CN107488625B - 一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用，通过在去除蛋白的成牛血清中加入特定的化合物，得到了良好的胎牛血清替代替物。本发明的胎牛血清替代物用于细胞培养时，细胞的生长状态良好，与使用胎牛血清基本一致。胎牛血清替代物具有较好的批间稳定性，不同批次的胎牛血清替代物的培养基对细胞的培养无显著影响。本发明的胎牛血清替代物，生产和使用成本相对较低，价格波动较小。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制品，特别涉及一种胎牛血清替代物及其制备方法和应用。
背景技术
动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，常用于动物细胞的体外培养。
动物血清主要包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清等，其中以胎牛血清的使用最为普遍。动物血清在细胞培养中提供细胞增殖所需的生长因子、激素、转移蛋白、贴壁和铺展在培养基质上的因子、蛋白酶抑制剂和其他营养物质。使用血清的优点是血清含有促进细胞增殖和维持的大部分因子，它几乎是通用的生长添加物，适用于动物、人和昆虫细胞等的细胞培养。因而使用血清不需要为每一个细胞系优化培养基，节省了大量时间和精力。
血清中蛋白含量大且成分复杂(大于100种)，这使实验和生产的标准化都变得困难，也使疫苗、单克隆抗体及生物活性蛋白等用培养细胞生产的生物产品的下游分离和纯化变得更加复杂。干细胞培养要求在促进细胞增殖的同时，又要保持细胞的发育特性，不发生分化，这对细胞培养基组分的要求更加苛刻。而使用血清则可能改变细胞在体内的正常状态，可能促进某种细胞(成纤维细胞)生长的同时，抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。在培养原代细胞时使用含血清的培养基可能无法阻止成纤维细胞过度增殖，而影响原代细胞的生长。
虽然血清含有促进细胞生长的成分，但同时也含有内毒素、血色素、补体、抗体等其他有害成分，影响细胞生长甚至导致细胞死亡。低质量的血清常被病毒、真菌和支原体等微生物感染。血清来源不稳定，可能受来源地区环境及牛群疾病影响导致供应紧张，造成价格波动。
胎牛血清是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体，取自剖腹产的胎牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，品质最高，相应的，其生产和使用成本也是极其高昂的。此外，胎牛血清的收集过程也一直遭到伦理学的质疑。因此，更符合人道的无血清细胞培养基或胎牛血清替代物值得到大力支持和推广。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的不足，提供一种适用于细胞培养的胎牛血清替代物。
本发明的另一个目的在于提供一种胎牛血清替代物的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供使用了上述胎牛血清替代物的培养基。
本发明所采取的技术方案是：
一种胎牛血清替代物，由去除蛋白的成牛血清和营养组分组成，各营养组分在去除蛋白沉淀的成牛血清中的终含量为：
| CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 154.4mg/L±10％ |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.0013mg/L±10％ |
| 1％柠檬酸亚铁 | 2.46ml/L(0.246％v/v)±10％ |
| 氢化可的松 | 0.5mg/L±10％ |
| FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.417mg/L±10％ |
| KCl | 311.8mg/L±10％ |
| MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 61mg/L±10％ |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 99.88mg/L±10％ |
| NaCl | 6.9g/L±10％ |
| NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 70.68mg/L±10％ |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O | 71.02mg/L±10％ |
| 葡萄糖 | 1.25g/L±10％ |
| 丙酮酸钠 | 55mg/L±10％ |
| GABA储存液 | 2ml/L±10％ |
| LiCl储存液 | 2ml±10％ |
| 哌啶酸浓缩液 | 129.7ul/L±10％ |
| Stock A储存液 | 20ml/L±10％ |
| Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>储存液 | 0.2ml/L±10％ |
其中，GABA储存液按5155mgGABA溶解于100ml超纯水中得到；LiCl储存液按氯化锂847.2mg溶于40ml超纯水中得到；哌啶酸浓缩液中，哌啶酸的浓度为1mg/ml；Stock A储存液按165mg盐酸硫胺素、50mg还原型谷胱甘肽，1650mg L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐溶于500ml超纯水中得到；Na2SeO3储存液按7mg***钠溶于100ml超纯水中得到。
作为上述胎牛血清替代物的进一步改进，各营养组分在去除蛋白沉淀的成牛血清中的终含量为：
| CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O | 154.4mg/L±5％ |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.0013mg/L±5％ |
| 1％柠檬酸亚铁 | 2.46ml/L(0.246％v/v)±5％ |
| 氢化可的松 | 0.5mg/L±5％ |
| FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.417mg/L±5％ |
| KCl | 311.8mg/L±5％ |
| MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 61mg/L±5％ |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 99.88mg/L±5％ |
| NaCl | 6.9g/L±5％ |
| NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 70.68mg/L±5％ |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O | 71.02mg/L±5％ |
| 葡萄糖 | 1.25g/L±5％ |
| 丙酮酸钠 | 55mg/L±5％ |
| GABA储存液 | 2ml/L±5％ |
| LiCl储存液 | 2ml±5％ |
| 哌啶酸浓缩液 | 129.7ul/L±5％ |
| Stock A储存液 | 20ml/L±5％ |
| Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>储存液 | 0.2ml/L±5％ |
更佳的，作为上述胎牛血清替代物的进一步改进，各营养组分在去除蛋白沉淀的成牛血清中的终含量为：
作为上述胎牛血清替代物的进一步改进，去除蛋白的成牛血清的制备方法如下：
1)取健壮成牛血液，加入抗凝剂，静置后无菌条件下取黄色血浆，离心去除沉淀，取上清；
2)在上清中加入终浓度为20mM的CaCl2，37℃水浴2h；
3)将水浴后的上清冷冻，之后放置融化，去除蛋白沉淀并收集上清；
4)向上清中加入NaCl进行盐析，分离上清，离心去除沉淀，收集上清；
5)脱盐，将NaCl质量浓度调到0.7％，得到去除蛋白的成牛血清。
一种胎牛血清替代物的制备方法，包括如下步骤：
1)取健壮成牛血液，加入抗凝剂，静置后无菌条件下取黄色血浆，离心去除沉淀，取上清；
2)在上清中加入终浓度为20mM的CaCl2，37℃水浴2h；
3)将水浴后的上清冷冻，之后放置融化，去除蛋白沉淀并收集上清；
4)向上清中加入终浓度为4.79M的NaCl，放置沉淀，分离上清，离心去除沉淀，收集上清；
5)将上清脱盐，调整NaCl质量浓度为0.7％，得到去除蛋白的成牛血清；
6)在成牛血清中加入营养元素，各营养元素在成牛血清的终浓度如上所述；
7)灭菌、包装得到胎牛血清替代物。
作为上述制备方法的进一步改进，抗凝剂为柠檬酸三钠溶液。
作为上述制备方法的进一步改进，4℃静置4～24h后无菌条件下取黄色血浆，4℃、3000rpm离心去除沉淀。
作为上述制备方法的进一步改进，将水浴后的上清-20℃～-40℃下冷冻4～24h后，室温放置融化。
作为上述制备方法的进一步改进，灭菌的方法为过滤灭菌或辐照灭菌。
一种细胞培养基，添加有上述的胎牛血清替代物。
本发明的有益效果是：
本发明的胎牛血清替代物具有很好地代替胎牛血清，用于细胞培养时，细胞的生长状态良好，与使用胎牛血清基本一致。
本发明的胎牛血清替代物具有较好的批间稳定性，不同批次的胎牛血清替代物的培养基对细胞的培养无显著影响。
本发明的胎牛血清替代物，生产和使用成本相对较低。
附图说明
图1是不同胎牛血清和本发明胎牛血清替代物培养SP2/0细胞的细胞形态照片；
图2是不同胎牛血清和本发明胎牛血清替代物培养293T细胞的细胞形态照片；
图3是不同胎牛血清培养A549细胞的细胞形态照片；
图4是不同胎牛血清培养A549细胞的细胞形态照片；
图5是不同胎牛血清培养A549细胞的细胞形态照片。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种胎牛血清替代物，其制备方法如下：
1)选择体型健壮成牛，取血时以5升为单位，加入抗凝剂(4％的二水合柠檬酸三钠)量为500ml；4℃冰箱过夜放置，无菌条件下取黄色的血浆，4℃3000rpm离心10min后取上清；
2)向上清中加入终浓度为20mM的CaCl2，37℃水浴2h；
3)-20℃放置12小时后，室温放置融化，去除蛋白沉淀收集上清；
4)向上清中加入终浓度为4.79M的NaCl，4℃沉淀12h；
5)5000rpm离心15min，收集上清；
6)脱盐，将NaCl浓度调到0.7％；
7)加入细胞生长必需的离子，加入终浓度为：
8)调节pH至7.4；用NaCl调节渗透压至290，0.22μm滤器过滤一次或者直接辐照灭菌；
其中，GABA储存液按5155mgGABA溶解于100ml超纯水中得到；LiCl储存液按氯化锂847.2mg溶于40ml超纯水中得到；哌啶酸浓缩液中，哌啶酸的浓度为1mg/ml；Stock A储存液按165mg盐酸硫胺素、50mg还原型谷胱甘肽，1650mg L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐溶于500ml超纯水中得到；Na2SeO3储存液按7mg***钠溶于100ml超纯水中得到。
胎牛血清替代物和胎牛血清的性能比较：
SP2/0细胞培养
分别使用不同胎牛血清和实施例1的胎牛血清替代物，配制成20％FBS—DMEM培养基，按如下方法培养SP2/0细胞：
1)将已长到80％～90％的SP2/0细胞培养瓶从37℃、5％的CO2培养箱中取出，用75％的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，使用无菌移液管吸净原有的培养基，加入1ml PBS溶液洗去残留的培养基，吸净PBS；
2)向该25cm2培养瓶加入1ml 0.25％的胰酶，消化30～60s；
3)镜下观察细胞单层出现缝隙时，加入等体积的3倍含有血清的DMEM培养基终止消化；
4)将细胞移至15ml离心管中，离心800rpm/3min；
5)倒去上清液，加5ml的含有血清DMEM培养基重悬细胞；
6)细胞计数，传代的密度为2～5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个25cm2的培养瓶加5ml含有血清的DMEM培养基，放于37℃、5％CO2培养箱中培养。
对比细胞的生长状态及相关生化指标，结果如下：
说明：A公司通用型01UC、A公司杂交瘤O2HO、B公司、进口知名品牌的血清均为胎牛血清。
从表中的数据和图可以看出，对于SP2/0细胞，用不同血清的培养基培养得到的细胞形态上基本无差别，本发明的胎牛血清替代物与市售胎牛血清效果无显著区别，同时，血清替代物的批间稳定性较好，性能接近。
293T细胞培养：
分别使用不同胎牛血清和实施例1的胎牛血清替代物，配制成10％FBS—DMEM培养基，按如下方法培养293T细胞：
1)将已长到80％～90％的293T细胞培养瓶从37℃、5％的CO2培养箱中取出，用75％的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，使用无菌移液管吸净原有的培养基，加入1ml PBS溶液洗去残留的培养基，吸净PBS；
2)向该25cm2培养瓶加入1ml 0.25％的胰酶，消化3～5min；
3)镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入等体积的3倍含有血清的DMEM培养基终止消化；
4)将细胞移至15ml离心管中，离心1000rpm/3min；
5)倒去上清液，加5ml的含有血清DMEM培养基重悬细胞；
6)细胞计数，传代的密度为2～5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个25cm2的培养瓶加5ml含有血清的DMEM培养基，放于37℃、5％CO2培养箱中培养。
按培养公开的方法培养293T细胞，观察对比细胞的生长状态。实验结果如下：
从表中的数据和图可以看出，对于293T细胞，用不同血清的培养基培养得到的细胞形态上基本无差别，本发明的胎牛血清替代物与市售胎牛血清效果无显著区别，同时，血清替代物的批间稳定性较好，性能接近。
A549细胞培养
分别使用不同胎牛血清和实施例1的胎牛血清替代物，配制成10％FBS—DMEM培养基，按如下方法培养A549细胞：
1)将已长到80％～90％的A549细胞培养瓶从37℃、5％的CO2培养箱中取出，用75％的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，使用无菌移液管吸净原有的培养基，加入1ml PBS溶液洗去残留的培养基，吸净PBS；
2)向该25cm2培养瓶加入1ml 0.25％的胰酶，消化1～3min；
3)镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入等体积的3倍含有血清的DMEM培养基终止消化；
4)将细胞移至15ml离心管中，离心1000rpm/3min；
5)倒去上清液，加5ml的含有血清DMEM培养基重悬细胞；
6)细胞计数，传代的密度为2～5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个25cm2的培养瓶加5ml含有血清的DMEM培养基，放于37℃、5％CO2培养箱中培养。
按培养公开的方法培养A549细胞，连续培养5代，观察对比细胞的生长状态。实验结果如下：
从表中的数据和图可以看出，通过五代的培养，A549细胞的形态和细胞倍增保持正常。对于A549细胞，用不同血清的培养基培养得到的细胞形态上基本无差别，A公司Front(通用)对于A549细胞的培养完全支持，表现较南美进口品牌血清好。本发明的胎牛血清替代物与市售胎牛血清效果无显著区别，同时，血清替代物的批间稳定性较好，性能接近。
Claims (6)
1.一种胎牛血清替代物，由去除蛋白的成牛血清和营养组分组成，其特征在于：各营养组分在去除蛋白的成牛血清中的终含量为：
其中，去除蛋白的成牛血清的制备方法如下：
1)取健壮成牛血液，加入抗凝剂，静置后无菌条件下取黄色血浆，离心去除沉淀，取上清；
2)在步骤1）得到的上清中加入终浓度为20mM的CaCl2，37℃水浴2h；
3)将步骤2）水浴后的上清冷冻，之后放置融化，去除蛋白沉淀并收集上清；
4)向步骤3）的上清中加入NaCl进行盐析，分离上清，离心去除沉淀，收集上清；
5)脱盐，将NaCl质量浓度调到0.7%，得到去除蛋白的成牛血清。
2.一种胎牛血清替代物的制备方法，包括如下步骤：
1)取健壮成牛血液，加入抗凝剂，静置后无菌条件下取黄色血浆，离心去除沉淀，取上清；
2)在步骤1）得到的上清中加入终浓度为20mM的CaCl2，37℃水浴2h；
3)将步骤2）水浴后的上清冷冻，之后放置融化，去除蛋白沉淀并收集上清；
4)向步骤3）的上清中加入终浓度为4.79 M 的NaCl，放置沉淀，分离上清，离心去除沉淀，收集上清；
5)将步骤4）的上清脱盐，调整 NaCl质量浓度为0.7%，得到去除蛋白的成牛血清；
6)在成牛血清中加入营养元素，各营养元素在成牛血清的终浓度如权利要求1所述；
7)灭菌、包装得到胎牛血清替代物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：抗凝剂为柠檬酸三钠溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：4℃静置4～24h后无菌条件下取黄色血浆，4℃、3000rpm离心去除沉淀。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将水浴后的上清-20℃～-40℃下冷冻4～24h后，室温放置融化。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：灭菌的方法为过滤灭菌或辐照灭菌。
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