línea discontinua verde representa el auténtico tejido GFP+. Tras el trasplante de células trasplantadas [CD45+Ter119+AlfaV-], no hay auténtica fluorescencia verde y, por tanto, no auténtico injerto de tejido, sin embargo, hay auto fluorescencia (línea discontinua amarilla) presente en la esponja. Tras el trasplante de la población [Tie2-AlfaV+] (recuadro rojo), vemos que hay formación de tejido, representado por la línea discontinua verde. Tras el trasplante de la población Tie2+AlfaV-, hay algo de tejido fluorescente verde presente, sin embargo, esto no era coherente con el tejido óseo, en lugar de formar un tejido fibroso (inserto de gran aumento), con estructuras tubulares presentes (que probablemente representan los vasos sanguíneos, representadas por flechas blancas en el inserto de gran aumento). Paneles izquierdos, derechos: barra de escala equivalente a 1 mm. (E) (i) Niveles de expresión génica de leptina (izquierda) y su receptor (derecha) en poblaciones estromales esqueléticas. Expresión negativa de ligando pero alta expresión de receptor en subconjunto Thy implica que la leptina se proporciona extrínsecamente. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. FPKM: Fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas (E) (ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCSP. La gráfica ilustra la expresión del receptor de Leptina por las mSSC y la progenie posterior. Esto ilustra que no hay expresión del receptor de Leptina por las poblaciones de mSSC (verde) y BCSP (turquesa), en comparación con la progenie posterior (6C3 - púrpura, Thy - rojo). (F) (i) Niveles de expresión génica de FoxA2 en poblaciones estromales esqueléticas. En este caso, vemos expresión marcada de FoxA2 en las mSSC en comparación con la progenie posterior. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/-y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCSP. La gráfica ilustra la expresión de FoxA2 a un nivel de célula individual. Consecuente con (i), observamos que Foxa2 se regula al alza significativamente en la mSSC, a niveles mucho menores en CSP, y casi no existentes en la progenie posterior. G (i) Niveles de expresión génica de Runx2 en poblaciones estromales esqueléticas. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCSP. La gráfica ilustra la expresión de Runx2. H (i) Niveles de expresión génica de Colágeno 2A en poblaciones estromales esqueléticas. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCs P. La gráfica ilustra la expresión de Colágeno 2A. I (i) Niveles de expresión génica de Colágeno 10A en poblaciones estromales esqueléticas. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/- y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCSp . La gráfica ilustra la expresión de Colágeno 10A. J (i) Niveles de expresión génica de Sox9 en poblaciones estromales esqueléticas. Hay que tener en cuenta que, ya que estos experimentos se realizaron antes del refinamiento adicional con CD200, la población *mSSC estudiada representa las poblaciones de célula triple negativa [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-CD105-6C3-], que incluye ambas poblaciones celulares CD200+/-y, por tanto, ilustra los datos de expresión transcripcional de la mSSC/pre-BCSP. (ii) Secuenciación de ARN de célula individual de las siguientes poblaciones celulares: 6C3(+) (que abarca las subpoblaciones 6C3 y HEC), Thy (+) (que abarca las subpoblaciones CCP, Thy y BLSP), mSSC y BCSp . La gráfica ilustra la expresión de Sox9.

Figura 16. (A) Una sección trasversal del fémur fetal humano de 17 semanas de vida teñida con pentacromo de Movat que muestra regiones de cartílago (azul) y hueso (amarillo). La fotografía del inserto muestra la placa de crecimiento donde encontramos alta frecuencia de SSC. (B) Esquema experimental para el aislamiento prospectivo de células madre/progenitoras esqueléticas humanas y caracterización fenotípica secundaria in vivo. (C) Estrategia de separación por FACS de subconjuntos de madre/progenitor esquelético humano de fémur fetal humano de 17 semanas, que indica las poblaciones definidas que dan lugar a cartílago, hueso con cartílago, o hueso con médula ósea. Las flechas coloreadas indican secciones teñidas con pentacromo de tejidos derivados de progenitor humanos explantados en riñón (azul = cartílago; verde = hueso cartílago; amarillo = hueso). (D) Diagrama que indica la región de la cabeza femoral y la fotografía de la región de la cabeza femoral adulta donde se pueden aislar los subconjunto de madre/progenitor esquelético humano. (E) Estrategia de separación por FACS de subconjuntos de madre/progenitor esquelético humano de tejido de la cabeza femoral de adulto.

Figura 17. (A) Esquema para el análisis in vitro de la progresión de linaje por hSSC y subconjuntos de progenitor esquelético humano. (B) (Paneles superiores y centrales) Diferenciación de hSSC cultivada en subconjuntos restringidos a linaje analizada por FACS. (Panel inferior) Capacidad osteogénica diferente de subconjuntos de progenitor esquelético humano individuales determina mediante tinción con rojo alizarina (hSSC = célula madre esquelética humana; BCSP = célula progenitora de hueso, cartílago y estroma; hCP = progenitor de condrocitos humanos; hOP = progenitor osteogénico humano). El rojo Alizarina más fuerte se muestra en hOP. (C) Esquema experimental de la marcación vírica RGB y expansión clonal in vivo de la célula madre esquelética humana (hSSC) lentivíricamente marcada (D) Clones de hSSC lentivíricamente marcados con EGFP y RFP en hueso (amarillo) y cartílago (azul) in vivo como se muestra en las secciones teñidas con Pentacromo de injertos de riñón derivados de hSSC. (E) (Panel superior) Micrografía de las colonias derivadas de los cultivos de hSSC, BCSP, hOP, y hCP, respectivamente. (Panel inferior) Gráficos de FACS de cuatro subconjuntos de madre/progenitor esquelético humano.

Figura 18. Mapas de linaje de hSSC (izquierda) frente mSSC (derecha). (pre) BCSP = (pre) célula progenitora de hueso, cartílago y estroma; hCP = progenitor de condrocitos humanos; hOP = progenitor osteogénico humano.

Figura 19. (A) (Panel izquierdo) Diagrama que muestra la localización de subconjuntos de progenitor esquelético humano en huesos en desarrollo al lado de (panel derecho) del diagrama que representa el intervalo de factores de nicho esquelético (hSSC = célula madre esquelética; BCSP = célula progenitora de hueso, cartílago y estroma; hCP = progenitor de condrocitos humanos; hOP = progenitor osteogénico humano). (B) Diagrama de las interacciones de nicho de hSSC. (C) Expansión de hSSC a partir del tratamiento con factor de nicho de mSSC representativo. (D) Predicción de las interacciones de factor/receptor cognado de nicho entre las poblaciones esqueléticas humanas por el algoritmo de GEXC. (E) Expresión normalizada de factores de nicho de SSC representativos BMP2, VEGF, WNT1, WNT3 en subconjuntos de progenitor esquelético humano. (F) (Panel izquierdo) Mapas de calor de cuatro progenitores esqueléticos humanos a partir de la secuenciación de ARNm de célula individual. (Paneles derechos) Diagrama de Venn que ilustra la expresión conjunta de los ligandos BMP2 o WNT y los receptores a nivel de célula sencilla.

Figura 20. (A) (Gráficos de FACS de la parte superior) Las hASC muestran la expresión de BMPR1B que indica la capacidad de respuesta a la señalización de BMP. (Gráficos de FACS de la parte inferior) Inducción de la formación de hSSC a partir de hASC por BMP2. (B) Esquema para la coadministración de hASC con BMP2 reprogramadora. (C) (Paneles izquierdos) Foto en bruto de osículo subcutáneamente inducido derivado de la coadministración de hASC con BMP2. El panel inferior ilustra imágenes 3x aumentadas del rectángulo en el panel superior. (Paneles derechos) Micrografía de la sección de osículo inducido teñida con Pentacromo de Movat (hueso = amarillo; cartílago = azul verdoso). (D) Diagrama de inducción in situ de la formación de hueso o cartílago a partir de tejido adiposo de ratón usando combinaciones de BMP2 y receptor de VEGF soluble. (E) La señalización de VEGF puede cambiar mSSC inducidas por BMP2 hacia destinos de hueso (izquierda) o cartílago (derecha).

Figura 21. Medicina regenerativa esquelética basada en célula madre de próxima generación.

Descripción detallada de las realizaciones de la invención

Antes de describir los presentes métodos y composiciones, ha de entenderse que la presente invención no se limita al método o composición particular descritos, ya que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se desvela específicamente. Está abarcado en la invención cada intervalo menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos o excluidos independientemente en el intervalo, y también se abarca en la invención cada intervalo donde alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen alguno de los límites incluidos o ambos.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la cual pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o en el ensayo de la presente invención, a continuación, se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

Cabe destacar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias al plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la materia y así sucesivamente.

Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No ha de interpretarse que nada en el presente documento constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer dicha publicación por virtud de una invención anterior. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que tal vez deban ser confirmadas independientemente.

Definiciones

Se proporcionan métodos, composiciones y kits para producir condrocitos, células esqueléticas, células estromales de médula ósea y células progenitoras de los mismos funcionales. Estos métodos, composiciones y kits encuentran uso en la producción de condrocitos, osteoblastos, células estromales y células progenitoras de los mismos para trasplante, para evaluación experimental, como una fuente de productos específicos a linaje y célula, y similares, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de trastornos humanos del cartílago, hueso y sistema hematopoyético. También se proporcionan métodos, composiciones y kits para el cribado de agentes candidatos para la actividad en la conversión de células en células esqueléticas, astrocitos, oligodendrocitos y células progenitoras de los mismos.

Las composiciones y los métodos se proporcionan para dirigir la diferenciación de células madre esqueléticas de mamífero, que incluye la diferenciación en linajes osteogénicos, condrogénicos y estromales. Las composiciones y los métodos se proporcionan para dirigir la diferenciación de células no esqueléticas, por ejemplo, células madre pluripotentes, células madre mesenquimales (MSC), etc., en células madre esqueléticas. Para sus usos in vivo, se pueden proporcionar sistémicamente un factor o factores de reprogramación o como un implante localizado, y opcionalmente se proporcionan con una dosis eficaz de células, por ejemplo, SSC, MSC, células progenitoras de cartílago comprometidas (CCP), y similares. También se proporcionan sistemas de cultivo celular para tales métodos. Las células encuentran uso en los métodos terapéuticos, por ejemplo, para proporcionar células para la terapia de reemplazo esquelético o condrogénico; en métodos de cribado, y similares. Las células son células humanas.

Estos y otros objetivos, ventajas y características de la invención llegarán a estar claros para los expertos en la materia tras leer los detalles de los métodos y las composiciones objetivos como se describe más completamente más adelante.

Pueden encontrarse métodos generales de bioquímica molecular y celular en libros de texto estándar tales como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); "Short Protocols in Molecular Biology", 4a Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); "Protein Methods" (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); "Nonviral Vectors for Gene Therapy" (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); "Viral Vectors" (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); "Immunology Methods Manual" (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y "Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology" (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta divulgación están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

Por "proliferar" se quiere decir dividir por mitosis, es decir, someterse a mitosis. Una "población expandida" es una población de células que ha proliferado, es decir, se ha sometido a mitosis, de modo que la población expandida tiene un incremento en el número celular, es decir, un número mayor de células, que la población a comienzo.

El término "explante" se refiere a una porción de un órgano o tejido del mismo tomado del cuerpo y cultivado en un medio artificial. Las células que se cultivan "ex vivo" son células que se toman del cuerpo de esta manera, se cultivan temporalmente in vitro y se vuelven al cuerpo.

El término "cultivo primario" indica una población celular mezclada de células de un órgano o tejido dentro de un órgano. La palabra "primaria" toma su significado habitual en la técnica de cultivo de tejido.

El término "tejido" se refiere a un grupo o capa de células igualmente especializadas que realizan juntas ciertas funciones especiales.

El término "órgano" se refiere a dos o más capas adyacentes de tejido, dichas capas de tejido mantienen algo de la forma de la interacción célula-célula y/o célula-matriz para formar una microarquitectura.

Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", se usan indistintamente en el presente documento y hacen referencia a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular, seres humanos.

Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se usan en el presente documento para hacer referencia generalmente a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a la prevención completa o parcial de una enfermedad o de un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a la estabilización o curación parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) evitar la aparición de la enfermedad o síntoma en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma, pero aún no se ha diagnosticado que la padece; (b) inhibir el síntoma de enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar el síntoma de enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.

"Coadministrar" significa administrar junto con otro, conjuntamente, de forma coordinada, incluyendo administración simultánea o secuencial de dos o más agentes.

"Que comprende" significa, sin otra limitación, que incluye lo mencionado, necesariamente, sin ninguna reserva o exclusión sobre cualquier otra cosa que pueda incluirse. Por ejemplo, "una composición que comprende x e y" abarca cualquier composición que contiene x e y, sin importar qué otros componentes que puedan estar presentes en la composición. Igualmente, "un método que comprende la etapa de x" abarca cualquier método en que se realiza x, sea x la única etapa en el método o sea únicamente una de las etapas, sin importar cuantas otras etapas puedan haber y sin importar como de simple o compleja es x en comparación con ellas. "Comprendido de" y expresiones similares que usan palabras de la raíz "comprender" se usan en el presente documento como sinónimos de "que comprende" y tienen el mismo significado. Los métodos de la invención también incluyen el uso de combinaciones de factores que consisten, o consisten prácticamente en los factores deseados.

"Cantidad eficaz" significa generalmente una cantidad que proporciona el efecto local o sistémico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado. Las cantidades eficaces pueden proporcionarse todas de una vez en una única administración o en cantidades fraccionarias que proporcionan la cantidad eficaz en varias administraciones. La determinación precisa de lo que se consideraría una cantidad eficaz puede basarse en factores individuales para cada sujeto, entre los que se incluyen su tamaño, edad, lesión y/o enfermedad o lesión que se está tratando, y la cantidad de tiempo desde que se ha producido la lesión o ha empezado la enfermedad. Un experto en la materia también será capaz de determinar la cantidad eficaz para un sujeto dado basándose en estas consideraciones que son rutinarias en la técnica. Como se usa en el presente documento, "dosis eficaz" significa lo mismo que "cantidad eficaz".

El cartílago es un estructura hiperhidratada con agua que comprende 70 % a 80 % de su peso. El restante 20 % a 30 % comprende colágeno tipo II y proteoglucano. El colágeno generalmente se considera el 70 % del peso seco del cartílago. Los proteoglucanos están compuestos de un núcleo proteico central desde el cual se extienden cadenas largas de polisacáridos. Estos polisacáridos, denominados glucosaminoglucanos, incluyen: condroitín-4-sulfato, condrotín-6-sulfato, y sulfato de queratano. El cartílago tiene una organización estructural característica que consiste en células condrogénicas dispersadas dentro de una matriz extracelular endógenamente producida y secretada. Las cavidades en la matriz que contienen los condrocitos se denominan lagunas de cartílago. A diferencia del hueso, el cartílago ni es inervado ni es penetrado por los sistemas vasculares o linfáticos.

Tres tipos de cartílago están presentes en mamíferos e incluyen: cartílago hialino; fibrocartílago y cartílago elástico. El cartílago hialino consiste en una masa cartilaginosa que tiene una firme consistencia elástica, es translúcido y es de color azul perla. El cartílago hialino se encuentra predominantemente en las superficies articuladas de las articulaciones articuladas. También se encuentra en placas epifisiarias, cartílago costal, cartílago traqueal, cartílago bronquial y cartílago nasal. El cartílago es prácticamente el mismo que el cartílago hialino excepto que contiene fibrillas de colágeno tipo I que añaden resistencia a la tracción al cartílago. Las fibras de colágeno se disponen en manojos, con las células de cartílago localizadas entre los manojos. El fibrocartílago comúnmente se encuentra en la fibrosis anular del disco invertebral, inserciones tendinosas y ligamentosas, menisco, la sínfisis del pubis y las inserciones de las cápsulas de articulación. El cartílago elástico también es similar al cartílago hialino excepto que contiene fibras de elastina. Es más opaco que el cartílago hialino y es más flexible y maleable. Estas características se definen en parte por las fibras elásticas incrustadas en la matriz de cartílago. Normalmente, el cartílago elástico está presente en el pabellón de la oreja, la epiglotis, y la laringe.

Las superficies de los huesos articulados en las articulaciones de mamífero están recubiertas con cartílago articular. El cartílago articular evita el contacto directo de las superficies óseas opuestas y permite el movimiento cercano sin fricción de los huesos articulados uno en relación con el otro. Comúnmente se observan dos tipos de defectos del cartílago articular en mamíferos e incluyen defectos del espesor completo y del espesor parcial. Los dos tipos de defectos difieren no solamente en el grado del daño físico sino también en la naturaleza de la respuesta de reparación que provoca cada tipo de lesión.

Los defectos de cartílago articular de espesor completo incluyen el daño al cartílago articular, el tejido de hueso subcondral subyacente, y la capa calcificada del cartílago localizado entre el cartílago articular y el hueso subcondral. Los defectos de espesor completo normalmente surgen durante un trauma grave de la articulación o durante las fases tardías de las enfermedades degenerativas de la articulación, por ejemplo, durante osteoartritis. Puesto que el tejido óseo subcondral está tanto inervado como vascularizado, el daño a este tejido es con frecuencia doloroso. La reacción de reparación inducida por daño al hueso subcondral generalmente da como resultado la formación de fibrocartílago en el sitio del defecto de espesor completo. El fibrocartílago, sin embargo, carece de las propiedades biomecánicas del cartílago articular y falla en persistir en la articulación a largo plazo.

Los defectos del cartílago articular de grosor parcial se restringen al propio tejido de cartílago. Estos defectos generalmente incluyen fisuras o grietas en la superficie articulada del cartílago. Los defectos de grosor parcial están causados por disposiciones mecánicas de la articulación que de una en una inducen desgaste del tejido del cartílago dentro de la articulación. En ausencia de la inervación y la vasculatura, los defectos de grosor parcial no provocan repuestas de reparación y, por lo tanto, no se curan. Aunque sin dolor, los defectos de grosor parcial con frecuencia degeneran en defectos de grosor completo.

La expresión "célula madre esquelética" se refiere a una célula multipotente y auto renovante capaz de generar células estromales de médula ósea, células esqueléticas, células condrogénicas. Por auto renovación, se quiere decir que cuando se someten a mitosis, producen al menos una célula hija que es una célula madre esquelética. Por multipotente se quiere decir que es capaz de dar lugar a célula progenitora (progenitores esqueléticos) que dan lugar a todos los tipos celulares del sistema esquelético. No son pluripotentes, es decir, no son capaces de dar lugar a células de otros órganos in vivo.

Las células madre esqueléticas también se reprograman a partir de células no esqueléticas, que incluyen, sin limitación, células madre mesenquimales, y tejido adiposo que contiene tales células. Las células reprogramadas pueden denominarse célula madre esquelética inducida, o iSSC. "iSSC" surge de una célula no esquelética por manipulación experimental. Las células esqueléticas inducidas tienen características de SSC funcionales derivadas de la naturaleza, es decir, pueden dar lugar a los mismo linajes.

Las poblaciones de célula SSC humana son negativas para la expresión de CD45, CD235, Tie2 y CD31; y expresan positivamente podoplanina (PDPN). Una población de células, por ejemplo, células aisladas de tejido óseo, que tienen esta combinación de marcadores puede denominarse células [PDPN+/146-]. La población [PDPN+/146'] además puede subdividirse en tres poblaciones: un subconjunto unipotente capaz de condrogénesis [PDPN+CD146-CD73-CD164-], una subpoblación celular unipotente capaz de osteogénesis [PDPN+CD146-CD73-CD164+] y una célula multipotente [PDPN+CD146-CD73+CD164+] capaz de osificación endocondral (hueso y cartílago). Una población de células de interés para su uso en los métodos de la invención puede aislarse de hueso con respecto a CD45, CD235, Tie2, y CD31 y PDPN. Otras poblaciones celulares de interés son células [PDPN+CD146-CD73-CD164-]; células [PDPN+CD146-CD73-CD164+]; y células [PDPN+CD146-CD73+CD164+].

El linaje esquelético de ratón se caracteriza como CD45-, Ter119-, Tie2-, av integrina+. La SSC se caracteriza también como Thy1-6C3-CD105-CD200+.

Células madre derivadas de tejido adiposo. Células madre derivadas de tejido adiposo. o "células estromales derivadas de tejido adiposo" se refieren a células que se originan a partir del de tejido adiposo. Por "adiposo" se entiende cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo pardo o blanco, derivado de sitio de tejido adiposo subcutáneo, omental/visceral, mamario, gonadal u otros. Preferentemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Tales células pueden proporcionarse como cultivo celular primario o una línea celular inmortalizada. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido graso. Preferentemente, el tejido adiposo es de mamífero, lo más preferentemente el tejido adiposo es humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es de la cirugía de liposucción, sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento del tejido adiposo no es crítico para la invención.

El tejido adiposo ofrece muchas ventajas prácticas para las aplicaciones de la ingeniería de tejidos. Es abundante y accesible para los métodos de extracción con riesgo mínimo al paciente. Se estima que hay más de 104 células madre por gramo de tejido adiposo (Sen et al 2001, Journal o f Cellular Biochemistry 81:312-319), cuyas células pueden usarse inmediatamente o crioconservarse para futuras aplicaciones autólogas o alogénicas.

Se han publicado métodos para el aislamiento, expansión y diferenciación de células derivadas de tejido adiposo humano. Véase, por ejemplo, Burris et al 1999, Mol. Endocrinol 13:410-7; Erickson et al 2002, Biochem Biophys Res Commun. 18 de enero, 2002; 290(2):763-9; Gronthos et al 2001, Journal o f Cellular Physiology, 189:54-63; Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Halvorsen et al 2001, Tissue Eng. 7(6):729-41; Harp et al 2001, Biochem Biophys Res Commun 281:907-912; Saladin et al 1999, Cell Growth & D iff 10:43-48; Sen et al 2001, Journal o f Cellular Biochemistry 81:312-319; Zhou et al 1999, Biotechnol. Techniques 13: 513-517. Las células estromales derivadas de tejido adiposo se pueden obtener de tejido adiposo humano picado por digestión por colagenasa y centrifugación diferencial [Halvorsen et al 2001, Metabolism 50:407-413; Hauner et al 1989, J. Clin. Invest. 84:1663-1670; Rodbell et al 1966,. J. Biol. Chem. 241:130-139].

Se han publicado células madre derivadas de tejido adiposo que expresan marcadores entre los que se incluyen: CD13, CD29, CD44, CD63, CD73, CD90, CD166, aldehído deshidrogenasa (ALDH) y ABCG2. Las células madre derivadas de tejido adiposo pueden ser una población de células mononucleares purificadas extraídas de tejido adiposo capaz de proliferar en cultivo durante más de 1 mes.

Para el aislamiento de células del tejido, puede usarse una solución apropiada para la dispersión o la suspensión. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución de sal equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero fetal de ternero u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc.

La población celular puede usarse inmediatamente. Como alternativa, la población celular puede congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelándose y siendo capaz de reutilizarse. En tales casos, las células generalmente se congelarán en d Ms O al 10 %, suero al 50%, medio tamponado al 40 % o alguna otra solución similar como se usa comúnmente en la técnica para conservar las células a tales temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.

Las células adiposas pueden cultivarse in vitro en diferentes condiciones de cultivo. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo, conteniendo agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse convenientemente en un medio nutriente apropiado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI-1640, normalmente suplementado con suero fetal de ternero (aproximadamente 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. En una realización de la invención, las células adiposas se mantienen en cultivo en ausencia de células capa alimentadoras, es decir, en ausencia de suero, etc. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células son sensibles. Los factores de crecimiento, como se define en el presente documento, son moléculas capaces de fomentar la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen factores polipeptídicos y no polipeptídicos.

Las expresiones "eficacia de la reprogramación", "eficacia reprogramante", o "eficacia de conversión" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a la capacidad de las células de un linaje celular para dar lugar a una célula inducida de otro linaje celular cuando se ponen en contacto con el sistema de reprogramación apropiado, por ejemplo, la capacidad de las células del tejido adiposo para dar lugar a iSSC cuando se ponen contacto con altas dosis de BMP2. En otras palabras, las células producen aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 200 veces el número de células inducidas (por ejemplo, iSSC) como la población no contactada, o más.

Además de la reprogramación, se pueden dirigir las células pueden para diferenciarse a lo largo de una vía específica. Por ejemplo, en ausencia de intervención, SSC in vivo dan lugar a muy pocos condrocitos, pero se pueden dirigir a condrogénesis por factores de diferenciación, que pueden denominarse en el presente documento factores de condrogénesis.

Como se usa en el presente documento, el término "BMP-2" se refiere a la familia de proteínas morfogenéticas de hueso del tipo 2, derivadas de cualquier especie, y pueden incluir miméticos y variantes de las mismas. La referencia a BMP-2 en el presente documento se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas actualmente identificadas, que incluyen BMP-2A y BMP-2B, así como a especies BMP-2 identificadas en el futuro. El término "BMP-2" también incluye los polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier BMP-2 conocida cuya secuencia madura es al menos aproximadamente un 75 % homóloga con la secuencia de una BMP- humana madura, cuya secuencia de referencia puede encontrarse en Genbank, número de acceso NP_001191.

BMP-2 señaliza por dos tipos de receptores (BRI y BRII) que se expresan en la superficie celular como complejos homéricos así como heteroméricos. Antes de la unión del ligando, se encuentra un nivel bajo pero medible de receptores de BMP en complejos heterooligoméricos preformados. La fracción principal de los receptores se recluta dentro de los complejos heterooligoméricos únicamente después de la adición del ligando. Para esto, BMP-2 se une primero el receptor BRI de alta afinidad y, a continuación, recluta BRII dentro del complejo de señalización. Sin embargo, aún se requiere la unión del ligando al complejo preformado compuesto de BRII y BRI para la señalización, lo que sugiere que puede mediar los cambios conformacionales activadores. Las señales inducidas por la unión de BMP-2 a los complejos de receptor preformados activan la vía de Smad, mientras que el reclutamiento inducido por BMP-2 de receptores activa una vía independiente de Smad diferente que da como resultado la inducción de la actividad de la fosfatasa alcalina por p38 MAPK.

En algunas realizaciones, se proporciona una dosis de BMP2 en un implante, por ejemplo, una matriz o un armazón para la administración localizada del factor, donde se proporciona la BMP2 como una proteína BMP2 o un fragmento activo de la misma. La dosis eficaz puede determinarse basándose en el tejido específico, la velocidad de liberación a partir del implante, el tamaño del implante, y similares y puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica. La dosis puede proporcionar actividad biológica equivalente a 1 |jg de proteína BMP2, 10 |jg, 100 |jg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 250 mg, 500 mg, 750 mg, 1 g de proteína BMP2. La dosis puede administrarse en un solo momento, por ejemplo, como un implante único; o puede fraccionarse, por ejemplo, administrada en una configuración de microaguja. La dosis puede administrarse, una vez, dos, tres veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más como sea requerido para alcanzar el efecto deseado, y la administración puede ser diaria, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o más.

Los "miméticos de BMP2" incluyen moléculas que funcionan igualmente que BMP2 uniéndose y activando sus receptores como se ha descrito anteriormente. Las moléculas útiles como miméticos de BMP2 incluyen derivados, variantes y fragmentos biológicamente activos de BMP2 de origen natural. Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo como se define a continuación que tiene menos del 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen polipéptidos en donde se añaden uno o más residuos de aminoácidos en el extremo N o C de, o dentro de, la secuencia nativa; desde aproximadamente uno a cuarenta residuos de aminoácidos se someten a deleción, y opcionalmente se sustituyen con uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en donde un residuo de aminoácido se ha modificado covalentemente de modo que el producto resultante tenga un aminoácido de origen no natural. Habitualmente, una variante biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa, preferentemente al menos aproximadamente un 95 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 99 %. Los polipéptidos variantes pueden estar naturalmente y no naturalmente glucosilados, es decir, el polipéptido tiene un patrón de glucosilación que difiere del patrón de glucosilación encontrado en la correspondiente proteína de origen natural. Los polipéptidos variantes pueden tener modificaciones postraduccionales no encontradas en la proteína BMP2 natural.

Los fragmentos de la BMP2 soluble, en particular, los fragmentos biológicamente activos y/o los fragmentos correspondientes a los dominios funcionales, son de interés. Los fragmentos de interés normalmente serán de al menos aproximadamente 10 aa a al menos aproximadamente 15 aa de longitud, generalmente al menos 50 aa de longitud, pero generalmente no superarán aproximadamente los 142 aa de longitud, donde el fragmento tendrá un tramo de aminoácidos que es idéntico a BMP2. Un fragmento de "al menos 20 aa de longitud", por ejemplo, se pretende que incluya 20 o más aminoácidos contiguos de, por ejemplo, el polipéptido codificado por un ADNc para BMP2. En el contexto "aproximadamente" incluyen el valor particularmente citado o un valor mayor o menor por varios (5, 4, 3, 2, o 1) aminoácidos. Las variantes proteicas descritas en el presente documento son codificadas por polinucleótidos que están dentro del alcance de la invención. El código genético puede usarse para seleccionar los codones apropiados para construir las correspondientes variantes. Los polinucleótidos pueden usarse para producir polipéptidos, y estos polipéptidos pueden usarse para producir anticuerpos por métodos conocidos.

Un polipéptido de "fusión" es un polipéptido que comprende un polipéptido o una parte (por ejemplo, uno o más dominios) del mismo fusionado o unido a polipéptido heterólogo. Una proteína BMP2 de fusión, por ejemplo, compartirá al menos una propiedad biológica en común con un polipéptido de BMP2 nativa. Ejemplos de polipéptidos de fusión incluyen inmunoadhesinas, como se ha descrito anteriormente, que combinan una parte del polipéptido de BMP2 con una secuencia de inmunoglobulina, y polipéptidos etiquetados epítopo, que comprende un polipéptido de BMP2 o parte del mismo fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual se puede producir un anticuerpo, incluso es demasiado corto de modo que no interfiere con la actividad biológica del polipéptido de BMP2. Los polipéptidos etiquetas adecuados en general tienen al menos seis residuos de aminoácidos y generalmente entre aproximadamente 6-60 residuos de aminoácidos.

Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. El término "derivado" abarca tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos del polipéptido como las modificaciones covalentes de la misma. Los derivados y la fusión de BMP2 soluble encuentran uso como moléculas miméticas de BMP2.

Las proteínas plasmáticas estables son proteínas que normalmente tienen de 30 a 2.000 residuos, que presentan en su ambiente natural una semivida prolongada en la circulación, es decir, más de aproximadamente 20 horas. Ejemplos de proteínas plasmáticas estables adecuadas son inmunoglobulinas, albúmina, lipoproteínas, apolipoproteínas y transferrina. La región extracelular de BMP2 normalmente se fusiona con la proteína plasmática en el extremo N de la proteína plasmática o el fragmento de la misma que es capaz de conferir una semivida prolongada a la BMP2 soluble. Los incrementos de más de aproximadamente el 100% en la semivida en plasma de la BMP2 soluble son satisfactorios.

Los miméticos de BMP2 adecuados y/o las proteínas de fusión pueden identificarse por cribado de compuesto detectando la capacidad de un agente de imitar la actividad biológica de BMP2, por ejemplo, en el incremento del número de células madre esqueléticas en una población sobre las células no esqueléticas, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 405, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o más.

VEGF es una glucoproteína de 46 kDa unida a disulfuro, dimérica, relacionada con el factor de crecimiento derivado de plaqueta ("PDGF"). Es producida por líneas celulares normales y líneas celulares tumorales; es un mitógeno selectivo de célula endotelial; muestra actividad angiogénica en sistemas de ensayo in vivo (por ejemplo, córnea de conejo); es quimiotáctico para células endoteliales y monocitos; e induce activadores del plasminógeno en células endoteliales, que están implicados en la degradación proteolítica de la matriz extracelular durante la formación de capilares. Se conocen un número de isoformas de VEGF, que cuando muestran actividad biológica comparable, difieren en el tipo de células que las secretan y en su capacidad de unión a heparina. Además, hay otros miembros de la familia de VEGF, tales como el factor de crecimiento de placenta ("PGF") y VEGF-C.

Los receptores celulares de VEGF (VEGFR) son tirosina cinasas receptoras transmembranosas. Se caracterizan por un dominio extracelular con siete dominios tipo inmunoglobulinas y un dominio tirosina cinasa intracelular. Se han caracterizado diferentes tipos de receptor de VEGF, que incluyen VEGFR-1 (también conocido como fit-1), VEGFR-2 (también conocido como KDR), y VEGFR-3.

El "inhibidor de VEGF" como se usa en el presente documento es cualquier sustancia que disminuye la señalización por la vía de VEGF-VEGFR. Los inhibidores de VEGF pueden ser, por nombrar solo algunos ejemplos, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas, que incluyen anticuerpos más específicos, incluidos anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGFR, intracuerpos, maxicuerpos, minicuerpos, diacuerpos, proteínas de fusión Fc tales como pepticuerpos, recepticuerpos, proteínas receptoras de VEGF solubles y fragmentos, y diversos otros. Muchos inhibidores de VEGF funcionan uniéndose a VEGF o a un receptor de VEGF. Otros funcionan más indirectamente uniéndose a factores que se unen a VEGF o a un receptor de VEGF o a otros componentes de la vía de señalización de VEGF. Incluso otros inhibidores de VEGF actúan alterando las modificaciones postraduccionales reguladoras que modulan la señalización de la vía del VEGF. Los inhibidores de VEGF de acuerdo con la invención también actúan a través de más mecanismos indirectos. Cualquiera que sea el mecanismo implicado, como se usa en el presente documento, un inhibidor de VEGF disminuye la actividad eficaz de la vía de señalización de VEGF en una circunstancia dada durante la que estaría en la misma circunstancia en ausencia del inhibidor.

En algunas realizaciones, se proporciona una dosis del inhibidor de VEGF en un implante, por ejemplo, una matriz o armazón para la administración localizada del factor. La dosis eficaz puede determinarse basándose en el tejido específico, la velocidad de liberación a partir del implante, el tamaño del implante, y similares y puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica. La dosis puede proporcionar actividad biológica equivalente a 1 |jg de receptor de Ve Gf soluble, 10 jg , 100 jg , 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 25o mg, 500 mg, 750 mg, 1 g de receptor de VEGF soluble. La dosis puede administrarse en un solo momento, por ejemplo, como un implante único; o puede fraccionarse, por ejemplo, administrada en una configuración de microaguja. La dosis puede administrarse, una vez, dos, tres veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más como sea requerido para alcanzar el efecto deseado, y la administración puede ser diaria, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o más.

En la bibliografía se han descrito un gran número de inhibidores de VEGF. Además de los descritos en más detalle a continuación, los inhibidores de VEGF se describen en los siguientes documentos de patente: US 2003/0105091, US2006/0241115, US 5.521.184, US 5.770.599, US 5.990.141, US 6.235.764, US 6.258.812, US 6.515.004, US 6.630.500, US 6.713.485, WO2005/070891, WO 01/32651, WO 02/68406, WO 02/66470, WO 02/55501, WO 04/05279, WO 04/07481, WO 04/07458, WO 04/09784, WO 02/59110, WO 99/450029, WO 00/59509, WO 99/61422, WO 00/12089, WO 00/02871 y WO 01/37820, particularmente en partes pertinentes a los inhibidores de VEGF.

Los siguientes están entre inhibidores de VEGF específicos: ABT-869 (Abbott) que incluye formulaciones para la administración oral e inhibidores de VEGF muy relacionados; AEE-788 (Novartis) (también denominado AE-788 y NVP-AEE-788, entre otros) que incluye formulaciones para la administración oral e inhibidores de VEGF muy relacionados; AG-13736 (Pfizer) (también denominado AG-013736) que incluye formulaciones para la administración oral e inhibidores de VEGF muy relacionados; AG-028262 (Pfizer) e inhibidores de VEGF muy relacionados; Angiostatina (EntreMed) (también denominado número de registro CAS 86090-08-6, K1-4, y rhuAngiostatina, entre otros) e inhibidores muy relacionados como se describe en, entre otros, los documentos de Patente de los Estados Unidos n.° 5.792.825 y 6.025.688, particularmente en partes que pertenecen a Angiostatina e inhibidores de VEGF muy relacionados, sus estructuras y propiedades, y métodos para producirlos y usarlos; Avastin™ (Genentech) (también denominado bevacizumab, R-435, rhuMAB-VEGF, y número de registro CAS 216974-75-3, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; AVE-8062 (Ajinomoto Co. y Sanofi-aventis) (también denominado AC-7700 y análogo de combretastatina A4, entre otros), e inhibidores de Ve Gf muy relacionados; AZD-2171 (AstraZeneca) e inhibidores de VEGF muy relacionados; Nexavar® (Bayer AG y Onyx) (también denominado número de registro CAS 284461-73-0, BAY-43-9006, inhibidores de raf cinasa, sorafenib, análogos de sorafenib y IDDBCP150446, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; BMS-387032 (Sunesis y Bristol-Myers Squibb) (también denominado SNS-032 y número de registro CAS 345627-80-7, entre otros) e inhibidores de Ve Gf muy relacionados; CEP-7055 (Cephalon y Sanofi-aventis) (también denominado CEP-11981 y SSR-106462, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados; CHIR-258 (Chiron) (también denominado número de registro CAS 405169-16-6, GFKI, y GFKI-258, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; CP-547632 (OSI Pharmaceuticals y Pfizer) (también denominado número de registro CAS 252003-65-9, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados tales como, por ejemplo, CP-564959; E-7080 (Eisai Co.) (también denominado número de registro CAS 417716-92-8 y ER-203492-00, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; 786034 (GlaxoSmithKline) e inhibidores de VEGF muy relacionados; GW-654652 (GlaxoSmithKline) e inhibidores de indazolilpirimidina Kdr muy relacionados; IMC-1C11 (ImClone) (también denominado DC-101 y p1C11, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados; KRN-951 (Kirin Brewery Co.) y otros inhibidores de VEGF de quinolina urea muy relacionados; PKC-412 (Novartis) (también denominado número de registro CAS 120685-11-2, benzoilestaurosporina, CGP-41251, midostaurina, y STI-412, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; PTK-787 (Novartis y Schering) (también denominado número de registro CAS 212141-54-3 y 212142-18-2, PTK/ZK, PTK-787/ZK-222584, ZK-22584, VEGF-TKI, VEGF-RKI, PTK-787A, DE-00268, CGP-79787, CGP-79787D, vatalanib, ZK-222584, entre otros) e inhibidores de VEGF derivados de anilinoftalazina muy relacionados; SU11248 (Sugen y Pfizer) (también denominado SU-11248, SU-011248, SU-11248J, Sutent®, y malato de sunitinib, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; SU-5416 (Sugen y Pfizer/Pharmacia) (también denominado número de registro CAS 194413-58-6, semaxanib, 204005-46-9, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; SU-6668 (Sugen y Taiho) (también denominado número de registro CAS 252916-29-3, SU-006668, y TSU-68, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados como se describe en, entre otros, los documentos WO-09948868, WO-09961422 y WO-00038519, particularmente en partes que pertenecen a SU-6668 e inhibidores de VEGF muy relacionados, sus estructuras y propiedades, y métodos para producirlos y usarlos; VEGF Trap (Regeneron y Sanofi-aventis) (también denominado AVE-0005 y Systemic VEGF Trap, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados como se describe en, entre otros, el documento WO-2004110490, particularmente en partes que pertenecen a VEGF Trap e inhibidores de VEGF muy relacionados, sus estructuras y propiedades, y métodos para producirlos y usarlos; Talidomida (Celgene) (también denominado número de registro CAS 50-35-1, Synovir, Thalidomide Pharmion, y Thalomid, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; XL-647 (Exelixis) (también denominado EXEL-7647, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados; XL-999 (Exelixis) (también denominado EXEL-0999, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados; XL-880 (Exelixis) (también denominado EXEL-2880, entre otros), e inhibidores de VEGF muy relacionados; ZD-6474 (AstraZeneca) (también denominado número de registro CAS 443913-73-3, Zactima, y AZD-6474, entre otros) e inhibidores de VEGF muy relacionados; y ZK-304709 (Schering) (también denominado inhibidores de CDK (derivados de indirrubina), ZK-CDK, MTGI, e inhibidor del crecimiento tumoral multidiana, entre otros) y otros compuestos muy relacionados que incluyen los inhibidores de VEGF derivados de indirrubina descritos en los documentos WO-00234717, WO-02074742, WO-02100401, WO-00244148, WO-02096888, WO-03029223, WO-02092079 y WO-02094814, particularmente en partes pertinentes a estos e inhibidores de VEGF muy relacionados, sus estructuras y propiedades, y métodos para producirlos y usarlos.

Los inhibidores de VEGF pueden administrarse de una manera apropiada a la naturaleza del inhibidor, por ejemplo, como una proteína, molécula pequeña, ácido nucleico, etc., incluyendo, sin limitación, vehículos y vectores apropiados como sea requerido.

El factor de crecimiento transformante (TGF-p) indica una familia de proteínas, TGF-p1, TGF-p2, y TGF-p3, que son moduladores pleiotrópicos del crecimiento y la diferenciación celular, el desarrollo embrionario y de hueso, la formación de matriz extracelular, hematopoyesis, respuestas inmunitarias e inflamatorias (Roberts and Sporn "Handbook of Experimental Pharmacology" (1990) 95:419-58; Massague et al. Ann. Rev. Cell. Biol. (1990) 6:597-646). TGF-p inicia las vías de señalización intracelular que conducen finalmente a la expresión de los genes que regulan el ciclo celular, las respuestas proliferativas control, o relacionadas con las proteínas de la matriz extracelular que median desde fuera hacia dentro la señalización celular, la adhesión celular, la migración y la comunicación intercelular.

TGF-p ejerce sus actividades biológicas a través de un sistema receptor que incluye los receptores de TGF-p de transmembrana únicos tipo I y tipo II (también referidos como subunidades receptoras) con dominios de serina-treonina cinasa intracelulares, que señaliza a través de la familia de Smad de los reguladores transcripcionales. La unión de TGF-p al dominio extracelular del receptor tipo II induce la fosforilación y la activación del receptor tipo I (TGFp-R1) por el receptor tipo II (TGFp-R2).

Un inhibidor del TGFp se refiere a una molécula, por ejemplo, un receptor señuelo, un anticuerpo o un derivado del mismo, una molécula pequeña no peptídica, etc. que se une específicamente a un receptor TGFp-R1 que tiene la capacidad de inhibir la función biológica de una molécula TGF-p nativa.

Las proteínas Wnt forman una familia de moléculas de señalización secretadas altamente conservadas que regulan las interacciones célula-célula durante la embriogénesis. Las expresiones "Wnt" o "producto génico de Wnt" o "proteína Wnt" o "polipéptido de Wnt" se usan indistintamente y abarcan los polipéptidos de Wnt de secuencia nativa, las variantes del polipéptido de Wnt, los fragmentos del polipéptido de Wnt y los polipéptidos de Wnt quiméricos. Estos polipéptidos son agonistas de Wnt, dicho término también incluye molécula pequeña, miméticos, por ejemplo, peptidomiméticos, anticuerpos agonistas, y proteínas que funcionan como agonistas de la función de wnt, como se conoce en la técnica. Un polipéptido de "secuencia nativa" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido de Wnt derivado de la naturaleza, independientemente del método usado para la producción. Tales polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de células que producen proteína Wnt endógena o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. Por tanto, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, el polipéptido humano de origen natural, el polipéptido murino o el polipéptido de cualquier otra especie de mamífero y de especies no mamíferas, por ejemplo, Drosophila, C. elegans y similares.

Los polipéptidos de Wnt adecuados (es decir, las proteínas Wnt) incluyen, pero, sin limitación alguna, polipéptidos de Wnt humanos. Las proteínas Wnt humanas de interés en la presente solicitud incluyen las siguientes (los números de registro son para los ARNm que codifican la proteína Wnt asociada): Wnt-1 (n.° de acceso de GenBank NM_005430); Wnt-2 (n.° de acceso de GenBank NM_003391); Wnt-2B (Wnt-13) (n.° de acceso de GenBank NM_004185 (isoforma 1), NM_024494.2 (isoforma 2)), Wnt-3 (RefSeq.: NM_030753), Wnt3a (n.° de acceso de GenBank NM_033131), Wnt-4 (n.° de acceso de GenBank NM_030761), Wnt-5A (n.° de acceso de GenBank NM_003392), Wnt-5B (n.° de acceso de GenBank NM_032642), Wnt-6 (n.° de acceso de GenBank NM_006522), Wnt-7A (n.° de acceso de GenBank NM_004625), Wnt-7B (n.° de acceso de GenBank NM_058238), Wnt-8A (n.° de acceso de GenBank NM_058244), Wnt-8B (n.° de acceso de GenBank NM_003393), Wnt-9A (Wnt-14) (n.° de acceso de GenBank NM_003395), Wnt-9B (Wnt-15) (n.° de acceso de GenBank NM_003396), Wnt-10A (n.° de acceso de GenBank NM_025216), Wnt-10B (n.° de acceso de GenBank NM_003394), Wnt-11 (n.° de acceso de GenBank NM_004626), Wnt-16 (n.° de acceso de GenBank NM_016087)). Aunque cada miembro tiene grados variantes de identidad de secuencia con la familia, todos codifican glucoproteínas pequeñas (es decir, de 39-46 kD), aciladas, palmitoiladas, secretadas que contienen 23-24 residuos de cisteína conservados cuyo espaciado está altamente conservado (McMahon, A P et al., Trends Genet.

1992; 8: 236-242; Miller, J. R. Genome Biol. 2002; 3(1): 3001,1-3001,15). Otros polipéptidos de Wnt de interés en la presente invención incluyen ortólogos de lo anterior de cualquier mamífero, incluidos animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de laboratorio o de compañía, perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, ratas, ratones, ranas, pez cebra, mosca de la fruta, lombrices, etc.

La expresión "polipéptido de Wnt de secuencia nativa" incluye, sin limitación, polipéptidos de Wnt humanos y murinos. Las proteínas Wnt humanas incluyen las siguientes: Wnt1, referencia de Genbank NP005421.1; Wnt2, referencia de Genbank NP003382.1, que se expresa en el cerebro en el tálamo, en el pulmón fetal y adulto y en la placenta; dos isoformas de Wnt2B, referencias de Genbank NP004176.2 y NP078613.1. La isoforma 1 se expresa en corazón, cerebro, placenta, pulmón, próstata, testículo, ovario, intestino delgado y colon adulto. En el cerebro adulto, principalmente se encuentra en el núcleo caudado, el núcleo subtalámico y el tálamo. También se detecta en cerebro, pulmón y riñón fetal. La isoforma 2 se expresa en cerebro fetal, pulmón fetal, riñón fetal, núcleo caudado, testículos y líneas de célula cancerosa. Wnt 3 y Wnt3A juegan distintos papeles en la señalización célula-célula durante la morfogénesis del tubo neural en desarrollo, y tienen las referencias de Genbank NP11 0380.1 y X56842 (Swiss-Prot P56704), respectivamente.

La secuencia de aminoácidos de Wnt3A humana nativa tiene la referencia de Genbank NP_149122.1. Wnt 4 tiene la referencia de Genbank NP11 0388.2. Wnt 5A y Wnt 5B tienen las referencias de Genbank NP003383.1 y AK013218. Wnt 6 tiene la referencia de Genbank NP006513.1; Wnt 7A tiene la referencia de Genbank NP004616.2. Wnt 7B tiene la referencia de Genbank NP478679.1. Wnt 8A tiene dos transcritos alternativos, referencias de Genbank NP114139.1 y NP490645.1. Wnt 8B tiene la referencia de Genbank NP003384.1. Wnt 10A tiene la referencia de Genbank NP079492.2. Wnt 10B tiene la referencia de Genbank NP003385.2. Wnt 11 tiene la referencia de Genbank NP004617 .2. Wnt 14 tiene la referencia de Genbank NP003386.1. Wnt 15 tiene la referencia de Genbank NP003387.1. Wnt 16 tiene dos isoformas, Wnt 16a y Wnt 16b, producidas por corte y empalme alternativo, las referencias de Genbank son NP057171.2 y NP476509.1.

La dosis eficaz de la proteína Wnt puede variar dependiendo de la fuente, la pureza, el método de preparación, etc. Para los fines de la presente invención, las proteínas Wnt de interés incluyen proteínas Wnt3 y Wnt5 humanas para el aumento de la osteogénesis por células madre esqueléticas. Cuando la proteína Wnt es Wnt3, Wnt3A, Wnt5A, Wnt5B, por ejemplo, el homólogo humano de estas proteínas, la dosis eficaz es generalmente de al menos 0,1 pg/ml, al menos 0,5 pg/ml, al menos 1 pg/ml, al menos 2,5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 7,5 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 15 pg/ml y puede ser de al menos 25 pg/ml, al menos 50 pg/ml o al menos 100 pg/ml.

Un agonista de Wnt es cualquier molécula (por ejemplo, un compuesto químico; un ácido nucleico no codificante, por ejemplo, un ARN no codificante; un polipéptido; un ácido nucleico que codifica un polipéptido, etc.) que da como resultado una producción incrementada (es decir, expresión del gen objetivo incrementada) de la vía de señalización de Wnt. Por ejemplo, un agonista de Wnt puede funcionar estabilizando, aumentando la expresión o aumentando la función de un componente regulador positivo de la vía o desestabilizando, reduciendo la expresión o inhibiendo la función de un componente regulador negativo de la vía. Por tanto, un agonista de Wnt puede ser un componente regulador positivo de la vía (por ejemplo, una proteína Wnt), o un ácido nucleico, que codifica uno o más componentes reguladores positivos de la vía. Un agonista de Wnt también puede ser una molécula pequeña o un ácido nucleico que estabiliza un componente regulador positivo de la vía ya sea a nivel de ARNm o de proteína.

Un agonista de Wnt funciona estabilizando la p-catenina, permitiendo de este modo el aumento de los niveles nucleares de p-catenina. La p-catenina puede estabilizarse de múltiples modos diferentes. Debido a que múltiples componentes reguladores negativos de la vía de señalización de Wnt funcionan facilitando la degradación de la pcatenina, un agonista de Wnt puede ser un inhibidor de molécula pequeña o de ácido nucleico (por ejemplo, microARN, ARNhc, etc.) (que funciona a nivel de ARNm o proteína) de un componente regulador negativo de la vía. Por ejemplo, el agonista de Wnt puede ser un inhibidor de GSK-3p. Un inhibidor de GSK-3p puede ser un compuesto químico de molécula pequeña (por ejemplo, TWS119, BIO, CHIR-99021, SB 216763, SB 415286, CHIR-98014 y similares).

TWS119: 3-(6-(3-aminofenil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-iloxi)fenol es descrito por Ding et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 24 de junio de 2003;100(13):7632-7. BIO: 6-bromo-3-[(3E)-1,3-dihidro-3-(hidroxiimino)-2H-indol-2-iliden]-1,3-dihidro-(3Z)-2H-indol-2-ona o (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxima es descrito por Meijer et al, Chem. Biol. diciembre de 2003;10(12):1255-66. CHIR-99021: 6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinocarbonitrilo es descrito por Bennett et al., J. Biol. Chem. 23 de agosto de 2002;277(34):30998-1004. SB 216763: 3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona está descrito por Cross et al., J. Neurochem. abril de 2001;77(1):94-102. SB 415286: 3-(3-cloro-4-hidroxifenilamino)-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona está descrito por Cross et al., J. Neurochem. abril de 2001;77(1):94-102. CHIR-98014: N2-(2-(4-(2,4-diclorofenil)-5-(1H-imidazol-1-il)pirimidin-2-ilamino)etil)-5-nitropiridin-2,6-diamina está descrito por Ring et al., Diabetes. marzo de 2003; 52(3):588-95.

La dosis eficaz de un agonista de Wnt puede ser de al menos 0,1 pM, al menos 1 pM, al menos 2,5 pM, al menos 5 |jM y generalmente no más de 500 jiM, no más de 250 jiM, no más de 100 jiM, o no más de 50 jiM.

La ingeniería de tejido es el uso de una combinación de células, materiales y métodos de ingeniería, y factores bioquímicos y fisicoquímicos adecuados para mejorar o reemplazar las funciones biológicas. Las células pueden implantarse o "sembrarse" dentro de una estructura capaz de soportar la formación tridimensional del tejido. Estas estructuras, denominadas en el presente documento como matriz o armazón, permiten la unión y migración celular, administran y retienen células y factores bioquímicos, posibilitan la difusión de nutrientes celulares vitales y productos expresados. Una alta porosidad y un tamaño de poro adecuado son necesarios para facilitar la siembra celular y la difusión a través de toda la estructura de tanto las células como los nutrientes. La biodegradabilidad es con frecuencia un factor ya que los armazones pueden ser absorbidos por los tejidos circundantes sin la necesidad de una extirpación quirúrgica. La velocidad a la que ocurre la degradación tiene que coincidir tanto como sea posible con la velocidad de formación de tejido: esto quiere decir que mientras las células están fabricando su propia estructura de matriz natural alrededor de las mismas, el armazón es capaz de proporcionar integridad estructural dentro del cuerpo y finalmente se descompondrá dejando el neotejido, tejido nuevamente formado que asumirá la carga mecánica. La inyectabilidad es también importante para los usos clínicos.

Se han investigado muchos materiales diferentes (naturales y sintéticos, biodegradables y permanentes), por ejemplo, Puramatrix, ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y policaprolactona (PCL) y combinaciones de los mismos. Los armazones también pueden estar construidos por materiales naturales, por ejemplo, proteínas tales como colágeno, fibrina, etc; materiales polisacáridos, tales como chitosán; alginato, glucosaminoglucanos (GAG) tales como ácido hialurónico, etc. Los grupos funcionalizados de armazones pueden ser útiles en la administración de moléculas pequeñas (fármacos) a tejidos específicos. Otra forma de armazón bajo investigación son extractos de tejido descelularizado de modo que los restantes remanentes celulares/matrices extracelulares actúan como el armazón.

Un sistema para el uso farmacéutico, es decir, un armazón o implante con células y/o factores, puede incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos no tóxicos de diluyentes, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos habitualmente usados para formular composiciones farmacéuticas para su administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de tal forma que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Son ejemplos de tales diluyentes agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición farmacéutica NR o formulación puede incluir otros vehículos, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tampón, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes.

La composición también puede incluir cualquiera de diversos agentes estabilizantes, tal como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede formar complejos con diversos compuestos bien conocidos que aumentan la estabilidad in vivo del polipéptido, o aumenta de otro modo sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, incrementa la semivida del polipéptido, reduce su toxicidad, aumenta la solubilidad o la absorción). Ejemplos de tales modificaciones o agentes de formación de complejos incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los polipéptidos de una composición también pueden formar complejos con moléculas que aumentan sus atributos in vivo. Tales moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.

Pueden encontrarse directrices adicionales con respecto a las formulaciones que son adecuadas para diferentes tipos de administración en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17a ed. (1985). Para una breve revisión de los métodos para suministro de fármacos, véase, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

La composición farmacéutica, es decir, combinaciones de factores y/o células, puede administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y la eficacia terapéutica del principio activo pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares y/o animales experimentales, que incluyen, por ejemplo, determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren compuestos que muestran índices terapéuticos grandes.

Los datos obtenidos de estudios de cultivo celular y/o en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosis para seres humanos. La dosis del principio s activo normalmente está dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con baja toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada.

Los componentes usados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, al menos calidad de "National Food" (NF), en general al menos calidad analítica y más normalmente al menos calidad farmacéutica). Además, las composiciones destinadas a uso in vivo habitualmente son estériles. En la medida en que un compuesto dado debe sintetizarse antes de su uso, el producto resultante está normalmente libre sustancialmente de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y se preparan en condiciones GMP.

La cantidad eficaz de una composición terapéutica a dar a un paciente particular dependerá de diversos factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente será capaz de determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico a administrar a un paciente para parar o invertir la progresión de la enfermedad como sea requerido. Utilizando los datos de DL50 de animales, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis intravenosamente administrada puede ser más que una dosis intratecal administrada, dado el cuerpo mayor de fluido dentro del cual se está administrando la composición. De manera similar, las composiciones que se eliminan rápidamente del organismo pueden administrarse a dosis mayores, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando las técnicas habituales, el médico competente será capaz de optimizar la dosis de una composición terapéutica particular durante el transcurso de ensayos clínicos rutinarios.

Las especies mamíferas que se pueden tratar con los presentes métodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc. y primates, en particular, seres humanos. Modelos animales, particularmente mamíferos pequeños, por ejemplo, murino, lagomorfos, etc. pueden usarse para investigaciones experimentales.

Más particularmente, la presente invención encuentra su uso en el tratamiento de sujetos, tales como pacientes humanos, en necesidad de terapia de reemplazo de hueso o cartílago. Ejemplos de tales sujetos serían sujetos que padecen de afecciones asociadas a la pérdida de cartílago de osteoartritis, defectos genéticos, enfermedad, etc. Los pacientes que tienen enfermedades y trastornos caracterizados por tales afecciones se verán muy beneficiados por un protocolo de tratamiento de la invención reivindicada pendiente.

Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención es la cantidad que dará como resultado un incremento del número de condrocitos, células esqueléticas, masa de cartílago o hueso en el sitio de implante, y/o dará como resultado la reducción medible en la velocidad de progresión de la enfermedad in vivo. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una composición farmacéutica incrementará la masa de hueso o cartílago en al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, preferentemente de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %, e incluso más preferentemente en más de un 50 % (por ejemplo, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 100 %) en comparación con el control apropiado, siendo el control normalmente un sujeto no tratado con la composición farmacéutica.

Los métodos de la presente divulgación también encuentran uso en terapias combinadas, por ejemplo, con terapias que ya son conocidas en la técnica para proporcionar alivio de los síntomas asociados a las enfermedades, trastornos y afecciones anteriormente mencionadas. El uso combinado de una composición farmacéutica de la presente invención y estos otros agentes puede tener las ventajas de que las dosis requeridas para los fármacos individuales es menor, y el efecto de los diferentes fármacos complementarios.

En algunas realizaciones una dosis eficaz de células estromales adiposas, preferentemente células madre derivadas de tejido adiposo, se proporciona en un implante o armazón para la regeneración de tejido esquelético o cartilaginoso. Una dosis celular eficaz puede depender de la pureza de la población. En algunas realizaciones una dosis eficaz suministra una dosis de células madre derivadas de tejido adiposo de al menos aproximadamente 102, aproximadamente 103, aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109 o más células, dichas células madre pueden estar presentes en la población celular a una concentración de aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o más.

La presente invención proporciona métodos y una composición para la diferenciación de células no esqueléticas, entre las que se incluyen las células madre derivadas de tejido adiposo, en condrocitos. Las células producidas por los métodos de la invención son útiles en la proporción de una fuente de células completamente diferenciadas y funcionales para investigación, trasplante y desarrollo de productos de ingeniería de tejido para el tratamiento de enfermedad humana y reparación de lesión traumática.

"Condrocitos (células de cartílago)" se refieren a células que son capaces de expresar marcadores bioquímicos característicos de condrocitos, que incluyen, pero sin limitación, colágeno tipo II, sulfato de condroitina, sulfato de queratina y marcadores morfológicos característicos de músculo liso, que incluyen, pero sin limitación, la morfología redondeada observada en cultivo, y capaces de secretar colágeno tipo II, que incluye, pero sin limitación, la generación de tejido o matrices con propiedades hemodinámicas de cartílago in vitro.

Métodos de la divulgación

La invención objetivo está dirigida, en parte, a los métodos de reprogramación y dirección de la diferenciación de una célula a una célula linaje esquelética deseada. Las realizaciones específicas incluyen el sesgo de la diferenciación de una célula madre esquelética a un condrocito; y la reprogramación de una célula madre derivada de tejido adiposo, en una célula madre esquelética. En algunas realizaciones, los dos métodos se combinan para proporcionar una fuente de cartílago. En alguna divulgación, se incluye una población celular no esquelética con factores de reprogramación y/o condrogénicos.

La siguiente descripción se enfoca en la reprogramación, es decir, conversión, de células somáticas no esqueléticas en SSC poniéndolas en contacto con una dosis eficaz de BMP2 o una variante o mimético de la misma. En otras realizaciones la descripción incluye métodos de sesgado de la SSC para diferenciarse en cartílago poniéndola en contacto con una dosis eficaz de uno o ambos de un inhibidor de VEGF y un inhibidor del TGFp; y el uso de los mismos en la reparación de tejido. Otros ejemplos de células esqueléticas que se pueden generar por los métodos de la invención incluyen célula madre esquelética (SSC), pre-progenitor de hueso, cartílago y estroma (pre-BCSP), BCSP, progenitor de cartílago comprometido (CCP), progenitor de hueso, progenitores estromales de linfocitos B (BLSP); estroma 6C3, célula estromal que expresa factor de leucemia hepática (HEC); y su progenie.

Si se proporcionan como polipéptidos, los factores para inducir condrogénesis y reprogramación pueden prepararse por síntesis in vitro, usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Están disponibles diferentes aparatos sintéticos comerciales, por ejemplo, sintetizadores automatizados de Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Al usar sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden sustituirse por aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la forma de preparación se determinarán por conveniencia, economía, pureza requerida y similares. Otros métodos para preparar polipéptidos en un sistema sin célula incluyen, por ejemplo, aquellos métodos enseñados en la Solicitud de Estados Unidos n.° de Serie 61/271.000.

Los polipéptidos también pueden aislarse y purificarse de acuerdo con métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresión y purificarse el lisado usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otras técnicas de purificación. En su mayoría, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 20 % en peso del producto deseado, más generalmente al menos aproximadamente el 75 % en peso, preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en peso y, para fines terapéuticos, generalmente al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, en relación con los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Generalmente, los porcentajes se basarán en la proteína total. Los polipéptidos pueden producirse por recombinación no únicamente directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o el polipéptido maduro.

En otras realizaciones, los factores para la reprogramación o inducción de condrogénesis se proporcionan como ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Los vectores usados para proporcionar tales ácidos nucleicos a las células objeto comprenderán normalmente promotores adecuados para dirigir la expresión, es decir, la activación transcripcional, de los ácidos nucleicos. Esto puede incluir promotores de actuación ubicua, por ejemplo, el promotor CMV-p-actina, o promotores inducibles, tales como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como tetraciclina. Por activación transcripcional, se pretende que la transcripción se incrementará por encima de los niveles basales en la célula diana en al menos aproximadamente 10 veces, en al menos aproximadamente 100 veces, más generalmente en al menos aproximadamente 1.000 veces. Los ácidos nucleicos pueden proporcionarse directamente o en un vector, por ejemplo, virus, por ejemplo, un lentivirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, etc., como se conoce en la técnica.

Cuando se proporciona más de un factor, por ejemplo, cuando se combina una dosis eficaz de BMP2 con una dosis eficaz de un inhibidor de VEGF, un polipéptido de wnt, etc. los factores pueden proporcionarse individualmente o como una composición única, es decir, como una composición premezclada, de factores. Los factores pueden añadirse a células objeto simultáneamente o secuencialmente en diferentes momentos. Los factores se pueden proporcionar a la misma relación molar o a diferentes relaciones molares. Los factores pueden proporcionarse una o múltiples veces en el trascurso del tratamiento. Por ejemplo, se puede proporcionar un implante que comprende células y factores a un individuo, y factores adicionales y/o células proporcionadas durante el trascurso del tratamiento.

Las células progenitoras objeto y/o las combinaciones de factores pueden proporcionarse para su uso in vivo en una solución celular, en la que una solución hidratante, suspensión u otros fluidos que contienen células progenitoras de hueso o factores que son capaces de diferenciarse en hueso o cartílago.

Se pueden proporcionar los dispositivos de injerto de hueso o cartílago y las composiciones que estén optimizados en términos de una o más de composición, bioactividad, porosidad, tamaño de poro, potencial de unión a proteína, degradabilidad o concentración para su uso en aplicaciones de injerto de hueso o de tanto cartílago que porta carga como que no porta carga. Preferentemente, los materiales injerto se formulan de modo que fomentan uno o más procesos implicados en la curación de hueso o cartílago que puede ocurrir con la aplicación de un material de injerto sencillo: condrogénesis, osteogénesis, osteoinducción y osteoconducción. La condrogénesis es la formación de nuevas estructuras cartilaginosas. La osteogénesis es la formación de nuevo hueso por las células contenidas dentro del injerto. La osteoinducción es una proceso químico en el que las moléculas contenidas dentro del injerto (por ejemplo, proteínas morfogenéticas de hueso y TGF-beta) convierten las células progenitoras de hueso del paciente u otro que son capaces de formar hueso. La osteoconducción es un efecto físico por el cual la matriz del injerto forma un armazón en el que las células formadoras de hueso en el receptor son capaces de formar nuevo hueso.

La inclusión de los factores y/o las células de la divulgación pueden usarse para facilitar el reemplazo y el relleno del material de cartílago o hueso en y alrededor de estructuras preexistentes. En algunas realizaciones, las células producen primero condrocitos, seguido de deposición de matriz extracelular y hueso. Los injertos de hueso pueden proporcionar un armazón osteoconductivo que comprende cerámicas de fosfato de calcio que proporcionan un marco para las células progenitoras implantadas y osteocitos locales para diferenciarse en células formadoras de hueso y depositar nuevo hueso. El uso de cerámicas de fosfato de calcio puede proporcionar una degradación lenta de la cerámica, que da como resultado una fuente local de calcio y fosfato para la formación de hueso. Por lo tanto, se puede formar nuevo hueso sin pérdida de calcio y fosfato del hueso hospedador que rodea el sitio del defecto. Las cerámicas de fosfato de calcio son químicamente compatibles con las del componente mineral de los tejidos óseos. Ejemplos de tales cerámicas de fosfato de calcio incluyen compuestos de fosfato de calcio y sales, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las células y/o los factores se preparan como una pasta inyectable. Se puede añadir una suspensión celular a una o más células precursoras en polvo para formar una pasta hidratada inyectable. La pasta puede inyectarse en el sitio de implante. En algunas realizaciones, la pasta puede prepararse antes del implante y/o almacenamiento de la pasta en la jeringa a temperaturas inferiores a la del ambiente hasta que sea necesario. En algunas realizaciones, la aplicación de la composición por inyección puede parecerse a un cemento óseo que puede usarse para unir y sostener fragmentos de hueso en el lugar o para mejorar la adhesión de, por ejemplo, una prótesis de cadera, para reemplazo de cartílago dañado en articulaciones, y similares. El implante también puede realizarse en un entorno de cirugía no abierta.

En otras realizaciones las células y/o los factores se preparan como masilla formable. Se puede añadir una suspensión celular a uno o más minerales en polvo para formar una composición de injerto hidratado tipo masilla. La masilla de injerto hidratado puede prepararse y moldearse para aproximarse a cualquier forma de implante. A continuación, la masilla puede apretujarse dentro del lugar para rellenar un vacío en el cartílago, hueso, alveolo dental u otro sitio. En algunas realizaciones, la masilla de injerto puede usarse para reparar defectos en hueso de no unión o en otras situaciones donde la fractura, el hueco o el vacío a rellenar es grande y requiere un grado de integridad mecánica en el material de implante para tanto rellenar el hueco como retener su forma.

La presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de una lesión, o herida, de cartílago o hueso, en un ser humano u otro sujeto animal, que comprende aplicar al sitio una composición que comprende las células y/o los factores de la invención, que pueden proporcionarse junto con cementos, factores, geles, etc. Como se refiere en el presente documento tales lesiones incluyen cualquier afección que implica al tejido esquelético, incluido cartilaginoso, que es inadecuado para fines fisiológicos o cosméticos. Tales defectos incluyen aquellos que son congenitales, el resultado de la enfermedad o el trauma, y consecuentes de una cirugía u otros procedimientos médicos. Tales defectos incluyen, por ejemplo, un defecto de hueso que resulta de la herida, defecto ocasionado durante el trascurso de la cirugía, osteoartritis, osteoporosis, infección, malignidad, malformación del desarrollo, y roturas de hueso tal como fracturas simples, compuestas, transversales, patológicas, avulsiones, de tallo verde y divididas. En algunas realizaciones, un defecto de hueso es un vacío en el hueso que requiere relleno con una composición progenitora de hueso.

Las células para su uso en esta invención también pueden alterarse genéticamente con el fin de aumentar su capacidad para implicarse en la regeneración de tejidos, o para suministrar un gen terapéutico a un sitio de administración. Un vector se diseña usando la secuencia codificante conocida para el gen deseado, unido operativamente a un promotor que es o bien panespecífico o específicamente activo en el tipo celular diferenciado. De particular interés son células que se alteran genéticamente para expresar una proteína morfogénica de hueso, tal como BMP-2 o BMP-4. Véase el documento WO 99/39724. La producción de estos u otros factores de crecimiento en el sitio de administración puede aumentar el efecto beneficioso de la célula administrada, o incrementar la proliferación o la actividad de las células hospedadoras cercanas al sitio de tratamiento.

Métodos in vitro de conversión, y los usos para células convertidas in vitro

En algunas realizaciones, las células madre de tejido adiposo, o las células madre y progenitoras esqueléticas definidas en el presente documento, se conectan in vitro con los factores de reprogramación y/o condrogénicos. Las células objeto pueden ser de ser humano. Pueden ser líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y que se dejaron crecer in vitro durante un número limitado de pases.

Las células objeto pueden aislarse de células frescas o congeladas, que pueden ser de un neonato, un joven o un adulto, y de tejidos entre los que se incluyen tejidos de piel, músculo, médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, adiposo, y otros diferenciados. El tejido puede obtenerse por biopsia o aforesis de un donante vivo, u obtenido de un donante muerto o moribundo dentro de las aproximadamente 48 horas después de la muerte, o tejido recién congelado, el tejido congelado dentro de las aproximadamente 12 horas después de la muerte y mantenido por debajo de aproximadamente -20 °C, generalmente a aproximadamente temperatura de nitrógeno líquido (-190 °C) indefinidamente. Para el aislamiento de células del tejido, puede usarse una solución apropiada para la dispersión o la suspensión. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución de sal equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero fetal de ternero u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc.

Las células conectadas in vitro con los factores definidos en el presente documento, es decir, los factores que fomentan la reprogramación y/o fomentan el crecimiento y/o la diferenciación de condrocitos, y similares, pueden incubarse en presencia de lo(s) reactivo(s) durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, por ejemplo, 1 hora, 1,5 hora, 2 hora, 2,5 hora, 3 hora, 3,5 horas, 4 horas, 5 hora, 6 hora, 7 hora, 8 hora, 12 hora, 16 hora, 18 hora, 20 horas, o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de aproximadamente todos los días a aproximadamente cada 4 días, por ejemplo, cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia desde aproximadamente todos los días hasta aproximadamente cada cuatro días. El o los agentes pueden proporcionarse a las células objeto una o más veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces, o más de tres veces, y las células se dejan incubar con el o los agentes durante algún tiempo después de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas, después de este momento los medios se reemplazan por medios frescos y las células se cultivan adicionalmente.

Después de poner en contacto las células con los factores, las células contactadas pueden cultivarse con el objetivo de fomentar la supervivencia y la diferenciación de células madre esqueléticas, condrocitos, o las poblaciones de célula progenitora definidas en el presente documento. Los métodos y reactivos para cultivar células son bien conocidos en la técnica, cualquiera de los cuales pueden usarse en la presente invención para cultivar y aislar las células. Por ejemplo, las células (poniéndose en contacto antes o después con los factores) pueden sembrase en placa en Matrigel u otro sustrato como se conoce en la técnica. Las células pueden cultivarse en medios, suplementados con factores. Como alternativa, las células contactadas pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, siendo capaces de usarse en la descongelación. Si se congelan, las células normalmente se almacenarán en Dm So al 10 %, FCS al 50 %, medio RPMI 1640 al 40 %. Una vez descongeladas, las células pueden desarrollarse mediante el uso de los factores de crecimiento y/o células estromales asociadas a la supervivencia y diferenciación esquelética.

Las células esqueléticas o condrogénicas inducidas producidas por los anteriores métodos in vitro pueden usarse en terapia de reemplazo celular o trasplante celular para tratar enfermedades. Específicamente, las células pueden transferirse a sujetos que padecen de un amplio rango de enfermedades o trastornos con un componente esquelético o cartilaginoso.

En algunos casos, las células o una subpoblación de células de interés pueden purificarse o aislarse del resto del cultivo celular antes de ser transferidas al sujeto. En otras palabras, pueden ejecutarse una o más etapas para enriquecerse las células o una subpoblación de células, es decir, para proporcionar una población de células o subpoblación de células enriquecidas. En algunos casos, uno o más anticuerpos específicos para un marcador de células del linaje esquelético/condrogénico o un marcador de una subpoblación de células del linaje esquelético se incuban con la población celular y se aíslan aquellas células unidas. En otros casos, las células o una subpoblación de las células expresan un marcador que es un gen indicador, por ejemplo, EGFP, dsRED, lacz, y similares, que está bajo el control de un promotor específico, que, a continuación, se usa para purificar o aislar las células o una subpoblación de las mismas.

Por marcador se entiende que, en cultivos que comprenden células que se han reprogramado para llegar a ser células esqueléticas/condrogénicas, el marcado se expresa únicamente por las células del cultivo que desarrollarán, están desarrollando y/o se han desarrollado en células esqueléticas/condrogénicas. Los expertos en la materia entenderán que los niveles de expresión indicados reflejan cantidades detectables de la proteína marcador sobre o en la célula. Una célula que es negativa para la tinción (el nivel de unión de un reactivo específico para un marcador no es diferente de manera detectable de un control emparejado isotipo) puede aun expresar cantidades menores del marcador. Y aunque en la técnica es frecuente hacer referencia a las células como "positivas" o "negativas" para un marcador particular, los niveles de expresión reales son un rasgo cuantitativo. El número de moléculas sobre la superficie celular puede variar en varios grados logarítmicos, y aun así caracterizarse como "positivas".

La células de interés, es decir, las células que expresan el marcador de elección, pueden enriquecerse, es decir, separarse del resto de la población celular, mediante un número de métodos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, citometría de flujo, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), puede usarse para separar la población celular basándose en la fluorescencia intrínseca del marcador, o la unión del marcador a un reactivo fluorescente específico, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con fluoróforo, así como otros parámetros, tales como el tamaño celular y la dispersión de la luz. En otras palabras, la selección de las células puede estar afectada por la citometría de flujo. Aunque el nivel absoluto de tinción puede diferir con un fluorocromo y una preparación de reactivo particulares, los datos pueden normalizarse a un control. Para normalizar la distribución a un control, cada célula se registra como un punto de datos que tiene una intensidad de tinción particular. Estos puntos de datos pueden presentarse de acuerdo con una escala logarítmica, donde la unidad de medición es una intensidad de tinción arbitraria. En un ejemplo, las células con una tinción más brillante en una muestra pueden tener una intensidad tan elevada como de 4 log mayor que las células no teñidas. Cuando se presentan de esta manera, resulta evidente que las células que se encuentran en el mayor grado logarítmico de intensidad de tinción son brillantes, mientras que aquellas en el de menor intensidad son negativas. Las células con tinción positiva "baja" tienen un nivel de tinción por encima del brillo de un control emparejado de isotipo, pero no son tan intensas como las células con tinción más brillante normalmente halladas en la población. Un control alternativo puede utilizar un sustrato que tiene una densidad definida de marcador sobre su superficie, por ejemplo, una perla fabricada o una línea celular, que proporciona el control positivo para la intensidad.

Otros métodos de separación, es decir, los métodos por los cuales puede estar afectada la selección de células, basándose en marcadores incluyen, por ejemplo, clasificación celular activada magnética (MACS), inmunoselección, y microdisección de captura por láser.

El enriquecimiento de la población celular puede realizarse aproximadamente 3 días o más después de poner en contacto las células con los factores de la invención, por ejemplo, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 14 días o 21 días después de poner en contacto las células somáticas con los factores. Las poblaciones que se enriquecen mediante selección para la expresión de uno o más marcadores generalmente tendrán al menos aproximadamente un 80 % de células del fenotipo seleccionado, más generalmente al menos un 90 % de células y puede ser un 95 % de las células, o más, del fenotipo seleccionado.

Además de los métodos de trasplante anteriormente descritos, las células aisladas del tejido, o inducidas por los métodos anteriormente descritos in vitro pueden usarse como una herramienta de investigación básica o de investigación de fármaco, por ejemplo, para evaluar el fenotipo de una enfermedad genética, por ejemplo, para comprender mejor la etiología de la enfermedad, para identificar proteínas diana para el tratamiento terapéutico, para identificar agentes candidatos con actividad modificadora de la enfermedad, por ejemplo, para identificar un agente que será de eficacia en el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, puede añadirse una agente candidato a un cultivo celular que comprende iSSC derivadas de las células no esqueléticas del sujeto, o cualquiera de las células progenitoras esqueléticas y condrogénicas descritas en el presente documento, y el efecto del agente candidato evaluado haciendo un seguimiento de los parámetros de rendimiento tales como supervivencia, capacidad de formar hueso y cartílago, y similares, mediante métodos descritos en el presente documento en la técnica.

Los parámetros son componentes cuantificables de las células, particularmente componentes que se pueden medir con precisión, deseablemente en un sistema de alto rendimiento. Un parámetro puede ser cualquier componente celular o producto celular, incluido el determinante de la superficie celular, receptor, proteína o la modificación conformacional o postraduccional de los mismos, lípido, carbohidrato, molécula orgánica o inorgánica, ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADN, etc. o una porción derivada de dicho componente celular o combinaciones de los mismos. Si bien la mayoría de los parámetros proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos será aceptable un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un solo valor determinado o pueden incluir la media, el valor de la mediana o la varianza, etc. Característicamente, se obtendrá un intervalo de los valores de lectura del parámetro para cada parámetro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtendrá un intervalo de valores para cada uno de los conjuntos de parámetros de ensayo usando métodos estadísticos estándar con un método estadístico común usado para proporcionar valores únicos.

Los agentes candidatos de interés para el cribado incluyen compuestos conocidos y desconocidos que abarcan numerosas clases químicas, principalmente moléculas orgánicas, que pueden incluir moléculas organometálicas, moléculas inorgánicas, secuencias genéticas, etc. Un aspecto importante de la invención es evaluar fármacos candidatos, incluyendo controles de toxicidad; y similares.

Los agentes candidatos incluyen moléculas orgánicas que comprenden grupos funcionales necesarios para las interacciones estructurales, particularmente puentes de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente, al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden, a menudo, estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, que incluyen péptidos, polinucleótidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Se incluyen fármacos farmacológicamente activos, moléculas genéticamente activas, etc. Los compuestos de interés incluyen agentes quimioterapéuticos, hormonas o antagonistas de hormonas, etc. Los ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados para esta invención son aquellos descritos en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y, (1996), novena edición.

Los compuestos, incluidos los agentes candidatos, se obtienen de una gran variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos, incluidas las biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Como alternativa, bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles y se producen fácilmente.

Adicionalmente, las bibliotecas naturales o sintéticamente producidas y los compuestos se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc. para producir análogos estructurales.

Los agentes candidatos se seleccionan por la actividad biológica añadiendo el agente a una pluralidad de muestras celulares, generalmente junto con células que carecen del agente. Se mide el cambio en los parámetros en respuesta al agente y se evalúa el resultado en comparación con los cultivos de referencia, por ejemplo, en presencia y ausencia del agente, obtenido con otros agentes, etc.

Los agentes se añaden convenientemente en solución o en forma fácilmente soluble, al medio de las células en cultivo. Los agentes se pueden añadir en un sistema de flujo continuo, como una corriente, intermitente o continua o como alternativa, añadiendo un bolo del compuesto, de manera individual o incremental, a una solución de otra manera estática. En un sistema de flujo continuo, se usan dos fluidos, donde uno es una solución fisiológicamente neutra y el otro es la misma solución con el compuesto de ensayo añadido. Se hace pasar el primer fluido sobre las células, seguido del segundo. En un único método de solución, se añade un bolo del compuesto de ensayo al volumen del medio que rodea las células. Las concentraciones globales de los componentes del medio de cultivo no deberían cambiar significativamente con la adición del bolo, o entre las dos soluciones en un método de flujo continuo.

Se puede realizar una pluralidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Como se conoce en la técnica, la determinación de la concentración eficaz de un agente normalmente usa un intervalo de concentraciones resultantes de 1:10, u otra escala logarítmica, diluciones. Las concentraciones pueden refinarse aún más con una segunda serie de diluciones, si es necesario. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección del agente o a la concentración del agente o por debajo que no produce un cambio detectable en el fenotipo.

Los métodos descritos en el presente documento proporcionan un sistema útil para el cribado de los agentes candidatos para la actividad en la modulación de la conversión de la célula en células de un linaje esquelético o condrogénico, por ejemplo, condrocitos, osteoblastos o células progenitoras de los mismos. En ensayos de cribado para agentes biológicamente activos, las células, generalmente cultivos de células, se ponen en contacto con un agente candidato de interés en presencia del sistema de reprogramación o diferenciación celular o un sistema de reprogramación o diferenciación celular incompleta, y el efecto del agente candidato se evalúa haciendo un seguimiento de los parámetros de rendimiento tales como el nivel de la expresión de los genes específicos para el tipo celular deseado, como se conoce en la técnica, o la capacidad de las células que se inducen para funcionar como el tipo celular deseado; etc., tal como se conoce en la técnica.

AISLAMIENTO DE CÉLULAS PROGENITORAS DE HUESO/CONDROGÉNICAS/ESTROMALES

Las células progenitoras de hueso objeto se separan de una mezcla complejo de células por técnicas que enriquecen las células que tienen las características descritas. Las células progenitoras de la invención se han caracterizado en un linaje, como se expone en la Figura 2G. Aunque la caracterización inicial se realizó sobre las células de ratón, las células humanas pueden caracterizarse con los homólogos funcionales de los marcadores, por ejemplo, CD200, 6C3, PDPN, CD105, CD90, CD45, Tie2 y av integrina. Se proporcionan métodos y composiciones para la separación y caracterización de tales células progenitoras de hueso. Las células pueden separarse de otras células mediante la expresión de estos marcadores de superficie celular específicos.

Para el aislamiento de células del tejido, puede usarse una solución apropiada para la dispersión o la suspensión. Dicha solución generalmente será una solución de sal equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero fetal de ternero u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc. El tejido puede disociarse enzimáticamente y/o mecánicamente. En alguna divulgación el tejido óseo se trata con una proteasa suave, por ejemplo, dipasa, etc., durante un período de tiempo suficiente para disociar las células, a continuación, se disocia mecánicamente de manera suave.

Una separación inicial puede seleccionar células por diferentes métodos conocidos en la técnica, que incluyen elutriación, Ficoll-Hypaque o citometría de flujo usando los parámetros de dispersión directa y obtusa.

La separación de la población celular objeto, a continuación, usará la separación por afinidad para proporcionar una población básicamente pura. Las técnicas de separación por afinidad pueden incluir la separación magnética, que usa perlas magnéticas recubiertas por anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usado junto con un anticuerpo monoclonal,, por ejemplo, complemento y citotoxinas, y selección ("panning") con anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo, placa, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificador celular activado por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de independencia, etc. Las células pueden seleccionarse frente a células muertas empleando colorantes asociados a células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio, 7-AAD). Puede emplearse cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células seleccionadas.

Los reactivos de afinidad pueden ser receptores específicos o ligandos para las moléculas superficiales celulares anteriormente indicadas. De particular interés es el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su idoneidad para su uso como miembros de unión específica son bien conocidos por los expertos en la materia. Dependiendo de la población específica de las células a seleccionar, anticuerpos que tienen especificidad para CD105 y CD90 se ponen en contacto con la población de partida de las células. Opcionalmente, también se incluyen los reactivos específicos para CD45, Tie2 y av integrina.

Como se conoce en la técnica, los anticuerpos se seleccionarán por tener especificidad para las especies relevantes, es decir, se usan anticuerpos específicos para marcadores humanos para la selección de células humanas; los anticuerpos específicos para marcadores de ratón se usan en la selección de células de ratón, y similares.

Convenientemente, estos anticuerpos están conjugados con una etiqueta para usarse en la separación. Las etiquetas incluyen perlas magnéticas, que permiten la separación directa, biotina, que se puede retirar con avidina o estreptavidina unida a un soporte, fluorocromos, que pueden usarse con un clasificador celular activado por fluorescencia, o similares, para permitir la facilidad de separación del tipo de célula particular. Los fluorocromos que encuentran utilidad incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína y rojo Texas. Con frecuencia, cada anticuerpo se marca con un fluorocromo diferente, para permitir la clasificación independiente para cada marcador.

Los anticuerpos se añaden a una suspensión de células, y se incuban durante un período de tiempo suficiente para unir los antígenos de superficie celular disponibles. La incubación generalmente será de al menos aproximadamente 5 minutos y generalmente de menos de aproximadamente 30 minutos. Es deseable tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción, de modo que la eficacia de la separación no está limitada por la falta de anticuerpos. La concentración apropiada se determina por titulación. El medio en el que se separan las células será cualquier medio que mantenga la viabilidad de las células. Un medio preferido es solución salina tamponada con fosfato que contiene BSA al 0,1 a 0,5 %. Diversos medios están disponibles en el mercado y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de las células, entre los que se incluyen medio Eagle modificado de Dulbecco (dMEM), solución salina equilibrada de Hank (HBSS), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove, PBS con EDTA 5 mM, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal de ternero, BSA, HSA, etc.

A continuación, las células marcadas se separan con respecto al fenotipo anteriormente descrito. Las células separadas pueden recogerse en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad de las células, que generalmente tiene una banda de suero en el fondo del tubo de recogida. Diversos medios están disponibles en el mercado y pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de las células, entre los que se incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medio de Iscove, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal de ternero.

Las composiciones altamente enriquecidas para la actividad progenitora de hueso se consiguen de esta manera. La población objeto será un 50 % o aproximadamente o más de la composición celular, y generalmente un 90 % o aproximadamente o más de la composición celular, y puede ser tanto como aproximadamente un 95 % o más de la población celular viva. La población celular enriquecida puede usarse inmediatamente, o puede congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelándose y siendo capaz de reutilizarse. Las células generalmente se almacenarán en DMSO al 10 %, FCS al 50 %, medio RPMI 1640 al 40 %. Una vez descongeladas, las células pueden expandirse mediante el uso de los factores de crecimiento y/o las células estromales para la proliferación y diferenciación.

Los presentes métodos son útiles en el desarrollo de un modelo in vitro o in vivo para la función del hueso y también son útiles en la experimentación en terapia génica y para la construcción de órgano artificial. Los huesos en desarrollo sirven como una fuente valiosa de novedosos factores de crecimiento y agentes farmacéuticos y para la producción de virus o vacunas, para el ensayo de toxicidad in vitro y del metabolismo de fármacos y compuestos industriales, para la experimentación de la terapia génica, para la construcción de huesos trasplantables artificiales, y para la mutagénesis de hueso y carcinogénesis.

Las características y ventajas de la presente invención se apreciarán más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que no deben considerarse como limitantes de la invención.

Sección experimental

Ejemplo 1

Los destinos intercambiables de los progenitores osteogénicos y condrogénicos revelados por el amplio mapeo del linaje de las células madre esqueléticas multipotentes.

Hueso, cartílago y estroma de médula ósea son los componentes principales del esqueleto pero los orígenes de los tejidos esqueléticos postnatales permanecen pocos claros. En este caso, mapeamos el desarrollo del hueso y el cartílago de una población de células madre esqueléticas postnatales (célula madre esquelética de ratón, mSSC) de alta pureza, y su distintos progenitores posteriores de hueso, cartílago y tejido estromal. A continuación, determinamos la relación del linaje de mSSC con su progenie. Investigamos el transcriptoma de las células madre/progenitoras para patrones únicos de expresión génica que indicarían los reguladores intrínsecos y extrínsecos potenciales del compromiso del linaje de mSSC. Estos análisis revelan que el estroma de soporte generado de mSSC regula reflexivamente la diferenciación de mSSC y también regula la hematopoyesis. Demostramos que algunos factores de nicho de mSSC pueden ser inductores potentes de la regeneración esquelética, y varias combinaciones específicas de factores de nicho de mSSC recombinantes pueden activar los programas genéticos de mSSC in situ, incluso en tejidos no esqueléticos, dando como resultado la formación de novo de cartílago o hueso y estroma de médula ósea.

Implementando un sistema de "Ratón Rainbow", aislamos sistemáticamente células estromales no hematopoyéticas de regiones clonogénicas de tejido óseo y evaluamos su capacidad para diferenciar tejidos esqueléticos in vivo en un entorno de trasplante heterotópico. A continuación, identificamos ocho subpoblaciones de células progenitoras por fraccionamiento por FACS y análisis transcripcional. Entre estas subpoblaciones encontramos una célula madre esquelética de ratón (mSSC) capaz de generar hueso, cartílago y médula ósea. Posteriormente, identificamos la relación lineal entre esta mSSC y las otras siete subpoblaciones para desarrollar un mapa de linaje de progenitores esqueletogénicos. A continuación, volvimos nuestra atención a los mecanismos y/o factores en el nicho que regulan la proliferación de mSSC y la diferenciación hacia linajes específicos, especialmente hacia el desarrollo de cartílago. Mediante manipulación de morfógenos identificados, importantes en el mantenimiento del microambiente del nicho esquelético, pudimos inducir osteogénesis ectópica en tejido adiposo. También pudimos sesgar la determinación de linaje de tejido óseo a condrogénico mediante manipulación adicional de los factores de nicho identificados que son instrumentales en la determinación del destino de la célula madre y progenitora esquelética. Por tanto, demostramos la utilidad de este mapa de linaje, y las relaciones identificadas entre la mSSC y su progenie, distinguiendo los factores de nicho esqueletogénico específicos que se podrían traducir para la regeneración esquelética terapéutica.

Identificación de la célula madre esquelética, su progenie y sus relaciones de linaje. Se derivaron hueso y cartílago de progenitores restringidos a linaje, clonales. Un reto principal en la purificación de novedosos progenitores de tejido es la identificación de marcadores moleculares que pueden distinguir con exactitud estas células raras de su ambiente. Los estudios indican que seleccionar poblaciones de células progenitoras esqueléticas puede trazarse genéticamente en ratones transgénicos modificados por ingeniería genética para expresar GFP o Cre-Recombinasa, bajo el control regulador de promotores que conducen la expresión de los genes específicos tales como Nestina o Mx1. Sin embargo, puesto que Nestina y Mx1 se expresan ampliamente en diversos tejidos y tipos celulares, la expresión de estos marcadores en diferentes células puede no implicar necesariamente que comparten un linaje común. Por tanto, usamos un modelo de "ratón Rainbow" para evaluar las relaciones de linaje clonales in vivo para determinar si los tejidos mesenquimales en hueso que incluyen estroma, grasa, hueso, cartílago y músculo comparten un progenitor común.

El sistema de ratón Rainbow es un sistema marcador dependiente de Cre multicolor que porta una construcción indicadora de cuatro colores (rojo, amarillo, verde, azul: véase la sección de Métodos experimentales). Para visualizar los patrones clonales dentro de todos los tejidos, cruzamos ratones "Rainbow" con ratones portadores de una Cre expresada de manera ubicua inducible por tamoxifeno bajo el promotor del gen de actina (Actina-Cre-ERT) (Figura 1C). A continuación, inducimos la expresión de Cre en la progenie por inyección de tamoxifeno a distintos momentos del desarrollo, entre los que se incluyen el día 15 (E15), el día 3 postnatal (P3) y a las 6 semanas (adultos jóvenes (Figuras 1C). La inducción de la actividad de la Cre-recombinasa desencadena expresión constitutiva de hasta 16 disposiciones aleatorias distintas de RFP, GFP, CFP, y YFP en todas las células, incluidas las células madre. Seis semanas después de esta activación de la recombinasa, se pudieron detectar las regiones clonales como áreas uniformemente marcadas de un color distinto (Figura 8A, B).

Usando este sistema, observamos las regiones clonales en el hueso, particularmente en la placa de crecimiento, que abarca hueso, cartílago, y tejido estromal, pero no tejido hematopoyético, adiposo o muscular en todos los momentos (inducción en E15, P3 y semana 6 postnatal) (Figura 1A, C, D, Figura 8D). Estos datos indican que el hueso, cartílago y tejido estromal se derivan clonalmente in vivo de células madre y progenitoras restringidas a linaje que no dan lugar también a músculo y grasa, al menos en los momentos examinados (de E15 a la semana 6 postnatal) (Figura 8D).

Hay una reducción suave en la actividad clonal esquelética en la placa de crecimiento femoral de los ratones inducidos en la semana 6 postnatal, que refleja probablemente el descenso postnatal gradual en el crecimiento (Figura 8C, ilustrando la cabeza de flecha las regiones clonales en los insertos de (ii)-(iv)). También observamos las regiones clonales en los metacarpos y los metatarsos y en los huesos del esqueleto axial, en concreto el esternón y las costillas (Figuras 8E-G). Las células progenitoras purificadas de cartílago, hueso y estromales son heterogéneas y están restringidas a linaje.

Después de determinar que el hueso, el cartílago y el tejido estromal se derivan clonalmente de células madre y progenitoras restringidas a linaje in vivo, buscamos purificar poblaciones esqueletogénicas clonales específicas mediante aislamiento anticipado usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Debido a que habíamos observado una alta frecuencia de regiones clónales en la placa de crecimiento durante nuestro análisis clonal de "ratón Rainbow", aislamos células de las placas de crecimiento de fémures mediante disociación enzimática y mecánica y se analizaron por FACS para la expresión diferencial de CD45, Ter119, Tie2, e integrina AlfaV. Estos marcadores de superficie corresponden a aquellos presentes en células hematopoyéticas (CD45, Ter119), vasculares y hematopoyéticas (Tie2), y osteoblásticas (integrina AlfaV).

Encontramos que la placa de crecimiento tenía una alta frecuencia de células que eran CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+, a continuación, en el presente documento se denominan células [AlfaV+]. Basándose en un análisis de micromatriz posterior de la población [AlfaV+] que muestra expresión diferencial de CD105, Thy, 6C3 y CD200, fraccionamos esta población en ocho subpoblaciones (Figura 1B y E). Para evaluar la capacidad intrínseca de las ocho subpoblaciones para dar lugar al tejido esquelético, aislamos 20.000 células de cada subpoblación de los huesos largos (fémures, tibias, húmeros, radios), las costillas y el esternón de ratones GFP+ (Figura 1E) y los trasplantamos debajo de la cápsula renal de ratones RAG-2/gamma(c)KO inmunocomprometidos (Figura 1H).

Previamente habíamos determinado que la localización subcapsular en el riñón es un sitio extraesquelético ideal para el injerto de células esqueletogénicas trasplantadas. Cuatro semanas después del trasplante, explantamos los injertos de riñón GFP marcados y procesamos los tejidos para el análisis histológico para determinar su resultado de desarrollo (Figura 1F). Las ocho subpoblaciones presentaron diferentes destinos de desarrollo (Figura 1F-G): tres siguieron un patrón de osificación endocondral, dando como lugar a injertos que consistían en hueso, cartílago y médula ósea (Figura 1F-G: poblaciones a, e, f); cuatro dieron lugar a principalmente hueso con cartílago mínimo y no médula ósea (Figura 1F-G: poblaciones b, c, d, h); y uno dio lugar a principalmente tejido cartilaginoso con hueso mínimo y no médula ósea (Figura 1F-G: población g). Estos resultados indican que los progenitores esqueletogénicos son diversos, con distintos perfiles de marcador de superficie celular y destinos de tejido esquelético, igual que las diversas células hematopoyéticas que generan diferentes células sanguíneas terminalmente diferenciadas. Para asegurar que las subpoblaciones [CD45+Ter 119+] o [Tie2+] no contenían subpoblaciones de células esqueletogénicas, aislamos las poblaciones celulares [CD45+Ter 119+] y [Tie2+] (que habíamos excluido previamente en el fraccionamiento por FACS) de los huesos largos de ratones GFP marcados P3 por digestión mecánica y enzimática y posterior fraccionamiento por FACS.

A continuación, trasplantamos 20.000 células de cada uno de los subconjuntos debajo de la cápsula renal de ratones RAG-2/gamma(c)KO inmunodeficientes para evaluar el potencial esqueletogénico intrínseco. A diferencia de las ocho subpoblaciones de la fracción [AlfaV+], no se encontró que los subconjuntos CD45/Ter119+ y Tie2+ formaran hueso, cartílago o estroma cuatro semanas después del trasplante (Figura 15D), lo que enfatiza más la existencia de distintos progenitores de hueso, cartílago y tejido estromal en esqueleto de ratón.

Identificación de una célula madre esquelética postnatal. Planteamos la hipótesis de que la esqueletogénesis puede proceder a través una jerarquía de desarrollo de progenitores restringidos a linaje como se ve en la hematopoyesis, el sistema de organogénesis que ha sido el enumerado más a fondo. Por tanto, de nuevo aislamos las ocho subpoblaciones celulares de la placa de crecimiento femoral, basándose en la expresión diferencial de marcadores de superficie de célula CD105, CD200, Thy y 6C3 en la población [AlfaV+].

A continuación, intentamos determinar la capacidad de diferenciación de cada subpoblación e identificar las relaciones de linaje que podrían estar presentes entre las subpoblaciones. Observamos que la subpoblación [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] genera linealmente todas las otras (siete) subpoblaciones a través de una secuencia de fases tanto in vitro como in vivo, comenzando con la generación de dos tipos celulares progenitoras multipotentes: en primer lugar, la población celular [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200-], a continuación en el presente documento se denomina la pre-BCSP (para el pre-progenitor de hueso, cartílago y estroma); y la población de la célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105+] que previamente describimos como b Cs P; para el progenitor de hueso, cartílago y estroma.

La subpoblación [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] genera in vitro e in vivo todas las otras (siete) subpoblaciones de una manera lineal. In vitro, las células recién clasificadas se cultivaron durante un periodo de 25 días, en dicho momento se volvieron a fraccionar por FACS (Figura 2A) (i), Figura 2B (i), (ii)), y posteriormente se trasplantaron debajo de la cápsula renal (Figura 2A (i), Figura 2B (iii)). In vivo, las células purificadas se trasplantaron debajo de la cápsula renal y se explantaron un mes después para la disociación y el análisis por FACS (Figura 2A (ii), Figura 2C (i), (ii)) o inmunohistoquímica (Figuras 2C (iii)).

Estos datos demuestran que la subpoblación [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] genera todas las otras (siete) subpoblaciones de una manera lineal tanto in vitro como in vivo. Las células clasificadas individuales de la subpoblación [CD45-Ter119-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] generan también todas las otras subpoblaciones de una manera lineal tanto in vitro como in vivo (Figura 2D, Figura 2E).

In vitro: Las células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] individuales se sembraron en placa y se cultivaron durante 14 días (Figura 2D (ii)). El análisis por FACS de las colonias primarias resultantes indicaron que contenían clones de la célula original y todas las otras (siete) subpoblaciones de la población [AlfaV+] (Figura 2E (iv): gráfico de FACS del panel central). Estas colonias contenían tanto tejido de cartílago colágeno 2(+) como de hueso osteocalcina (+) cuando se examinaron por inmunohistoquímica (Figura 2E (Ni)). Asimismo, cuando una célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] recién clasificada individual aislada de la colonia primaria se sembró de nuevo en placa y se cultivó durante 14 días, la colonia secundaria resultante contenía clones de la célula original y de nuevo todas las otras subpoblaciones (Figura 2E(ii)) en el análisis por FACS (Figura 2E(iv): gráfico de FACS del panel inferior). Estos resultados demuestran que la auto renovación in vitro de una célula [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] individual mantenía las propiedades esqueletogénicas de las células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] recién aisladas.

In vivo: Cuando se trasplantaron de manera individual, las células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] no se injertaron eficazmente debajo de la cápsula renal, reflejando quizás su necesidad de un ambiente de soporte, es decir, un nicho de célula madre esquelética. Por lo tanto, trasplantamos conjuntamente células [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] GFP marcadas individuales con cinco mil células RFP marcadas aisladas no clasificadas de los huesos largos de ratones P3 para estimular un nicho de célula madre esquelética (Figura 2D(i)). Dos semanas después del trasplante, explantamos los injertos para el seccionamiento y el análisis inmunohistoquímico. Las células trasplantadas GFP marcadas se diferenciaron en tanto condrocitos teñidos con azul alcián como osteocitos teñidos con azafrán in vivo (Figura 2F (iv), (vi)), consecuentes con sus propiedades in vitro (Figura 2E (iii)). Estos datos indican que la población [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] posee características tipo célula madre definitivas de auto renovación y multipotencia. Por lo tanto, concluimos que la población celular [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] representa una población de célula madre esquelética de ratón (mSSC) en tejidos esqueléticos postnatales (Figura 2G), y que las otras siete subpoblaciones de la población [AlfaV+] son progenie de mSSC.

Las mSSC identificadas por estos criterios también se detectaron en otras regiones del esqueleto, que incluyen la cola, la columna vertebral, las costillas, la pelvis, el neurocráneo, la mandíbula y las falanges, que indica que mSSC es también importante para el mantenimiento postnatal de estos huesos. (Figura 14) Resaltando las capacidades regenerativas potenciales de la mSSC, hemos evidenciado que el número de mSSC es significativamente mayor en el callo de un fémur fracturado que en el fémur ileso contralateral; esta diferencia era la mayor 7 días después de una fractura (Figura 9A-B).

Además, hemos visto tres fenómenos adicionales, que enfatizan el papel de la mSSC en la regeneración después de la lesión. En primer lugar, observamos que las mSSC aisladas de un callo de fractura tienen capacidad osteogénica aumentada (en comparación con aquellas células aisladas de un fémur ileso) cuando se cultivan in vitro en medio de diferenciación osteogénica, demostrando absorción significativamente mayor del colorante rojo Alizarina en comparación con las mSSC aisladas de un fémur ileso (Figura 9C panel izquierdo). En segundo lugar, cuando trasplantamos 10.000 mSSC, aisladas de o bien un callo de fractura o un hueso ileso, debajo de la cápsula renal y se explantaron los injertos un mes después, vimos que cuando ambos grupos de células producían injertos consistentes en hueso y médula ósea, los injertos producidos por mSSC obtenidos del ambiente de la fractura daban como resultado injertos notablemente mayores que aquellos producidos por mSSC aisladas del hueso ileso, resaltando la alteración intrínseca de la actividad de la mSSC en presencia de la lesión (Figura 9C: panel derecho). Finalmente, ya que es bien conocido que la irradiación da como resultado osteopenia y curación reducida de la fractura, a continuación, examinamos la actividad de mSSC en respuesta a la lesión tras irradiación. En este caso, vimos que cuando se irradiaban los ratones 12 horas antes de la inducción de fractura, encontrábamos que había una reducción significativa de la expansión de mSSC una semana después de la fractura en comparación con fémures no irradiados 1 semana después de la fractura (Figura 9D).

Por tanto, estos datos resaltan la capacidad regenerativa funcional de la mSSC. Basándose en los análisis descritos anteriormente, definimos un árbol de linaje de las células madre/progenitoras esqueléticas (Figura 2G). La mSSC inicia la esqueletogénesis mediante la producción de una jerarquía de progenitores cada vez más limitados por el destino, igual a la de la HSC. La mSSC multipotente y auto renovante primero da lugar a progenitores multipotentes, pre células progenitoras de hueso, cartílago y estromales (pre-BCSP) y células progenitoras de hueso, cartílago y estromales (BCSP). Estos dos tipos celulares, a continuación, producen los siguientes progenitores de oligolinaje: progenitores de cartílago comprometidos (CCP) [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy+6C3-CD105+CD200+]; la subpoblación Thy, [CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy+6C3-CD105+] a continuación en el presente documento denominada Thy; progenitores estromales de linfocitos B, BLSP [CD45-Ter119-AlfaV+Thy+6C3-CD105-]; la subpoblación 6C3, [CD45-Ter119-AlfaV+Thy-6C3+CD105-] a continuación en el presente documento denominada 6C3; y la célula de expresión del factor de leucemia hepático, HEC [CD45-Ter119-AlfaV+Thy-6C3+CD105-] (Figura 2G). Linajes derivados de mSSC incluyen tipos celulares que previamente hemos caracterizado tal como las subpoblaciones Thy, BLSP y 6C3, que poseen distintas capacidades de soporte hematopoyético (Figura 12A,B).

Identificación de los factores que regulan la actividad de la célula madre y progenitora esquelética y la diferenciación. El nicho de mSSC se compone de otras células de linaje esquelético que regulan la actividad de mSSC. En experimentos iniciales, notamos que la primera población esqueletogénica de las extremidades fetales era triple negativa para Thy, 6C3, y CD105 ([CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-], a continuación en el presente documento, indicadas colectivamente como TN, células Tiple Negativas). La célula TN dio lugar a células CD105+,, Thy+ y 6C3+/- in vitro e in vivo y las células TN también eran capaces de auto renovarse in vitro. Por tanto, las células TN fueron nuestra primera versión de una población que se enriqueció para las mSSC. Esta es la misma población que se usó cuando realizamos nuestro análisis de micromatriz (descrita como *mSSC; Figura 3).

El análisis de micromatriz de la población *mSSC reveló un conjunto de marcadores que podrían enriquecer las mSSC aún más. Entre los varios candidatos posibles observamos que CD200 parece aumentar significativamente la actividad de la unidad formadora de colonia de la célula TN. Por tanto, todos los experimentos posteriores que incluían la secuenciación de ARN de célula individual reciente se realizaron sobre la mSSC con el inmunofenotipo descrito en la Figura 2G ([CD45-Ter119-Tie2-AlfaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]). De manera similar, el inmunofenotipo del progenitor de cartílago comprometido (CCP) se refinó más con la observación de la importancia de CD200 en subfraccionamiento adicional de las células madre/progenitoras esqueletogénicas (Figura 2G).

Una vez que habíamos aislado las mSSC, volvimos nuestra atención a la identificación de los tipos celulares que componen el nicho de mSSC (el microambiente que soporta y regula la actividad de la célula madre). Primero, conducimos los análisis de expresión génica con micromatriz de una población pura recién clasificada de mSSC y cinco de sus poblaciones progenitoras: (i) BCSP; (ii) Thy; (iii) 6C3; (iv) BLSP; y (v) HEC. El fin de estos análisis de expresión génica era identificar receptores para señalizar vías que pueden regular la actividad de la mSSC y su progenie (Figura 3D-E).

Para interpretar los perfiles de expresión génica de estas células, usamos la "Gene Expression Commons", una plataforma que normaliza datos de la micromatriz frente a una gran colección (n = 11.939) de datos de micromatriz públicamente disponibles del "National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus" (NCBI GEO). Por tanto, generamos mapas de calor que representaban fold-change de la expresión génica y realizamos análisis estadístico de la vía con el programa informático "Ingenuity Pathway Analysis" (QlAGEN Redwood City).

La *mSSC y su progenie diferencialmente expresan muchos receptores implicados en el factor de crecimiento transformante (TGF) beta (específicamente la proteína morfogenética de hueso (BMP)), y vías de señalización de WNT, y morfógenos cognados de estas vías, que incluyen BMP2, TGF-p3 y Wnt3a (Figura 3D-E). Estos resultados sugieren que la señalización autocrina y/o paracrina entre mSSC* y su progenie puede regular positivamente su propia expansión (Figura 3F). Asimismo, la secuenciación del ARN de célula individual reveló la expresión conjunta de BMP2 y su receptor (BMPRIa) (Figura 3A-C) en la mSSC, lo que ilustra el potencial para la señalización autocrina en las mSSC.

En apoyo de los datos transcripcionales, la adición de la BMP2 recombinante exógena para cultivar medios rápidamente indujo la expansión de mSSC aisladas, mientras que el suplemento de medios con o bien TGFp recombinante exógeno o TNFa no lo hizo (Figura 3G, 3H). Además, la proliferación de mSSC in vitro se inhibió notablemente mediante la adición a los medios de cultivo de proteína gremlin 2 recombinante, un antagonista de la señalización de BMP2, al contrario que el control (Figura 15A). La progenie de mSSC expresa antagonistas de la vía de señalización de BMP2, tales como Gremlin 2 y Nogina (Figura 10A, panel derecho), lo que sugiere la presencia de un mecanismo de retroalimentación negativo potencial para controlar la proliferación de mSSC por más linajes esqueléticos diferenciados. Específicamente, Thy expresa Gremlin 2, y tanto Thy como BLSP expresan Nogina. Por tanto, especulamos que las subpoblaciones Thy y BLSp pueden actuar en un bucle de retroalimentación negativa para inhibir la proliferación inducida por BMP-2 de la mSSC, lo que sugiere además que la señalización autocrina y paracrina pueden ocurrir entre las mSSC y su progenie puede regular su propia expansión. Planteamos la hipótesis de que la regulación endocrina sistémica, así como la regulación autocrina y paracrina, pueden ser importantes en la regulación de las mSSC y su progenie. La expresión transcripcional de los receptores cognados para las hormonas sistémicas, leptina y hormona estimulante tiroidea (TSH), se reguló al alza selectivamente en los subconjuntos Thy y BLSP aislados de ratones P3, pero no en las BCSP o las poblaciones de *mSSC (Figura 10A). Asimismo, la secuenciación de ARN de célula individual ilustró que el receptor de leptina se expresó a un nivel celular individual únicamente sobre los subconjuntos Thy/BLSP aislados de ratones P3 (Figura 15E (ii)). Por el contrario, todas estas subpoblaciones tenían expresión transcripcional mínima de los correspondientes ligandos a estos receptores de leptina o TSH (Figura 10C). Estos descubrimientos sugieren que la progenie posterior puede servir como intermediario entre las señales endocrinas sistémicas y la mSSC (Figura 10A, E). Encontramos respaldo adicional para esta hipótesis en que el cultivo de subconjuntos Thy con la hormona de crecimiento leptina recombinante (1 pg/ml) estaba asociado a la regulación por aumento de Nogina y Gremlin-2, antagonistas de la vía de señalización de BMP-2 (Figura 10D). De forma correspondiente, los medios acondicionados de los subconjuntos Thy tratados con leptina inhibieron la proliferación de mSSC (Figura 10B). Además, el cultivo de células Thy en medios suplementados con hormona de crecimiento leptina recombinante (1 pg/ml) condujo a expresión incrementada de gremlin 2, como se observa mediante la tinción inmunofluorescente (Figura 10D (ii)-(iii)). Este descubrimiento indica además que los progenitores posteriores pueden actuar como un mediador entre las señales endocrinas sistémicas y la mSSC, traduciendo las señales endocrinas a paracrinas (Figura 10E). Las células Thy y 6C3 se localizan conjuntamente con y pueden contribuir a un nicho para las mSSC marcadas por Foxa2. Ya que tenemos evidencia de que los subconjuntos Thy y 6C3 expresan los componentes del entorno de señalización que regula la actividad de mSSC, planteamos la hipótesis de que los subconjuntos Thy y 6C3 no funcionan solo como progenie de mSSC sino también como células nicho de soporte.

Para probar esta hipótesis buscamos determinar si los subconjuntos Thy y 6C3 se localizan conjuntamente con la mSSC in vivo. Sin embargo, esto requería encontrar un marcador único que pudiera distinguir la mSSC de estas subpoblaciones por histología inmunofluorescente. Por tanto, usamos la plataforma de "Gene Expression Commons" como se ha descrito anteriormente y se identificó Foxa2 como un factor intracelular notablemente expresado en lo más alto por las mSSC, significativamente menor por CSP, pero no por cualquier célula progenitora esquelética posterior (Figura 3I), célula hematopoyética o endotelial. Consecuentemente, mediante la secuenciación de ARN de célula individual observamos que Foxa2 se regula al alza significativamente en la mSSC, a niveles mucho menores en BCSP, y casi no existentes en la progenie posterior (Figura 15F(ii)). Para validar la expresión de mSSC de Foxa2 a un nivel proteico, realizamos FACS intracelular usando un anticuerpo específico para Foxa2 en mSSC permeabilizadas, que confirmó de nuevo alta expresión de Foxa2 por el subconjunto de mSSC (Figura 3K). La tinción inmunofluorescente de secciones de hueso femoral indicaron que las células Foxa2+ se localizan en las placas de crecimiento de acuerdo con la detección de mSSC en estas áreas mediante análisis por FACS de tejido disociado de estas subregiones (Figura 1B). En la placa de crecimiento femoral, las subpoblaciones Thy y 6C3, teñidas por inmunofluorescencia, se localizan adyacentes a las células Foxa2+, lo que sugiere el papel potencial de las subpoblaciones Thy y 6C3 como células de nicho de soporte para la mSSC (Figura 3 J, L). Los destinos de cartílago pueden sesgarse hacia la formación de hueso. Al haber determinado que las células progenitoras constituyentes de la mSSC forman parte del nicho estromal de soporte para mSSC, nos planteamos si el estroma derivado de mSSC podría influir en el compromiso del destino de las células progenitoras esqueléticas (Figura 2G).

Observamos que los subconjuntos esqueléticos CD200(+) [CD45-Ter119-AlfaV+Thy+6C3-CD105+CD200+] (Figura 1F, población g) aislados de ratones RFP+ se dirigen principalmente hacia la formación de cartílago cuando se trasplantan aisladamente debajo de la cápsula renal de ratones receptores no fluorescentes; por tanto, designamos esta célula el progenitor de cartílago comprometido (CCP) (Figura 4A y B). Sin embargo, cuando las células CCP RFP marcadas (Figura 2G) se trasplantan conjuntamente con BCSP GFP marcadas, se diferencian en tejido óseo pero no en cartílago (Figura 4C). El análisis de la expresión génica de los linajes derivados de mSSC (incluidos BCSP, Thy, 6C3, BLSP y HEC) indica que la mSSC y la mayoría de su progenie expresan altos niveles de WNT3A, WNT4 y WNT5a (Figura 3D).

Por el contrario, CCP, que cuando se trasplantan solas se someten a diferenciación condrogénica, expresan bajos niveles de Axin1, indicativo de señalización de WNT reprimida. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la señalización de WNT puede estar implicada en el cambio de progenitores condrogénicos hacia destinos osteoblásticos. Para ensayar esta posibilidad, de nuevo trasplantamos conjuntamente debajo de la cápsula de riñón 20.000 células CCP RFP marcadas con 20.000 BCSP GFP marcadas que tenían señal de WNT canónica mediada por el receptor Frizzled de Wnt local inhibida (por transducción anterior con 108-109 unidades MOI de vector lentivírico que codifica el receptor frizzled-2 [SFRP-2]secretado ) (Figura 4A). Ya que cuando se trasplantaron solas, las células CCP se sometieron a diferenciación condrogénica, que reprime la osteogénesis, indicando de este modo que la influencia osteogénica por BCSP está mediada por WNT (Figura 4D). Estos resultados sugieren que los gradientes de la actividad de señalización relacionada con w Nt son un mecanismo posible en la determinación del compromiso del destino en los progenitores esqueléticos (Figura 2G).

Los destinos de hueso pueden sesgarse hacia la formación de cartílago por bloqueo de VEGF. Al haber observado que la señalización de WNT y BCSP podían desviar las células destinadas a cartílago hacia la formación de hueso, a continuación, buscamos identificar los factores que podrían, por el contrario, fomentar selectivamente las mSSC a destinos condrogénicos en lugar de hueso. Basándose en los siguientes resultados, planteamos la hipótesis de que la señalización de VEGF era crucial en esta determinación de destino. Al comparar el transcriptoma de las mSSC purificadas y el de los progenitores esqueléticos comprometidos, encontramos que las mSSC expresaban muchos genes clave asociados con la condrogénesis entre los que se incluyen Runx2, Sox9, Colágeno 2, y Colágeno 10, lo que sugiere que las mSSC ya están preparadas hacia un destino cartilaginoso. La secuenciación de ARN de célula individual confirmó este descubrimiento en mSSC, mostrando altos niveles de expresión de Sox9 y Colágeno 2 y bajos niveles de expresión de Runx2 y Colágeno 10. Las mSSC purificadas también forman inicialmente cartílago hipertrófico cuando se trasplantan, antes de la progresión hacia la formación de hueso y médula ósea a través de la osificación endocondral.

La evidencia emergente en modelos de osteoartritis indican que la desregulación de la señalización de HIF2, que da como resultado expresión de VEGF incrementada, puede incitar a los condrocitos restantes a volver a entrar en un estado hipertrófico y resumir la osificación endocondral. El tratamiento de células estromales mesenquimales in vitro con VEGF también fomenta la calcificación de células estromales mesenquimales derivadas de médula ósea cultivadas y la expresión de marcadores de formación de hueso temprana tal como fosfatasa alcalina. Por tanto, se determinó si la inhibición de la señalización de VEGF podría fomentar la diferenciación condrogénica de mSSC trasplantadas por bloqueo de la osificación dependiente de VEGF (Figura 5A). En estos experimentos usamos tanto mSSC fetales (E14.5) como postnatales. La inclusión de lo anterior nos permitió enfocarnos en un periodo de desarrollo esquelético embrionario en el que la señalización de VEGF juega un papel crucial en la vascularización, posibilitando que el cartílago llegue a calcificarse para formar hueso. Administramos 109 unidades formadoras de placa (ufp) de vectores adenovíricos que codificaban un ectodominio de unión a ligando (ECD) soluble del receptor VEGFR1 (Ad sVEGFR1) por inyección intravenosa, conduciendo a transducción en hígado y secreción hepática de VEGFR1 ECD en la circulación y produciendo antagonismo de VEGF sistémico potente. El adenovirus que codificaba un dominio Fc de inmunoglobulina IgG2< servía como tratamiento control. Un día después, trasplantamos fémures fetales preosteogénicos E14.5 intactos bajo la cápsula renal de estos ratones y, a continuación, explantamos el tejido 3 semanas después (Figura 5A).

Los injertos de los ratones tratados con Ad sVEGFRI parecían viables pero aparecían (extremadamente) pálidos y contenían tejido predominantemente cartilaginoso (Figura 5B: los dos paneles superiores a la derecha; Figura 5C). Por el contrario, los injertos de los animales Ad Fc control eran extremadamente rojizos de color y evidenciaban, en el examen histológico, osificación endocondral y formación de una cavidad de médula ósea alrededor del hueso cortical (Figura 5B: los dos paneles superiores a la izquierda; Figura 5C). Estos resultados muestran que el bloqueo de VEGF puede fomentar la condrogénesis en el coste de la osteogénesis, quizás al nivel del compromiso de mSSC.

Para ensayar si la inhibición de VEGF fomenta la formación de cartílago en el coste de la formación de hueso al nivel del compromiso de linaje de mSSC, aislamos mSSC de las extremidades de ratones P3 neonatales, como se ha descrito previamente, y trasplantamos 20.000 de estas bajo la cápsula renal de ratones tratados con Ad sVEGFR1 (Figura 5A). Tres semanas después del trasplante, explantamos los riñones, y realizamos análisis histológico de tejido derivado de mSSC seccionado con Pentacromo de Movat. De nuevo, como en el entorno de trasplante femoral de hueso completo fetal, las mSSC en los ratones tratados con bloqueo de VEGF formaron cartílago pero no hueso o médula ósea (Figura 5B: los dos paneles más inferiores a la derecha; Figura 5C). Por el contrario, las mSSC trasplantadas en los ratones control se sometieron a osificación endocondral, formando hueso y médula ósea (Figura 5B: los dos paneles más inferiores a la izquierda; Figura 5C).

Dado el efecto drástico del bloqueo de VEGF sobre la osteogénesis en tanto en los ensayos de trasplante femoral como mSSC fetales, sorprendentemente se encontró que la expresión de los receptores de VEGF (VEGFR; incluidos VEGFR1, 2, 3) y los ligandos VEGFA y VEGFB eran extremadamente bajos a indetectables en mSSC y su progenie (subconjuntos BCSP, Thy, 6C3, BLSP, HEC) (Figura 5D: panel de la izquierda). Sin embargo, VEGFC se expresó a niveles altos en las subpoblaciones progenitoras (Figura 5D: panel de la izquierda). Además, mSSC y sus linajes derivados expresan altos niveles de neuropilina 1 y 2, que funcionan como receptores para algunas formas de VEGf , incluido el factor de crecimiento placentario (PIGF), y VEGFR1 soluble antagoniza la activación de NRP1 por PIGF (Figura 5D: panel de la derecha). Por lo tanto, el bloqueo de VEGF puede afectar a mSSC y su progenie (dando como resultado la formación de cartílago en lugar de hueso) (Figura 5A-C), a través del antagonismo de NRP1 en lugar de inhibición directa de la señalización de VEGF.

Ya que el bloqueo de VEGF sistémico estimula drásticamente la condrogénesis en primordio fetal trasplantado y mSSC, nos cuestionamos si la condrogénesis está mediada por un efecto indirecto o directo del antagonismo de VEGF en la mSSC. Por tanto, exploramos qué destino se fomentaba (formación de cartílago o hueso) tras la activación o inactivación exógena (directa) de NRP1/VEGFR1. Sembramos en placa mSSC recién aisladas de ratones GFP marcados para tratamiento in vitro con proteína de fusión sVEGFR1-Fc (5 pg/ml), ectodominio NRP1 soluble (25 pg/ml) y PIGF (0,5 pg/ml). Después de una semana de tratamiento in vitro, trasplantamos 20.000 mSSC debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes (Figura 5E). Tres semanas después del trasplante, explantamos los injertos y notamos que ni el agonismo ni el antagonismo de la señalización de VEGF y PIGF in vitro alteraba significativamente el potencial de mSSC para diferenciarse en hueso in vivo, lo que indicaba que el mecanismo del antagonismo de VEGFR que da como resultado promoción de destino condrogénico ocurre indirectamente a través del ambiente, en lugar de un efecto directo sobre las mSSC (Figura 5F).

A continuación, nos cuestionamos si la promoción de la condrogénesis podría ocurrir tras la activación o la inhibición de la señalización de TGFp, que se informa que está implicada en la formación de hueso endocondral postnatal. Aislamos mSSC de ratones GFP marcados por disociación mecánica y enzimática y posterior FACS. A continuación, sembramos en placa estas células en presencia de o bien TGFp (250 ng/ml) o por el contrario receptor de TGFp soluble (5 pg/ml) durante una semana antes de trasplante debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes. Tres semanas después del trasplante, se explantaron estos injertos por análisis histológico. Tras la inhibición directa de TGFp, encontramos que estos injertos formaron cartílago y poco hueso, lo que refleja que el antagonismo directo de la señalización de TGFp da como resultado la promoción del destino de cartílago en las mSSC.

La manipulación de la vía de BMP puede inducir la formación de novo de las mSSC en las localizaciones extraesqueléticas. Puesto que establecimos que las poblaciones de hueso, cartílago y estromales en el tejido esquelético se derivan de mSSC y su progenie, a continuación, investigamos si otros tipos de tejido contienen células que son osteoinducibles o portan mSSC latentes que pueden activarse para someterse a osteogénesis. Ensayamos BMP2 como agente que puede inducir tal osteogénesis. Aunque las propiedades osteogénicas de BMP2 son bien conocidas y está aprobada en procedimientos ortopédicos clínicos para estimular la osteogénesis, no se ha determinado el mecanismo biológico que sustenta la inducción osteogénica mediada por BMP2. Observamos que BMP2 puede expandir mSSC in vitro, como se ha detallado anteriormente (Figura 3G, H).

Para mejor el entendimiento del efecto osteogénico de BMP2, dispusimos esponjas de colágeno que contenían 3 pg de BMP2 recombinante liofilizada en sitios extraesqueléticos, o bien subcutáneamente dentro de la almohadilla de grasa inguinal o debajo de la cápsula renal. La extracción de las esponjas de colágeno 4 semanas después de la disposición reveló abundantes osteoides óseos repletos con médula ósea de los sitios en el riñón y el tejido subcutáneo (Figura 6A-C). Asimismo, El análisis por FACS de las células dentro de la médula ósea de los osteoides reveló una frecuencia de HSC (Figura 6B, fila inferior) igual a la encontrada en fémures adultos "normales" (Figura 6B, fila superior). Estos datos muestran que los huesos inducidos por BMP2 son funcionalmente iguales a los huesos normales (Figura 6B). Por el análisis por FACS determinamos que mSSC son normalmente no detectables o son sumamente raras en el tejido adiposo subcutáneo (Figura 6C: panel derecho). Por el contrario, las mSSC se encuentran en números altos en osteoides inducidos por BMP2 10 días después del implante, mientras que aún se está procediendo a la osificación (Figura 6C, panel izquierdo).

Ya que habíamos establecido que mSSC y los progenitores esqueléticos posteriores son sumamente raros en el tejido adiposo subcutáneo "normal", nos cuestionamos el origen de los progenitores esqueléticos que contribuyen a la formación de hueso ectópico inducida por BMP2. Para determinar si BMP2 inducía la transformación esquelética de células in situ o la migración de progenitores esqueléticos circulantes reclutados de tejido óseo, usamos modelo parabionte (Figura 6D). Fusionamos quirúrgicamente ratones transgénicos actina-GFP con ratones congénicos no GFP de modo que establecimos un sistema circulatorio compartido por ramificación de los vasos y anastomosis en las regiones unidas. Dos semanas después de la parabiosis, después de que se había confirmado una circulación común entre parabiontes mediante análisis por FACS, las esponjas de colágeno que contenían 3 |jg de BMP2 recombinante liofilizada (como se ha descrito anteriormente) se dispusieron en la almohadilla de grasa inguinal del parabionte no GFP. Diez días después del implante, explantamos la esponja y el tejido circundante y se realizó disociación mecánica y química para aislar las poblaciones celulares constituyentes.

Ensayamos la contribución de las células GFP marcadas a la formación de hueso ectópico en el ratón no GFP mediante análisis por FACS, para determinar si las células circundantes contribuían al desarrollo del hueso ectópico. El tejido de los explantes contenían abundantes células GFP marcadas en la extracción, pero el análisis por FACS reveló que las células GFP marcadas en el injerto eran únicamente células hematopoyéticas CD45(+) (Figura 6D, panel izquierdo, superior e inferior), y progenitores no esqueléticos (Figura 6D, gráficos de FACS, población de célula mSSC mostrada en el extremo derecho). La población progenitora esquelética presente en el tejido explantado era enteramente GFP negativa, lo que sugiere que las células progenitoras esqueléticas circulantes no contribuían a los huesos ectópicos inducidos por BMP2 (Figura 6D, gráficos de FACS, población de célula mSSC mostrada en el extremo derecho).

Estos datos indican que la osteogénesis inducida por BMP2 implica la respuesta celular local que es suficiente para inducir la formación de progenitores esqueléticos mSSC primitivos en las almohadillas de grasa subcutáneas, conduciendo a la formación de hueso ectópico que puede soportar la hematopoyesis. Ya que habíamos establecido que BMP2 podía inducir la formación de hueso ectópico tanto subcutáneamente como debajo de la cápsula renal, deseamos determinar qué tipos de células podrían someterse a reprogramación a mSSC mediada por BMP2 en estos sitios extraesqueléticos. Por lo tanto, condujimos análisis por FACS de células suspendidas aisladas del riñón y el tejido adiposo subcutáneo y buscamos marcadores que pudieran distinguir tipos celulares comunes a ambos de estos órganos extraesqueléticos. Encontramos que tanto el riñón como el tejido adiposo contienen altos números de células que expresan Tie2 y PDGFRa. La expresión de Tie2 se ha detectado en subconjuntos de célula madre endotelial, de pericitos y hematopoyéticas, mientras que PDGFR (se expresa en diferentes tejidos. Usando un ratón indicador Tie2Cre x MTMG específico, que genéticamente marca células que expresan Tie2 y GFP y otras células con RFP, de nuevo insertamos esponjas de colágeno que contenían 3 jg de BMP2 recombinante liofilizada en la almohadilla de grasa inguinal y se extrajo el tejido implantado a los 32 días después (Figura 6E). Los análisis por FACS revelaron que los osículos derivados de BMP2 incorporaron claramente tanto osteocitos derivados de Tie2 GFP positivos con canalículos visibles (Figura 6F, inserto de gran aumento) como osteocitos RFP marcados Tie2 negativos (Figuras 6F). Este descubrimiento sugiere que tanto los linajes Tie2 positivos como los Tie2 negativos se sometieron a reprogramación esquelética inducida por BMP2. De acuerdo con estas observaciones, las células Tie2(+)PDGFR<(+) y Tie2(-)PDGFR<(+) subcutáneas expresaron altos niveles de BMPRIa, que es un receptor primario para la señalización de BMP2 (Figura 7D).

Estos datos sugieren que diversos tipos celulares podrían ser inducidos por BMP2 para iniciar la formación de mSSC. La coadministración de inhibidor de VEGF y BMP2 es suficiente para inducir de novo la formación de cartílago articular en el tejido adiposo. Aunque el propio hueso posee capacidad regenerativa, la capacidad para la regeneración en otros tipos de tejidos esqueléticos, tales como cartílago, es muy baja. Como se ha descrito anteriormente, el bloqueo de VEGF estimula indirectamente a las mSSC para formar cartílago (Figura 5 AC). Ya que la inducción de BMP2 podría estimular la expansión y la formación de mSSC (Figura 3G-H, Figura 6C), especulamos que la capacidad de inducción de mSSC de BMP2 podría acoplarse con el bloqueo de VEGF para dirigir de novo la formación de cartílago.

Para ensayar esta posibilidad, implantamos esponjas de colágeno tratadas con BMP2 dentro del tejido adiposo de ratones que se habían tratado 24 horas antes con o bien administración intravenosa de Ad sVEGFRI como en la Figura 5, o sVEGFRI ECD soluble incluido (50 jg ) directamente en la esponja de colágeno (Figura 7A). Un mes después de que se explantaron la esponja y el tejido circundante. BMP2 sola generó tejido óseo con actividad hematopoyética (Figura 7B: panel izquierdo). Sin embargo, BMP2 con inhibición de VEGF sistémica o local dio como resultado la formación de cartílago predominante (Figura 7B: panel derecho). Como el cartílago natural en la oreja de ratón, este cartílago inducido contenía una alta frecuencia de CCP detectada por FACS (Figura 7C). Este cartílago probablemente deriva de la reprogramación de novo del tejido adiposo en destinos condrogénicos puesto que el tejido adiposo nativo normalmente expresa niveles muy bajos a indetectables de genes asociados a condrogénesis, tales como Sox9 o Runx2 (Figuras 7E).

Las vías genéticas necesarias para el mantenimiento de células madre/progenitoras postembrionarias de tejidos esqueléticos y cómo se coordinan al nivel de célula madre para mantener el patrón esquelético durante el crecimiento esquelético y la regeneración son poco conocidas. Par complicar más el asunto, continua una considerable incertidumbre en cuanto a los orígenes y las identidades de los progenitores esqueléticos y su relación lineal con una célula madre mesenquimal prototípica, que se ha propuesto como un progenitor ubicuo para diversos tipos de tejido mesenquimal, que incluyen hueso, músculo, cartílago y grasa. Usando un modelo de "ratón Rainbow" transgénico para el trazado genético in vivo de los tejidos clonalmente derivados, encontramos que los tejidos de hueso, cartílago y estromal están en realidad clonalmente relacionados. Por el contrario, encontramos poca evidencia de que compartan los mismos orígenes clonales que la grasa, los vasos sanguíneos o el tejido esquelético muscular, lo que supone que estos tejidos probablemente surgen de sus propias células madre/progenitoras distintas tras la embriogénesis.

Identificación de las células madre/progenitoras esqueléticas postnatales y definición del árbol de linaje de célula madre esquelética. Después de identificar la existencia de poblaciones clonales que dan lugar a tejido esquelético (hueso, cartílago y estromal), compilamos un mapa de linaje de células madre/progenitoras prospectivamente aisladas con anticipación con potencial esqueletogénico para ayudar a resolver la incertidumbre en cuanto a las relaciones de linaje entre las células madre y progenitoras esqueléticas (Figura 2G). Este mapa de linaje consiste en ocho subpoblaciones celulares diferentes con distintas propiedades esqueletogénicas. Algunas de estas subpoblaciones tienen características de tipos celulares esqueletogénicos recientemente descritos que se identificaron por trazado de linaje genético (véase Park et al. (2012) Cell stem cell 10, 259-272; Mendez-Ferrer et al. (1998) Radiographics: a reviewpublication o f the Radiological Society o f North America, Inc 18, 1125-1136; Zhou et al. (2014) Cell stem cell 15, 154-168).

Por ejemplo, el subtipo Thy expresa selectivamente altos niveles de CXCL12, receptor de leptina, y nestina, que son característicos de células reticulares CXCL12 abundantes, células que expresan el receptor de leptina (LepR+), y células madre mesenquimales que expresan Nestina, respectivamente. A diferencia de la publicación reciente de que las células LepR+ en la médula ósea adulta son la fuente principal de hueso y tejido adiposo postnatalmente, nuestros resultados indican que las mSSC neonatales no expresan LepR. Asimismo, notamos que las mSSC y su progenie dan lugar únicamente a tejido esquelético pero no adiposo. También encontramos que las poblaciones Nestina-cre y Mx1-cre marcadas se superponen con la población de mSSC.

Este trabajo representa la primera publicación de una célula madre esquelética postnatal y sus progenitores posteriores. Mecanísticamente, la expansión de mSSC y la autor renovación deben estar firmemente controladas, evidenciado por la expresión de numerosos receptores cognados con las moléculas de señalización que pertenecen a la mayoría de las vías de señalización conocidas que incluyen Hedgehog, BMP, FGF, TGF, Notch, etc. BMP2 en particular es suficiente para expandir mSSC en cultivo. Tanto BMP2 como 4 se expresan por mSSC y la mayoría de los subconjuntos derivados de mSSC, donde probablemente median la supervivencia y la expansión por tanto bucles autocrinos como paracrinos. Por el contrario, la progenie posterior de las mSSC tales como las poblaciones Thy como BLSP también expresan nogina y/o gremlin-2, que antagonizan la señalización de BMP. Esto sugiere que mSSC y alguna de su progenie forman una parte de su propio nicho, manteniendo los niveles críticos de los pro factores de supervivencia tales como BMP2 pero manteniendo también el crecimiento esquelético en el control antagonizando la señalización de BMP. Estas señales inhibidoras pueden representarse tras la lesión, por ejemplo, observamos que hay notable amplificación del número de SSC tras la fractura femoral inducida, que es la más marcada en las fases tempranas de la curación de la fractura.

Dirección de la determinación de destino de mSSC de hueso a cartílago. La señalización antagonista entre subconjuntos esqueléticos derivados de mSSC parece ser un mecanismo clave en el compromiso de linaje de los subconjuntos esqueléticos, particularmente a destino de hueso o de cartílago. Cuando antagonizamos la señalización de VEGf en los progenitores esqueléticos tempranos, los destinos de hueso se inhibieron en favor de los destinos de cartílago. No obstante, no observamos expresión significativa de VEGF o los receptores de VEGF en las mSSC o los subconjuntos esqueléticos posteriores. En cambio, vemos que expresan los homólogos de VEGF y VEGFR, PIGF y neuropilina, respectivamente.

Al dirigir la determinación del destino del progenitor esquelético de cartílago a hueso, la señalización de WNT también juega un papel en la determinación de la formación de hueso frente a cartílago, específicamente en favor de hueso. La alteración de la señalización de WNT en una subpoblación particular puede dirigir el destino esquelético de otras subpoblaciones en el microambiente. Por ejemplo, encontramos evidencia de que la señalización de WNT en BCSP que se trasplantaron conjuntamente con CCP (es decir, progenitores de cartílago comprometidos), hizo que estas últimas formaran hueso en lugar de cartílago cuando se dispusieron bajo la cápsula renal. Los destinos de cartílago pueden fomentarse por antagonismo de WNT y que esto podría mediarse por las subpoblaciones de mSSC, BCSP y 6C3+, que expresan altos niveles de SFRP-2, un antagonista endógeno de la señalización de WNT canónica (Figura 3D).

Las afecciones patológicas que implican calcificación de tejidos cartilaginosos, tales como osteoartritis, podrían ser el resultado de los defectos en el nicho de mSSC, posiblemente debido a la activación de la señalización de WNT y la promoción resultante de la osteogénesis.

Condujimos el análisis de la expresión génica de múltiples subconjuntos de célula madre y progenitora hematopoyética altamente purificados incluyendo HSC, y los progenitores comprometidos de los principales linajes hematopoyéticos y encontramos que los progenitores hematopoyéticos expresan innumerables factores asociados con la esqueletogénesis, que incluyen BMP2, BMP7, TGFbl y Wnt3a (Tabla 1).

T l 1 Ex r i n f r h m i r r ni r l i *

Los receptores cognados de estos factores son altamente expresados por mSSC y progenitores derivados esqueléticos (Figura 3D-E). Curiosamente, mientras la progenie generada de mSSC, tal como Thy y BLSP, expresa selectivamente receptores para hormonas sistémicas circulantes, tales como leptina, testosterona, ghrelina y hormona estimulante de la tiroides, estos receptores no se expresan altamente en HSC o subconjuntos hematopoyéticos (Tabla 2).

*

Por tanto, las células estromales derivadas de mSSC constituyen una regulación endocrina sistémica ligada a interfaz celular para tanto el sistema esquelético como el hematopoyético.

La determinación de la actividad y el destino de la mSSC depende del origen esquelético. Nuestros análisis han establecido un marco para examinar el circuito genético que guía el desarrollo esquelético postnatal al nivel de célula madre. Las mSSC se encargan del mantenimiento de la forma del sistema esquelético durante el crecimiento y su recuperación después de la lesión. Las diferencias en la actividad de las mSSC puede ser la base de muchas diferencias en las formas esqueléticas. De acuerdo con esta posibilidad, encontramos que las mSSC son funcionalmente heterogéneas, y hay diferencias sustanciales en la frecuencia de mSSC, el potencial formador de colonia, y el potencial de linaje que dependen de los tipos de huesos de los que se extrajeron (Figura 14).

Alteración de la señalización del nicho extraesquelético para inducir la osteogénesis y la condrogénesis. Puesto que la mayoría de los órganos están compuestos de múltiples tipos de tejido, el nicho de la célula madre puede coordinar la actividad de diferentes progenitores residentes específicos a tejido. La modulación de la señalización del nicho puede estimular el crecimiento tisular mediante la inducción de la proliferación de las células madre, como ya hemos observado con las células madre esqueléticas y se han descrito en el sistema hematopoyético. Las interacciones del nicho también pueden jugar papeles significativos en el mantenimiento del compromiso del linaje, por ejemplo, altos niveles de la señalización de BMP2 pueden dominar la señalización microambiente de adiposo local y volver a especificar los subconjuntos Tie2(+) y Tie2(-) residentes para someterse a osteogénesis. Las interacciones de nicho también pueden determinar el destino de las mSSC. Al implantar esponjas de colágeno tratadas con BMP2 en sintonía con la aplicación sistémica o local del receptor de VEGF soluble, demostramos que el cartílago puede inducirse para formarse enteramente por manipulación de las vías de señalización locales en el tejido extraesquelético.

La inducción de la formación de mSSC con factores solubles y posteriormente la regulación del nicho de mSSC para controlar su diferenciación hacia las células de hueso, cartílago o estromales representa un cambio de paradigma en la regeneración terapéutica de los tejidos esqueléticos. Esta modalidad terapéutica también se puede extender al sistema hematopoyético codependiente incluso cuando los niveles residentes de las mSSC endógenas se han reducido por la enfermedad o el envejecimiento.

Procedimientos experimentales. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, a menos que se indique lo contrario. Los experimentos animales incluían una cohorte de al menos tres animales en cada grupo experimental y, al menos, tres sujetos control. Para los experimentos de trasplante, se cogieron 7-10 ratones P3 para cada trasplante de mSSC/progenitora (por ejemplo, se cogieron de 7-10 ratones para obtener 20.000 células madre/progenitoras para posterior trasplante como se ha detallado a continuación).

Ratones. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones para animales de laboratorio de la Universidad de Stanford de acuerdo con "Stanford Animal Care and Use Committee" y "National Institutes of Health guidelines". C57BL/Ka-Thy1.1-CD45.1 (HZ), C57BL/Ka-Thy1.1-CD45.1 (BA), C57BL/Ka-Thy1.2-CD45.1 (Ly5.2) y C57BL/Ka-Thy1.2-CD45.1 (B6), Rag-2/gamma(c)KO, C57BL/6-Tg(CAGEGFP) 10sb/J, Mx1Cre se derivaron y mantuvieron en nuestro laboratorio. Se obtuvieron ratones Rosa-Tomato Red RFP y Tie2Cre de Jackson Labs y se estableció una colonia de cría. Los ratones mTmG fueron un regalo de Liqun Luo. Los ratones se alojaron en microaisladores estériles y se les dio agua y comida de roedor ad libitum.

Sistema de ratón Rainbow. Utilizamos un modelo "ratón Rainbow" para evaluar las relaciones de linaje clonales in vivo para determinar si los tejidos mesenquimales en hueso, incluyendo estroma, grasa, hueso, cartílago y músculo comparten un progenitor común. El ratón indicador Rainbow (R26VT2/GK3), que nos posibilita trazar las células individuales del tejido esquelético en extremidades in vivo durante largos periodos de tiempo, es un sistema marcador dependiente de Cre multicolor que porta una construcción indicadora de cuatro colores (verde, azul, amarillo, rojo) dentro del locus de ROSA. Después de la recombinación, cada célula se marca aleatoriamente y permanentemente (genéticamente) con uno de los cuatro colores, dando como resultado un patrón fluorescente mosaico dentro de los tejidos. Las células hijas mantienen el mismo color que la célula de origen, de modo que los productos de las divisiones clonales pueden visualizarse como regiones que se expanden de un color único. Los ratones Rainbow se cruzaron con el conductor ActinaCreER ubicuo con el objetivo de marcar universalmente, y trazar clonalmente, todas las células dentro de los tejidos esqueléticos después de la administración de tamoxifeno. A pesar de la oportunidad de que dos células adyacentes se coloreen igualmente, nuestro laboratorio y otros grupos han encontrado que el trazado del linaje durante largos periodos de tiempo descubre una lectura celular leal a la observada usando indicadores específicos a tejido o específicos a célula madre. Asimismo, ya que este ensayo puede usarse ampliamente para trazar todos los tipos celulares, permite el análisis clonal de incluso células madre de tejido raras y todavía no identificadas que pueden activarse durante el desarrollo embrionario/postnatal que no se descubrirían usando los indicadores de célula madre existentes.

Para contar con precisión los clones, utilizamos la plataforma de análisis del programa informático Image J (National Institute of Health, Bethesda). Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) La citometría de flujo se realizó en FACS Aria II en la instalación de FACS compartida en el "Lokey Stem Cell Institute", los detalles del perfil de clasificación se detallan a continuación y se ilustran en la Figura 1B, Figura 1E, Figura 6B, Figura 6D, Figura 7C y Figura 13.

Aislamiento y trasplante de progenitores esqueléticos adultos y fetales. Los tejidos esqueléticos se diseccionaron de ratones GFP marcados P3 y se diseccionaron por disociación mecánica y enzimática. Específicamente, el tejido se colocó en tampón de digestión de colagenasa suplementado con ADNasa y se incubó a 37 °C durante 40 minutos bajo agitación constante. Después de la digestión por colagenasa y la neutralización, los materiales no digeridos se trituraron suavemente por pipeteo repetido. Las células disociadas totales se filtraron a través de una malla de nailon de 40 m, se sedimentaron a 200 g a 4 °C, se resuspendieron en medios de tinción (suero fetal de ternero al 2 % en PBS), se bloquearon con IgG de rata y se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD45, Tie2, integrina AlfaV, CD105, Thy1.1, Thy 1.2, 6C3 y CD200 para el fraccionamiento por clasificación celular activada por fluorescencia.

Los progenitores esqueléticos clasificados y no clasificados se sedimentaron, se resuspendieron en 2 ml de matrigel, a continuación, se inyectaron debajo de la cápsula renal de ratones Rag-2/gamma(c)KO inmunocomprometidos anestesiados de 8-12 semanas de vida. Los huesos de ratones de adultos de 6 semanas de vida GFP marcados se diseccionaron, se machacaron suavemente en mortero, y posteriormente se digirieron en tampón de colagenasa con ADNasa a 37 °C durante 40 minutos bajo agitación constante. Después de este tratamiento con colagenasa, los materiales no digeridos se trituraron suavemente por pipeteo repetido. Las células disociadas totales se filtraron a través de una malla de nailon de 40 pm, se sedimentaron a 200 g a 4 °C, se resuspendieron en medios de tinción (suero fetal de ternero al 2 % en PBS), se bloquearon con IgG de rata y se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD45 (Biolegend, San Diego, CA), Tie2 (eBioscience, San Diego, CA), integrina AlfaV (eBioscience, San Diego, CA), CD105 (eBioscience, San Diego, CA), Thy1.1 (eBioscience, San Diego, CA), Thy 1.2 (eBioscience), 6C3 (Biolegend, San Diego, CA) y CD200 (Biolegend, San Diego, CA) para la purificación por clasificación por citometría de flujo.

Se aislaron CCP para experimentos de cotrasplante con BCSP del esternón y de la oreja donde están presentes en las más altas frecuencias. Se usó CD200 para enriquecer las CCP para la mayoría de estos experimentos. Los progenitores esqueléticos clasificados y no clasificados se sedimentaron y se resuspendieron en 2 ml de matrigel, a continuación, se inyectaron debajo de la cápsula renal de ratones Rag-2/gamma(c)KO anestesiados de 8-12 semanas de vida. En experimentos iniciales, notamos que la primera población esqueletogénica de las extremidades fetales era triple negativa para Thy, 6C3 y CD105. La célula "triple negativa" (TN) dio lugar a células CD105+, y Thy y 6C3+/- in vitro e in vivo y también se auto renueva al menos in vitro. Por lo tanto, la población TN fue nuestra primera nomenclatura para la mSSC y estos resultados se muestra en los datos transcripcionales de micromatriz. Observamos que CD200 parece refinar la actividad de la unidad formadora de colonia de la TN y, por tanto, se realizaron experimentos recientes que incluían la secuenciación de ARN de célula individual sobre las mSSC con el inmunofenotipo descrito en la Figura 2G. De manera similar, el inmunofenotipo del progenitor de cartílago comprometido (CCP) se refinó con la observación de la importancia de CD200 en subfraccionamiento adicional de las células madre/progenitoras esqueletogénicas.

Perfil de expresión transcripcional. Realizamos análisis de micromatriz sobre las poblaciones de mSSC doblemente clasificadas, altamente purificadas, BCSP, Thy(+), 6C3(+), HEC y las poblaciones estimulantes de linfocito B (BLSP) de células estromales mesenquimales de médula ósea y HSC, MEP, GMP y CLP. Cada población se clasificó en clasificaciones independientes usando células aisladas de ratones de 3 días postnatales. El ARN se aisló con Micro kit RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. El ARN se amplificó dos veces con un kit de amplificación de ARN RiboAmp ((Arcturus Engineering, Mountain View, CA). El ARNc amplificado se marcó con estreptavidina, se fragmentó, y se hibridó con matrices Affymetrix 430-2.0 como era recomendado por el fabricante (Affymetrix, Santa Clara). Las matrices se escanearon con un Gene Chip Scanner 3000 (Affymetrix) que funcionaba con el programa informático GCOS 1.1.1. Los datos de micromatriz brutos se sometieron a "Gene Expression Commons", donde se calculó la normalización de datos frente a la Referencia Común, que es una gran colección (n = 11.939) de datos de micromatriz públicamente disponibles del "National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus" (NCBI GEO). El metanálisis de la Referencia Común también proporciona el intervalo dinámico de cada conjunto de sonda en la matriz, y, en situaciones donde hay múltiples conjuntos de sonda para el mismo gen, se usó el conjunto de sonda con el mayor intervalo dinámico para el análisis. El "Affymetrix Mouse Genome 4302.0 Array" incluye 45.101 conjuntos de sondas, de los cuales 17.872 genes anotados son medibles. Los mapas de calor que representan el "fold change" de la expresión génica se generaron en "Gene Expression Commons". La comparación estadística al nivel de la vía se realizó usando el programa informático "Ingenuity Pathway Analysis" (IPA, Ingenuity Systems, Qiagen, Redwood City, CA).

Análisis histológico de osificación endocondral. Los especímenes diseccionados se fijaron en PFA al 2 % a 4 °C durante una noche, a continuación, se descalcificó en EDTA 0,4 M en PBS (pH 7,2) a 4 °C durante 2 semanas. A continuación, los especímenes se procesaron para incrustarlos en parafina (mediante deshidratación en alcohol o xileno) u OCT (por crioprotección en sacarosa) y se seccionaron. Las secciones representativas se tiñeron con colorantes Hematoxilina y Eosina recién preparada, Pentacromo modificado de Movat, o Rojo Alizarina dependiendo del experimento individual.

Inmunofluorescencia. Se realizó inmunofluorescencia sobre especímenes de hueso ectópico crioconservados usando un kit de inmunodetección M.O.M (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los especímenes se trataron con un reactivo de bloqueo, a continuación, se sondaron con anticuerpo monoclonal a 4 °C durante una noche. A continuación, los especímenes se lavaron con PBS, se sondaron con anticuerpos conjugados con colorante alexa, se lavaron, se taparon con un cubre objetos, y se generó una imagen con un sistema de microscopio invertido Leica DMI6000B. La inmunofluorescencia sobre especímenes de célula cultivada de tejido se realizó igual que los especímenes crioconservados usando un kit de inmunodetección M.O.M (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células cultivadas en placas de cultivo de 6 pocilios a 96 pocilios se lavaron con PBS y se fijaron en PFA al 2 % a 4 °C durante una noche. Los especímenes se trataron con un reactivo de bloqueo, a continuación, se sondaron con anticuerpo monoclonal a 4 °C durante una noche. A continuación, los especímenes se lavaron con PBS, se sondaron con anticuerpos conjugados con colorante alexa, se lavaron, se sumergieron en PBS y se generó una imagen con un sistema de microscopio invertido Leica DMI6000B.

Los anticuerpos monoclonales para los siguientes antígenos de ratón se obtuvieron de diversos proveedores (con cada respectivo proveedor enumerado entre paréntesis tras el antígeno): colágeno II de ratón (Abcam, Cambridge, MA), osteocalcina (Abcam, Cambridge, MA), perilipina A (Chemicon / EMD Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), CD31 (Abcam, Cambridge, MA), CD45 (Biolegend, San Diego, CA), Receptor de leptina (R&D, Minneapolis, MN), gremlin 2 (Biorbyt LLC, San Francisco, c A), Foxa2 (Abcam, Cambridge, MA), 6C3 (Abcam, Cambridge, MA), Thy (Abcam, Cambridge, MA), DAPI (Abcam, Cambridge, MA) y CD31 (Abcam, Cambridge, MA). Los anticuerpos secundarios conjugados con colorante Alexa se adquirieron en Molecular Probes (Molecular Probes, Eugene, Oregón).

Cultivo celular. Los progenitores esqueléticos se cultivaron in vitro en medio MEM alfa con FCS al 10 %, Penicilina-Estreptomicina al 1 % bajo condiciones de O²bajo (2 % de oxígeno atmosférico, 7,5 % de CO²). Los recipientes de cultivo primero se recubrieron con Gelatina al 0,1 %. Las células cultivadas se recogieron para análisis o paso mediante incubación con M199 con 2 mg/ml de Colagenasa II (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri). Para los ensayos de formación de colonia de mSSC, se clasificaron células individuales en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 2 semanas. En este momento, los especímenes se examinaron bajo microscopía de fases y se usó un anillo de clonación para la cuantificación. Posteriormente, las células se recogieron para tinción y análisis por FACS.

Parabiosis. La parabiosis se realizó como se describe. Brevemente, para la parabiosis se seleccionaron ratones emparejados por edad y sexo de ratones GFP y no GFP de idéntico origen B6/Ka. Los ratones se anestesiaron con anestesia inhalada. Se realizó una incisión en la piel desde la base de la pata delantera a la base de la pata trasera en el lado derecho de un parabionte y el lado izquierdo del compañero. Las patas delanteras y traseras se suturaron juntas en las articulaciones mientras que los pliegues dorsal-dorsal y ventral-ventral de los colgajos de la piel se graparon juntos. La anestesia se administró después de la operación. Después de dos semanas de parabiosis, se recolectaron muestras periféricas de la cola y se evaluó el quimerismo de la sangre del parabionte por FACS. Los implantes de BMP2-colágeno se trasplantaron dentro de la grasa subcutánea de la almohadilla de grasa inguinal a la tercera semana después de que el quimerismo de la sangre periférica haya alcanzado una relación de 1:1 que indica fusión completa del sistema circulatorio entre los parabiontes.

Osteoinducción in vivo con BMP2. Se resuspendieron 10 pg de rhBMP2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) en 30 pl de tampón filtrado estéril (glutamato de sodio 30 mM, glicina al 2,5 %, sacarosa al 0,5 %, Tween 80 al 0,01 %, pH 4,5), a continuación, se aplicó a una esponja de colágeno (Helistat, Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ) de 3x1.5x1.5 cm de dimensiones. La esponja se liofilizó y se trasplantó dentro de ratones anestesiados debajo de la piel, dentro de la cápsula renal, o dentro de los músculos del muslo posterior.

Ensayos de suplemento (TGFp, BMP-2, TNFa) de cultivo in vitro. Se cultivaron conjuntamente cinco mil mSSC (derivadas de un ratón GFP marcado) con o bien medios regulares [medio MEM alfa con FCS a 10%, Penicilina-Estreptomicina al 1 %], o medios regulares suplementados con TGFp (5 ng/ml), BMP-2 (100 ng/ml) o TNFa (10 ng/ml) en condiciones de bajo O²(2 % de oxígeno atmosférico, 7.5 % de CO²). 14 días después del cultivo, las células se recogieron usando tampón de digestión de colagenasa (como anteriormente) para tinción y análisis FACS.

Generación de medios acondicionados de poblaciones Thy(+), BLSP tratadas con leptina. Se cultivaron diez mil células Thy (+) y BLSP recién aisladas durante tres días en medios regulares hasta que se alcanzó confluencia celular del 80 %. En esta fase, los medios se cambiaron a medios sin suero suplementados con los siguientes tres factores de crecimiento: IGF (125 ng/ml), FGF2 (100 ng/ml) y Sulfato de heparina (10 U/ml) que se suplementaron con o sin leptina recombinante (1 pg/ml). Las células se cultivaron posteriormente durante 14 días, en dicho momento se recogieron los medios acondicionados. A continuación, se sembraron en placa 10.000 mSSC recién clasificadas en diferentes condiciones: (i) medios reguladores control; (ii) medios acondicionados del subconjunto Thy(+) tratado con leptina; (iii) medios acondicionados del subconjunto Thy(+) tratado con medios sin suero; (iv) medios acondicionados del subconjunto BLSP tratado con leptina y (v) medios acondicionados del subconjunto BLSP tratado con medios sin suero. A continuación, estas células se recolectaron para el análisis por FACS para determinar el número de mSSC presente tras el cultivo en los medios experimentales/control.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa. El ARN de las células cultivadas se extrajo usando el Mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizó transcripción inversa y la expresión génica se examinó por reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) usando el sistema de detección de secuencia aplicado Applied Biosystems Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) y mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems). La cantidad de producto de la PCR se calculó usando la curva patrón de GAPDH externa y el programa informático LightCycler. Todos los valores se normalizaron basándose en la expresión de GAPDH en las correspondientes muestras. Los cebadores específicos para los genes examinados (Nogina, Gremlin 2, Receptor de leptina) estaban basados en su secuencia de PrimerBank.

Inhibición de la señalización de VEGF. (i) Inhibición de VEGF sistémica. Para estudiar la inhibición sistémica de la señalización de VEGF, se inyectaron intravenosamente 109 ufp de los vectores adenovíricos que codificaban el ectodominio VEGFR1 murino soluble (Ad sVEGFR1) a los ratones receptores designados 24 horas antes del trasplante, conduciendo a infección hepática y secreción de este fuerte antagonista de la señalización de VEGF/PIGF en la circulación. Para un control negativo, se usó el adenovirus que codifica un fragmento de inmunoglobulina IgG2< Fc murina (Ad Fc). Estos reactivos se describen en otra parte. (ii) Inhibición de VEGF local. Para estudiar la inhibición local de la señalización de VEGF, se dispusieron 50 |jg de VEGFR1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) dentro de la grasa subcutánea de la almohadilla de grasa inguinal junto con una esponja de colágeno que contenía 3 jg de BMP2 recombinante liofilizada.

Fractura femoral. Se realizó una incisión desde el doblez de la ingle hasta la rodilla del fémur derecho. Tras la dislocación patelar manual, se insertó una vara medular en el fémur de los ratones tipo silvestre C57BL6 de 8 semanas de vida anestesiados. Se creó una fractura de la diáfisis media transversal bicortical usando unas microtijeras rectas. La rótula se recolocó manualmente y se dispuso una sutura para prevenir la posterior dislocación. Se cerró la incisión de la piel con suturas de nailon y los ratones recibieron analgesia postoperatoria. Los ratones se sacrificaron en el día 3, día 7 y el día 21 después de la disposición de la fractura. Se extrajeron los callos y se aislaron las células constitutivas por disociación mecánica y enzimática y el posterior fraccionamiento por FACS, como se ha detallado anteriormente. El fémur izquierdo ileso actuó como el control, fémur ileso. Irradiación de la pata trasera. Los ratones C57BL6 de 8 semanas de vida se dispusieron en un escudo de radiación, de modo que únicamente estaban expuestas a radiación las patas traseras. Los ratones recibieron una dosis única de 800 rads (8 Gy) a las patas traseras bilaterales. La disposición quirúrgica de la fracturas (como se ha descrito anteriormente) se realizó 12 horas después de la irradiación.

Secuenciación de ARN de célula individual. La secuenciación de ARN de célula individual se realizó como se ha descrito previamente.

Ejemplo 2

SSC HUMANA

Como se analiza en el Ejemplo 1, usando un modelo de "ratón Rainbow" transgénico (para el trazado in vivo de los tejidos clonalmente derivados), encontramos que los tejidos de hueso, cartílago y estromal están clonalmente relacionados en los ratones. Por el contrario, no encontramos evidencia de que compartan los mismos orígenes clonales que la grasa, los vasos sanguíneos o el tejido esquelético muscular, lo que implica que los tejidos de hueso, cartílago y estromal surgen de sus propias células madre/progenitoras distintas tras la embriogénesis. Nuestros datos de célula madre/progenitora esquelética humana demuestran la existencia de las hSSC y sus células progenitoras posteriores en tanto tejido esquelético fetal como adulto.

Los análisis incluyen estudios genómicos, potencial de diferenciación, trazado de linaje realizado sobre células primarias recién aisladas de tanto tejido humano fetal como adulto. Se determinó que la localización subcapsular en el riñón es un sitio extraesquelético novedoso para el injerto de células esqueletogénicas trasplantadas. La incorporación de estas técnicas define un ensayo funcional para examinar el potencial de destino de subconjuntos celulares aislados con anticipación específicos de células madre/progenitoras en un estudio de ratón. El trasplante de la cápsula renal subcapsular de las células previamente ha permitido la identificación de (i) los componentes celulares mínimos del nicho de la médula ósea requerido para soportar las HSC adultas y (ii) un subconjunto celular de huesos de las extremidades fetales de ratón con la capacidad de iniciar la formación de un nicho HSC completamente funcional. Las condiciones se optimizaron para someter a transducción progenitores esqueléticos fetales y adultos recién aislados con los vectores lentivíricos, posibilitando tanto la vigilancia de los subconjuntos celulares en un modelo de xenoinjerto como la evaluación de las vías genéticas claves usando tanto los planteamientos de disminución de la expresión como sobreexpresión, habilidad técnica que es integral para el análisis de célula humana.

La identificación de la célula madre esquelética humana (hSSC) y sus progenitores restringidos a linaje posteriores. La estrategia descrita en el Ejemplo 1 se usó para purificar poblaciones esqueletogénicas específicas de tejido esquelético fetal humano por aislamiento anticipado usando FACs . Aislamos células de las placas de crecimiento de fémures fetales humanos de 17 semanas por disociación mecánica y enzimática y analizamos en ellas los marcadores de superficie correspondientes a aquellos presentes en los linajes (CD45, CD235, Tie2, CD31) (Figura 16 a-c). Al trasplantar las células esqueléticas fetales humanas disociadas a cápsula renal de ratón en ratones inmunodeficientes, confirmamos que únicamente las células negativas para CD45, CD235, Tie2 y CD31 poseían la actividad esqueletogénica intrínseca cuando se trasplantaban in vivo (Figura 16c, Panel derecho).

El análisis de la expresión génica en células esqueléticas fetales disociadas [CD45(-)CD31(-)Tie2(-)CD235(-)] identificó los marcadores adicionales entre los que se incluyen CD146, PDPN, CD73 y CD164 que separaron más las células femorales fetales humanas en distintas poblaciones, que, a continuación, trasplantamos dentro de la cápsula renal para determinar su potencial esqueletogénico intrínseco (Figura 16b-c). Encontramos que la placa de crecimiento tenía una alta frecuencia de células [CD45-CD235-Tie2-CD31-PDPN+CD146-], a continuación en el presente documento, denominadas células [PDPN+/146-] que mostraban expresión diferencial de CD164 y CD73. La expresión diferencial de estos marcadores nos posibilita además subfraccionar la población [PDPN+/146-] en tres poblaciones: un subconjunto unipotente capaz de condrogénesis [PDPN+CD146-CD73-CD164-], una subpoblación celular unipotente capaz de osteogénesis [PDPN+CD146-CD73-CD164+] y una célula multipotente [PDPN+CD146-CD73+CD164+] capaz de osificación endocondral (hueso y cartílago).

Entre las distintas poblaciones examinadas, el subconjunto [PDPN+CD146-CD73+CD164+] selectivamente da lugar a la frecuencia más alta de unidades formadoras de colonias (UFC). Además, tras los ensayos de formación de colonia in vitro, encontramos que las células [PDPN+CD146-CD73+CD164+] aisladas de nuevo de estas colonias poseen capacidad formadora de UFC en serie. Por tanto, nuestros datos muestran que las células [PDPN+CD146-CD73+CD164+] poseen la capacidad de contraste de las células madre para auto renovarse in vitro.

Importantemente encontramos que las células [PDPN+CD146-CD73+CD164+] pueden aislarse de los especímenes de cabeza femoral adultos recolectados después de los procedimientos de reemplazo de cadera en pacientes de 38 73 años de edad. Por tanto, los procedimientos de reemplazo de cadera son muy comunes y se practican de manera rutinaria en la mayoría de los centros médicos en el mundo, los especímenes de cabeza femoral constituyen una fuente fácilmente accesible para que el material tome parte en la investigación de SSC y para el uso clínico (Figura 16d y e). Las células [PDPN+CD146-CD73+CD164+] derivadas tanto fetales como adultas son capaces de dar lugar todos los otros subconjuntos esqueléticos in vitro (Figura 17a-b).

Hemos trazado además la actividad esqueletogénica clonal de [PDPN+CD146-CD73+CD164+] hSSC in vivo. Seguimos la formación clonal in vivo de las hSSC que se sometieron a transducción con vectores de ontología génica lentivírica (LeGO) que codificaban proteínas fluorescentes rojas, verdes o azules (RGB). De acuerdo con el modelo de color aditivo, las marcadas RGB marcadas individuales muestran una gran variedad de colores únicos y altamente específicos. Los códigos de color permanecen estables después de la división celular y, por tanto, facilitan el trazado clonal in vivo e in vitro (Figura 17c). Los datos demuestran que las hSSC tras la transducción lentivírica pueden formar clones tanto in vitro como in vivo (Figura 17d-e).

Los datos humanos de tejido tanto fetal como adulto indican un precursor clonal de auto renovación de hueso, cartílago y estroma (hSSC, hSSC) in vitro, definidos por el siguiente inmunofenotipo [PDPN+CD146-CD73+CD164+]. Los resultados indican que los progenitores esqueletogénicos humanos son diversos, con distintos perfiles de marcador de superficie y destinos esqueléticos, como en hematopoyesis. Las hSSC derivadas adultas y fetales se aíslan con anticipación para el análisis funcional por trasplante a la cápsula renal para ensayar su potencial esqueletogénico intrínseco, y también a la cavidad femoral de ratones inmunodeficientes para evaluar de nuevo su potencial de diferenciación en el contexto de un microambiente esqueletogénico normal.

La plataforma de "Gene Expression Commons" normaliza los datos de micromatriz de ARN frente a la "Refencia Común", que es una gran colección (n = 11.939) de datos de micromatriz públicamente disponibles del "National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus". Este sistema algorítmico innovador posibilita la identificación de los marcadores de superficie celular adicionales para correlacionar genes asociados osteoblásticos, condrogénicos o fibroblásticos con proteínas marcadoras de superficie específicas. Estos marcadores pueden resolver distintos subconjuntos de progenitor con capacidades de formación de colonia características y destinos de desarrollo. El destino de desarrollo de las células progenitoras esqueletogénicas nuevamente resueltas en el mapa de linaje de SSC humana para diferenciarse en tejido esquelético in vivo se determina trasplantándolas debajo de la cápsula renal en un modelo de xenoinjerto de ratón. La células madre/progenitoras esqueléticas recién aisladas se someten a transducción con vectores lentivíricos y se hizo un seguimiento de la clonalidad de cada célula trasplantada in vivo (Figura 17d).

Se predice que las hSSC [PDPN+CD146-CD73+CD164+] generan linealmente todas las subpoblaciones de progenitor a través de una secuencia de fases tanto in vitro como in vivo (Figura 18). Para evaluar el potencial comparativo de los subconjuntos de progenitor esquelético humano individuales para generar un subtipo posterior, se ensayan células madre y progenitoras lentivíricamente marcadas, purificadas por FACS, de fémures a las 17 semanas de gestación y cabezas femorales adultas tanto (i) in vitro como (ii)in vivo.

In vitro: Las hSSC recién clasificadas lentivíricamente marcadas individuales se trasplantan (junto con 5.000 células de hueso fetales disociadas no marcadas como alimentadores) en la cápsula renal durante un periodo de 14 días, en dicho momento se explantan, se vuelven a fraccionar por FACS y posteriormente se vuelven a trasplantar debajo de la cápsula renal para la lectura funcional. Los datos indican que las hSSC tanto se auto renuevan como se diferencian en los ensayos de formación de colonia seriales (Figura 17d y e). Se espera que las hSSC, tras la siembra en placa de célula sencilla, (i) generen los progenitores posteriores linealmente y (ii) tanto se auto renueven como se diferencien en los ensayos de formación de colonia en serie, conforme a las características de célula madre.

In vivo: se trasplantan 2.000 hSSC fetales y adultas recién aisladas en la cápsula renal de ratones RAGy, a continuación, los progenitores injertados se explantan 2/4/8 semanas o 6 meses después del trasplante para análisis. Los datos indican que los progenitores esqueléticos humanos xenoinjertados primitivos pueden generar células maduras de hueso, cartílago y estromales capaces de soportar las HSC en 4 semanas de trasplante debajo de la cápsula renal. El destino del desarrollo de los injertos humanos se muestra por análisis histológico usando tinción con Pentacromo de Movat que diferencia los tejidos de hueso, cartílago y estromal (Figura 16c). Para correlacionar mejor el resultado fenotípico de las células trasplantadas, con la aparición de los distintos subconjuntos esqueléticos definidos por FACS, el tejido injerto explantado se disocia y analiza por FACS.

Métodos experimentales:

Aislamiento de progenitores esqueléticos humanos fetales usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS): El tejido fetal humano a las 17 semanas de gestación es adquirido de StemExpress (Placerville, CA, Estados Unidos). Se disocian huesos de extremidades fetales humanas, se digieren serialmente en tampón de digestión de colagenasa suplementado con ADNasa a 37 °C durante 40 min bajo agitación constante y las células disociadas totales se filtran a través de una malla de nailon de 40 mm, se sedimentan a 200 g a 4 °C, se resuspenden en medios de tinción (suero fetal de ternero al 2 % en PBS), y se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorocromo para CD45, CD235ab, Tie2, CD31, CD146, PDPN, CD73, CD164 para análisis por FACS en un Instrumento FACS Aria II (BD Biosciences, San José, CA) usando una boquilla de 70 pm.

Aislamiento de progenitores esqueléticos adultos usando clasificación celular activada por fluorescencia (FACS): Los tejidos de la cabeza femoral descartados de procedimientos de sustitución de cadera se obtuvieron de "Stanford's Orthopedic Surgery Service". El tejido esquelético se extirpa de diferentes regiones de la cabeza femoral que incluye mecánicamente la cavidad de la médula ósea y, a continuación, se digiere serialmente en tampón de digestión de colagenasa suplementada con ADNasa a 37 °C durante 40 min bajo agitación constante y las células disociadas totales se filtran a través de una malla de nailon de 40 mm, se sedimentan a 200 g a 4 °C, se resuspenden en medios de tinción (suero fetal de ternero al 2 % en PBS), y se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorocromo para CD45, CD235ab, Tie2, CD31, CD146, PDPN, CD73, CDl64 para análisis por FACS en un Instrumento FACS Aria II (BD Biosciences, San José, CA) usando una boquilla de 100 pm.

Cultivo celular: Los progenitores esqueléticos se cultivan in vitro en recipientes de cultivo previamente recubiertos (gelatina al 0,1 %) en medio MEMa con FCS al 20 % bajo condiciones de bajo O²(2 % de oxígeno atmosférico, 7,5 % de CO²). Las células se recogen para análisis/paso mediante incubación con tampón de digestión de colagenasa seguido de neutralización de la actividad enzimática de la colagenasa con medios de tinción y centrifugación final.

Ensayos de formación de colonia in vitro: Las poblaciones de hSSC se clasifican por FACS para cultivar célula sencilla, como se ha descrito anteriormente. La unidades formadoras de colonia de hSSC se identifican usando un microscopio invertido bajo 40x de aumento. La colonias se evalúan para el tamaño y la morfología celular.

Análisis de micromatriz de poblaciones altamente purificadas de progenitores esqueléticos humanos: Cada población celular se obtiene por FACS de extremidades de un feto humano a 17 semanas de gestación o cabezas femorales adultas para la extracción de ARN para el análisis de micromatriz, usando técnicas publicadas por nuestro laboratorio y repetidas por triplicado (tres muestras diferentes) para asegurar la máxima precisión. El ARN se aísla con Micro Kit Rneasy (Qiagen) por las instrucciones del fabricante. La amplificación de ARNm se realiza usando un sistema de marcaje de diana de dos ciclos durante la transcripción 3' in vitro, se hibrida con una matriz U133 plus 2.0 de genoma humano y se escanea de acuerdo con el protocolo del fabricante (Affymetrix). La corrección del ruido de fondo y la normalización de la señal se realiza usando el algoritmo medio de multichip estándar.

Análisis de la micromatriz usando "Gene Expression Commons" (GEXC): Los datos en bruto obtenidos del análisis de micromatriz se suben a GEXC, un sistema creado por nuestro laboratorio para minar conjuntos de datos. La plataforma GEXC normaliza los datos de micromatriz de ARN frente a la "Referencia Común", (una gran colección (n = 11.939) de datos de micromatriz públicamente disponibles del "National Center for Biotechnology Information") y genera mapas de calor que representan el "fold change" de la expresión génica. El análisis GEXC también proporciona una interfaz fácil para el usuario intuitiva para conducir el análisis de la expresión diferencial para identificar los genes que se regulan al alza selectivamente en una población y no otra.

Trasplante de células fetales y adultas debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes: Los trasplantes de cápsula renal se realizan como se ha publicado previamente. Brevemente, bajo anestesia general, la disección roma se realiza para identificar el riñón de un ratón RAGy inmunocomprometido. Los ratones RAGy son inmunodeficientes debido a las deleciones homocigotas de la polimerasa Rag2 y el receptor de IL2 que son necesarios para la formación de linfocitos B, T y NK maduros. Una pequeña capsulotomía renal usando aguja de calibre 25 permite la inserción de la cánula de inyección roma y 2.000 células suspendidas en Matrigel se disponen debajo de la cápsula renal. La formación de una ampolla visible entre el parénquima renal y la capsula y la falta de sagrado significativo o fuga extrarenal de células inyectadas son criterios usados para la inyección con éxito. El tejido que cubre y la piel por encima del riñón, a continuación, se suturan para el cierre. Los injertos se explantarán usando un microscopio de disección a las 2/4/8 semanas o 6 meses después de la disposición y se analiza por FACS tras la digestión enzimática y la posterior disociación mecánica de las células o por análisis histológico.

Ensayos de diferenciación de progenitor esquelético in vitro: Los progenitores esqueléticos recién aislados se marcan de manera fluorescente con vectores lentivíricos como se describe. Este proceso hace uso de la transducción simultánea de las células diana con tres vectores de ontología génica lentivírica (LeGO) que codifican proteínas fluorescentes rojas, verdes o azules (RGB). De acuerdo con el modelo de color aditivo, las marcadas RGB marcadas individuales muestran una gran variedad de colores únicos y altamente específicos. Los códigos de color permanecen estables después de la división celular y, por tanto, facilitan el trazado clonal in vivo e in vitro (Figura 17c-d). Después de 8 horas de transducción, se aíslan distintas poblaciones sometidas a transducción por FACS, a continuación, se cocultivan con poblaciones progenitoras totales no clasificadas/no marcadas, por sí misma, o con distintas fracciones aisladas por FACS juntas en medio MEMa.

Ensayos de diferenciación de progenitor esquelético in vivo: Después de la transducción, las poblaciones aisladas por FACS se incrustaron en Matrigel (Corning, NY) y se trasplantaron debajo de la cápsula renal como anteriormente. El Matrigel localiza las células trasplantadas bajo la cápsula renal. Un mes después del trasplante, los injertos se explantan de los riñones del ratón receptor y se disocian (enzimáticamente y mecánicamente) para análisis por FACS. Las porciones de injertos explantados se fijan y se preparan para análisis histológico

Análisis histológico: Los especímenes diseccionados se fijan, se descalcifican y se incrustan en parafina u OCT para la realización de secciones y la tinción para la osificación endocondral usando tinción con Pentacromo de Movat. Evaluamos los destinos no esqueléticos potenciales generados por nuestras poblaciones purificadas trasplantadas por inmunotinción, con marcadores de diferenciación específicos para adipocitos y fibrocitos, tales como adiponectina y actina de músculo liso, respectivamente.

Ejemplo 3

El destino de la célula madre está influenciado por el microambiente especializado o el "nicho", en el que residen las células (Figura 19a-b). La modulación de la señalización del nicho puede estimular el crecimiento tisular mediante la inducción de la proliferación de las células madre, como hemos observado con mSSC. Las interacciones del nicho también pueden jugar papeles significativos en el mantenimiento del compromiso del linaje; por ejemplo, la señalización de BMP2 local incrementada puede fomentar la expansión y la supervivencia de las SSC de ratón. Los datos de micromatriz sobre hSSC demostraron la conversión de genes implicados en la señalización de BMP, WNT y VEGF que observamos que estaban implicadas en la supervivencia, proliferación y diferenciación de mSSC (Figura 19c-e). Por tanto, un sistema de señalización autocrina y paracrina en el microambiente del nicho de las hSSC, regula su expansión, actividad y diferenciación (Figura 19b). La aplicación de morfógenos exógenos específicos tales como BMP2, WNT y VEGFA pueden imitar la señalización de nicho, que conduce a la supervivencia, y/o proliferación, de hSSC en condiciones mínimas. Como alternativa, otras combinaciones de BMP2, WNT o VEGF pueden fomentar la diferenciación de SSC hacia destinos esqueléticos específicos, tal como hueso, cartílago o estroma.

El análisis de micromatriz comparativo sobre las células madre/esqueléticas humanas purificadas por FACS identifica genes específicos que se regulan al alza claramente en hSSC y poblaciones progenitoras brutas. Los datos ilustran alta expresión transcripcional de BMP2 en hSSC, que refleja lo visto en nuestro estudio de ratón (Figura 19d). Además, la alta expresión transcripcional de los genes implicados en las vías de señalización dependientes de WNT y VEGF es vista en las hSSC y sus células progenitoras derivadas posteriores, igual que nuestros descubrimientos sobre los progenitores esqueléticos de ratón (Figura 19e). Por el contrario, observamos expresión reducida de VEGF en hCP (subconjunto de progenitor condrogénico humano). Esto concuerda con la observación de que el antagonismo de VEGF fomenta la diferenciación de condrocitos por SSC de ratón endógenas e inducidas (Figura 20e). Las vías de BMP2, WNT y VEGF están altamente implicadas en la regulación de la expansión, formación y diferenciación de SSC de ratón y humanas (Figura 19t).

Se determina si los subconjuntos de progenitor humano pueden mantener la supervivencia y la proliferación de hSSC en condiciones mínimas. In vitro: cocultivar subconjuntos estromales lentivíricamente marcados con fluorescencia (por ejemplo, GFP) con hSSC recién extraídas en condiciones sin suero que se han marcado con un color diferente (por ejemplo, RFP). Después de un periodo de dos semanas de cocultivo, se determinan los porcentajes relativos de hSSC por FACS para determinar la capacidad de un subconjunto estromal particular para mantener la supervivencia y la proliferación de las células madre/progenitoras esqueléticas humanas en condiciones mínimas. In vivo: La capacidad de distintas fracciones estromales para afectar a la actividad de hSSC se ensaya directamente in vivo, trasplantando conjuntamente 100-200 hSSC marcadas con proteína diferencialmente fluorescente con distintos subconjuntos estromales debajo de la cápsula renal de ratones RAGy y, a continuación, explantando el tejido injertado un mes después para la disociación y el análisis por FACS/histología. Trasplantamos 100-200 hSSC en este ensayo. El perfilado sistemático de los distintos subtipos de progenitor permite la identificación de las condiciones mínimas in vivo requeridas para la supervivencia/proliferación de las células madre/progenitoras humanas. Los subconjuntos de progenitor esquelético humano mantienen la supervivencia y la proliferación de hSSC en condiciones mínimas.

El papel de BMP2, WNT3A y VEGF, solos o en combinación para regular el mantenimiento, la expansión y la diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas fetales y adultas humanas en condiciones mínimas in vitro e in vivo. El papel de las distintas vías de nicho de hSSC se evalúa directamente usando factores recombinantes purificados disponibles en el mercado (BMP2, WNT y VEGF) administrándolos a hSSC en cultivo (en medio sin suero) o bien como agentes únicos o en combinaciones específicas que emparejan la presentación de sus receptores cognados específicos en las hSSC, como se muestra mediante análisis de micromatriz a través de GEXC. La expresión de los genes clave implicados en las vías de BMP2, WNT y VEGF se valida usando secuenciación de ARN de célula individual (Figura 19f).

In vivo: Las combinaciones de estos factores se ensayan en hSSC, trasplantando hSSC en combinación directa con un depósito de BMP2, WNT y VEGF. Para evaluar la actividad de las combinaciones candidatas de BMP2, WNT y VEGF in situ y el papel del ambiente de hSSC intacto como efectos modificadores potenciales de la matriz esquelética, los huesos fetales humanos xenoinjertados intactos establecidos tras los trasplantes de primordios de extremidad fetal intactos (por ejemplo, falanges), se implantan subcutáneamente con un catéter pequeño conectado a una bomba osmótica implantable que administra BMP2, WNT y VEGF o un control disolvente/PBS en una administración diaria de constante de velocidad controlada (distinta a la administración por depósito suprafisiológica que puede dar como resultado una liberación rápida del morfógeno o morfógenos). Se ensaya la morfología bruta y la histología de las extremidades fetales humanas tratadas y no tratadas o se disocian para el análisis por FACS para determinar los cambios en la abundancia relativa de las hSSC y los subconjuntos esqueléticos posteriores.

Las vías de señalización críticas en una interacción de hSSC-nicho particular se evalúan además usando silenciamiento lentivíricamente mediado de o bien la expresión del ligando de señalización en las células estromales o su correspondiente receptor en hSSC.

Métodos experimentales:

Marcación lentivírica de hSSC para cocultivo in vitro e in vivo con subconjuntos estromales: Las hSSC se marcan de manera fluorescente por transfección con lentivirus (GFP, RFP o CFP). Después de 8 horas de transducción, se aíslan por FACS distintas poblaciones sometidas a transducción con GFP, RFP o CFP. Esto posibilita la observación de la interacción funcional entre las hSSC y las poblaciones estromales tanto in vitro como in vivo.

Análisis de micromatriz de poblaciones altamente purificadas de progenitores esqueléticos humanos: se realiza y los datos se analizan usando GEXC. Usando GEXC se mapean las interacciones célula-célula entre las hSSC y otros componentes celulares del nicho esquelético. Se identifican las células estromales que expresan ligandos o están implicadas en la señalización de BMP, WNT y VEGF.

Análisis de la expresión génica de célula individual por secuenciación de ARN de célula individual: Para determinar los patrones de expresión de los genes de la vía de BMP2, WNT y VEGF a un nivel de célula individual, las hSSC purificadas aisladas utilizan el sistema microfluídico C1 (Fluidigm) para capturar células individuales por pocillo. El sistema C1 usa un circuito microfluídico para capturar las células individuales seguido de lisis celular, aislamiento de ARN, preparación de ADNc, y amplificación del ADNc de una manera completamente automatizada. Las bibliotecas se preparan usando ADNc amplificado de células individuales usando el kit Nextera-XT (Illumina) y se secuencian usando la plataforma Nextseq-500 (Illumina) para obtener 10-15 millones de lecturas del extremo de pares de 2x150 pares de bases por pocillo.

Cocultivo de hSSC con subconjuntos estromales: Subconjuntos estromales diferencialmente marcados de manera fluorescente lentivíricamente sometidos a transducción y hSSC recién extraídas se cocultivan en condiciones sin suero. Después de una semana de cocultivo, se determinan los porcentajes relativos de hSSC por FACS para determinar la capacidad de un subconjunto estromal particular para mantener la supervivencia y la proliferación de hSSC en condiciones mínimas.

Análisis por FACS del comportamiento de hSSC en presencia de subconjunto o subconjuntos estromales: Después de una semana de cocultivo (de hSSC diferencialmente marcadas de manera fluorescente y progenitores estromales), los porcentajes relativos de hSSC se determinan mediante análisis por FACS, a continuación, se reclasifican y trasplantan in vivo para determinar si el o los subtipos celulares estromales pueden mantener, amplificar o diferenciar hSSC bajo los linajes esqueléticos particulares in vivo.

Trasplante de células debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes: Ensayo de cotrasplante directo: se cotrasplantan 100-200 hSSC directamente in vivo con subconjunto o subconjuntos estromales encontrados que afectan a las hSSC cuando se ensayan in vitro. Los injertos se explantan y se analizan por FACS.

Uso de factores de citocina para evaluar la función génica in vitro y manipular la función de células in vivo: Para evaluar la función génica in vitro y evaluar el papel de los genes reguladores clave identificados, se cocultivan hSSC en presencia de factores de crecimiento de citocina (por ejemplo, BMP2, WNT y VEGF). Las concentraciones óptimas de estos factores de crecimiento de citocina se determina por la recombinación del fabricante de acuerdo con el nivel de actividad medida por lote de los factores de crecimiento. Los ensayos de formación de colonia permiten medir los efectos de combinaciones particulares de BMP2, WNT y VEGF para regular la expansión de hSSC, la diferenciación y la supervivencia.

Silenciamiento génico en hSSC y subconjuntos estromales usando lentivirus: Para evaluar el papel de los genes específicos que están diferencialmente regulados y necesarios para la regulación del nicho en la interacción entre hSSC y los componentes celulares del nicho, los genes implicados en la señalización de BMP2, WNT y VEGF se silencian usando supresión de genes mediada por ARNhc lentiviral. Las vías de señalización críticas en una interacción de nicho de hSSC particular se evalúan usando silenciamiento lentivíricamente mediado de o bien la expresión del ligando de señalización en las células estromales o su correspondiente receptor en hSSC.

Manipulación de hSSC con morfógenos recombinantes in vitro e in vivo: La identificación de las vías de regulación claves que controlan el destino de diferenciación de hSSC se realiza usando análisis de micromatriz como se ha descrito anteriormente. Esto permite la identificación de una combinación de factores de crecimiento de citocina tales como BMP2, WNT y VEGF para el análisis in vitro e in vivo con hSSC. Las células se cocultivan con BMP2 recombinante, WNT y VEGF y dos semanas después las células (i) se analizan usando FACS o (ii) se trasplantan debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes. Después de un mes estos injertos se explantan para evaluar el papel de las citocinas sobre la diferenciación y proliferación de hSSC, usando combinaciones de histología e inmunofluorescencia. Los efectos de los morfógenos recombinantes se ensayan sobre hSSC in vivo, trasplantando conjuntamente depósitos de morfógeno con hSSC, por ejemplo, implantando hidrogeles que liberan lentamente BMP2, WNT y VEGF.

Trasplante de primordios de extremidades fetales: Los primordios de extremidades fetales se aíslan de las falanges de un feto humano a las 10-12 semanas de gestación. Bajo anestesia, los primordios se trasplantan al espacio subcutáneo dorsal de un ratón RAGy. Después de 1 mes, los primordios se explantan y se evalúa su morfología usando histología.

Administración de citocina a primordios fetales in vivo: El diseño y el crecimiento del primordio de extremidad fetal humano xenoinjertado se manipula administrando factores de crecimiento de citocina (por ejemplo, BMP2, WNT y VEGF) usando localmente una bomba osmótica subcutánea. Las bombas son adquiridas en Alzet (Cupertino, CA). Para establecer los xenoinjertos de hueso fetal humano subcutáneos, los primordios de hueso humano se diseccionan de tejido fetal humano de 10-12 semanas gestancionales adquirido en StemExpress (Placerville, CA, Estados Unidos). Los primordios diseccionados se trasplantan subcutáneamente y se aseguran en el lugar con sutura sencilla. El catéter de la bomba osmótica se dispone al lado del injerto y también se asegura usando sutura sencilla. Tras un mes de tratamiento, los primordios se explantarán para análisis por histología e inmunofluorescencia. Los efectos del tratamiento de citocina se evalúan funcionalmente comparando con primordios que no se habían tratado con citocinas.

Histología e inmunofluorescencia (IF): La IF sobre especímenes crioconservados de hueso ectópico se realizan usando un kit de inmunodetección MOM de Vector Laboratories (CA) como se ha descrito previamente. Brevemente, los especímenes se tratan con un reactivo de bloqueo; se sondan con anticuerpo monoclonal a 4 °C durante una noche; se lavan con PBS; se sondan con anticuerpos conjugados con colorante alexa; se lavan; se pone un cubre objetos; y se genera una imagen con un sistema de microscopio invertido Leica DMI6000B. La IF sobres especímenes celulares cultivados de tejido se realiza igualmente que lo usado para los especímenes crioconservados. (Análisis de imagen: microscopía confocal, sistema confocal Zeiss 780).

Inhibición sistémica de la señalización vascular: Para estudiar el efecto de la inhibición de VEGF sobre la regulación del nicho esquelético y específicamente sobre la promoción del destino condrogénico, se inyectan intravenosamente 109 unidades ufp de los vectores adenovíricos que codifican el ectodominio VEGFR1 murino soluble (Ad sVEGFR1) a los ratones receptores designados 24 horas antes del trasplante, conduciendo a la infección hepática y a la secreción de este fuerte antagonista de la señalización de VEGF en la circulación. Para un control negativo, se usa el adenovirus que codifica un fragmento de inmunoglobulina IgG2a Fc murino (Ad Fc). Los injertos se explantan 3 semanas después del trasplante.

Ejemplo 4

Las condiciones para la reprogramación in situ eficaz del tejido adiposo humano en hueso, cartílago o estroma de médula ósea. La inducción de la formación de SSC con factores solubles y posteriormente la regulación del nicho de SSC para especificar su diferenciación hacia las células de hueso, cartílago o estromales representa un cambio de paradigma en la regeneración terapéutica de los tejidos esqueléticos. La inducción in situ de la formación de SSC es posible en el tejido adiposo de ratón, y la BMP2 puede desencadenar la inducción in situ de la formación de SSC en tejido adiposo humano (Figura 20a-c). Esta modalidad terapéutica extiende la capacidad para tratar defectos esqueléticos o la degeneración incluso cuando los niveles residentes de las SSC endógenas se han reducido por la enfermedad o el envejecimiento. La grasa es naturalmente abundante y ofrece una fuente fácilmente disponible de células mesenquimales que pueden reprogramarse dentro de los progenitores esqueléticos. Esta estrategia tiene enorme potencial traduccional para las enfermedades esqueléticas, tal como osteoartritis y osteoporosis (Figura 21).

Las concentraciones de BMP2 pueden desencadenar la activación de programas transcripcionales esqueletogénicos en células mesenquimales no esqueléticas que residen en el tejido adiposo, como se ve en ratón. Estas SSC inducidas derivadas de adiposo (iSSC), a continuación, pueden ser dirigidas con factores adicionales (WNT, VEGF) hacia destino esquelético específico (por ejemplo, hueso, cartílago o estroma de médula ósea) para la regeneración terapéutica de tejido esquelético in situ. La administración de células estromales derivadas de adiposo con combinaciones de BMP2 que inducen SSC y factores de nicho que especifican SSC, por ejemplo, (WNT y VEGF) maximizarán la formación de tejido esquelético inducido en los sitios de lesión.

Los estromas derivados de tejido adiposo humano expresan BMPR1B indicando que son sensibles a la señalización de BMP2 (Figura 20a parte superior). Las células estromales adiposas humanas reducidas hematopoyéticas no clasificadas (hASC) forman eficazmente hueso cuando se trasplantan con 0,3 mg/ml de BMP2 en ratones RAGy subcutáneamente (Figura 20c). Estos datos respaldan el uso de BMP2 para inducir hSSC en células derivadas de tejido adiposo.

La proteína RhBMP2 puede inducir la formación de SSC en tejido adiposo (i) in situ en ratones o (ii) cuando las hASC se cotrasplantan con BMP2 (Figura 20c). La concentración óptima de BMP2 necesaria para inducir la formación de hSSC en hASC se determina: tras reducción de célula hematopoyética por clasificación celular activada magnética, se resuspenden 106 hASC recién aisladas en matrigel que contienen concentraciones crecientes de rhBMP2, (de 1 |jg/ml a 1 mg/ml), en un volumen final total de 20 j l para el trasplante subcutáneo en ratones transgénicos RAGy actina-CFP. Los injertos se explantan a intervalos semanales para el análisis histológico por Pentacromo de Movat y FACS para los progenitores esqueléticos humanos. Las mSSC inducidas por BMP2 se someten a osificación endocondral que conduce a la formación de cartílago en la primera semana y la formación de hueso/médula ósea en la cuarta semana. Los injertos se explantan a intervalos semanales para determinar el ritmo de la formación de hueso inducido por concentración de BMP2 ensayada. Después de determinar la concentración óptima de BMP2 para inducir hueso, se inyectaron conjuntamente 100x unidades de actividad por lote con de otros factores moduladores esqueléticos (por ejemplo, VEGFR, WNT) para determinar la capacidad para seguir la condrogénesis inducida por BMP2 o hueso (Figura 20d y e).

Los distintos tipos celulares múltiples en el tejido adiposo pueden ser capaces de someterse a esqueletogénesis inducida por BMP2. Resolver la identidad de estos tipos celulares en el tejido adiposo humano podría elucidar el mecanismo de la osteoinducción mediada por BMP2 y revelar nuevas direcciones para modificar por ingeniería esta respuesta para regenerar el tejido esquelético enfermo o dañado. Los distintos subconjuntos de hASC expresan BMPR indicando que son sensibles a la señalización mediada por BMP. Tras el suplemento de los medios con BMP2, se inducen hASC para expresar varios de los marcadores que definen identificados en hSSC y el subconjunto de progenitor posterior (hBCSP) que incluye PDPN y CD146 (Figura 20a). Para determinar si BMPR define células competentes para someterse a esqueletogénesis, se aíslan distintas poblaciones de subconjuntos que expresan BMPR por FACS y se cotrasplantan con BMP2 en matrigel en ratones RAGy CFP subcutáneamente. Los injertos se explantan cuatro semanas después del trasplante ya que esto corresponde al momento cuando la esqueletogénesis inducida por BMP2 alcanza in vivo su pico. Las muestras se analizan histológicamente por tinción con Pentacromo. Se establece el tejido murino frente al humano a través de la expresión de CFP. La tinción con antígeno nuclear humano podría suplantar la expresión de CFP negativa para marcar el tejido humano como sea requerido. Se espera que la esqueletogénesis inducida por BMP2 se correlacione con el grado de expresión de BMPR.

Métodos experimentales:

Aislamiento de hASC: las hASC se aíslan en el momento de la liposucción de pacientes sanos que se someten a liposucción opcional de la región del abdomen, costado y/o muslo, como se ha descrito previamente.

Clasificación celular activada magnética: Se incuban hASC con anticuerpos CD45 y CD235 conjugados con perlas magnéticas (Miltenyi Biotech, San Diego, CA) durante 20 minutos a 4 °C en condiciones de rotación. Las células se pasan a través de un imán para reducir las hASC de las células hematopoyéticas. Este procedimiento enriquece el tejido liposuccionado fresco con células estromales antes de la separación adicional por FACS.

Suplemento de hASC con rhBMP2 in vitro: se aíslan hASC como anteriormente y se cultivan en presencia de concentraciones crecientes de rhBMP2 de 1 jg/m l a 1 mg/ml.

Trasplante subcutáneo de hASC con concentraciones crecientes de rhBMP2: hASC recién reducidas (106) se resuspenden en matrigel con concentraciones crecientes de rhBMP2 de 1 jg/m l a 1 mg/ml en un volumen total de 20 j l para posterior trasplante subcutáneo en la almohadilla de grasa inguinal de ratones transgénicos RAGy actina-CFP. Los injertos se explantan a intervalos semanales para el análisis histológico por Pentacromo de Movat y FACS para los progenitores esqueléticos humanos.

Aislamiento de hASC que expresan BMPR1a, BMPR1b, BMPR2: se aíslan hASC como anteriormente y se resuspenden en medios de tinción (suero fetal de ternero al 2 % en PBS), y se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorocromo para BMPR1a /BMPR1b / BMPR2 para análisis por FACS en un Instrumento FACS Aria II (BD Biosciences, San José, CA).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula madre esquelética humana para su uso en un método para regenerar cartílago o hueso, comprendiendo el método: administrar a un individuo una dosis eficaz de la célula madre esquelética humana, en donde la célula se selecciona del tejido humano para el fenotipo negativo para la expresión de CD45, CD235, Tie2 y CD31 y positivo para la expresión de podoplanina (PDPN), en un sitio donde se desea la regeneración de hueso o cartílago.

2. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 1, en donde las células se seleccionan además para la expresión de CD73 y CD164.

3. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 2, en donde las células son [PDPN+CD146-CD73-CD164-] y se implantan para regenerar cartílago.

4. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 2, en donde las células son [PDPN+CD146-CD73-CD164+] y se implantan para regenerar hueso.

5. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 2, en donde las células son [PDPN+CD146-CD73+CD164+] y se implantan para la regeneración endocondral.

6. Una célula madre derivada de tejido adiposo humana (hASC) para su uso en un método para regenerar cartílago, comprendiendo el método:

administrar a un individuo una dosis eficaz de las hASC y una dosis eficaz de BMP2 para reprogramar las células a células madre esqueléticas humanas (hSSC) CD45-CD235-Tie2-CD31-PDPN+CD146-CD73+CD164+ en un sitio donde se desea la regeneración de cartílago, y;

administrar un inhibidor de VEGF en una dosis eficaz para inducir un destino condrogénico en la hSSC; en donde el cartílago se regenera en el sitio.

7. La célula madre esquelética para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el tejido óseo comprende médula ósea, opcionalmente en donde el tejido óseo es tejido óseo de cadera.

8. La célula madre esquelética para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, comprendiendo además la administración de una dosis eficaz de una proteína Wnt, un inhibidor de VEGF, una proteína TGF-p o un inhibidor de TGF-p que se unen específicamente a un receptor de TGFp-R1 y tienen la capacidad de inhibir la función biológica de una molécula TGF-p nativa.

9. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 8, en donde la dosis eficaz de un inhibidor de VEGF se administra para inducir un destino condrogénico en las células.

10. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 8, en donde la dosis eficaz de una proteína Wnt se administra para inducir un destino osteogénico en las células.

11. La célula madre esquelética para su uso de la reivindicación 10, en donde la proteína Wnt es Wnt3 o Wnt3a, o Wnt5a o Wnt5b.

12. La célula madre esquelética o derivada de tejido adiposo humana para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde las células se proporcionan en un armazón, una pasta o un implante, y en donde el cartílago o el hueso se forman en el sitio del implante.

13. Una población de células madre esqueléticas aislada, en donde las células se selecciona de un tejido óseo para el fenotipo negativo para la expresión de CD45, CD235, Tie2 y CD31 y positivo para la expresión de podoplanina (PDPN).