WO2016121908A1 - 抗ａｌｋ２抗体 - Google Patents

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岳信 片桐
賢次 大澤
翔 塚本
真之介 辻
喜郎 川口
健介 中村
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第一三共株式会社
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a substance useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for ectopic ossification and / or bone dysplasia, and a method for treating and / or preventing ectopic ossification and / or bone dysplasia.
  • Non-Patent Documents 1-3 Progressive ossifying fibrodysplasia (Fibrodysplasia ossificans prostiva (FOP)) is an ectopic formation of cartilage or bone tissue in soft tissues such as skeletal muscles, tendons, and ligaments that normally do not form bone tissue. It is a hereditary disease (Non-Patent Documents 1-3). In this disease, ectopic ossification occurs throughout the body, including the face, and the ectopic bone tissue and existing bone tissue coalesce to significantly reduce the range of motion of the joint or cause body deformation (non- Patent Documents 1-3).
  • Ectopic ossification in FOP is known to be acute ectopic ossification that progresses with a symptom called flare-up caused by muscle damage or viral infection in addition to chronic progression with growth (Non-Patent Document 1). Flare-up is an swelling mainly caused by an inflammatory reaction or long-term pain. In addition to being induced by bruises, falls, or intramuscular injections that cause muscle damage, there are sudden cases where the cause is not clear. It has been.
  • ectopic bone tissue is formed after flare-up, so invasive medical practices such as biopsy and surgery are contraindicated, and ectopic bone tissue cannot be removed surgically.
  • the ectopic bone tissue formed by FOP is formed by normal chondrocytes and osteoblasts and is metabolized in the same manner as normal bone tissue. It is not possible to remove only bone tissue.
  • ALK2 Activin Like Kinase 2
  • BMP bone morphogenetic protein
  • Human and mouse ALK2 is a single-transmembrane protein having a signal peptide consisting of 509 amino acids, and functions as a transmembrane serine / threonine kinase receptor that binds to BMP (Non-patent Documents 1-3).
  • BMP is bound in the extracellular region on the N-terminal side, and a downstream intracellular signal transduction system is activated by intracellular serine, threonine kinase.
  • BMP receptors are classified into two types according to their structure and function: type I receptors including ALK2 and type II receptors (Non-Patent Documents 1-3).
  • Type II receptors are constitutively active enzymes that exhibit kinase activity without binding BMP.
  • type I receptor containing ALK2 is an inactive enzyme in a state where it does not bind to BMP, and exhibits kinase activity depending on the binding to BMP. This is considered to be because the kinase of type II receptor is phosphorylated using the intracellular domain of type I receptor as a substrate by binding to BMP, and the three-dimensional structure is changed to activate type I receptor.
  • Non-Patent Documents 1-3 Non-Patent Documents 1-3.
  • Non-patent Documents 1-3 Non-patent Documents 1-3.
  • this constitutively active mutant of type I receptor is overexpressed, the intracellular signal transduction system is activated without applying BMP stimulation. Therefore, it is considered that the type I receptor is a responsible molecule that transmits BMP information from outside the cell to inside the cell.
  • Non-patent Document 4 The mutation of ALK2 identified from familial and typical sporadic FOP cases was R206H mutant in which Arg206 was replaced with His. So far, all the gene mutations identified from FOP cases have been found to cause amino acid mutations in the intracellular region of ALK2. Many of these mutations in FOP cases are concentrated in the vicinity of the ATP-binding region in the intracellular region of ALK2 (Non-patent Document 5).
  • Non-patent Document 6 When the ALK2 mutant identified by FOP is overexpressed in cultured cells, the intracellular signal transduction system of BMP is activated without applying BMP stimulation (Non-patent Document 6). Therefore, as a therapeutic agent for FOP, a small molecule inhibitor for ALK2 kinase, RNAi or exon skip method that specifically suppresses the expression of genetically mutated ALK2, a transcription factor inhibitor downstream of ALK2 receptor, and An osteoblast differentiation inhibitor by BMP signal has been developed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1-3).
  • the currently developed low molecular weight compounds and nucleic acid FOP therapeutic agents are all expected to permeate the cell membrane and inhibit the ALK2 signal in the cell.
  • an effective drug delivery method has not been established for nucleic acid drugs, and problems remain such that kinase inhibitors have low specificity for other ALK receptor families having high identity to ALK2. Therefore, development of a new therapeutic agent having high specificity for ALK2 with respect to FOP is desired.
  • Antibody drugs that act on the extracellular domain of ALK2 to inhibit signals are highly safe treatments that utilize the physiological immune system. An antibody drug is easy to deliver a stable drug via the bloodstream, and does not act on other ALK receptor families with high identity, and can exhibit specificity that inhibits only ALK2. .
  • an inhibitory action can be expected for various mutants in the intracellular region including ALK2 wild-type and novel mutants.
  • ALK2 wild-type and novel mutants since it does not inhibit ALK3 that is expressed in cells throughout the body, a specific inhibitory antibody against ALK2 is different from a general osteoblast differentiation inhibitor in the growth, maintenance, and regeneration of normal skeletal tissue. Can be expected to be a drug with little impact.
  • antibodies that specifically bind to ALK2 and have a therapeutic effect on FOP have not been known so far.
  • An object of the present invention is to provide a substance useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for ectopic ossification and / or bone dysplasia, and a method for treating and / or preventing ectopic ossification and / or dysplasia. There is to do.
  • the present inventors diligently studied to solve the above-mentioned problems. As a result, the present inventors specifically bind to ALK2, and have a novel effect of treating and / or preventing ectopic ossification and / or bone dysplasia. The present invention was completed by successfully obtaining a novel antibody.
  • the present invention includes the following inventions.
  • A amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84
  • B amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 123 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84
  • c amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86
  • a BMP signal that specifically binds to a polypeptide sequence consisting of at least 7 amino acids in the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence described in any one of (f) to (j) below and that is mediated by ALK2
  • An antibody or antigen-binding fragment of the antibody that suppresses transmission An antibody or antigen-binding fragment of the antibody that suppresses transmission.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 85 (g) nucleotide sequence consisting of nucleotide residues 728 to 1036 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 85 (h) nucleotide sequence (i) sequence shown in SEQ ID NO: 87 (A polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence according to any one of nucleotide sequences (j) (f) to (i) consisting of nucleotide residues 728 to 1036 of the nucleotide sequence shown in No. 87 Sequence of polynucleotides that hybridize with stringent conditions
  • any of (1) to (5), wherein the antibody and the antigen-binding fragment are a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a single chain antibody, a bispecific antibody, or a multispecific antibody. Or an antigen-binding fragment thereof.
  • At least one selected from the group consisting of an antibody comprising a region, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and an antibody comprising a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 The antibody according to any one of (1) to (6), which cross-competes for binding to two antibodies and the polypeptide, Antigen-binding fragment of the body.
  • At least one selected from the group consisting of an antibody comprising a region, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and an antibody comprising a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 The antibody according to any one of (1) to (6), which binds to an epitope to which two antibodies bind, or antigen binding of the antibody Pieces.
  • the heavy chain sequence includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, the CDRH1 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 72, the CDRH2 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, and the CDRH3 Consists of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74; and a light chain sequence comprising a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, said CDRL1 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 75, Said CDRL2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and said CDRL3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77;
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (8), wherein
  • the antibody according to (15), comprising a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • An antigen-binding fragment of the antibody comprising a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the heavy chain sequence includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, the CDRH1 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 59, the CDRH2 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 60, and the CDRH3 Consists of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61; and a light chain sequence comprising a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, said CDRL1 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62,
  • the CDRL2 comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63 or 71, and the CDRL3 comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 64;
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (8), wherein
  • a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable consisting of the 21st to 133rd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36
  • the heavy chain sequence includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, the CDRH1 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 78, the CDRH2 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79, and the CDRH3 Consists of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 80; and a light chain sequence comprising a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, said CDRL1 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 81, Said CDRL2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82, and said CDRL3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 83;
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (10) and (13) to (14),
  • the antibody according to (19), comprising a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a light chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • An antigen-binding fragment of the antibody comprising a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a light chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the heavy chain sequence includes a variable region having CDRH1, CDRH2, CDRH3, the CDRH1 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 65, the CDRH2 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 66, and the CDRH3 Consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67; and the light chain sequence comprises a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, said CDRL1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68, The CDRL2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, and the CDRL3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70;
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (8) and (11) to (14),
  • the antibody according to (21), comprising a heavy chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. An antigen-binding fragment of the antibody.
  • the heavy chain comprises a constant region of a human immunoglobulin G1 heavy chain, a human immunoglobulin G2 heavy chain, or a human immunoglobulin G4 heavy chain
  • the light chain comprises a constant region of a human immunoglobulin kappa light chain (1 ) To (24).
  • A a heavy chain variable region sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: a1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30; a3) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 105; a4) an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence of a1) to a3); a5) an amino acid sequence having at least 99% identity with the amino acid sequence of a1) to a3); a6) an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the amino acid sequence of a1) to a3); and
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues 20 to 472 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 and an amino acid sequence comprising amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 468 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 105 and amino acids 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36
  • the antibody according to (33) which is an antibody consisting of a light chain comprising an amino acid sequence consisting of residues.
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues 20 to 468 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 105 and an amino acid sequence comprising amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36
  • a heavy chain variable region sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: a1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42; a3) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44; a4) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46; a5) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48; a6) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 107;
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 470 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109 and amino acids 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 56
  • the antibody according to (37) which is an antibody consisting of a light chain comprising an amino acid sequence consisting of residues.
  • a heavy chain variable region sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: a1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113; a3) an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence of a1) or a2); a4) an amino acid sequence having at least 99% identity with the amino acid sequence of a1) or a2); a5) an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the amino acid sequence of a1) or a2); and (b) a light chain variable region selected from the group consisting of the following amino acid sequences: Array: b1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to
  • a heavy chain variable region sequence selected from the group consisting of the following amino acid sequences: a1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 123; a3) an amino acid sequence having at least 95% identity with the amino acid sequence of a1) or a2); a4) an amino acid sequence having at least 99% identity with the amino acid sequence of a1) or a2); a5) an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the amino acid sequence of a1) or a2); and (b) a light chain variable region selected from the group consisting of the following amino acid sequences: Array: b1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121; a2) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to
  • a pharmaceutical composition comprising at least one of the antibody according to any one of (1) to (44) or an antigen-binding fragment of the antibody.
  • At least one of the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (44), an anti-inflammatory agent, a steroid agent, a bisphosphonate, a muscle relaxant, and retinoin A pharmaceutical composition for treating and / or preventing ectopic ossification, comprising at least one selected from the group consisting of acid receptor (RAR) ⁇ agonists.
  • RAR acid receptor
  • Ectopic ossification is progressive ossification fibrosis (FOP), progressive bone dysplasia (POH), traumatic ectopic ossification, or ectopic after artificial joint replacement
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification or ectopic after artificial joint replacement
  • composition according to (45) which is a therapeutic and / or prophylactic agent for anemia.
  • DIPG diffuse bridge glioma
  • a method of treating and / or preventing ectopic ossification characterized by comprising:
  • RAR retinoic acid receptor
  • Ectopic ossification is progressive ossification fibrosis (FOP), progressive bone dysplasia (POH), traumatic ectopic ossification, or ectopic after artificial joint replacement
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification or ectopic after artificial joint replacement
  • the treatment and / or prevention method according to (52) or (53), wherein the method is sexual ossification.
  • (59) (a) a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29; a3) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104; a4) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) to a3); a5) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) to a3); a6) a nucleotide sequence possessed by a polynucleotide that hybridizes under stringent
  • a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41; a3) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43; a4) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45; a5) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 47; a6) a nucleotide sequence consisting of nucleotide sequence consisting of
  • (61) (a) a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112; a3) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a4) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a5) a nucleotide sequence possessed by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a1) or a2); a6)
  • (62) (a) a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 120; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 122; a3) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a4) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a5) a nucleotide sequence possessed by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a1) or a2); a6)
  • a vector comprising any one of the polynucleotides according to any one of (58) to (62).
  • a transformed host cell comprising any one of the polynucleotides according to any one of (58) to (62).
  • a transformed host cell comprising the vector according to (63).
  • a therapeutic agent and / or a preventive agent for ectopic ossification and / or abnormal bone formation can be obtained.
  • FIG. 2 is a graph showing recognition of monoclonal antibodies produced by hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D to mouse ALK2-His & Fc (“mALK2-Fc”) and binding to human Fc. Medium was used as a control (“Control medium”). It is the graph which showed that the monoclonal antibody which hybridoma A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D produce does not recognize the fluorescent protein EGFP expression cell.
  • FIG. 5 is a graph showing that monoclonal antibodies produced by hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D recognize wild-type mouse ALK2-expressing cells (mALK2 (WT) -EGFP).
  • FIG. 5 is a graph showing that monoclonal antibodies produced by hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D recognize wild-type human ALK2-expressing cells (hALK2 (WT) -EGFP).
  • a graph showing that the monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D specifically recognize only ALK2-expressing cells and not ALK1, ALK3, ALK6-expressing cells. It is.
  • Monoclonal antibodies produced by hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D recognize wild-type ALK2-expressing cells and 12 types of ALK2 mutant-expressing cells identified by FOP. It is the graph which showed.
  • BMP7-induced luciferase induced by BMP7 in HEK293A cells in which monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D overexpress the wild-type and R206H mutants of ALK2 ( luc) is a graph showing that the activity is suppressed in a dose-dependent manner.
  • FIG. 3 is a graph showing that chimerized antibodies cA2-15A and cA2-27D inhibit the differentiation of C2C12 cells induced by BMP into osteoblast-like cells in a dose-dependent manner.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence of each CDR sequence of the A2-15A antibody. It is the figure which showed the amino acid sequence of each CDR arrangement
  • FIG. 10 shows the amino acid sequence of each CDR sequence of the A2-11E antibody.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence of each CDR sequence of the A2-25C antibody.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-15A-H1.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-15A-H4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-15A-L1.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-15A-L4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-15A-L6.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-15A-L7.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H1.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H2.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H3.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H5.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-27D-L1.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-27D-L2.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-27D-L3.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-27D-L4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of a DNA fragment containing a sequence encoding humanized hA2-27D-L5.
  • FIG. 5 is a graph showing that humanized A2-15A antibody (IgG1) and humanized A2-27D antibody (IgG1) suppress BMP7-induced BMP-specific luciferase (luc) activity in a dose-dependent manner.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-15A-H4 IgG2 type.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H2-LALA.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-27D-H3-LALA.
  • FIG. 3 is a graph showing that humanized A2-15A antibody (IgG2) and humanized A2-27D antibody (LALA) inhibit BMP7-induced BMP-specific luciferase (luc) activity in a dose-dependent manner.
  • FIG. 3 shows that humanized A2-15A antibody (IgG2) and humanized A2-27D antibody (LALA) suppress ectopic bone induction in mouse skeletal muscle tissue induced by BMP7.
  • FIG. 3 is a view showing an X-ray crystal structure of a complex of human ALK2-ECD and human chimeric cA2-27D-Fab.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-11E-H3.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-11E-H4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-11E-L2.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-11E-L3. It is the figure which showed the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-11E-L4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-25C-H3.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-25C-H4.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-25C-L1.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-25C-L2.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of humanized hA2-25C-L3.
  • Humanized A2-11E antibody (IgG1) and humanized A2-25C antibody (IgG1) showed dose-dependent inhibition of BMP-induced differentiation of C2C12 cells into osteoblast-like cells It is a graph.
  • FIG. 3 is a diagram showing an X-ray crystal structure of a complex of human ALK2-ECD and human chimeric cA2-25C-Fab.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA, and cRNA.
  • polynucleotide is used in the same meaning as a nucleic acid, and includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.
  • polypeptide and “protein” are used without distinction.
  • RNA fraction refers to a fraction containing RNA.
  • cell includes cells in an individual animal and cultured cells.
  • ALK2 is used in the same meaning as the ALK2 protein, and includes a wild type and a mutant (also referred to as a mutant).
  • the “antigen-binding fragment of an antibody” is also referred to as “functional fragment of an antibody” and means a partial fragment of an antibody having binding activity with an antigen.
  • Fab ′ which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab ′) 2 under reducing conditions, is also included in the antigen-binding fragment of an antibody.
  • the molecule is not limited to these molecules as long as it has the ability to bind to an antigen.
  • These antigen-binding fragments include not only those obtained by treating full-length antibody protein molecules with appropriate enzymes, but also proteins produced in appropriate host cells using genetically engineered antibody genes. It is.
  • epitope is also referred to as “antigen-binding site” and generally refers to an antigen site to which an antibody binds, consisting of at least 7 amino acids, at least 8 amino acids, at least 9 amino acids, or at least 10 amino acids of an antigen.
  • it means a partial peptide or partial tertiary structure of ALK2 to which a specific anti-ALK2 antibody binds.
  • the epitope which is a partial peptide of ALK2 can be determined by a method well known to those skilled in the art such as an immunoassay. For example, it can be performed by the following method.
  • Various partial structures of ALK2 are prepared.
  • a known oligopeptide synthesis technique can be used. For example, after preparing a series of polypeptides sequentially shortened from the C-terminus or N-terminus of ALK2 by an appropriate length using a gene recombination technique well known to those skilled in the art, the reactivity of the antibody against them is examined. After determining the recognition site, the epitope can be determined by synthesizing shorter peptides and examining their reactivity with those peptides. In addition, an epitope that is a partial three-dimensional structure of ALK2 to which a specific ALK2 antibody binds can be determined by specifying an amino acid residue of ALK2 adjacent to the antibody by X-ray crystal structure analysis.
  • the second anti-ALK2 antibody binds to the partial peptide or partial three-dimensional structure to which the first anti-ALK2 antibody binds, it can be determined that the first antibody and the second antibody have a common epitope. Also, confirm that the second anti-ALK2 antibody (cross) competes for binding of the first anti-ALK2 antibody to ALK2 (ie, the second antibody prevents binding of the first antibody to ALK2). Thus, even if the sequence or structure of a specific epitope is not determined, it can be determined that the first antibody and the second antibody have a common epitope. Further, when the first antibody and the second antibody bind to a common epitope and the first antibody has an activity such as an inhibitory activity of BMP signal via ALK2, the second antibody also has the same activity. I can expect that.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the complementarity-determining region is also called a hypervariable domain, and is located in the variable region of the heavy and light chains of the antibody and has a particularly high primary structure variability.
  • the polypeptide chains are separated at three locations on the primary structure of the polypeptide chain.
  • the complementarity determining region of an antibody is expressed as CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence, and the complementarity determining region of the light chain is lightly expressed.
  • CDRL1, CDRL2, and CDRL3 are represented from the amino terminal side of the chain amino acid sequence. These sites are close to each other on the three-dimensional structure and determine the specificity for the antigen to be bound.
  • hybridize under stringent conditions means to hybridize at about 50-70 ° C. (for example, 68 ° C.) in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech), or After hybridization at about 50-70 ° C. (eg, 68 ° C.) in the presence of about 0.7-1.0 M NaCl using a filter on which DNA is immobilized, about 0.1-2 times the concentration of SSC Use a solution (single-concentration SSC consists of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate. If necessary, the solution may contain about 0.1-0.5% SDS). Conditions that can be identified by washing at about 50-70 ° C. (eg 68 ° C.) At the same say that hybridizes under the same conditions.
  • “several” when there are descriptions “1 to several” and “one or several” means 2 to 10. Preferably, it is 10 or less, more preferably 5 or 6 or less, and still more preferably 2 or 3.
  • ALK2 The ALK2 gene is a responsible gene of FOP that encodes a kind of BMP receptor that induces ectopic bone formation in soft tissues including skeletal muscle tissues. Mutant ALK2 with amino acid substitutions has been found in familial and sporadic FOP cases.
  • the mutant forms of human ALK2 include L196P (mutation in which 196th leucine is replaced by proline), delP197_F198insL (mutation in which 197th proline and 198th phenylalanine are deleted, and leucine is inserted), R202I (202 Arginine substituted with isoleucine), R206H (206th arginine substituted with histidine), Q207E (207th glutamine substituted with glutamic acid), R258S (258th arginine substituted with serine) ), R258G (mutation in which the 258th arginine is substituted with glycine), G325A (mutation in which the 325th glycine is substituted with alanine), G328E (variation in which the 328th glycine is substituted with glutamic acid) ), G328R (mutation in which the 328th glycine is replaced with arginine), G328W (mutation in which the 328
  • ALK2 used in the present invention can be obtained by synthesis in vitro or by producing it in a host cell by genetic manipulation. Specifically, ALK2 cDNA is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or eukaryotic host cells. The protein can be obtained by expressing ALK2 by transforming.
  • ALK2 used in the present invention is ALK2 derived from mammals including humans and mice.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of human ALK2 can be obtained by referring to GenBank accession number NM-001105.
  • SEQ ID NO: 84 the nucleotide sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 85.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of mouse ALK2 is available by reference to GenBank accession number NP-0011033674, the amino acid sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 86, and the nucleotide sequence is also disclosed herein as SEQ ID NO: 87.
  • ALK2 is sometimes called ACVR1 (Activin A type I Receptor 1) or ACTR1 (Activin Receptor Type 1), which all indicate the same molecule.
  • ALK2 cDNA can be obtained by, for example, polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a cDNA library expressing ALK2 cDNA as a template and a primer that specifically amplifies ALK2 cDNA (Saiki, R. et al. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49).
  • PCR polymerase chain reaction
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence encoding human or mouse ALK2, and that encodes a protein having a biological activity equivalent to ALK2, is also ALK2.
  • a polynucleotide that is a splicing variant transcribed from a human or mouse ALK2 locus or a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions thereto, and that encodes a protein having a biological activity equivalent to that of ALK2, is also ALK2. contained in cDNA.
  • ALK2 It consists of an amino acid sequence of human or mouse ALK2, or an amino acid sequence obtained by subtracting, deleting, or adding one or several amino acids in the amino acid sequence obtained by removing the signal sequence from these sequences, and is equivalent to ALK2. Proteins having the biological activity of ALK2 are also included in ALK2. Furthermore, the amino acid sequence encoded by the splicing variant transcribed from the human or mouse ALK2 locus, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added, and ALK2 ALK2 also includes a protein having a biological activity equivalent to that of ALK2.
  • Ectopic ossification means that a bone is formed in a site where bone is not originally present, and “abnormal bone formation” means that there is an abnormality in the shape and quality of existing bone.
  • Ectopic ossification includes progressive ossification fibrodysplasia (FOP), progressive bone dysplasia (POH), traumatic ectopic ossification, ectopic nature after artificial joint replacement
  • FOP progressive ossification fibrodysplasia
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification ectopic nature after artificial joint replacement
  • Examples of “bone dysplasia” as ossification include spondyloarthritis (SpA) and ankylosing spondylitis (AS), but are not limited thereto.
  • ALK2 is a transmembrane serine / threonine kinase receptor that binds BMP, binds BMP in the extracellular region on the N-terminal side, and is downstream in the intracellular signal transduction system by serine / threonine kinase in the cell.
  • BMP Bone morphogenetic protein
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • BMP-2 and BMP-4 are considered to have higher affinity for ALK3 than ALK2.
  • ALK3 is expressed more ubiquitously than ALK2, it is considered that BMP-2 and BMP-4 are commonly used in experiments for inducing ectopic ossification at various sites.
  • BMP-7 has a relatively high affinity for ALK2, and BMP-9 is generally considered to have a high affinity for ALK1, but it also has a relatively high affinity for ALK2. I know. Since ectopic ossification via ALK2 occurs in FOP, the efficacy against ectopic bone induction by the activation of AMP2 mediated signal by BMP-7 and BMP-9 is verified. It is considered that the presence or absence of therapeutic and / or prophylactic effects can be confirmed.
  • BMP signaling via ALK2 can be analyzed by a model for inducing differentiation into osteoblasts by BMP using C2C12 cells.
  • the antibody against ALK2 of the present invention can be obtained, for example, by the method described in WO2009 / 091048, WO2011 / 027808, or WO2012 / 133572. That is, a non-human animal is immunized with a target antigen, lymphoid fluid, lymphoid tissue, blood cell sample or bone marrow-derived cells are collected from the immunized animal, and the non-human animal plasma cells that specifically bind to the target antigen and / or Alternatively, plasmablasts are selected.
  • An antibody gene against the target antigen is collected from the obtained plasma cells and / or plasma blasts, the base sequence thereof is identified, and the antibody or antibody fragment can be obtained based on the base sequence of the identified gene.
  • antibodies or antibody fragments can be obtained by obtaining plasma cells and / or plasmablasts from the blood of a human-infected patient.
  • the obtained antibodies can be screened for antibodies applicable to human diseases by testing the binding to ALK2. Examples of the monoclonal antibody thus obtained include A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D.
  • amino acid positions assigned to the CDR / FR characterizing the antibody are KABAT numbering (KABAT et al., Sequences of Proteins of Immunological Institute, 5th Ed. Public Health Health. (1991)).
  • Hybridomas can be established by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against ALK2 and myeloma cells to obtain monoclonal antibodies. Specific examples of such a method are described in WO2009 / 48072 (published on April 16, 2009) and WO2010 / 117011 (published on October 14, 2010). However, the method for obtaining a monoclonal antibody corresponds to an established field, and is not limited to the above specific examples.
  • the antibody of the present invention has a therapeutic / preventive effect, for example, a polyclonal antibody, or a genetically engineered gene modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity against humans, etc.
  • a therapeutic / preventive effect for example, a polyclonal antibody, or a genetically engineered gene modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity against humans, etc.
  • type antibodies for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and the like. These antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody examples include antibodies in which the variable region and the constant region (Fc) of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which a variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).
  • a chimeric antibody in which a variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).
  • the chimeric antibody derived from A2-15A it consists of a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 472 of SEQ ID NO: 20 in the sequence listing, and amino acid residues 21 to 237 of SEQ ID NO: 22.
  • an antibody consisting of a light chain having an amino acid sequence a chimeric antibody derived from A2-27D, a heavy chain having an amino acid sequence consisting of the 20th to 470th amino acid residues of SEQ ID NO: 24 in the Sequence Listing, and SEQ ID NO: 26
  • or 234th amino acid residue can be mentioned.
  • Humanized antibodies include antibodies in which only CDRs are incorporated into human-derived antibodies (see Nature (1986) 321, p.522-525), and by CDR grafting, the amino acid residues of some frameworks in addition to the CDR sequences.
  • Examples of the antibody include an antibody (International Publication No. WO90 / 07861 pamphlet) transplanted to a human antibody.
  • the humanized antibody derived from the A2-15A antibody includes all six CDR sequences of A2-15A and is included in the antibody of the present invention as long as it has binding activity to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-15A antibody includes CDRH1 (GFTFSHYYMA) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59, CDRH2 (SITNSGGSINYRDSVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60, and SEQ ID NO: 61.
  • CDRH3 EGGENYGGYPPFAY
  • the light chain variable region of the A2-15A antibody is represented by CDRL1 (RANQGVSLSRYNLMH) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62, CDRL2 (RSSNLAS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63, and SEQ ID NO: 64.
  • CDRL3 QQSRESPFT
  • the humanized antibody derived from the A2-27D antibody is included in the antibody of the present invention as long as it contains all six A2-27D CDR sequences and has binding activity to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-27D antibody is represented by CDRH1 (GSTFSNYGMK) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65, CDRH2 (SISRSSTYYYADTVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 67.
  • CDRH3 AISTPFYWYFDF
  • the light chain variable region of the A2-27D antibody is represented by CDRL1 (LASSSVSYMT) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68, CDRL2 (GTSNLAS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, and SEQ ID NO: 70.
  • CDRL3 LHLTSYPPPYT
  • the humanized antibody derived from the A2-11E antibody includes all six CDR sequences of A2-11E and is included in the antibody of the present invention as long as it has binding activity to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-11E antibody includes CDRH1 (GFTFSNYYMY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 72, CDRH2 (SINTDGSTYYPDSVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73, and SEQ ID NO: 74.
  • CDRH3 STPNIPLAY
  • the light chain variable region of the A2-11E antibody is represented by CDRL1 (KASQNIYKYLN) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 75, CDRL2 (YSNSLQT) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 77.
  • CDRL3 FQYSSGPT
  • the amino acid sequences of these CDRs are also shown in FIG.
  • the humanized antibody derived from the A2-25C antibody includes all six CDR sequences of A2-25C and is included in the antibody of the present invention as long as it has binding activity to ALK2.
  • the heavy chain variable region of the A2-25C antibody includes CDRH1 (GFTFSYYAMS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78, CDRH2 (SISRGGDNTYYRDTVKG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 79, and SEQ ID NO: 80.
  • CDRH3 LNYNNYFDY
  • the light chain variable region of the A2-25C antibody is represented by CDRL1 (QASQDIGNWLS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 81, CDRL2 (GATSLAD) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82, and SEQ ID NO: 83.
  • CDRL3 LQAYSAPFT
  • CDRL2 examples include CDRL2 in which one amino acid is substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34.
  • CDRL2 RSSNLAQ
  • RSSNLAQ consists of an amino acid sequence shown by sequence number 71. The amino acid sequence of this CDR is also described in FIG.
  • humanized antibodies derived from the A2-15A antibody include an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 of the sequence listing, and 20 to 20 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30.
  • a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of the 142nd amino acid residue, or an amino acid sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 105 of the Sequence Listing, and SEQ ID NO:
  • a preferred combination includes a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 and amino acids 21 to 133 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.
  • a more preferable combination is a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 472 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28 and amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.
  • An antibody comprising a light chain comprising the amino acid sequence comprising the amino acid residue of the th, a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 472th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 32 Consisting of a light chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 238 of the sequence A heavy chain containing an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 472 of the
  • Further preferred combinations include a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 142 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 and amino acid sequences 21 to 133 of SEQ ID NO: 36.
  • a heavy chain comprising the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 472 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 and the 21st to 238th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36 are used.
  • An antibody comprising a light chain comprising an amino acid sequence comprising a group, or a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues 20 to 468 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 105 and 21 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36
  • or the 238th amino acid residue can be mentioned.
  • the most preferred combination is a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 468 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 105 and amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.
  • humanized antibodies derived from the A2-27D antibody include an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 of the sequence listing, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the sequence listing Amino acid sequence consisting of 20th to 140th amino acid residues, amino acid sequence consisting of 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 of the sequence listing, amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 of the sequence listing Amino acid sequence consisting of 20th to 140th amino acid residues, amino acid sequence consisting of 20th to 140th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48, and 20th to 140th amino acid sequences of amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 107 An amino acid sequence consisting of amino acid residues, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109 A heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of 0 to 140th amino acid residues
  • a preferred combination includes a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 and amino acids 21 to 129 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50.
  • the antibody which consists of a light chain containing the light chain variable region sequence which consists of a 129th amino acid residue can be mentioned.
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 470 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 and amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 50
  • An antibody comprising a light chain comprising the amino acid sequence comprising: a heavy chain comprising the amino acid sequence of amino acids 20 to 470 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40; and 21 to 234 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52
  • An antibody comprising a light chain comprising an amino acid sequence comprising the amino acid residue of the th, a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 470th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 54
  • An anti-light chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 234 of the sequence
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 470th amino acid residues of the amino
  • Further preferred combinations include a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 and amino acid sequences 21 to 129 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52.
  • a heavy chain containing the amino acid sequence consisting of the 20th to 470th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42 and the 21st to 234th amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 are used.
  • An antibody comprising a light chain comprising an amino acid sequence comprising the 234th amino acid residue, a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 470th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 107, and SEQ ID NO: 52 Is it a light chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence?
  • a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues 20 to 470 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 109 and an amino acid comprising amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56
  • Mention may be made of antibodies consisting of a light chain comprising a sequence.
  • the most preferred combination is a heavy chain comprising an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 470 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 107 and amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52.
  • An antibody consisting of a light chain comprising an amino acid sequence consisting of the 234th amino acid residue can be mentioned.
  • humanized antibodies derived from the A2-11E antibody include an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111 of the sequence listing, or 20 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113.
  • a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 137 to 137, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 115, shown in SEQ ID NO: 117
  • a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of the amino acid sequence or an amino acid sequence consisting of amino acid sequences 21 to 128 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 119 Any combination can be mentioned.
  • a preferred combination includes a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111 and amino acids 21 to 128 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 115.
  • a more preferred combination is a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 467 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 111 and amino acid residues 21 to 233 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 115.
  • An antibody comprising a light chain comprising an amino acid sequence comprising the amino acid residue of the th, a heavy chain comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 119 Contains an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of the sequence
  • humanized antibodies derived from the A2-25C antibody include an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121 of the sequence listing, or 20 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 123.
  • a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 137 to 137, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 125, shown in SEQ ID NO: 127
  • a light chain comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence comprising the 21st to 129th amino acid residues of the amino acid sequence, or an amino acid sequence comprising the 21st to 129th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 129 Any combination can be mentioned.
  • a preferred combination includes a heavy chain comprising a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 137 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121 and amino acids 21 to 129 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 125.
  • a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 467 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121 and amino acid residues 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 125 An antibody consisting of a light chain comprising the amino acid sequence consisting of: a heavy chain comprising the amino acid sequence of amino acids 20 to 467 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 121; and 21 to 234 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 127
  • An antibody comprising a light chain comprising the amino acid sequence comprising the amino acid residue of the th, a heavy chain comprising the amino acid sequence comprising the 20th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 121, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 129 Includes an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 234 of the sequence
  • an anti-ALK2 human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
  • the anti-ALK2 human antibody is a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133. Kuroiwa, Y. et.al., Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects.10. p.
  • the endogenous immunoglobulin heavy chain and light chain loci are disrupted, and instead human artificial chromosome (HAC) vectors and mouse artificial chromosomes (Mouse artificial chromosomes).
  • HAC human artificial chromosome
  • Mouse artificial chromosomes mouse artificial chromosomes
  • MAC chromosome
  • a recombinant human monoclonal antibody is produced by transforming a eukaryotic cell with a cDNA encoding each of the heavy chain and light chain of such a human antibody, preferably a vector containing the cDNA, by genetic recombination technology.
  • This antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cells.
  • eukaryotic cells preferably CHO cells
  • mammalian cells such as lymphocytes and myeloma can be used as the host.
  • a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library (Wormstone, IM et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Mé, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; Siriwardena, D. et., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431 etc.) are also known.
  • a phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105) in which a variable region of a human antibody is expressed on a phage surface as a single chain antibody (scFv) and a phage that binds to an antigen is selected. ⁇ 1116) can be used. By analyzing the gene of the phage selected by binding to the antigen, the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • an expression vector having the sequence is prepared, and introduced into a suitable host for expression to obtain a human antibody (WO92 / 01047, WO92 / 20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
  • Antibodies having the same epitope as the antibody provided by the present invention are also included in the antibody of the present invention. Examples thereof include antibodies having the same epitope as the A2-11E antibody, A2-15A antibody, A2-25C antibody and / or A2-27D antibody.
  • the epitope of such antibody is determined by identifying amino acid residues on the antigen adjacent to the antibody using X-ray structural analysis Can do.
  • an amino acid residue on an antigen having an interaction distance with an antibody can be specified by binding an antibody or a fragment thereof and an antigen or a fragment thereof for crystallization, and conducting structural analysis.
  • the interaction distance is 8 angstroms ( ⁇ ) or less, preferably 6 ⁇ or less, and more preferably 4 ⁇ or less.
  • One or more amino acid residues having an interaction distance with such an antibody may constitute an antibody epitope (antigen-binding site). When there are two or more such amino acid residues, each amino acid may not be adjacent to each other on the primary sequence.
  • a peptide containing the Fab fragment of the chimeric A2-27D antibody and the human ALK2 ECD fragment (amino acid numbers 21 to 123 of SEQ ID NO: 84) was bound, and (2% (v / v) Tacsimate pH 7.0, 100 mM HEPES pH 7.
  • the body group is monoclinic
  • the space group is C121
  • b 37.32 ⁇
  • the phase can be determined by performing a molecular replacement method using the three-dimensional structure coordinates (see Example 16).
  • the A2-27D antibody recognizes a partial higher order structure on human ALK2.
  • the amino acid residues having an interaction distance with the A2-27D antibody, that is, the epitopes are the 18th glutamic acid (Glu), the 19th glycine (Gly), and the 39th isoleucine.
  • An antibody that binds to such an epitope or has an interaction distance with such an amino acid residue, an antigen-binding fragment thereof, or a modified form thereof is also encompassed in the antibody, the antigen-binding fragment thereof, or a modified form thereof of the present invention.
  • the phase can be determined by performing a molecular replacement method using the three-dimensional structural coordinates (see Example 21).
  • the A2-25C antibody recognizes a partial higher order structure on human ALK2.
  • the amino acid residues having an interaction distance with the A2-25C antibody, that is, the epitopes are the 18th glutamic acid (Glu), the 19th glycine (Gly), and the 20th leucine. (Leu), 39th isoleucine (Ile), 40th asparagine (Asn), 41st aspartic acid (Asp), 42nd glycine (Gly), 43rd phenylalanine (Phe), 44th histidine ( His), 45th valine (Val), 46th tyrosine (Tyr), 84th threonine (Thr).
  • An antibody that binds to such an epitope or has an interaction distance with such an amino acid residue, an antigen-binding fragment thereof, or a modified form thereof is also encompassed in the antibody, the antigen-binding fragment thereof, or a modified form thereof of the present invention.
  • the above antibody can be selected for a suitable antibody by evaluating the binding property to the antigen by the method shown in Example 2, Example 6, Example 9 or Example 10.
  • the dissociation constant of the antibody is, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M, but is not limited to this range as long as the desired therapeutic or prophylactic effect can be obtained with the antibody of the present invention.
  • the dissociation constant between the antibody and the antigen can be measured using Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience) based on the detection principle of surface plasmon resonance (SPR).
  • the binding rate constant ka1, dissociation rate constant kd1, and dissociation constant (KD) KD kd1 / ka1) can be obtained.
  • the evaluation of the binding to ALK2 is not limited to the use of Biacore T200, but a device based on surface plasmon resonance (SPR) as a detection principle, KinExA (Sapidyne Instruments, Inc.) based on a binding equilibrium exclusion method (Kinetic Exclusion Assay), A BLItz system (Pall) or an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method using a bio-layer interferometry (Bio-Layer Interferometry) as a detection principle is also possible.
  • SPR surface plasmon resonance
  • KinExA Stemetic Exclusion Assay
  • a BLItz system Pall
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • An example of another index for comparing the properties of antibodies is antibody stability.
  • DSC Differential scanning calorimetry
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • the difference in thermal stability can be compared by measuring the Tm value using DSC and comparing the values.
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • a suitable antibody can be selected using stability as an index.
  • Other indicators for selecting antibodies include high yields in suitable host cells and low aggregation in aqueous solutions. For example, since the antibody with the highest yield does not necessarily exhibit the highest thermal stability, it is necessary to select the most suitable antibody for human administration based on a comprehensive judgment based on the above-mentioned indicators. .
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a single heavy chain variable region and no light chain sequence.
  • Such an antibody is called a single domain antibody (sdAb) or nanobody, and is actually observed in a camel or llama and reported to retain antigen-binding ability.
  • sdAb single domain antibody
  • nanobody single domain antibody
  • the above antibody can also be interpreted as a kind of antigen-binding fragment of the antibody in the present invention.
  • WO99 / 54342, WO2000 / 61739, WO2002 / 31140 and the like are known as techniques for regulating antibody sugar chain modification, but are not limited thereto.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • the antibody gene include a gene (or polynucleotide) encoding the heavy chain sequence of the antibody described in the present specification, a gene (or polynucleotide) encoding the light chain sequence, or those genes (or polynucleotides). And a combination of nucleotides).
  • polynucleotide encoding the antibody or antibody component (heavy chain or light chain) are as follows.
  • polynucleotide (a) and / or (b).
  • A a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29; a3) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 426 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104; a4) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) to a3); a5) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) to a3); a6) a nucleotide sequence possessed by
  • polynucleotide (a) and / or (b).
  • A a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 39; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41; a3) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43; a4) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45; a5) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 420 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 47;
  • polynucleotide (a) and / or (b).
  • A a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 110; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 112; a3) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a4) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a5) a nucleotide sequence possessed by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleo
  • polynucleotide (a) and / or (b).
  • A a polynucleotide selected from the group consisting of the following nucleotide sequences: a1) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 120; a2) a nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 411 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 122; a3) a nucleotide sequence having at least 95% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a4) a nucleotide sequence having at least 99% identity with the nucleotide sequence of a1) or a2); a5) a nucleotide sequence possessed by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the
  • the heavy chain sequence gene (or polynucleotide) and the light chain sequence gene (or polynucleotide) can be inserted into the same expression vector, or can be expressed separately. It can also be inserted into a vector.
  • animal cells include mammalian cells such as COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL), which are monkey cells.
  • -1658 Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase-deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (1980) 77, p. 4126-4220).
  • CHO cells ATCC CCL-61
  • dihydrofolate reductase-deficient strain Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (1980) 77, p. 4126-4220.
  • Escherichia coli and Bacillus subtilis can be mentioned, for example.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. In the above culture method, the yield may vary depending on the sequence of the antibody. From the antibodies having equivalent binding activity, those that can be easily produced as pharmaceuticals can be selected using the yield as an index.
  • IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
  • IgM IgA (IgA1, IgA2)
  • IgD or IgE preferably IgG or IgM
  • IgG1, IgG2 or IgG4 can be mentioned.
  • IgG1 When IgG1 is used as the isotype of the antibody of the present invention, the effector function can be adjusted by substituting a part of the amino acid residues in the constant region (WO88 / 07089, WO94 / 28027, WO94 / 29351). reference).
  • IgG1 mutants include IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A), and preferably IgG1 LALA.
  • IgG4 When IgG4 is used as the isotype of the antibody of the present invention, by substituting a part of the amino acid residues in the constant region, it is possible to suppress the division specific to IgG4 and to extend the half-life (Molecular Immunology, 30, 1-105-108 (1993)).
  • IgG4 variants include IgG4 pro (IgG4-S241P).
  • the antibody of the present invention may be an antigen-binding fragment of an antibody having an antigen-binding portion of the antibody or a modified product thereof.
  • a fragment of the antibody can be obtained by treating the antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin, or modifying the antibody gene by a genetic engineering technique and expressing it in an appropriate cultured cell.
  • a fragment that retains all or part of the functions of the full-length antibody molecule can be referred to as an antigen-binding fragment of an antibody.
  • Antibody functions generally include antigen-binding activity, activity that inhibits antigen activity, activity that enhances antigen activity, antibody-dependent cytotoxicity, complement-dependent cytotoxicity, and complement-dependence Mention may be made of cellular cytotoxic activity.
  • the function of the antigen-binding fragment of the antibody in the present invention is ALK2 binding activity, preferably activity that inhibits ALK2 activity, more preferably activity that suppresses BMP signaling through ALK2. Most preferably, the activity is to suppress ectopic ossification and / or bone dysplasia.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fv, or single chain Fv (scFv) in which Fv of heavy chain and light chain are linked by an appropriate linker, diabody (diabody or diabodies), Examples include linear antibodies and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • Fab ′ which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab ′) 2 under reducing conditions, is also included in the antibody fragment.
  • the antibody of the present invention may be a multispecific antibody having specificity for at least two different antigens.
  • a molecule binds to two types of antigens (ie, bispecific antibodies), but the “multispecific antibody” in the present invention is more than that (for example, three types). It includes an antibody having specificity for the antigens.
  • the multispecific antibody of the present invention may be a full-length antibody or a fragment of such an antibody (for example, a bispecific antibody).
  • Bispecific antibodies can be prepared by combining the heavy and light chains (HL pairs) of two types of antibodies, or by hybridizing hybridomas that produce different monoclonal antibodies to produce a bispecific antibody. It can also be produced by producing cells (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539).
  • the antibody of the present invention may be a single chain antibody (also referred to as scFv).
  • a single-chain antibody is obtained by linking an antibody heavy chain variable region and light chain variable region with a polypeptide linker (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg and Moore, edited by Springer Verlag, New). York, p. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136)
  • a BiscFv fragment produced by linking two scFvs with a polypeptide linker is used as a bispecific antibody. It can also be used.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked via a linker that does not form a conjugate, preferably a polypeptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883).
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region in scFv may be derived from the same antibody or different antibodies.
  • the polypeptide linker that links the variable regions for example, any single chain peptide consisting of 12 to 19 residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the heavy chain or heavy chain variable region of the antibody, and a DNA encoding the light chain or light chain variable region.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained in accordance with conventional methods.
  • ScFv can be obtained according to the method.
  • These antibody fragments can be produced by a host after obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the antibody of the present invention may be one that has been increased in quantity and has increased affinity for the antigen.
  • the antibody that multiplies may be one type of antibody or a plurality of antibodies that recognize multiple epitopes of the same antigen. Examples of the method for increasing the number of antibodies include binding of IgG CH3 domain and two scFvs, binding to streptavidin, introduction of helix-turn-helix motif, and the like.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody that is a mixture of a plurality of types of anti-ALK2 antibodies having different amino acid sequences.
  • a polyclonal antibody a mixture of plural kinds of antibodies having different CDRs can be mentioned.
  • a polyclonal antibody a mixture of cells producing different antibodies can be cultured, and an antibody purified from the culture can be used (see WO2004 / 061104).
  • the antibody of the present invention may be an antibody having 80% to 99% identity compared to the heavy chain and / or light chain of the above antibody.
  • identity shall have the general definition used in the art.
  • The% identity refers to the percentage of the number of identical amino acids per total number of amino acids (including gaps) when the two amino acid sequences are aligned (aligned) for maximum amino acid identity.
  • amino acid sequence in which 1 to several amino acid residues are substituted, deleted, and / or added to the heavy chain and / or light chain amino acid sequences, various actions equivalent to those of the above antibodies can be achieved. It is possible to select an antibody having.
  • the number of amino acid residues to be substituted, deleted and / or added is generally 10 amino acid residues or less, preferably 5 to 6 amino acid residues, more preferably 2 to 3 amino acid residues or less. And most preferably 1 amino acid residue.
  • deletion of these heavy chain sequences or modification of heavy or light chain sequences has an effect on the antigen-binding ability and effector functions (such as complement activation and antibody-dependent cytotoxicity) of antibodies. Does not reach.
  • the present invention includes antibodies that have undergone such deletions or modifications, and deletions in which one or two amino acids have been deleted at the heavy chain carboxyl terminus, and such deletions that have been amidated (for example, carboxyls)
  • a heavy chain in which the proline residue at the terminal site is amidated an antibody in which the amino terminal amino acid residue of the heavy chain or light chain is pyroglutamylated, and the like.
  • the carboxyl-terminal deletion of the heavy chain of the antibody according to the present invention is not limited to the above type.
  • the two heavy chains constituting the antibody according to the present invention may be either one of the full length and the heavy chain selected from the group consisting of the above-mentioned deletion forms, or a combination of any two of them. It may be a thing.
  • the amount ratio of each deletion can be influenced by the type and culture conditions of cultured mammalian cells producing the antibody according to the present invention, but the main component of the antibody according to the present invention is the carboxyl in both of the two heavy chains. A case where one terminal amino acid residue is deleted can be mentioned.
  • Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, ZhangDangMl, Web. (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • Blast algorithm can be found on the Internet at www. ncbi. nlm. nih. It can also be used by accessing gov / blast. Note that two types of percentage values of Identity (or Identities) and Positivity (or Positivity) are calculated by the above Blast algorithm.
  • the former is a value when amino acid residues are identical between two types of amino acid sequences whose identity is to be obtained, and the latter is a numerical value considering amino acid residues having similar chemical structures.
  • the identity value is defined by having the identity value when the amino acid residues match.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibody of the present invention may be one in which these antibody and another drug form a conjugate (Immunoconjugate).
  • conjugate examples include those in which the antibody is bound to a radioactive substance or a compound having a pharmacological action (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Stratesies) for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies:. A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ( 988)) it is not intended to be limited thereto.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography.
  • chromatography can be performed using liquid chromatography such as HPLC or FPLC.
  • Examples of columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns.
  • Hyper D Hyper D
  • POROS Sepharose F. F. (GE health care) and the like.
  • Drug containing anti-ALK2 antibody From the anti-ALK2 antibody obtained by the method described in the above-mentioned section "4. Production of anti-ALK2 antibody", an antibody that inhibits the biological activity of ALK2 can be obtained. Since these antibodies that inhibit the biological activity of ALK2 inhibit the biological activity of ALK2 in vivo, that is, BMP signaling through ALK2, as a medicine, treatment for ectopic ossification and / or bone dysplasia and It can be used as a preventive agent or / and a treatment and / or preventive agent for anemia.
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification artificial joint Ectopic ossification after replacement
  • SpA spondyloarthritis
  • AS ankylosing spondylitis
  • DIPG diffuse pontine glioma
  • FOP progressive ossification Dysplasia
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification or ectopic ossification after artificial joint replacement
  • progressive ossification fiber if it is a dysplasia (FOP), if it is a disease resulting from BMP signaling via ALK2, it is not limited to these.
  • FOP progressive ossification Dysplasia
  • POH progressive bone dysplasia
  • traumatic ectopic ossification or ectopic ossification after artificial joint replacement
  • progressive ossification fiber if it is a disease resulting from BMP signaling via ALK2, it is not limited to these.
  • fusion or deformation of fingers and toes, fusion or deformation of the cervical spine, etc. are also observed, and hearing loss is also observed, but these are also included in diseases caused by BMP signaling via ALK2.
  • mutations have been observed in ALK2 in all FOP patients, and more than 10 mutation types have been reported so far. All of these mutations are known to be amino acid mutations (missense mutations) present in the intracellular region of the ALK2 protein, and there is no change in the amino acid sequence of the extracellular region. Since the antibody of the present invention binds to the extracellular region of ALK2, it can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for all FOP patients regardless of the type of mutation.
  • the treatment of FOP means healing of symptoms of FOP, improvement of symptoms, reduction of symptoms, or suppression of progression of symptoms.
  • ⁇ Prevention of FOP means avoiding or suppressing the occurrence of flare-up or ectopic ossification.
  • Non-inherited ectopic ossification includes ectopic ossification after brain contusion, ectopic ossification after spinal cord injury, ectopic ossification after burn injury, ectopic bone after artificial joint replacement For example.
  • immune cells such as neuropeptides, mast cells and macrophages has been reported as the cause of these non-inherent ectopic ossifications (J. Cell.
  • the antibody of the present invention can be used not only for ectopic ossification in FOP but also as a therapeutic and / or prophylactic agent for non-inherited ectopic ossification.
  • Hepcidin is known as a target gene whose transcription is positively controlled by the anemia BMP-ALK signaling pathway (see Blood, 118, 15 (2011)). Hepcidin is a peptide hormone produced mainly in the liver, and controls the degradation of a transporter (Ferroportin) involved in iron absorption expressed in the digestive tract (see Science, 306, 5704 (2004)). Since inhibition of Hepcidin function or suppression of expression level leads to promotion of iron uptake from the gastrointestinal tract through increase in expression level of Ferroportin, it has been reported that it may be a therapeutic drug for anemia (Pharmacol Ther, 146 (2015).). Therefore, the antibody of the present invention can also be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for iron deficiency anemia by increasing iron absorption through suppression of hepcidin expression in the liver.
  • the antibody of the present invention can also be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for diffuse bridge glioma (DIPG).
  • DIPG is a diffuse (invasive) astrocytic tumor found in the brainstem bridge, and is said to account for about 75-80% of childhood brainstem tumors. There is a report that the survival rate is reduced to about 10% in 2 years because the function is controlled (Khuong-Quung DA et al., Acta Neuropathol 124: 439-447, 2012).
  • the antibody of the present invention can also be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for DIPG.
  • Examples of the above-mentioned anti-ALK2 antibody as a medicament were prepared from the A2-15A antibody, A2-27D antibody, A2-11E antibody, or A2-25C antibody by the method described in “4. Production of anti-ALK2 antibody”. Mention may be made of chimeric antibodies or humanized antibodies. In addition, chimeric antibodies, humanized antibodies and human antibodies having the same epitope as the A2-15A antibody, A2-27D antibody A2-11E antibody, and / or A2-25C antibody can also be used as medicaments.
  • ALK2 biological activity includes, for example, luciferase assay using a BMP response element-inserted reporter plasmid, phosphorylation of SMAD1 / 5/8, BMP target gene This can be confirmed by measuring alkaline phosphatase activity in mouse myoblast C2C12 in which differentiation into osteoblasts was induced by expression analysis or stimulation with BMP ligand.
  • the treatment or prevention effect of ectopic ossification or bone dysplasia of anti-ALK2 antibody using an in vivo experimental animal is, for example, an ectopic ossification induction model in which a BMP ligand-containing pellet is transplanted into a mouse muscle,
  • anti-ALK2 antibody can be administered subcutaneously or intravenously to FOP model mice into which mutant ALK2 has been introduced, and the formation of ectopic bone can be confirmed.
  • the anti-AKL2 antibody thus obtained is useful as a pharmaceutical, particularly as a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of ectopic ossification such as progressive ossification fibrosis (FOP). .
  • FOP progressive ossification fibrosis
  • the anti-ALK2 antibody may be administered alone or in combination with at least one other ectopic ossification therapeutic agent for the treatment or prevention of ectopic ossification. it can.
  • an anti-ALK2 antibody can be administered in combination with a therapeutically effective amount of a therapeutic agent.
  • Other ectopic ossification treatments that can be administered in combination with anti-ALK2 antibodies include anti-inflammatory agents, steroids, bisphosphonates, muscle relaxants, retinoic acid receptor (RAR) ⁇ agonists, etc. However, it is not limited to these.
  • anti-inflammatory agent examples include aspirin, diclofenac, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, piroxicam, rofecoxib, celecoxib, azathioprine, penicillamine, methotrexate, sulfasalazine, leflunomide, infliximab, etanercept, etc. Piroxicam or celecoxib.
  • steroid agent examples include prednisolone, beclomethasone, betamethasone, fluticasone, dexamethasone, hydrocortisone, and prednisolone is preferable.
  • bisphosphonates include alendronate, simadronate, clodronate, etidronate, ibandronate, incadronate, minodronate, neridronate, olpadronate, pamidronate, pyridronate, risedronate, tiludronate, zoledronate, and preferably pamidronate. Or zoledronate.
  • muscle relaxant examples include cyclobenzaprine, metaxalone, baclofen and the like, preferably baclofen.
  • retinoic acid receptor ⁇ agonists examples include Palovarotene and the like.
  • two, three or more other therapeutic agents may be administered, and these other therapeutic agents may be of the same formulation. It can be administered simultaneously by encapsulating in. Other therapeutic agents and the anti-ALK2 antibody can be administered simultaneously by encapsulating them in the same preparation. Alternatively, the anti-ALK2 antibody and other therapeutic agent can be encapsulated in separate preparations and administered simultaneously. Furthermore, another drug and anti-ALK2 antibody can be administered separately in succession.
  • a therapeutic agent containing an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody as an active ingredient is administered after administration of another therapeutic agent, or an anti-ALK2 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody is contained as an active ingredient
  • Other therapeutic agents may be administered after the therapeutic agent is administered.
  • the protein ectopic ossification therapeutic agent gene and the anti-ALK2 antibody gene can be inserted separately or downstream of the same promoter region, separately or in the same vector Can be introduced.
  • any antibody fragment can be applied as long as the recognition of ALK2 is not completely lost.
  • fragments such as Fab, F (ab ′) 2 , and Fv are examples.
  • antibodies and fragments thereof can be used in the same manner.
  • the binding mode of the anti-ALK2 antibody or a fragment of the antibody and the FOP therapeutic agent is described in M.M. C.
  • Garnet “Targeted drug conjugates: principals and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G.A. T. T. et al. Hermanson “Bioconjugate Technologies” Academic Press, California (1996), Putnam and J. et al.
  • Kopecek Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. That is, mention may be made of a mode in which an anti-ALK2 antibody and an ectopic ossification therapeutic agent are bound chemically directly or via a spacer such as an oligopeptide, or a mode in which a suitable drug carrier is bound. it can.
  • Examples of drug carriers include liposomes and water-soluble polymers. More specifically, these drug carriers are intervened in such a manner that the ectopic ossification therapeutic agent is included in the liposome, the liposome and the antibody are bound, and the ectopic ossification therapeutic agent includes For example, a mode in which an antibody is bound to a water-soluble polymer (a compound having a molecular weight of about 1,000 to 100,000) chemically or directly through a spacer such as an oligopeptide and the antibody is bound to the water-soluble polymer. it can.
  • a water-soluble polymer a compound having a molecular weight of about 1,000 to 100,000
  • Binding of the antibody (or the fragment) to a drug carrier such as an ectopic ossification therapeutic agent, a liposome and a water-soluble polymer is described in G. T. T. et al. Hermanson “Bioconjugate Technologies” Academic Press, California (1996), Putnam and J. et al. It can be carried out by methods well known to those skilled in the art, such as the method described in Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Inclusion of ectopic ossification therapeutic agents in liposomes is described in D.C. D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications", Elsevier Science Publishers B.
  • Binding of the ectopic ossification therapeutic agent to the water-soluble polymer is described in D.C. It can be carried out by methods well known to those skilled in the art, such as the method described in Putnam and J Kopecek, “Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123.
  • a complex of an antibody (or the fragment) and a proteinous ectopic ossification therapeutic agent (or the fragment) can be prepared by a method well known to those skilled in the art in genetic engineering in addition to the above method. .
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically and / or prophylactically effective amount of an anti-ALK2 antibody and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilizer, emulsifier, preservative and / or adjuvant.
  • the present invention includes a therapeutically and / or prophylactically effective amount of an anti-ALK2 antibody, a therapeutically and / or prophylactically effective amount of at least one ectopic ossification therapeutic agent, a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, Also provided are pharmaceutical compositions comprising solubilizers, emulsifiers, preservatives and / or adjuvants.
  • the substance used in the preparation acceptable in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a substance that is non-toxic to a person who is administered the pharmaceutical composition at a dosage or concentration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention changes or maintains pH, osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, sterility, stability, dissolution rate, sustained release rate, absorption rate, and penetration rate. Can be included for the formulation.
  • Substances for formulation may include, but are not limited to: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid, sodium sulfate or sodium bisulfite Antioxidants, phosphoric acid, citric acid, boric acid buffer, sodium bicarbonate, buffer such as Tris-HCl (Tris-HCl) solution, filler such as mannitol and glycine, chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) , Caffeine, polyvinylpyrrolidine, complexing agents such as ⁇ -cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, bulking agents such as glucose, mannose or dextrin, other carbohydrates such as monosaccharides and disaccharides, coloring agents, flavors Agent, diluent, emulsifier, polyvinylpyrrolidine, etc.
  • amino acids such as gly
  • Hydrophilic polymers low molecular weight polypeptides, salt-forming counterions, benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorexidine, sorbic acid or hydrogen peroxide preservatives, glycerin, propylene ⁇ Solvents such as glycol or polyethylene glycol, sugar alcohols such as mannitol or sorbitol, suspension agents, sorbitan esters, polysorbates such as polysorbate 20 and polysorbate 80, surface activity such as triton, tromethamine, lecithin or cholesterol Agents, stabilization enhancers such as sucrose and sorbitol, elasticity enhancers such as sodium chloride, potassium chloride and mannitol / sorbitol, transport agents, excipients, and / Or pharmaceutically adjuvants.
  • solvents such as glycol or polyethylene glycol, sugar alcohols such as
  • the added amount of these substances for preparation is preferably 0.01 to 100 times, particularly 0.1 to 10 times the weight of the anti-ALK2 antibody.
  • the composition of a suitable pharmaceutical composition in the preparation can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the disease to be applied, the route of administration and the like.
  • the excipient or carrier in the pharmaceutical composition may be liquid or solid.
  • Appropriate excipients and carriers may be water for injection, physiological saline, artificial cerebrospinal fluid and other substances commonly used for parenteral administration.
  • Neutral physiological saline or physiological saline containing serum albumin can also be used as a carrier.
  • the pharmaceutical composition may include Tris buffer at pH 7.0-8.5, acetate buffer at pH 4.0-5.5, citrate buffer at pH 3.0-6.2. These buffers may also contain sorbitol and other compounds.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include a pharmaceutical composition containing an anti-ALK2 antibody and a pharmaceutical composition containing an anti-ALK2 antibody and at least one ectopic ossification therapeutic agent.
  • the pharmaceutical composition containing the anti-ALK2 antibody and the pharmaceutical composition containing the anti-ALK2 antibody and at least one ectopic ossification therapeutic agent are molded as a lyophilized product using an appropriate excipient such as sucrose. You can also.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared for parenteral administration or for oral digestive tract absorption.
  • the composition and concentration of the preparation can be determined by the administration method, and the affinity of the anti-ALK2 antibody for ALK2, that is, the dissociation constant (KD value) for ALK2, contained in the pharmaceutical composition of the present invention
  • KD value dissociation constant
  • the human anti-ALK2 antibody is administered to a human, for example, about 0.1 to 100 mg / kg may be administered once or several times for 1 to 180 days.
  • the dose and frequency of administration should generally be determined in consideration of the patient's gender, weight, age, symptoms, severity, side effects, etc., they are not limited to the above doses and usages.
  • the dose and frequency of administration should generally be determined in consideration of the patient's gender, weight, age, symptoms, severity, side effects, etc., they are not
  • Examples of the form of the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, an injection containing a drip, a suppository, a nasal agent, a sublingual agent, and a transdermal absorption agent.
  • the administration route is an oral route or a parenteral route, and examples of the parenteral route include, but are not limited to, intravenous, intraarterial, intramuscular, rectal, transmucosal, intradermal and the like.
  • Example 1 Preparation of rat anti-ALK2 antibody (11E2, 15A6, 25C11, and 27D11: hereinafter abbreviated as A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D) 1) -1 Preparation of antigen mALK2-Fc as antigen Is Sino Biological Inc. Mouse ALK2-His & Fc (Cat. # 50297-M03H) manufactured by KK was used.
  • an antigen diluted with PBS to 1 ⁇ g / ml was immobilized on a 96-well ELISA plate (NUNC, Cat. # 442404) for 2 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. .
  • the solid phase was removed, and blocking was performed for 30 minutes at room temperature with a 0.5% skim milk solution dissolved in PBS.
  • the culture supernatant of the hybridoma was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • an ALP-labeled anti-rat IgG antibody manufactured by SBA
  • diluted 1: 2500 with 0.5% skim milk was added, and the plate was further allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the phenylphosphate substrate was reacted at room temperature for 20 minutes, and then the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • hybridoma was cloned twice or more by the limiting dilution method.
  • hybridoma strains producing monoclonal antibodies A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D were isolated.
  • Example 2 In vitro evaluation of rat anti-ALK2 antibodies (A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D) 2) -1 Antibody screening by flow cytometry 2) -1-1 Mouse and human ALK2 expressing cells Preparation HEK293A cells were seeded in a 100 mm dish at 3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured overnight in DMEM medium containing 15% FBS under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • pcDEF3 / mouse ALK2 (WT) -EGFP, pcDEF3 / human ALK2 (WT) -EGFP, pcDEF3 / human ALK2 (R206H) -pcGFP, and pcDEF3 were introduced into HEK293A cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). And further cultured overnight.
  • 100 ⁇ L of the cell suspension adjusted to 1 ⁇ 10 6 cells / mL was dispensed into 1.5 mL microcentrifuge tubes, centrifuged at 500 g for 5 minutes, and then the supernatant was removed.
  • FIGS. 2A to 2D Monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D do not recognize fluorescent protein EGFP-expressing cells (FIG. 2A), but do not recognize mouse ALK2-expressing cells (FIG. 2B) and wild type. It was confirmed to specifically recognize type A and FOP human ALK2 expressing cells (FIGS. 2C and 2D, respectively). This result indicates that the monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D are antibodies that bind to the extracellular region of ALK2.
  • the OPTI-MEM I containing serially diluted monoclonal antibody and 10 ng / mL BMP7 (manufactured by Miltenney) or 0.5 ng / mL BMP9 (manufactured by Peprotech) was replaced and further cultured overnight.
  • Firefly and Renilla's luciferase activities were measured with a plate reader GENios (manufactured by TECAN) using Dual-Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega).
  • Monoclonal antibodies produced by hybridomas A2-11E, A2-15A, A2-25C, and A2-27D are BMP7-induced luciferase activity induced by BMP7 in HEK293A cells overexpressing wild-type and R206H mutants of ALK2. Was confirmed to be suppressed in a dose-dependent manner.
  • OPTI-MEM I containing serially diluted monoclonal antibody and 200 ng / mL BMP2 (manufactured by Corefront), 200 ng / mL BMP7 (manufactured by Miltenney), or 20 ng / mL GDF2 / BMP9 (manufactured by Peprotech). And further cultured for 3 days. After removing the medium of C2C12 cells and washing with PBS, the cells were treated with 50 ⁇ L / well of ice-cold acetone: ethanol (1: 1) solution for 1 minute and further washed 3 times with PBS. ALP activity was measured as an index of differentiation into osteoblast cells.
  • Measurement of ALP activity was performed using 100 ⁇ L / well of substrate solution (1 mg / mL 4-Nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) and 0.1 M Diethanolamine (Sigma-Aldrich) -HCl, pH 10. containing 1 mM MgCl 2 . 0) was added and allowed to react at room temperature for 15-30 minutes on a stirring shaker. The reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 3M NaOH, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured using a microplate reader infinite F50 (manufactured by TECAN).
  • Example 3 Determination of nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of rat anti-ALK2 antibody (A2-11E, A2-15A, A2-25C, A2-27D) 3) -1 Nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of A2-11E 3) -1-1 Preparation of total RNA from A2-11E-producing hybridoma To amplify cDNA containing the variable region of A2-11E, total RNA was used from A2-11E-producing hybridoma using TRIzol Reagent (Ambion). Was prepared.
  • a cDNA containing the variable region of the heavy chain of A2-11E was obtained by 5′-RACE PCR using the combination of this primer and the cDNA synthesized in Example 3) -1-2 (5′-RACE-Ready cDNA) as a template. Amplified. PCR was performed using a touchdown PCR program according to the manual of SMARTER RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) using KOD-Plus- (TOYOBO, Japan) as Polymerase.
  • the cDNA containing the variable region of the heavy chain amplified by 5'-RACE PCR was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and cloned. Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the variable region of the strand was performed.
  • an oligonucleotide having the sequence of 5′-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGAACTGGGC-3 ′ (RG2AR3; SEQ ID NO: 88) designed from the sequence of the rat heavy chain in the database, and NUP (Nested Universal Primer A: SMARTer RACE cDNA cDNA A Kit included).
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the heavy chain of A2-11E is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a cDNA containing the variable region of the light chain of A2-11E was obtained by 5′-RACE PCR using the combination of this primer and the cDNA synthesized in Example 3) -1-2 (5′-RACE-Ready cDNA) as a template. Amplified. PCR was performed using a touchdown PCR program according to the manual of SMARTER RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) using KOD-Plus- (TOYOBO, Japan) as Polymerase.
  • a cDNA containing a light chain variable region amplified by 5'-RACE PCR was purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN), then cloned using Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and cloned. Sequence analysis of the nucleotide sequence of the cDNA containing the variable region of the strand was performed.
  • the sequence primer was designed from the sequence of the constant region of the rat light chain in the database.
  • oligonucleotide having the sequence of 5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCCATTC-3 '(RKR5; SEQ ID NO: 89) and NUP (Nested Universal Primer A: attached to SMARTER RACE cDNA Amplification Kit) were used.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the light chain of A2-11E is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • RNA was prepared from the A2-15A producing hybridoma in the same manner as in Example 3) -1-1.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the heavy chain of A2-15A is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Example 3 3) -2-4 Amplification of cDNA containing A2-15A light chain variable region by 5′-RACE PCR and determination of sequence
  • Example 3 cDNA synthesized in 2-2 (5′-RACE-Ready cDNA) was used as a template to amplify a cDNA containing the light chain variable region of A2-15A in the same manner as in Example 3) -1-4, and the sequence was determined.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the light chain of A2-15A is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the heavy chain of A2-25C is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the light chain of A2-25C is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • RNA was prepared from the A2-27D producing hybridoma in the same manner as in Example 3) -1-1.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the heavy chain of A2-27D is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the light chain of A2-27D is shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16.
  • Example 4 In vivo evaluation of rat anti-ALK2 antibodies (A2-15A and A2-27D) 4) -1 Preparation of hybridoma culture supernatant 1.0 ⁇ 10 6 hybridomas obtained in Example 1) -4 were 10% The cells were cultured in FBS-containing TIL high glucose medium (T75 flask), and then high-density culture was performed in INTEGRA CL1000 (10% FBS medium). Next, the medium was replaced with serum-free medium, and after further culturing with INTEGRA CL1000, a required amount of hybridoma culture supernatant was obtained. The obtained hybridoma culture supernatant was stored at 2 to 8 ° C. until purification.
  • Example 4 Purification of antibody from hybridoma culture supernatant
  • the antibody was purified from the culture supernatant obtained in Example 4) -1 by Protein G affinity chromatography (under 4-6 ° C) in one step.
  • the buffer replacement step after purification by Protein G affinity chromatography was performed at 4 to 6 ° C.
  • the culture supernatant of the hybridoma was applied to a column packed with Protein G (GE Healthcare Bioscience) equilibrated with PBS. After all of the culture supernatant liquid entered the column, the column was washed with PBS having a column volume of 2 times or more.
  • the IgG concentration was adjusted to 8 mg / ml or more by concentration with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fractionated molecular weight UF10K, Sartorius, 4 ° C.). Finally, it was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • VIVASPIN 20 fractionated molecular weight UF10K, Sartorius, 4 ° C.
  • C57BL / 6 mice aged 8-10 weeks are anesthetized using a simple inhalation anesthesia device for small animal experiments (Natsume Seisakusho Co., Ltd., Japan) and 2% isoflurane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan).
  • One BMP-containing pellet was transplanted into each thigh muscle tissue.
  • Monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-15A and A2-27D are administered subcutaneously at 10 mg / kg once / week from 1 week before transplantation, and maintained in the same manner until 2 weeks after transplantation. did.
  • the control group was administered with an equal volume of solvent (25 mM Histidine / 5% Sorbitol, pH 6.0).
  • Two weeks after transplantation of the BMP-containing pellet the BMP-containing pellet transplanted together with the femur was removed, and the formation of ectopic bone was analyzed by micro CT ( ⁇ CT35, manufactured by SCANCO).
  • mice transplanted with BMP7 and GDF2 / BMP9 and treated with vehicle ectopic bone was induced on the right side of the femur by micro CT analysis.
  • the mice administered with the monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-15A and A2-27D no ectopic bone was detected even after transplantation with BMP7 and GDF2 / BMP9. Therefore, it was confirmed that the monoclonal antibodies produced by the hybridomas A2-15A and A2-27D suppress ectopic bone induction in skeletal muscle tissue induced by BMP7 and GDF2 / BMP9.
  • Example 5 Preparation of human chimerized anti-ALK2 antibody (cA2-15A, cA2-27D) 5) -1 Construction of chimera and humanized antibody light chain expression vector pCMA-LK And an about 5.4 kb fragment obtained by digestion with PmeI, and a DNA fragment comprising the DNA sequence encoding the human ⁇ chain secretion signal and human ⁇ chain constant region shown in SEQ ID NO: 17 as an In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech) was used to produce pcDNA3.3 / LK.
  • PCR was carried out with the following primer set, and the obtained 3.8 kb fragment was phosphorylated and self-ligated to downstream of the CMV promoter to establish a signal sequence, cloning site, and human kappa chain.
  • Chimeric and humanized antibody light chain expression vectors pCMA-LK with normal regions were constructed.
  • Primer set 5'-TATACCGTCGACTCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3 '(3.3-F1; SEQ ID NO: 90) 5′-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCCGACGTTG-3 ′ (3.3-R1; SEQ ID NO: 91)
  • the obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / cA2-15A”.
  • the nucleotide sequence of the cA2-15A heavy chain is shown in SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20.
  • cA2-15A heavy chain primer set 5′-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGGAG-3 ′ (A2-15AH-F; SEQ ID NO: 92) 5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTGACAGTGACCAGAGTGCCCTGGCCCCAG-3 '(A2-15AH-R; SEQ ID NO: 93)
  • cA2-15A The light chain nucleotide sequence of cA2-15A is shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 22.
  • cA2-15A light chain primer set 5′-ATCTCCGGCGCGTACCGGCGACATGTCTTGACCCAGCTCTCCTGC-3 ′ (A2-15AL-F; SEQ ID NO: 94) 5′-GGAGGGGGCGGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGTCCCAG-3 ′ (A2-15AL-R; SEQ ID NO: 95)
  • the obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / cA2-27D”.
  • the nucleotide sequence of the cA2-27D heavy chain is shown in SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • cA2-27D heavy chain primer set 5′-CCAGATGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAG-3 ′ (A2-27DH-F; SEQ ID NO: 96) 5'-CTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGGACCACGGTTCCTGGGCCCCAG-3 '(A2-27DH-R; SEQ ID NO: 97)
  • the nucleotide sequence of the light chain of the cA2-27D antibody is shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 26.
  • cA2-27D light chain primer set 5′-ATCTCCGGCGCGTACGGGCGAAATTGTTCTCACTCAGCTCTCCAAC-3 ′ (A2-27DL-F; SEQ ID NO: 98) 5′-GGAGGGGGCGGGCCACAGCCCGTTTCAGTTCCAGCTTGTCCCAG-3 ′ (A2-15AL-R; SEQ ID NO: 95)
  • Polyethyleneimine (Polyscience # 24765) 1.8 mg was dissolved in 20 ml of Opti-Pro SFM medium (Invitrogen), and then the H chain expression vector (0.24 mg) and L prepared using NucleoBond Xtra (TaKaRa, Japan) Chain expression vector (0.36 mg) was added to 20 ml of Opti-Pro SFM medium (Invitrogen). 20 ml of an expression vector / Opti-Pro SFM mixture was added to 20 ml of a polyethyleneimine / Opti-Pro SFM mixture, gently stirred, allowed to stand for another 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F cells.
  • the chimeric antibody of rat antibody A2-15A obtained by the combination of pCMA-G1 / cA2-15A and pCMA-LK / cA2-15A was named “cA2-15A”, and pCMA-G1 / cA2-27D and pCMA-
  • the chimeric antibody of rat antibody A2-27D obtained by combination with LK / cA2-27D was named “cA2-27D”.
  • the fraction was replaced with PBS by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis cassette), and then an antibody solution diluted 5-fold with a buffer of 5 mM sodium phosphate / 50 mM MES / pH 7.0 was diluted with 5 mM NaPi / This was applied to a ceramic hydroxyapatite column (Nippon Bio-Rad, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) equilibrated with a buffer of 50 mM MES / 30 mM NaCl / pH 7.0. Linear gradient elution with sodium chloride was performed and the fractions containing antibody were collected.
  • the fraction was subjected to liquid replacement with HBSor (25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0) by dialysis (Thermo Scientificsha, Slide-A-Lyzer Dialysis cassette).
  • HBSor 25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0
  • the IgG concentration was adjusted to 2 mg / ml or more by concentration with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (fractionated molecular weight UF10K, Sartorius, 4 ° C.). Finally, it was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
  • Example 6 In vitro activity evaluation of human chimerized anti-ALK2 antibodies (cA2-15A, cA2-27D) 6) -1 Antibody evaluation by luciferase reporter assay The inhibitory activity of intracellular signal via ALK2 of the produced human chimerized antibody is BMP Analysis was performed using a specific luciferase reporter. HEPG2 cells were seeded on a 96-well white plate for luciferase assay (CORNING) at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and 37 ° C., 5% CO 2 in DMEM medium containing 10% FBS.
  • CORNING luciferase assay
  • pGL4.26 / Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7,949 (2002)) was introduced using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 2.5 hours, the medium was replaced with fresh OPTI-MEM I (manufactured by Life Technologies), and further cultured for 3 hours. Thereafter, the antibody was replaced with OPTI-MEM I containing serially diluted monoclonal antibody and 10 ng / mL BMP7 (Milteny), and further cultured overnight. On the next day, luciferase activity was measured with a plate reader SpectraMaxM4 (Molecular Devices) using Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega).
  • C2C12 cells were seeded in a 96-well plate (manufactured by IWAKI) at 5 ⁇ 10 3 cells / well, and were cultured in a DMEM medium containing 15% FBS under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. Cultured overnight.
  • Measurement of ALP activity was carried out using 100 ⁇ L / well of substrate solution (1 mg / mL 4-Nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich) and 0.1 M Diethanolamine (Sigma-Aldrich) -HCl, pH 10 containing 1 mM MgCl 2. 0.0) and allowed to react on a shaker at room temperature for 15-30 minutes. The reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 3 M NaOH, and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured using a plate reader SpectraMaxM4 (manufactured by Molecular Devices).
  • the results are shown in FIG.
  • the chimerized antibodies cA2-15A and cA2-27D were confirmed to suppress the differentiation of C2C12 cells induced by BMP into osteoblast-like cells in a dose-dependent manner.
  • This result indicates that the chimerized antibodies cA2-15A and cA2-27D are antibodies that suppress endogenous ALK2 that is physiologically expressed by C2C12 cells.
  • the inhibitory activity is equivalent to each of the rat monoclonal antibodies A2-15A and A2-27D.
  • Example 7 Anti-ALK2 antibodies A2-15A and A2-27D humanized design 7) -1 Humanized hA2-15A design 7) -1-1 Molecular modeling of the variable region of A2-15A A2-15A variable region molecule Modeling was performed by a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of A2-15A determined above.
  • 3KYM and 3S35 were selected as having the highest sequence identity to the heavy and light chain variable regions of A2-15A, respectively.
  • the three-dimensional structure of the framework region was created by combining the 3KYM and 3S35 coordinates corresponding to the heavy and light chains of A2-15A to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model.
  • the sequence of the framework region of A2-15A was compared with the framework region of the human subgroup consensus sequence.
  • KABAT et al. Sequence of four groups of subgroups in the sequence of subgroups of subgroups of sequences in the sequence of human groups in the Sequence of Sequences of Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service of Health, Bethesda, MD. (1991)). was selected as an acceptor due to its high sequence identity in its framework region.
  • the amino acid residues in the framework regions for the human ⁇ chain subgroup 3 consensus sequence and the human ⁇ chain subgroup 4 consensus sequence are aligned with the amino acid residues for A2-15A, and the positions where different amino acids are used are Identified.
  • the positions of these residues are analyzed using the 3D model of A2-15A constructed above, and the donor residues to be grafted on the acceptor are described in Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1000029-10033 (1989)).
  • the sequence of humanized hA2-15A was constructed as described in the examples below by transferring several selected donor residues into the acceptor antibody.
  • the humanized hA2-15A heavy chain which was designed with asparagine and amino acid number 107 (serine) replaced with alanine, amino acid number 112 (threonine) with valine, and amino acid number 116 (threonine) with alanine was “humanized” hA2-15A-H1 type heavy chain "(sometimes called" hA2-15A-H1 " ) It was named.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-H1 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, the sequence consisting of amino acid residues 20 to 142, the sequence consisting of amino acid residues 143 to 472 are a signal sequence and a heavy chain, respectively. It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 is described in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 426th nucleotides, and the sequence consisting of the 427th to 1416th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-H4 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues, and the sequence consisting of the 143th to 472nd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 is set forth in SEQ ID NO: 29 of the Sequence Listing.
  • sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 426, and the sequence consisting of nucleotides 427 to 1416 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 are also shown in FIG.
  • amino acid number 29 is aspartic acid
  • amino acid number 29-30 is serine
  • amino acid number 36 is glutamic acid
  • amino acid number 41 is asparagine
  • amino acid Number 66 is proline
  • amino acid number 81 is valine
  • amino acid number 83 is aspartic acid
  • amino acid number 99 is aspartic acid
  • amino acid number 100 proline
  • Amino acid number 101 is leucine
  • amino acid number 104 is Amino acid number 106 (isoleucine) to valine
  • amino acid number 108 isthreonine
  • amino acid number 123 (alanine) to glutamine
  • amino acid number 127 leucine
  • amino acid number 129 leucine
  • the humanized hA2-15A light chain designed with the replacement of is replaced with iso
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-L1 type light chain is described in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 133rd amino acid residues, and the sequence consisting of the 134th to 238th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 is described in SEQ ID NO: 31 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 26th to 85th nucleotides, the sequence consisting of the 86th to 424th nucleotides, and the sequence consisting of the 425th to 739th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, respectively, are a signal sequence, a light chain variable region sequence, and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 are also shown in FIG.
  • hA2-15A-L4 type light chain The amino acid number 29 (alanine) of the light chain of the chimeric cA2-15A shown in SEQ ID NO: 22 is replaced by aspartic acid, and between amino acid numbers 29-30 (deleted) Residue) to serine, amino acid number 36 (glutamine) to glutamic acid, amino acid number 41 (serine) to asparagine, amino acid number 99 (asparagine) to serine, amino acid number 100 (proline) to serine, amino acid number 108
  • the humanized hA2-15A light chain designed with the replacement of (threonine) with valine and amino acid number 123 (alanine) with glutamine is referred to as “humanized hA2-15A-L4 type light chain” (“hA2-15A-L4 "Sometimes called").
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-L4 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 133rd amino acid residues, and the sequence consisting of the 134th to 238th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 is described in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 26th to 85th nucleotides, the sequence consisting of the 86th to 424th nucleotides, and the sequence consisting of the 425th to 739th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-L6 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 133rd amino acid residues, and the sequence consisting of the 134th to 238th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 is described in SEQ ID NO: 35 of the sequence listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 26 to 85, a sequence consisting of nucleotides 86 to 424, and a sequence consisting of nucleotides 425 to 739 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-15A-L7 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 38 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 133rd amino acid residues, and the sequence consisting of the 134th to 238th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is set forth in SEQ ID NO: 37 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 26 to 85, a sequence consisting of nucleotides 86 to 424, and a sequence consisting of nucleotides 425 to 739 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 are a signal sequence, a light chain variable region sequence, and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 are also shown in FIG.
  • An antibody consisting of a humanized hA2-15A-H4 type heavy chain and a humanized hA2-15A-L1 type light chain was designed and called “humanized hA2-15A-H4 / L1” (“hA2-15A-H4 / L1”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-15A-H4 type heavy chain and a humanized hA2-15A-L4 type light chain was designed and called “humanized hA2-15A-H4 / L4” (“hA2-15A-H4 / L4”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-15A-H4 type heavy chain and a humanized hA2-15A-L6 type light chain was designed and called “humanized hA2-15A-H4 / L6” (“hA2-15A-H4 / L6”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-15A-H4 type heavy chain and a humanized hA2-15A-L7 type light chain was designed and called “humanized hA2-15A-H4 / L7” (“hA2-15A-H4 / L7”).
  • the antibody designed as described above can be prepared according to Example 8 and evaluated according to Examples 2 and 4.
  • variable region of A2-27D is performed by a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of A2-27D determined above. As a result, 3EYQ and 4I9W were selected as having the highest sequence identity to the A2-27D heavy and light chain variable regions, respectively.
  • the three-dimensional structure of the framework region was created by combining the 3EYQ and 4I9W coordinates corresponding to the A2-27D heavy and light chains to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model.
  • sequence of the framework region of A2-27D was compared with the framework region of the human subgroup consensus sequence.
  • KABAT et al. Sequences of the sequence group and sub-groups of subgroups of the sequence group (subgroup ⁇ ) of subsequences of the sequence group of sequences in the sequence of sequences in the Sequence of Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service of Health, Bethesda, MD. was selected as an acceptor due to its high sequence identity in its framework region.
  • the amino acid residues in the framework regions for the human ⁇ chain subgroup 3 consensus sequence and the human ⁇ chain subgroup 3 consensus sequence are aligned with the amino acid residues for A2-27D, and the positions where different amino acids are used are Identified.
  • the positions of these residues are analyzed using the 3-dimensional model of A2-27D constructed above, and the donor residues to be grafted on the acceptor are described in Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1000029-10033 (1989)).
  • the sequence of humanized hA2-27D was constructed as described in the examples below by transferring several selected donor residues into the acceptor antibody.
  • amino acid number 35 (arginine) of the heavy chain of chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 24 was converted to glycine
  • amino acid number 38 (lysine) is arginine
  • amino acid number 42 (leucine) is alanine
  • amino acid number 56 (isoleucine) is valine
  • amino acid number 68 (alanine) is serine
  • amino acid number 94 (alanine) is serine.
  • amino acid number 95 is lysine
  • amino acid number 103 is asparagine
  • amino acid number 107 is alanine
  • amino acid number 112 is valine
  • amino acid number 117 is arginine.
  • Amino acid number 132 proline to glutamine
  • amino acid number 1 The humanized hA2-15A heavy chain designed to replace 5 (valine) with leucine is referred to as a “humanized hA2-27D-H1 type heavy chain” (sometimes referred to as “hA2-27D-H1”). Named.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-H1 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is set forth in SEQ ID NO: 39 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 are the signal sequence, heavy chain variable region sequence and heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-H2 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 42 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 is set forth in SEQ ID NO: 41 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 are the signal sequence, heavy chain variable region sequence and heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 are also shown in FIG.
  • the amino acid number 35 (arginine) of the heavy chain of the chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 24 is glycine, the amino acid number 38 (lysine) is arginine, Amino acid number 42 (leucine) to alanine, amino acid number 94 (alanine) to serine, amino acid number 95 (arginine) to lysine, amino acid number 103 (threonine) to asparagine, amino acid number 107 (serine) to alanine,
  • the humanized hA2-27D heavy chain designed with the replacement of amino acid number 112 (leucine) with valine, amino acid number 132 (proline) with glutamine, and amino acid number 135 (valine) with leucine is replaced with “humanized hA2- 27D-H3 type heavy chain "(also referred to as" hA2-27D-H3 " That) and was named.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-H3 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 44 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 is set forth in SEQ ID NO: 43 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and the sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 are also shown in FIG.
  • hA2-27D-H4 Humanized hA2-27D-H4 type heavy chain
  • the amino acid number 35 (arginine) of the heavy chain of the chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 24 is glycine
  • the amino acid number 38 (lysine) is arginine
  • Amino acid number 42 (leucine) to alanine amino acid number 94 (alanine) to serine
  • amino acid number 95 arginine) to lysine
  • amino acid number 103 threonine
  • a humanized hA2-27D heavy chain designed to replace amino acid number 135 (valine) with leucine may be referred to as a “humanized hA2-27D-H4 type heavy chain” (“hA2-27D-H4”). ).
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-H4 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 46 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 is described in SEQ ID NO: 45 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45 are the signal sequence, heavy chain variable region sequence and heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 are also shown in FIG.
  • hA2-27D-H5 type heavy chain Amino acid number 35 (arginine) of the heavy chain of the chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 24 as glycine, amino acid number 38 (lysine) as arginine, Humanized hA2 designed to replace amino acid number 42 (leucine) with alanine, amino acid number 95 (arginine) with lysine, amino acid number 103 (threonine) with asparagine, and amino acid number 135 (valine) with leucine.
  • the ⁇ 27D heavy chain was named “humanized hA2-27D-H5 type heavy chain” (sometimes referred to as “hA2-27D-H5”).
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-H5 type heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 48 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 is set forth in SEQ ID NO: 47 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and the sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 are also shown in FIG.
  • Amino acid number 66 (tryptophan) to leucine, amino acid number 77 (valine) To isoleucine, amino acid number 79 (asparagine) to aspartic acid, amino acid number 89 (serine) to aspartic acid, amino acid number 90 (tyrosine) to phenylalanine, amino acid number 91 (serine) to threonine, amino acid number 93 (alanine) ) To threonine, amino acid number 96 (serine) to arginine, amino acid number 97 (methionine) to leucine, amino acid number 99 (alanine) to proline, amino acid number 102 (valine) to phenylalanine, amino acid number 104 (threonine) ) For valine, amino acid number 120 (alanine) for glutamine, amino acid number 124 (leucine) for valine, and amino acid number 126 (leucine) for isoleucine. It was designated humanized h
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-L1 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 50 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 is set forth in SEQ ID NO: 49 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 26 to 85, a sequence consisting of nucleotides 86 to 412 and a sequence consisting of nucleotides 413 to 727 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively. The normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 are also shown in FIG.
  • Amino acid number 29 (threonine for glycine, amino acid number 31 (methionine) for leucine, amino acid for the light chain of the chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 26
  • Amino acid number 90 (tyrosine) to phenylalanine
  • Amino acid number 91 (serine) to threonine
  • amino acid number 93 (alanine) to threonine
  • amino acid number 96 (serine) to arginine
  • amino acid number 97 (methionine) to leucine
  • amino acid number 99 (alanine) to proline
  • Amino acid number 102 valine
  • amino acid number 104 (threonine) to valine
  • amino acid number 120 (alanine) to glutamine
  • amino acid number 124 (leucine) to valine
  • amino acid number 126 (leucine) to isoleucine
  • the humanized hA2-27D light chain designed with replacement was named “humanized hA2-27D-L2 type light chain” (sometimes referred to as “hA2-27D-L2”).
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-L2 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 52 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 is described in SEQ ID NO: 51 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 26 to 85, a sequence consisting of nucleotides 86 to 412 and a sequence consisting of nucleotides 413 to 727 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant. The normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 are also shown in FIG.
  • Amino acid number 29 (threonine for glycine, amino acid number 31 (methionine) for leucine, amino acid for the light chain of the chimeric cA2-27D shown in SEQ ID NO: 26
  • Amino acid number 93 (alanine) to threonine amino Number 96 (serine) is arginine, amino acid number 97 (methionine) is leucine, amino acid number 99 (alanine) is proline, amino acid number 102 (valine) is phenylalanine, amino acid number 124 (leucine) is valine, amino acid A humanized hA2-27D light chain designed to replace number 126 (leucine) with isoleucine is referred to as a “humanized hA2-27D-L3 type light chain” (sometimes referred to as “hA2-27D-L3”) Named.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-L3 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 54 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 is described in SEQ ID NO: 53 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 26th to 85th nucleotides, the sequence consisting of the 86th to 412th nucleotides, and the sequence consisting of the 413th to 727th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-L4 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 56 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 is set forth in SEQ ID NO: 55 of the Sequence Listing.
  • a sequence consisting of nucleotides 26 to 85, a sequence consisting of nucleotides 86 to 412 and a sequence consisting of nucleotides 413 to 727 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-27D-L5 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 58 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 is set forth in SEQ ID NO: 57 of the Sequence Listing.
  • sequence consisting of nucleotides 26 to 85, the sequence consisting of nucleotides 86 to 412 and the sequence consisting of nucleotides 413 to 727 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 are also shown in FIG.
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H1 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L3 type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H1 / L3” (“hA2-27D-H1 / L3”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H2-type heavy chain and a humanized hA2-27D-L1-type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H2 / L1” (“hA2-27D-H2 / L1”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H2-type heavy chain and a humanized hA2-27D-L2-type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H2 / L2” (“hA2-27D-H2 / L2”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H2 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L3 type light chain was designed and referred to as "humanized hA2-27D-H2 / L3"("hA2-27D-H2 / L3") Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H3 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L1 type light chain was designed and referred to as "humanized hA2-27D-H3 / L1"("hA2-27D-H3 / L1")
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H3 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L2 type light chain was designed and referred to as “humanized hA2-27D-H3 / L2” (“hA2-27D-H3 / L2”).
  • hA2-27D-H3 / L2 humanized hA2-27D-H3 / L2
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H3 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L3 type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H3 / L3” (“hA2-27D-H3 / L3”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H3 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L4 type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H3 / L4” (“hA2-27D-H3 / L4”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H4 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L3 type light chain was designed and referred to as "humanized hA2-27D-H4 / L3"("hA2-27D-H4 / L3") Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H4 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L4 type light chain was designed and referred to as “humanized hA2-27D-H4 / L4” (“hA2-27D-H4 / L4”).
  • hA2-27D-H4 / L4 humanized hA2-27D-H4 / L4
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H4 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L5 type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H4 / L5” (“hA2-27D-H4 / L5”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-27D-H5 type heavy chain and a humanized hA2-27D-L4 type light chain was designed and called “humanized hA2-27D-H5 / L4” (“hA2-27D-H5 / L4”) Sometimes named).
  • the antibody designed as described above can be prepared according to Example 8 and evaluated according to Examples 2 and 4.
  • Example 8 Construction of humanized A2-15A antibody and humanized A2-27D antibody expression vector and preparation of antibody 8) -1 Construction of humanized A2-15A heavy chain expression vector 8) -1-1 Humanized hA2-15A -Construction of H1-type heavy chain expression vector Including the DNA sequence encoding the variable region of humanized hA2-15A-H1 shown in nucleotide numbers 36 to 443 of the nucleotide sequence of humanized hA2-15A-H1 shown in SEQ ID NO: 27 A DNA fragment was synthesized (Geneart Artificial Gene Synthesis Service).
  • a DNA fragment containing the DNA sequence encoding the variable region of humanized hA2-15A-H1 was amplified with KOD-Plus- (TOYOBO, Japan) and the following primer set, and chimeric and human
  • the humanized hA2-15A-H1 expression vector was constructed by inserting the cloned antibody IgG1-type heavy chain expression vector pCMA-G1 into the site cut with the restriction enzyme BlpI using the In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech). .
  • the obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / hA2-15A-H1”.
  • Humanized hA2-15A-H4 type heavy chain expression vector Humanized hA2-15A- represented by nucleotide numbers 36 to 443 of the nucleotide sequence of humanized hA2-15A-H4 represented by SEQ ID NO: 29 A DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of H4 was synthesized (GENEART artificial gene synthesis service).
  • a humanized hA2-15A-L1 expression vector was constructed by insertion with the In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech) after digestion with PmeI and removal of the kappa chain secretion signal and the human kappa chain constant region. did.
  • the obtained expression vector was designated as “pCMA / hA2-15A-L1”.
  • Primer set 5′-CCAGCCCTCCGGACTCTAGAGCCACC-3 ′ (CM-inf-F; SEQ ID NO: 101)
  • 5′-AGTTAGCCTCCCCCCCTTTAAACTC-3 ′ CM-inf-R; SEQ ID NO: 102
  • Example 9 In vitro activity evaluation of humanized A2-15A antibody (IgG1) and humanized A2-27D antibody (IgG1) 9) -1 Antibody evaluation by luciferase reporter assay Humanized hA2-prepared in Example 8) -5 15A-H4 / L6, humanized hA2-27D-H2 / L2, and humanized hA2-27D-H3 / L4 were analyzed for the inhibitory activity of intracellular signals via ALK2, using a BMP-specific luciferase reporter did.
  • PGL4.26 / Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7,949 (2002)) was introduced into HEPG2 cells in the same manner as in Example 6) -1, and the medium was replaced with fresh FreeStyle293 expression medium (Invitrogen) after 3 hours. Exchanged). Thereafter, humanized antibody and 10 ng / mL BMP7 (Milteny) were added, and luciferase activity was measured the next day.
  • Example 10 Evaluation of binding of humanized A2-15A antibody (IgG1) and humanized A2-27D antibody (IgG1) to human ALK2 Humanized hA2-15A-H4 / L6 prepared in Example 8) -5, humanized hA2- Dissociation constant measurement between 27D-H2 / L2 and humanized hA2-27D-H3 / L4 and antigen (Recombinant Human ALK2 Fc Chimera, Sino Biological Inc.) uses Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences) Then, the antigen was immobilized as a ligand, and the antibody was measured as an analyte.
  • the antigen was added at 1.25 ⁇ g / mL for 60 seconds and immobilized on the sensor chip CM5 (GE Healthcare Biosciences).
  • HBS-EP + (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20) was used as a running buffer.
  • An antibody dilution series solution (0.2-50 nM) was added to the antigen-immobilized chip for 300 seconds at a flow rate of 30 ⁇ l / min, and then the dissociation phase for 1800 seconds was monitored.
  • 10 mM glycine hydrochloride solution pH 1.5 was added twice for 30 seconds at a flow rate of 10 ⁇ l / min.
  • Example 11 Preparation of humanized A2-15A antibody (IgG2) 11) -1 Construction of humanized IgG2-type heavy chain expression vector pCMA-G2 The pCMA-LK constructed in Example 5) -1 was digested with XbaI and PmeI and kappa chain In-Fusion Advantage PCR cloning of a DNA fragment (SEQ ID NO: 103) containing the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the human heavy chain secretion signal sequence and human IgG2 constant region, and the DNA fragment from which the secretion signal and human ⁇ chain constant region have been removed Using a kit (Clontech), a chimeric and humanized IgG2 type heavy chain expression vector pCMA-G2 having a signal sequence, a cloning site, and a human IgG2 heavy chain constant region downstream of the CMV promoter was constructed.
  • the nucleotide sequence of the humanized hA2-15A-H4 IgG2 type heavy chain is shown in SEQ ID NO: 104, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 105.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 426, and the sequence consisting of nucleotides 427 to 1404 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 104 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 142nd amino acid residues, and the sequence consisting of the 143th to 468th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 104 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105 are also shown in FIG.
  • Humanized hA2-15A-H4 IgG2 type heavy chain primer set 5′-CAGATGGGTGCTGAGCGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGC-3 ′
  • A-H4-F 5′-CTTGGGTCTGGCTGAGCTGACGGTCACGAGGGTGCC-3 ′
  • A-H4-R 5′-CTTGGGTCTGGCTGAGCTGACGGTCACGAGGGTGCC-3 ′
  • Example 12 Preparation of humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) 12) -1 Construction of humanized hA2-27D-H2-LALA type heavy chain expression vector pCMA-G1 / hA2-27D constructed in Example 8) -3-2 A hA2-27D-H2-LALA type heavy chain expression vector was constructed by introducing mutations using -H2 as a template and the following primer set and KOD-Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO). The constructed expression vector was named “pCMA-G1 / hA2-27D-H2-LALA”.
  • the nucleotide sequence of the humanized hA2-27D-H2-LALA type heavy chain is shown in SEQ ID NO: 106, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 107.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 420, and the sequence consisting of nucleotides 421 to 1410 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 106 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 106 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107 are also shown in FIG.
  • Primer set 5′-GCGGGGGGACCCCCAGCTCTCTCCTTCCCCC-3 ′ (LALA-F; SEQ ID NO: 132) 5′-GGCTTCAGGGTCTGGGCAGGGTGGGGCATGTG-3 ′ (LALA-R; SEQ ID NO: 133)
  • Example 12) Construction of humanized hA2-27D-H3-LALA type heavy chain expression vector Example 12) -1 using pCMA-G1 / hA2-27D-H3 constructed in Example 8) -3-3 as a template
  • the hA2-27D-H3-LALA type heavy chain expression vector was constructed in the same manner as described above.
  • the constructed expression vector was named “pCMA-G1 / hA2-27D-H3-LALA”.
  • the nucleotide sequence of the humanized hA2-27D-H3-LALA type heavy chain is shown in SEQ ID NO: 108, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 109.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1410th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 108 are the signal sequence, heavy chain variable region sequence and heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 470th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 108 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109 are also shown in FIG.
  • Humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) Production was carried out in the same manner as in Example 5) -7.
  • the antibody was named “humanized hA2-27D-H2 / L2 (IgG1 LALA)” and was constructed in Example 12) -2, and pCMA-G1 / hA2-27D-H3-LALA and Example 8) -4-4
  • the humanized A2-27D antibody obtained by the pCMA / hA2-27D-L4 combination constructed in 1 was named “humanized hA2-27D-H3 / L4 (IgG1 LALA)”.
  • Example 12) Two-step purification of humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) The culture supernatant obtained in Example 12) -3 was purified in the same manner as in Example 5) -8.
  • Example 13 In vitro activity evaluation of humanized A2-15A antibody (IgG2) and humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) 13) -1 Antibody evaluation by luciferase reporter assay Humanized A2- prepared in Example 11) -4 15A-H4 / L6 (IgG2), inhibitory activity of intracellular signal via ALK2 of humanized A2-27D-H2 / L2 (IgG1 LALA) obtained in Example 12) -4 is a BMP-specific luciferase -Analyzed using a reporter.
  • PGL4.26 / Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7,949 (2002)) was introduced into HEPG2 cells in the same manner as in Example 6) -1, and the medium was replaced with fresh FreeStyle293 expression medium (Invitrogen) after 3 hours. Exchanged). Thereafter, humanized antibody and 2.5 ng / mL BMP9 were added, and luciferase activity was measured on the next day in the same manner as in Example 6) -1.
  • Example 14 Evaluation of binding of humanized A2-15A antibody (IgG2) and humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) to human ALK2 14) -1 Purification of human ALK2 extracellular domain Human ALK2 extracellular domain (NCBI protein database DNA encoding ACCESSION number NP_001096, a polypeptide consisting of amino acid residues 21 to 123 of the amino acid sequence, is incorporated into vector pET-28b (+) (Novagen, catalog number: 69865), and His tag is located on the C-terminal side. A plasmid was constructed to express the protein with linked sequences.
  • Escherichia coli SHuffle T7 (New England Biolabs, catalog number: C3029H) was transformed and cultured in TB medium (Sigma Aldrich, catalog number: T0918). After culture, the ultrasonically disrupted cells were centrifuged, and the supernatant was purified with a HisTrap FF crude column (GE Healthcare, catalog number: 17-5286-01). Thereafter, the human ALK2 extracellular domain was purified by electrophoresis using a HiLoad 26/600 Superdex 200 column (GE Healthcare, catalog number: 28-9893-36) to a single band with a molecular weight of 12 kDa.
  • Capture and the capture method was performed by measuring the antigen as an analyte.
  • An anti-human IgG (Fc) antibody Human Antibody Capture kit, GE Healthcare Biosciences
  • CM5 Sensor Chip
  • the reference cell was similarly fixed.
  • Example 15 In vivo activity evaluation of humanized A2-15A antibody (IgG2) and humanized A2-27D antibody (IgG1 LALA) Humanized hA2-15A-H4 / L6 (IgG2) prepared in Example 11) -4 and Examples 12) -4 The inhibitory activity against ectopic ossification of humanized hA2-27D-H2 / L2 (IgG1 LALA) produced in 4) -4 was analyzed using an ectopic ossification model by transplantation of BMP7 using mice.
  • a Collapape (manufactured by Zimmer Dental) cut into a 4 mm diameter circle and BMP7 (manufactured by Miltenney) soaked with 2.5 micro G ( ⁇ g) was frozen overnight at ⁇ 80 ° C. and then vacuum-dried.
  • the hair of the skin near the femur of a mouse (C57BL / 6: 8-9 weeks old) was removed, incised under isoflurane suction anesthesia, and freeze-dried filter paper was transplanted into skeletal muscle. Two weeks after transplantation, ectopic ossification was analyzed by micro CT (Comscan), and then ectopic bone in skeletal muscle was taken out and weighed. did.
  • the antibody was administered subcutaneously once a week (Day-1, Day 6 with Day 0 as the transplant date). Dilution was performed with a solvent (HBSor) so that the concentration of the administered antibody was 1, 3, 10 mg / kg.
  • HBSor a solvent
  • IgG manufactured by JACKSON IMMUNORESEARCH
  • JACKSON IMMUNORESEARCH was prepared in a solvent so as to be 10 mg / kg and administered.
  • Example 16 Epitope analysis of A2-27D antibody 16) -1 Preparation of human chimeric cA2-27D Fab fragment A Fab fragment was prepared from the human chimeric cA2-27D antibody obtained in Example 5) -8 using Pierce Fab Preparation Kit.
  • X-ray diffraction data was collected under a 95K nitrogen stream at BL1A of the Synchrotron Radiation Research Laboratory, High Energy Accelerator Research Organization. From the obtained diffraction image, the diffraction intensity was quantified using software XDS (Acta Cryst. (2010). D66, 125-132) to obtain the crystal structure factor.
  • a molecular replacement method was performed to determine the phase.
  • a software phaser (CCP4: Collaborative Computation Project No. 4) was used for the calculation.
  • the crystal contained one complex per asymmetric unit.
  • the structure was refined using software refmac5 (CCP4), and the model was corrected using software coot. This operation was repeated to obtain a final R value of 22.3% and a freeR value of 26.7% with a resolution of 2.6 mm.
  • the model consists of one complex, A2-27D Fab L chain amino acid residues 1-211, H chain amino acid residues 1-134 and 141-223, ALK2-ECD amino acid residues 11-89, and 61 Contains water molecules.
  • amino acid residues of ALK2-ECD within 4 km from the determined A2-27D Fab are as follows: Glu18, Gly19, Ile39, Asn40, Asp41, Gly42, Phe43, His44, Val45, Tyr46, Asn82, Thr84, Gln86, Leu87.
  • FIG. 37 shows a ribbon model of the entire composite.
  • Example 17 Design of humanized A2-11E antibody and humanized A2-25C antibody 17) -1 Design of humanized hA2-11E 17) -1-1 Molecular modeling of variable region of A2-11E A2-11E variable region molecule Modeling was performed by a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of A2-11E determined above.
  • 3BN9 was selected as having the highest sequence identity to the heavy and light chain variable regions of A2-11E.
  • the three-dimensional structure of the framework region was created by combining the coordinates of 3BN9 to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model.
  • the amino acid residues in the framework regions for the human ⁇ chain subgroup 3 consensus sequence and the human ⁇ chain subgroup 1 consensus sequence are aligned with the amino acid residues for A2-11E, and the positions where different amino acids are used are Identified.
  • the positions of these residues are analyzed using the 3D model of A2-11E constructed above, and the donor residues to be grafted on the acceptor are described in Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1000029-10033 (1989)).
  • the sequence of humanized hA2-11E was constructed as described in the examples below by transferring several selected donor residues into the acceptor antibody.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-11E-H3 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 111 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 137th amino acid residues, the sequence consisting of the 138th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111 is described in SEQ ID NO: 110 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 411, the sequence consisting of nucleotides 412 to 1401 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 110 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 110 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111 are also shown in FIG.
  • the humanized hA2-11E heavy chain designed to replace amino acid number 88 (serine) with alanine and amino acid number 93 (threonine) with valine was named “hA2-11E-H4 type heavy chain”.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-11E-H4 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 113 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 137th amino acid residues, and the sequence consisting of the 138th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113 is set forth in SEQ ID NO: 112 of the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 411, and the sequence consisting of nucleotides 412 to 1401 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 112 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 112 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-11E-L2 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 115 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 128th amino acid residues, and the sequence consisting of the 129th to 233rd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115 is set forth in SEQ ID NO: 114 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 60, the sequence consisting of nucleotides 61 to 384, the sequence consisting of nucleotides 385 to 699 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 114 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 114 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115 are also shown in FIG.
  • amino acid number 10 (leucine) of the A2-11E light chain shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing is serine, and amino acid number 21 (leucine) is isoleucine.
  • Amino acid number 22 (serine) to threonine amino acid number 40 (leucine) to proline
  • amino acid number 42 amino acid number 42 (glutamic acid) to lysine
  • amino acid number 83 valine
  • amino acid number 85 isoleucine
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-11E-L3 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 117 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 128th amino acid residues, and the sequence consisting of the 129th to 233rd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117 is described in SEQ ID NO: 116 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides, the sequence consisting of the 61st to 384th nucleotides, and the sequence consisting of the 385th to 699th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 116 are a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 116 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117 are also shown in FIG.
  • the amino acid number 10 (leucine) of the A2-11E light chain shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is serine, and amino acid number 21 (leucine) is isoleucine.
  • the amino acid number 40 (leucine) is proline, the amino acid number 83 (valine) is phenylalanine, the amino acid number 103 (leucine) is valine, the amino acid number 105 (leucine) is isoleucine, and the amino acid number 108 (alanine) is threonine.
  • the humanized hA2-11E light chain designed with replacement was named “hA2-11E-L4 type light chain”.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-11E-L4 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 119 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 128th amino acid residues, and the sequence consisting of the 129th to 233rd amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 is set forth as SEQ ID NO: 118 in the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 118, the sequence consisting of the 61st to 384th nucleotides, the sequence consisting of the 385th to 699th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 118 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119 are also shown in FIG.
  • An antibody consisting of a humanized hA2-11E-H3 type heavy chain and a humanized hA2-11E-L4 type light chain was designed and called “humanized hA2-11E-H3 / L4” (“hA2-11E-H3 / L4”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-11E-H4 type heavy chain and a humanized hA2-11E-L2 type light chain was designed and called “humanized hA2-11E-H4 / L2” (“hA2-11E-H4 / L2”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-11E-H4 type heavy chain and a humanized hA2-11E-L3 type light chain was designed and called “humanized hA2-11E-H4 / L3” (“hA2-11E-H4 / L3”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-11E-H4 type heavy chain and a humanized hA2-11E-L4 type light chain was designed and called “humanized hA2-11E-H4 / L4” (“hA2-11E-H4 / L4”) Sometimes named).
  • the antibody designed as described above can be prepared according to Example 18 and evaluated according to Examples 2 and 4.
  • variable region of A2-25C is a method known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of AA2-25C determined above. As a result, 3BN9 was selected as having the highest sequence identity to the A2-25C heavy and light chain variable regions. The three-dimensional structure of the framework region was created by combining the coordinates of 3BN9 to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model.
  • the sequence of the framework region of A2-25C was compared with the framework region of the human subgroup consensus sequence.
  • KABAT et al. Sequences of subgroups of subgroups of sequence group 1 in the sequence of subgroups of sequences in sequence of sequence of humans, sequence of humans, sequence of humans, health services, health, bethesda, MD. (1991)).
  • the amino acid residues of the framework regions for the human ⁇ chain subgroup 3 consensus sequence and the human ⁇ chain subgroup 1 consensus sequence are aligned with the amino acid residues for A2-25C, and the positions where different amino acids are used are Identified.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-25C-H3 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 121 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 137th amino acid residues, and the sequence consisting of the 138th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121 is described in SEQ ID NO: 120 of the sequence listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 411, the sequence consisting of nucleotides 412 to 1401 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 120 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 120 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 121 are also shown in FIG.
  • the amino acid number 19 (lysine) of the A2-25C heavy chain shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing is arginine, and amino acid number 38 (cysteine) is arginine.
  • the amino acid number 42 (threonine) is glycine, the amino acid number 63 (threonine) is serine, the amino acid number 75 (alanine) is serine, the amino acid number 84 (aspartic acid) is asparagine, and the amino acid number 88 (serine) is alanine.
  • the humanized hA2-25C heavy chain designed by substituting amino acid number 113 (methionine) for leucine was named “hA2-25C-H4 type heavy chain”.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-25C-H4 type heavy chain is described in SEQ ID NO: 123 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 137th amino acid residues, and the sequence consisting of the 138th to 467th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 is described in SEQ ID NO: 122 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of nucleotides 1 to 57, the sequence consisting of nucleotides 58 to 411, the sequence consisting of nucleotides 412 to 1401 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 122 are a signal sequence, a heavy chain variable region sequence, and a heavy chain constant, respectively.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 122 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 123 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-25C-L1 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 125 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125 is described in SEQ ID NO: 124 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, and the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 125 are also shown in FIG.
  • Amino acid number 9 (alanine) of the A2-25C light chain shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing is serine, and amino acid number 15 (leucine) is valine.
  • the amino acid number 16 (glutamic acid) is glycine
  • the amino acid number 17 (glutamic acid) is aspartic acid
  • the amino acid number 18 (isoleucine) is arginine
  • the amino acid number 43 (serine) is alanine
  • the amino acid number 45 (glutamine) is lysine.
  • Amino acid number 70 (glutamine) aspartic acid, amino acid number 72 (serine) as threonine, amino acid number 74 (lysine) as threonine, amino acid number 77 (arginine) as serine, amino acid number 79 (arginine) as Glutamine, amino acid number 80 (valine) to proline Amino acid number 83 (isoleucine) to phenylalanine, amino acid number 84 (glycine) to alanine, amino acid number 85 (isoleucine) to threonine, amino acid number 100 (serine) to glutamine, amino acid number 104 (leucine) to valine, A humanized hA2-25C light chain designed to replace amino acid number 109 (alanine) with threonine was named “hA2-25C-L2 type light chain”.
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-25C-L2 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 127 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 127 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 127 is described in SEQ ID NO: 126 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 126, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, and the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 126 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 127 are also shown in FIG.
  • the amino acid number 9 (alanine) of the A2-25C light chain shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing is serine, and amino acid number 15 (leucine) is valine.
  • the amino acid number 16 (glutamic acid) is glycine
  • the amino acid number 17 (glutamic acid) is aspartic acid
  • the amino acid number 18 (isoleucine) is arginine
  • the amino acid number 45 (glutamine) is lysine
  • the amino acid number 72 (serine) is threonine.
  • amino acid number 74 (lysine) is threonine
  • amino acid number 77 (arginine) is serine
  • amino acid number 79 (arginine) is glutamine
  • amino acid number 80 (valine) is proline
  • amino acid number 83 (isoleucine) is phenylalanine.
  • Amino acid number 84 (glycine) The humanized hA2-25C light chain designed to replace amino acid number 85 (isoleucine) with threonine, amino acid number 104 (leucine) with valine, and amino acid number 109 (alanine) with threonine, -25C-L3 type light chain ".
  • the amino acid sequence of the humanized hA2-25C-L3 type light chain is set forth in SEQ ID NO: 129 in the Sequence Listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues, the sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, and the sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 are respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 is set forth in SEQ ID NO: 128 of the Sequence Listing.
  • sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 128, the sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides, and the sequence consisting of the 388th to 702th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 128 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 129 are also shown in FIG.
  • An antibody consisting of a humanized hA2-125C-H3 type heavy chain and a humanized hA2-25C-L3 type light chain was designed and called “humanized hA2-25C-H3 / L3” (“hA2-25C-H3 / L3”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-25C-H4 type heavy chain and a humanized hA2-25C-L1 type light chain was designed and referred to as “humanized hA2-25C-H4 / L1” (“hA2-25C-H4 / L1”).
  • humanized hA2-25C-H4 / L1 (“hA2-25C-H4 / L1”).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-25C-H4 type heavy chain and a humanized hA2-25C-L2 type light chain was designed and called “humanized hA2-25C-H4 / L2” (“hA2-25C-H4 / L2”) Sometimes named).
  • An antibody consisting of a humanized hA2-25C-H4 type heavy chain and a humanized hA2-25C-L3 type light chain was designed and called “humanized hA2-25C-H4 / L3” (“hA2-25C-H4 / L3”) Sometimes named).
  • the antibody designed as described above can be prepared according to Example 18 and evaluated according to Examples 2 and 4.
  • Example 18 Construction and preparation of humanized A2-11E antibody (IgG1) and humanized A2-25C antibody (IgG1) vector 18) -1 Construction of humanized A2-11E heavy chain expression vector 18) -1-1 Humanization Construction of hA2-11E-H3 type heavy chain expression vector DNA encoding the variable region of humanized hA2-11E-H3 shown in nucleotide numbers 36 to 428 of the nucleotide sequence of humanized hA2-11E-H3 shown in SEQ ID NO: 110 A DNA fragment containing the sequence was synthesized (Geneart Artificial Gene Synthesis Service).
  • humanized hA2-11E-H4 type heavy chain expression vector Humanized hA2-11E- represented by nucleotide numbers 36 to 428 of the nucleotide sequence of humanized hA2-11E-H4 represented by SEQ ID NO: 112
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of H4 was synthesized (GENEART artificial gene synthesis service).
  • Example 8 A humanized hA2-11E-H4 expression vector was constructed in the same manner as in 1-1. The obtained expression vector was designated as “pCMA-G1 / hA2-11E-H4”.
  • a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the variable region of humanized hA2-11E-L2 was amplified with KOD-Plus- (TOYOBO) and the following primer set, and Example 5)-
  • the humanized hA2-11E-L2 by inserting the chimeric and humanized antibody light chain expression vector pCMA-LK constructed in 1 into the site cleaved with the restriction enzyme BsiWI using the In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech). An expression vector was constructed. The obtained expression vector was designated as “pCMA / hA2-11E-L2”.
  • Primer set 5′-CTGTGGATCTCCGGCCGCGTACGCC-3 ′ (CM-LKF; SEQ ID NO: 134) 5′-GGAGGGGGCGCCACCCGTACG-3 ′ (KCL-Inf-R; SEQ ID NO: 135)
  • Opti-Pro SFM Invitrogen
  • 200 ⁇ L of the expression vector / Opti-Pro SFM mixed solution was added to 200 ⁇ L of the Polyethyleneimine / Opti-Pro SFM mixed solution, gently stirred, allowed to stand for another 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F cells.
  • a culture supernatant obtained by shaking culture at 90 rpm for 7 days in a 37 ° C., 8% CO 2 incubator was subjected to a Minisart-Plus filter (Sartorius) and filtered to obtain a sample for evaluation.
  • Example 19 In vitro activity evaluation of humanized A2-11E antibody (IgG1) and humanized A2-25C antibody (IgG1) 19) -1 Antibody evaluation by BMP osteoblast differentiation induction assay Human prepared in Example 18) -5 Inhibitory activity of intracellular signal via endogenous ALK2 of humanized A2-11E antibody (IgG1) and humanized A2-25C antibody (IgG1) was similar to that in Example 6) -2. It analyzed by the effect with respect to the differentiation-inducing activity to a cell. For differentiation induction, 2.5 ng / mL GDF2 / BMP9 (manufactured by RD-SYSTEMS) was used.
  • Example 20 Evaluation of binding of humanized A2-11E antibody (IgG1) and humanized A2-25C antibody (IgG1) to human ALK2 Humanized A2-11E antibody (IgG1) prepared in Example 18) -5, and humanized A2 Measurement of dissociation constant between -25C antibody (IgG1) and antigen (human ALK2 extracellular domain prepared in Example 14) -1 was performed using Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences).
  • the anti-human IgG (Fc) antibody was captured (captured) using an antibody as a ligand and the antigen was measured as an analyte, and the capture method was used.
  • An anti-human IgG (Fc) antibody (Human Antibody Capture kit, GE Healthcare Biosciences) was covalently bound to sensor chip CM5 (GE Healthcare Biosciences) by about 1000 RU by the amine coupling method. .
  • the reference cell was similarly fixed.
  • the dissociation phase for 600 seconds was monitored.
  • 3M MgCl 2 was added at a flow rate of 10 ⁇ l / min for 30 seconds.
  • Example 21 Epitope analysis of A2-25C antibody 21) -1
  • Human chimeric cA2-25C Fab fragment Human chimeric cA2-25C prepared in the same manner as in Example 5) -8 was prepared by using Papain (Sigma-Aldrich) with Fab fragment and Fc fragment. And added to a HiTrap Protein A HP column (GE Healthcare). The Fab fragment collected in the flow-through fraction was concentrated.
  • Example 21) -2 Crystallization and Structural Analysis of Human Chimeric cA2-25C Fab Fragment and ALK2-ECD Complex
  • Example 21) -1 Chimeric A2-25C Fab fragment obtained in Example 21 and ALK2-ECD prepared according to Example 14 The complex was concentrated to 3.8 mg / mL and used for crystallization. A vapor diffusion method was used for crystallization.
  • the diffraction intensity was quantified from the obtained diffraction image using software mosflm (CCP4: Collaborative Computation Project No. 4) to obtain the crystal structure factor.
  • a molecular replacement method was performed to determine the phase.
  • a software phaser (CCP4: Collaborative Computation Project No. 4) was used for the calculation.
  • the crystal contained two complexes in the asymmetric unit.
  • the structure was refined using software refmac5 (CCP4), and the model was corrected using software coot. This operation was repeated to obtain a final R value of 22.4% and a freeR value of 25.3% with a resolution of 2.1 mm.
  • the model consists of two complexes: A2-25C Fab L chain amino acid residue 1-212, H chain amino acid residue 1-219, ALK2-ECD amino acid residues 12-52 and 66-88, and 411 Contains water molecules.
  • amino acid residues of ALK2-ECD that are commonly within 4 cm from the two determined A2-25C Fabs are as follows: Glu18, Gly19, Leu20, Ile39, Asp41, Gly42, Phe43, His44, Val45, Tyr46 , Thr84.
  • FIG. 49 shows a ribbon model of the entire composite.
  • Example 22 Evaluation of inhibitory activity of A2-27D against various mutant ALK2 Thirteen mutants identified from FOP cases (L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D) In addition, the inhibitory activity of A2-27 against R375P) and wild type ALK2 was analyzed with a BMP-specific Id1WT4F-luciferase reporter using HEK293A cells in the same manner as in Example 2) -3.
  • the culture medium was fresh OPTI-MEM I (Life Technologies) containing 10 ng / mL BMP7 (Milteney), 3 ⁇ g / mL rat IgG1 (R & D Systems), or A2-27D. And the cells were cultured overnight. The next day, luciferase activity was measured using Dual-Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega).
  • the chimeric or humanized anti-ALK2 antibody of the present invention has an inhibitory action on BMP signaling through ALK2, and the pharmaceutical composition containing the anti-ALK2 antibody has ectopic ossification and / or dysplasia, anemia, Alternatively, it can be a therapeutic or preventive agent for diffuse bridge glioma (DIPG).
  • DIPG diffuse bridge glioma
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of cDNA encoding heavy chain variable region of A2-11E SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of heavy chain variable region of A2-11E SEQ ID NO: 3: Light chain variable region of A2-11E Nucleotide sequence of cDNA encoding SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of light chain variable region of A2-11E SEQ ID NO: 5: nucleotide sequence of cDNA encoding heavy chain variable region of A2-15A SEQ ID NO: 6: of A2-15A Amino acid sequence of heavy chain variable region SEQ ID NO: 7: nucleotide sequence of cDNA encoding light chain variable region of A2-15A SEQ ID NO: 8: amino acid sequence of variable region of light chain of A2-15A SEQ ID NO: 9: A2- Nucleotide sequence of cDNA encoding the variable region of the heavy chain of 25C SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of A

Abstract

　この出願は、ＡＬＫ２蛋白質に特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達の抑制活性を有する抗体、該抗体の生産方法、並びに、該抗体を含む異所性骨化及び／又は骨形成異常、貧血、或いはびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供する。

Description

抗ＡＬＫ２抗体
　本発明は、異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療及び／又は予防薬として有用な物質、並びに異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療及び／又は予防方法に関する。
　進行性骨化性線維異形成症（Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ　ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ（ＦＯＰ））は、骨格筋や腱、靭帯など、通常は骨組織が形成されない軟組織において、異所性に軟骨組織や骨組織が形成される遺伝性疾患である（非特許文献１-３）。本疾患では、異所性骨化が顔面を含む全身で起こり、異所性骨組織と既存の骨組織が癒合して関節の可動域が著しく低下したり、身体の変形が生じたりする（非特許文献１-３）。
　ＦＯＰにおける異所性骨化は、成長に伴って慢性的に進行する他に、筋損傷やウイルス感染等により生じるフレアアップと呼ばれる症状を伴って進行する急性の異所性骨化が知られている（非特許文献１）。フレアアップは炎症反応や長期間に渡る痛みを主症状とする膨脹であり、筋損傷を生じるような打撲や転倒・筋肉注射などで誘導される他に、原因が明確でない突発的な例も知られている。ＦＯＰではフレアアップ後に異所性骨組織が形成されることから、生検や手術などの侵襲的医療行為は禁忌とされており、異所性骨組織を外科的に除去することはできない。また、ＦＯＰで形成される異所性骨組織は、正常な軟骨細胞や骨芽細胞によって形成され、正常な骨組織と同様に代謝されているため、薬物等を用いて内科的に異所性骨組織だけを除去することもできない。
　ＦＯＰの異所性骨化を抑制するような根本的な治療法は確立されておらず、痛み等に対する対処療法が行われているのみである。従って、ＦＯＰで形成された異所性骨組織を除去することは極めて困難で、異所性骨化が始まる前に予防的な効果の期待できる薬物の開発が期待されている。
　ＦＯＰの責任遺伝子として、骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導する骨形成蛋白質（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ））の受容体の一種をコードするＡｃｔｉｖｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ　２（ＡＬＫ２；アクチビン様キナーゼ２）遺伝子が同定された（非特許文献４）。ＡＬＫ２は、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１（ＡＣＶＲ１）と呼ばれる遺伝子と同一である。家族性、および孤発性ＦＯＰ症例から、アミノ酸置換を伴ったＡＬＫ２が見出されている（非特許文献４）。
　ヒトおよびマウスＡＬＫ２は、５０９アミノ酸からなるシグナルペプチドを持つ１回膜貫通型タンパク質で、ＢＭＰと結合する膜貫通型のセリン・スレオニン・キナーゼ受容体として機能する（非特許文献１-３）。Ｎ末端側の細胞外領域でＢＭＰを結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。
　ＢＭＰの受容体は、それらの構造と機能から、ＡＬＫ２を含むＩ型受容体と、ＩＩ型受容体の２種類に分類される（非特許文献１-３）。ＩＩ型受容体は、ＢＭＰを結合しなくてもキナーゼ活性を示す構成的活性型酵素である。一方、ＡＬＫ２を含むＩ型受容体は、ＢＭＰと結合しない状態では不活性型の酵素で、ＢＭＰとの結合依存的にキナーゼ活性を示す。これは、ＢＭＰとの結合により、ＩＩ型受容体のキナーゼがＩ型受容体の細胞内ドメインを基質としてリン酸化し、立体構造を変化させてＩ型受容体を活性化するためと考えられている（非特許文献１-３）。
　Ｉ型受容体の細胞内領域の特定アミノ酸を置換すると、ＩＩ型受容体非依存的に活性化された構成的活性型受容体となることが知られている（非特許文献１-３）。このＩ型受容体の構成的活性型変異体を過剰発現すると、ＢＭＰ刺激を加えなくても細胞内情報伝達系が活性化される。従って、Ｉ型受容体が、細胞外から細胞内へＢＭＰの情報を伝達する責任分子であると考えられる。
　家族性および典型的孤発性ＦＯＰ症例から同定されたＡＬＫ２の変異は、Ａｒｇ２０６がＨｉｓに置換したＲ２０６Ｈ変異体であった（非特許文献４）。これまでにＦＯＰ症例から同定された遺伝子変異は、全てＡＬＫ２の細胞内領域のアミノ酸変異を起こすことが判明している。これらのＦＯＰ症例の変異の多くは、ＡＬＫ２の細胞内領域のＡＴＰ結合領域近傍に集中している（非特許文献５）。
　ＦＯＰで同定されたＡＬＫ２変異体を培養細胞に過剰発現させると、ＢＭＰ刺激を加えなくともＢＭＰの細胞内情報伝達系が活性化される（非特許文献６）。そこで、ＦＯＰの治療薬として、ＡＬＫ２のキナーゼに対する低分子阻害薬、遺伝的に変異したＡＬＫ２の発現を特異的に抑制するＲＮＡｉやエクソンスキップ法、ＡＬＫ２受容体の下流の転写因子阻害剤、および、ＢＭＰシグナルによる骨芽細胞分化阻害薬などが開発されている（特許文献１及び非特許文献１-３）。
　現在開発されている低分子化合物や核酸のＦＯＰ治療薬は、いずれも細胞膜を透過して細胞内でＡＬＫ２シグナルを阻害することが期待されている。しかし、核酸医薬は効果的な薬物デリバリー法が確立されておらず、また、キナーゼ阻害剤はＡＬＫ２と同一性の高い他のＡＬＫ受容体ファミリーに対する特異性が低いなどの問題が残されている。そのため、ＦＯＰに対してＡＬＫ２に対する特異性が高い新しい治療薬の開発が望まれている。ＡＬＫ２の細胞外領域に作用してシグナルを阻害する抗体医薬は、生理的な免疫系を利用した安全性の高い治療法である。抗体医薬は、血流を介した安定な薬物デリバリーが容易であると共に、同一性の高い他のＡＬＫ受容体ファミリーには作用せず、ＡＬＫ２のみを阻害する特異性を発揮させることが可能である。さらに、ＡＬＫ２の野生型や新規の変異体を含めた細胞内領域のさまざまな変異体に対しても抑制作用が期待できる。また、全身の細胞で発現するようなＡＬＫ３を阻害しないことから、ＡＬＫ２に対する特異的な阻害抗体は、一般的な骨芽細胞分化阻害剤とは異なり、正常な骨格組織の成長や維持、再生には影響の少ない医薬品となることが期待できる。しかし、ＡＬＫ２に特異的に結合し、ＦＯＰに対して治療効果を示す抗体については、これまで知られていなかった。
国際公開第ＷＯ２００７／１２３８９６号
Ｔ．　Ｋａｔａｇｉｒｉ，　Ｊ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．，５２，３３－４１（２０１０） Ｔ．　Ｋａｔａｇｉｒｉ，　Ｊ．Ｏｒａｌ　Ｂｉｏｓｃｉ．，５４，１１９－１２３（２０１２） Ｔ．　Ｋａｔａｇｉｒｉ　ａｎｄ　Ｓ．　Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９４，７０３－７１４（２０１３） Ｅ．Ｍ．　Ｓｈｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３８，５２５－５２７（２００６） Ａ．　Ｃｈａｉｋｕａｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７，３６９９０－３６９９８（２０１２） Ｔ．　Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，７１４９－７１５６（２００９）
　本発明の目的は、異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療及び／又は予防薬として有用な物質、並びに異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療及び／又は予防方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意、検討を行ったところ、ＡＬＫ２に特異的に結合し、異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療及び／又は予防効果を有する新規な抗体を取得することに成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
　（１）以下の（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列における少なくとも７アミノ酸からなるポリペプチド配列と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（ａ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
（ｅ）（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に１乃至数アミノ酸残基の置換、欠失又は付加を伴うアミノ酸配列
　（２）以下の（ｆ）乃至（ｊ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における少なくとも７アミノ酸からなるポリペプチド配列と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（ｆ）配列番号８５に示されるヌクレオチド配列
（ｇ）配列番号８５に示されるヌクレオチド配列の７２８乃至１０３６番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列
（ｈ）配列番号８７に示されるヌクレオチド配列
（ｉ）配列番号８７に示されるヌクレオチド配列の７２８乃至１０３６番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列
（ｊ）（ｆ）乃至（ｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
　（３）前記ポリペプチド配列が、ＡＬＫ２細胞外領域内の配列である、（１）又は（２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（４）前記抗体が、野生型ＡＬＫ２蛋白質及び変異型ＡＬＫ２蛋白質に結合する、（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（５）前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（６）前記抗体及び前記抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体である、（１）乃至（５）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、並びに配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つの抗体と前記ポリペプチドへの結合に対し交差競合することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、並びに配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つの抗体が結合するエピトープに結合することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（９）配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、８２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）、８６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）、８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）、及び８９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基を含むエピトープに結合することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１０）配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、８２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）、８６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）、８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）、及び８９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基との間で相互作用距離を有することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１１）配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、２０番目のロイシン（Ｌｅｕ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、及び８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基を含むエピトープに結合することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１２）配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、２０番目のロイシン（Ｌｅｕ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、及び８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基との間で相互作用距離を有することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１３）相互作用距離が６オングストローム以下である、（１０）又は（１２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１４）相互作用距離が４オングストローム以下である、（１０）又は（１２）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１５）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号７３に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号７５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする、（１）乃至（８）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１６）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、（１５）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１７）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号６３又は配列番号７１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする、（１）乃至（８）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１８）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１７）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（１９）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号７９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号８１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号８３に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする、（１）乃至（１０）、（１３）乃至（１４）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２０）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、（１９）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２１）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号６５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号６９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする、（１）乃至（８）、（１１）乃至（１４）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、（２１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２３）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（２２）のいずれかに記載の抗体の抗原結合断片。
　（２４）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（２２）のいずれかに記載の抗体。
　（２５）キメラ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（２２）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２６）ヒト化されていることを特徴とする、（１）乃至（２２）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（２７）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ１重鎖、ヒト免疫グロブリンＧ２重鎖、又はヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、（１）乃至（２４）のいずれかに記載の抗体。
　（２８）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の定常領域を含む、（２７）に記載の抗体。
　（２９）ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の２３４番目のロイシン（Ｌｅｕ）がアラニン（Ａｌａ）により置換され、２３５番目のロイシン（Ｌｅｕ）がアラニン（Ａｌａ）により置換された、（２８）に記載の抗体。
　（３０）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含む、（２７）に記載の抗体。
　（３１）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の定常領域を含む、（２７）に記載の抗体。
　（３２）ヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の２４１番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）により置換された、（３１）に記載の抗体。
　（３３）ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）　配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）　配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）　配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ５）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ６）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）　配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）　配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）　配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）　配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（３４）配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３３）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（３５）配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３３）に記載の抗体。
　（３６）配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３３）に記載の抗体。
　（３７）ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）　配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）　配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）　配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４）　配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５）　配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６）　配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７）　配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ９）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ１０）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）　配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）　配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）　配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）　配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５）　配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（３８）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３７）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（３９）配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３７）に記載の抗体。
　（４０）配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、（３７）に記載の抗体。
　（４１）ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）　配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）　配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）　配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）　配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）　配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（４２）ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
ａ１）　配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２）　配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
ｂ１）　配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２）　配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３）　配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（４３）カルボキシル末端の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体である、（１）乃至（４２）のいずれかに記載の抗体。
　（４４）重鎖又は軽鎖のアミノ末端のアミノ酸残基がピログルタミル化されている抗体である、（１）乃至（４３）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
　（４５）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
　（４６）異所性骨化の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（４５）に記載の医薬組成物。
　（４７）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニストからなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防用医薬組成物。
　（４８）異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であることを特徴とする、（４６）又は（４７）に記載の医薬組成物。
　（４９）異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であることを特徴とする、（４６）又は（４７）に記載の医薬組成物。
　（５０）貧血の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（４５）に記載の医薬組成物。
　（５１）びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（４５）に記載の医薬組成物。
　（５２）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（４５）乃至（４９）のいずれかに記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防方法。
　（５３）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（４５）乃至（４９）のいずれかに記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニストからなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後して投与することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防方法。
　（５４）異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であることを特徴とする、（５２）又は（５３）に記載の治療及び／又は予防方法。
　（５５）異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であることを特徴とする（５２）又は（５３）に記載の治療及び／又は予防方法。
　（５６）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、或いは（４５）又は（５０）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、貧血の治療及び／又は予防方法。
　（５７）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、或いは（４５）又は（５１）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防方法。
　（５８）（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
　（５９）（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ７）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号３１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号３３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号３５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（６０）（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）　配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）　配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）　配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）　配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ９）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ１０）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１１）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号４９に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号５１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号５３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　配列番号５５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）　配列番号５７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ９）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（６１）（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号１１２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号１１４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（６２）（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（６３）（５８）乃至（６２）のいずれかに記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
　（６４）（５８）乃至（６２）のいずれかに記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
　（６５）（６３）に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
　（６６）（６４）又は（６５）に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む（１）乃至（４４）のいずれかに記載の抗体の生産方法。
　本発明により、異所性骨化及び／又は骨形成異常の治療剤及び／又は予防剤を得ることができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-017882号の開示内容を包含する。
ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体のマウスＡＬＫ２-Ｈｉｓ＆Ｆｃ（「ｍＡＬＫ２－Ｆｃ」）に対する認識、およびヒトＦｃに対する結合を示したグラフである。対照として培地を用いた（「Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍｅｄｉｕｍ」）。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、蛍光タンパク質ＥＧＦＰ発現細胞を認識しないことを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、野生型のマウスＡＬＫ２発現細胞（ｍＡＬＫ２（ＷＴ）－ＥＧＦＰ）を認識することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、野生型のヒトＡＬＫ２発現細胞（ｈＡＬＫ２（ＷＴ）－ＥＧＦＰ）を認識することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＦＯＰ変異（Ｒ２０６Ｈ）のヒトＡＬＫ２発現細胞（ｈＡＬＫ２（Ｒ２０６Ｈ）－ＥＧＦＰ）を認識することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＡＬＫ２発現細胞のみを特異的に認識し、ＡＬＫ１、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６発現細胞は認識しないことを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、野生型のＡＬＫ２発現細胞、ＦＯＰで同定された表示の１２種類のＡＬＫ２変異体発現細胞を認識することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＡＬＫ２の野生型およびＲ２０６Ｈ変異型を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ａ細胞において、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＢＭＰ２が誘導するＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を完全には抑制できないことを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９が誘導するＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 ハイブリドーマＡ２-１５Ａ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９が誘導するマウスの骨格筋組織における異所性骨誘導を抑制することを示した図である。 キメラ化抗体ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄが、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性に対して、それぞれのラットモノクローナル抗体Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２７Ｄと同等の阻害活性を示すことを示したグラフである。 キメラ化抗体ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄが、ＢＭＰによって誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 Ａ２－１５Ａ抗体の各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示した図である。 Ａ２－２７Ｄ抗体の各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示した図である。 Ａ２－１１Ｅ抗体の各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示した図である。 Ａ２－２５Ｃ抗体の各ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化Ａ２-１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、およびヒト化Ａ２-２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）が、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化Ａ２-１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、およびヒト化Ａ２-２７Ｄ抗体（ＬＡＬＡ）が、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 ヒト化Ａ２-１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、およびヒト化Ａ２-２７Ｄ抗体（ＬＡＬＡ）が、ＢＭＰ７が誘導するマウスの骨格筋組織における異所性骨誘導を抑制することを示した図である。 ヒトＡＬＫ２－ＥＣＤとヒトキメラｃＡ２－２７Ｄ－Ｆａｂの複合体のＸ線結晶構造を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ヒト化Ａ２-１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、およびヒト化Ａ２-２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）が、ＢＭＰによって誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を、用量依存的に抑制することを示したグラフである。 ヒトＡＬＫ２－ＥＣＤとヒトキメラｃＡ２－２５Ｃ－Ｆａｂの複合体のＸ線結晶構造を示した図である。 ハイブリドーマＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＢＭＰ７によって誘導されるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）活性を、野生型（ＷＴ）および表示の１３種類すべての変異体で抑制することを示したグラフである。
１．定義
　本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
　本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
　本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
　本明細書中において、「ＡＬＫ２」は、ＡＬＫ２蛋白質と同じ意味で用いており、野生型及び変異体（変異型ともいう。）を含む。
　本明細書中における「抗体の抗原結合断片」とは、「抗体の機能性断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　本明細書における、「エピトープ」とは、「抗原結合部位」とも呼ばれ、一般に抗原の少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸からなる、抗体が結合する抗原部位を指し、本明細書では特定の抗ＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分ペプチドまたは部分立体構造を意味する。前記のＡＬＫ２の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。ＡＬＫ２の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、ＡＬＫ２のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定のＡＬＫ２抗体が結合するＡＬＫ２の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線結晶構造解析によって前記の抗体と隣接するＡＬＫ２のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。第一の抗ＡＬＫ２抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗ＡＬＫ２抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２に対する結合に対して第二の抗ＡＬＫ２抗体が（交差）競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＡＬＫ２の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体がＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナルの阻害活性等の活性を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、約５０－７０℃（例えば６８℃）でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて約０．７－１．０ＭのＮａＣｌ存在下、約５０－７０℃（例えば６８℃）でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１－２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１５　ｍＭ　クエン酸ナトリウムからなる。また、必要に応じて、当該溶液に約０．１－０．５％ＳＤＳを含有させてもよい。）を用い、約５０－７０℃（例えば６８℃）で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
　本明細書において、「１乃至数個」及び「１若しくは数個」なる記載がある場合の「数個」とは、２乃至１０個を示している。好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５若しくは６個以下、さらにより好ましくは、２若しくは３個である。
２．ＡＬＫ２
　ＡＬＫ２遺伝子は、骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導するＢＭＰの受容体の一種をコードするＦＯＰの責任遺伝子である。家族性、および孤発性ＦＯＰ症例からは、アミノ酸置換を伴った変異型ＡＬＫ２が見出されている。ヒトＡＬＫ２の変異型としては、Ｌ１９６Ｐ（１９６番目のロイシンがプロリンに置換された変異）、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ（１９７番目のプロリン及び１９８番目のフェニルアラニンが欠失し、ロイシンが挿入された変異）、Ｒ２０２Ｉ（２０２番目のアルギニンがイソロイシンに置換された変異）、Ｒ２０６Ｈ（２０６番目のアルギニンがヒスチジンに置換された変異）、Ｑ２０７Ｅ（２０７番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｒ２５８Ｓ（２５８番目のアルギニンがセリンに置換された変異）、Ｒ２５８Ｇ（２５８番目のアルギニンがグリシンに置換された変異）、Ｇ３２５Ａ（３２５番目のグリシンがアラニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｅ（３２８番目のグリシンがグルタミン酸に置換された変異）、Ｇ３２８Ｒ（３２８番目のグリシンがアルギニンに置換された変異）、Ｇ３２８Ｗ（３２８番目のグリシンがトリプトファンに置換された変異）、Ｇ３５６Ｄ（３５６番目のグリシンがアスパラギン酸に置換された変異）、Ｒ３７５Ｐ（３７５番目のアルギニンがプロリンに置換された変異）等が知られている。
　本発明で用いるＡＬＫ２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＡＬＫ２　ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＡＬＫ２を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
　本発明で用いるＡＬＫ２はヒトやマウスを含む哺乳動物由来のＡＬＫ２であり、例えばヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ－００１１０５を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号８４、ヌクレオチド配列は配列番号８５として本明細書中にも開示されている。マウスＡＬＫ２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ－００１１０３６７４を参照することにより入手可能であり、アミノ酸配列は配列番号８６、ヌクレオチド配列は配列番号８７として本明細書中にも開示されている。なお、ＡＬＫ２は、ＡＣＶＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）又はＡＣＴＲ１（Ａｃｔｉｖｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｐｅ　１）と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
　ＡＬＫ２のｃＤＮＡは、例えば、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＡＬＫ２のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
　なお、ヒト又はマウスのＡＬＫ２をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＡＬＫ２と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＡＬＫ２のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＡＬＫ２遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、ＡＬＫ２と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＡＬＫ２のｃＤＮＡに含まれる。
　また、ヒト又はマウスのＡＬＫ２のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＡＬＫ２と同等の生物活性を有する蛋白質もＡＬＫ２に含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＡＬＫ２遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＡＬＫ２と同等の生物活性を有する蛋白質もＡＬＫ２に含まれる。
３．異所性骨化及び／又は骨形成異常の検出
　ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達により、異所性骨化及び／又は骨形成異常が惹起される。
　「異所性骨化」とは、本来骨がない部位に骨ができることを意味し、「骨形成異常」とは、既存の骨の形や質に異常があることを意味する。「異所性骨化」としては、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、人工関節置換術後の異所性骨化等を、「骨形成異常」としては、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　ＡＬＫ２は、ＢＭＰを結合する膜貫通型のセリン・スレオニン・キナーゼ受容体であり、Ｎ末端側の細胞外領域でＢＭＰを結合し、細胞内のセリン・スレオニン・キナーゼによって下流の細胞内情報伝達系を活性化する。骨形成蛋白質（ＢＭＰ）は、形成転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーに属する多機能成長因子であり、約２０のＢＭＰファミリーメンバーが同定されている。ＢＭＰは骨格筋組織を含む軟組織において異所性骨形成を誘導することが確認されていることから、異常な骨形成を促進する疾患に関与していると考えられている。ＢＭＰ－２やＢＭＰ－４は、ＡＬＫ２に比べてＡＬＫ３に親和性が高いと考えられている。ＡＬＫ３は、ＡＬＫ２に比べてユビキタスに発現していることから、さまざまな部位で異所性骨化を誘導する実験ではＢＭＰ－２やＢＭＰ－４が一般的によく用いられていると考えられる。一方、ＢＭＰ－７は比較的ＡＬＫ２に対する親和性が高く、またＢＭＰ－９は一般的にＡＬＫ１に親和性が高いとが考えられているが、ＡＬＫ２に対しても比較的高い親和性をもっていることが分かっている。ＦＯＰではＡＬＫ２を介した異所性骨化が起こっていることから、ＢＭＰ－７及びＢＭＰ－９によるＡＬＫ２を介したシグナルの活性化による異所性骨誘導に対する薬効を検証することで、ＦＯＰに対する治療及び／又は予防効果の有無を確認することができると考えられる。
　筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）をＢＭＰ存在下で培養すると、ＢＭＰに特異的な細胞内シグナル伝達機構により成熟筋細胞への分化が抑制され、代わりに骨芽細胞への分化が誘導される。したがって、Ｃ２Ｃ１２細胞を用いたＢＭＰによる骨芽細胞への分化誘導モデルにより、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を解析することができる。
４．抗ＡＬＫ２抗体の製造
　本発明のＡＬＫ２に対する抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０９１０４８、ＷＯ２０１１／０２７８０８、又はＷＯ２０１２／１３３５７２に記載の方法で得ることができる。すなわち、非ヒト動物を目的抗原で免疫し、免疫成立後の動物からリンパ液、リンパ組織、血球試料又は骨髄由来の細胞を採取し、目的抗原に特異的に結合する非ヒト動物の形質細胞及び／又は形質芽細胞を選択する。得られた形質細胞及び／又は形質芽細胞から目的抗原に対する抗体遺伝子を採取し、その塩基配列を同定し、同定した遺伝子の塩基配列に基づいて上記抗体又は抗体の断片を得ることができる。また、ヒト感染患者の血液から同様に形質細胞及び／又は形質芽細胞を得ることにより、抗体又は抗体断片を得ることができる。取得された抗体はＡＬＫ２に対する結合性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。このようにして得られたモノクローナル抗体の例としては、Ａ２－１１Ｅ、Ａ２－１５Ａ、Ａ２－２５Ｃ、Ａ２－２７Ｄを挙げることができる。
　なお、本明細書中、抗体を特徴付けるＣＤＲ／ＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、ＫＡＢＡＴナンバリング（ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．　（１９９１））に従って割り付けられる。
　また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＡＬＫ２に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、ＷＯ２００９／４８０７２（２００９年４月１６日公開）及びＷＯ２０１０／１１７０１１（２０１０年１０月１４日公開）に記載されている。しかし、モノクローナル抗体を取得する方法は、既に確立された分野に該当し、前記の具体例に限定されるものではない。
　本発明の抗体には、上記ＡＬＫ２に対するモノクローナル抗体に加え、同様に治療／予防効果を有する、例えばポリクローナル抗体や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域（Ｆｃ）が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５（１９８４）参照）。Ａ２－１５Ａ由来のキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号２０の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２２の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、Ａ２－２７Ｄ由来のキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号２４の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号２６の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。
　Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１５Ａの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、Ａ２－１５Ａ抗体の重鎖可変領域は、配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡ）、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＴＮＳＧＧＳＩＮＹＲＤＳＶＫＧ）、及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＥＧＧＥＮＹＧＧＹＰＰＦＡＹ）を含む。また、Ａ２－１５Ａ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＮＱＧＶＳＬＳＲＹＮＬＭＨ）、配列番号６３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＳＳＮＬＡＳ）、及び配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＥＳＰＦＴ）を含む。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図１１にも記載されている。
　Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２７Ｄの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、Ａ２－２７Ｄ抗体の重鎖可変領域は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＳＴＦＳＮＹＧＭＫ）、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＳＲＳＳＴＹＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号６７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＩＳＴＰＦＹＷＹＦＤＦ）を含む。また、Ａ２－２７Ｄ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＬＡＳＳＳＶＳＹＭＴ）、配列番号６９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＧＴＳＮＬＡＳ）、及び配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＬＨＬＴＳＹＰＰＹＴ）を含む。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図１２にも記載されている。
　Ａ２－１１Ｅ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－１１Ｅの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、Ａ２－１１Ｅ抗体の重鎖可変領域は、配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＹ）、配列番号７３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＮＴＤＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）、及び配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＴＰＮＩＰＬＡＹ）を含む。また、Ａ２－１１Ｅ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ）、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＹＳＮＳＬＱＴ）、及び配列番号７７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＦＱＹＳＳＧＰＴ）を含む。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図１３にも記載されている。
　Ａ２－２５Ｃ抗体由来のヒト化抗体としては、Ａ２－２５Ｃの６種全てのＣＤＲ配列を含み、ＡＬＫ２に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。なお、Ａ２－２５Ｃ抗体の重鎖可変領域は、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＹＹＡＭＳ）、配列番号７９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＳＲＧＧＤＮＴＹＹＲＤＴＶＫＧ）、及び配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＬＮＹＮＮＹＦＤＹ）を含む。また、Ａ２－２５Ｃ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＱＡＳＱＤＩＧＮＷＬＳ）、配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＧＡＴＳＬＡＤ）、及び配列番号８３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＬＱＡＹＳＡＰＦＴ）を含む。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図１４にも記載されている。
　また、さらに各ＣＤＲ中の１乃至３個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したＣＤＲ改変ヒト化抗体も、ＡＬＫ２に対する結合活性を持つ限り、本発明の抗体に含まれる。ＣＤＲＬ２におけるアミノ酸置換例としては、配列番号３４に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸を置換したＣＤＲＬ２を挙げることができる。好ましくは、配列番号７１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＳＳＮＬＡＱ）である。このＣＤＲのアミノ酸配列は、図１１にも記載されている。
　Ａ２－１５Ａ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列表の配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　より好適な組合せとしては、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらに好適な組合せとしては、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらにより好適な組合せとしては、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　最も好適な組合せとしては、配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　Ａ２－２７Ｄ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列表の配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列表の配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列表の配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　より好適な組合せとしては、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらに好適な組合せとしては、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　さらにより好適な組合せとしては、配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　最も好適な組合せとしては、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　Ａ２－１１Ｅ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　より好適な組合せとしては、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　Ａ２－２５Ｃ抗体由来のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
　好適な組合せとしては、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　より好適な組合せとしては、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
　本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＡＬＫ２ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗ＡＬＫ２ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，；　Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。
　このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりにヒト人工染色体（Ｈｕｍａｎ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＨＡＣ）ベクターやマウス人工染色体（Ｍｏｕｓｅ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＭＡＣ）ベクターなどのベクターを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
　また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
　また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　＆　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ　ｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。
　例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
　本発明の提供する抗体と同じエピトープを有する抗体も本発明の抗体に含まれる。例えば、Ａ２－１１Ｅ抗体、Ａ２－１５Ａ抗体、Ａ２－２５Ｃ抗体及び／又はＡ２－２７Ｄ抗体と同じエピトープを有する抗体が挙げられる。
　抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体のエピトープは、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片および抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８オングストローム（Å）以下であり、好適には６Å以下であり、より好適には４Å以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つまたはそれ以上で抗体のエピトープ（抗原結合部位）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。
　キメラＡ２－２７Ｄ抗体のＦａｂフラグメントとヒトＡＬＫ２のＥＣＤ断片（配列番号８４のアミノ酸番号２１乃至１２３）を含むペプチドを結合させ、（２％（ｖ／ｖ）　Ｔａｃｓｉｍａｔｅ　ｐＨ７．０，　１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　７．５，　２０％（ｗ／ｖ）　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　３，３５０）の条件下で結晶化させると、体心単斜晶系で空間群がＣ１２１、結晶の単位格子がａ＝ｃ＝１１９．３９Å、ｂ＝３７．３２Å，β＝９２．５４の結晶が得られる。その三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定することができる（実施例１６参照）。
　Ａ２－２７Ｄ抗体は、ヒトＡＬＫ２上の部分高次構造を認識する。ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列（配列番号８４）中、Ａ２－２７Ｄ抗体と相互作用距離を有するアミノ酸残基、すなわちエピトープは、１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ），１９番目のグリシン（Ｇｌｙ），３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ），４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ），４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ），４２番目のグリシン（Ｇｌｙ），４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ），４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ），４５番目のバリン（Ｖａｌ），４６番目のチロシン（Ｔｙｒ），８２番目のアスパラギン（Ａｓｎ），８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ），８６番目のグルタミン（Ｇｌｎ），８７番目のロイシン（Ｌｅｕ），８８番目のプロリン（Ｐｒｏ），８９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基から構成される。かかるエピトープに結合するか、または、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その抗原結合断片またはその修飾体も、本発明の抗体、その抗原結合断片またはその修飾体に包含される。
　キメラＡ２－２５Ｃ抗体のＦａｂフラグメントとヒトＡＬＫ２のＥＣＤ断片（配列番号８４のアミノ酸番号２１乃至１２３）を含むペプチドを結合させ、（０．１５Ｍ　Ｌｉ２ＳＯ４，０．１Ｍ　ＮａＣｉｔｒａｔｅ　ｐＨ３．４，１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６，０００，２０％（ｖ／ｖ）　Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ）の条件下で結晶化させると、直方晶系で空間群がＰ２１２１２１、結晶の単位格子がａ＝７４．４９Å，ｂ＝１２８．０５Å、ｃ＝１４７．７３Åの結晶が得られる。その三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定することができる（実施例２１参照）。
　Ａ２－２５Ｃ抗体は、ヒトＡＬＫ２上の部分高次構造を認識する。ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列（配列番号８４）中、Ａ２－２５Ｃ抗体と相互作用距離を有するアミノ酸残基、すなわちエピトープは、１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ），１９番目のグリシン（Ｇｌｙ），２０番目のロイシン（Ｌｅｕ），３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ），４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ），４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ），４２番目のグリシン（Ｇｌｙ），４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ），４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ），４５番目のバリン（Ｖａｌ），４６番目のチロシン（Ｔｙｒ），８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基から構成される。かかるエピトープに結合するか、または、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その抗原結合断片またはその修飾体も、本発明の抗体、その抗原結合断片またはその修飾体に包含される。
　上記の抗体は、実施例２、実施例６、実施例９又は実施例１０に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の解離定数は、例えば１×１０－６－１×１０－１２Ｍであるが、本発明の抗体による目的の治療又は予防効果が得られる限り、この範囲に限定されない。抗体と抗原（ＡＬＫ２）との解離定数は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とするビアコアＴ２００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して測定することができる。例えば、リガンドとして固相化した抗原に対し、適当な濃度に設定した抗体をアナライトと反応させ、その結合および解離を測定することにより、結合速度定数ｋａ１、解離速度定数ｋｄ１および解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ１／ｋａ１）を得ることができる。ＡＬＫ２に対する結合性評価は、ビアコアＴ２００の使用に限定されず、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を検出原理とする機器、結合平衡除外法（Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙ）を検出原理とするＫｉｎＥｘＡ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）、バイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を検出原理とするＢＬＩｔｚシステム（Ｐａｌｌ社）あるいはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法等によっても可能である。
　抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ　Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
　また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ　Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合断片の一種と解釈することも可能である。
　また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。
　抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
　抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、軽鎖配列をコードする遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）、あるいは、それら遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）を組み合わせたものを挙げることができる。
　抗体又は抗体構成成分（重鎖又は軽鎖）をコードするポリヌクレオチドの具体例は以下のとおりである。
　（１）以下のポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）である。
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ７）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号３１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号３３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号３５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（２）以下のポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）である。
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４）　配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５）　配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６）　配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７）　配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ９）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ１０）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ１１）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号４９に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号５１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号５３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　配列番号５５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５）　配列番号５７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ９）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（３）以下のポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）である。
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号１１２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号１１４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　（４）以下のポリヌクレオチド（ａ）及び／又は（ｂ）である。
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１）　配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２）　配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１）　配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２）　配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３）　配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
　宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）と軽鎖配列遺伝子（もしくはポリヌクレオチド）は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
　本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４を挙げることができる。
　本発明の抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／０７０８９、ＷＯ９４／２８０２７、ＷＯ９４／２９３５１参照）。ＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）、ＩｇＧ１　ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ）等が挙げられ、好ましくはＩｇＧ１　ＬＡＬＡである。
　本発明の抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ４を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、ＩｇＧ４特有の分割が抑制され、半減期を延長することが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　３０，　１　１０５－１０８（１９９３）参照）。ＩｇＧ４の変異体としては、ＩｇＧ４　ｐｒｏ（ＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐ）等が挙げられる。
　また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を阻害する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞障害活性、及び補体依存性細胞性細胞障害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合断片が保持する機能は、ＡＬＫ２に対する結合活性であり、好ましくはＡＬＫ２の活性を阻害する活性であり、より好ましくはＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達を抑制する活性であり、最も好ましくは異所性骨化及び／又は骨形成異常を抑制する活性である。
　例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙもしくはｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
　さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
　本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。
　本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
　一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
　また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
　本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ　ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
　本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＡＬＫ２抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４参照）。
　本発明の抗体は、上記の抗体の重鎖及び／又は軽鎖と比較して８０％乃至９９％との同一性を有する抗体であってもよい。ここで「同一性」なる用語は、当分野で使用される一般的な定義を有するものとする。同一性の％は、２つのアミノ酸配列をアミノ酸の一致度が最大となるように整列（アラインメント）させたとき総アミノ酸数（ギャップを含む。）あたりの同一アミノ酸数のパーセンテージを指す。上記の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列と高い同一性を示す配列を組み合わせることによって、上記の各抗体と同等の抗原結合能、ＢＭＰシグナル伝達の抑制作用を有する抗体を選択することが可能である。このような同一性は、一般的には８０％以上の同一性であり、好ましくは９０％以上の同一性であり、より好ましくは９５％以上の同一性であり、最も好ましくは９９％以上の同一性である。また、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の各種作用を有する抗体を選択することが可能である。置換、欠失及び／又は付加されるアミノ酸残基数は、一般的には１０アミノ酸残基以下であり、好ましくは５乃至６アミノ酸残基以下であり、より好ましくは２乃至３アミノ酸残基以下であり、最も好ましくは１アミノ酸残基である。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。
　さらにまた、抗体の作製時に、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾されることが知られており、本発明の抗体はそのような修飾を有していてもよい（ＷＯ２０１３／１４７１５３）。
　しかし、これらの重鎖配列の欠失、或いは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。
　従って、本発明には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）、重鎖又は軽鎖のアミノ末端アミノ酸残基がピログルタミル化された抗体、等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　二種類のアミノ酸配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，　Ｊｉｎｇｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ，　Ｗｅｂｂ　Ｍｉｌｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、インターネットでｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔにアクセスすることによっても使用することができる。なお、上記のＢｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍによってＩｄｅｎｔｉｔｙ（又はＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）及びＰｏｓｉｔｉｖｉｔｙ（又はＰｏｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ）の２種類のパーセンテージの値が計算される。前者は同一性を求めるべき二種類のアミノ酸配列の間でアミノ酸残基が一致した場合の値であり、後者は化学構造の類似したアミノ酸残基も考慮した数値である。本明細書においては、アミノ酸残基が一致している場合のＩｄｅｎｔｉｔｙ（同一性）の値を持って同一性の値とする。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
　本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
　これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。
　例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア）等を挙げることができる。
　また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
５．抗ＡＬＫ２抗体を含有する医薬
　上述の「４．抗ＡＬＫ２抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗ＡＬＫ２抗体の中から、ＡＬＫ２の生物活性を阻害する抗体を得ることができる。これらＡＬＫ２の生物活性を阻害する抗体は、生体内でのＡＬＫ２の生物活性、すなわちＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を阻害することから、医薬として、異所性骨化及び／又は骨形成異常に対する治療及び／又は予防剤、又は貧血に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。
　抗ＡＬＫ２抗体で治療及び／又は予防可能な疾患としては、例えば、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、人工関節置換術後の異所性骨化、脊椎関節炎（ＳｐＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、貧血、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）、薄毛等を挙げることができ、好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であり、より好ましくは進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であるが、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達に起因する疾患であれば、これらに限定されない。ＦＯＰの患者には手足の指の癒合又は変形、頚椎の癒合又は変形なども見られ、難聴も認められるが、これらもＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達に起因する疾患に含まれる。
　全てのＦＯＰの患者ではＡＬＫ２に活性化型変異が認められており、これまでに１０種類以上の変異の種類が報告されている。それら変異は全てＡＬＫ２蛋白質の細胞内領域に存在するアミノ酸変異（ミスセンス変異）であることが分かっており、細胞外領域のアミノ酸配列には変化がない。本発明の抗体はＡＬＫ２の細胞外領域に結合することから、変異の種類に寄らず、全てのＦＯＰの患者に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。
　ＦＯＰの治療とは、ＦＯＰの症状の治癒、症状の改善、症状の軽減、又は症状の進行の抑制を意味する。
　ＦＯＰの予防とは、フレアアップ又は異所性骨化が発症することを回避又は抑制することを意味する。
　また、本発明の抗体は変異ＡＬＫ２だけでなく野生型のＡＬＫ２にも結合し、下流のシグナルを阻害するため、ＦＯＰとは異なる非遺伝性の異所性骨化に対しても治療及び／又は予防剤として用いることができる。非遺伝性の異所性骨化としては脳挫傷後の異所性骨化、脊髄損傷後の異所性骨化、熱傷後の異所性骨化、人工関節置換術後の異所性骨化などが挙げられる。それら非遺伝性の異所性骨化の原因として神経ペプチドや肥満細胞・マクロファージなどの免疫系細胞の関与が報告されており（Ｊ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，１０（２０１１）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，１０（２０１１）、及びＪ．Ｐａｔｈｏｌ．，２３６，２（２０１５）参照。）、ＦＯＰの患者におけるフレアアップにおいても同様のメカニズムが関わっていることが示唆されている（Ｈｕｍ．Ｐａｈｏｌ．，３２，８（２００１）、及びＨｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，２９，１０（２０１４）参照。）。したがって、本発明の抗体はＦＯＰにおける異所性骨化のみならず、非遺伝性の異所性骨化の治療及び／又は予防剤としても用いることができる。
　貧血のＢＭＰ－ＡＬＫシグナル伝達経路によって転写を正に制御されている標的遺伝子として、Ｈｅｐｃｉｄｉｎが知られている（Ｂｌｏｏｄ，１１８，１５（２０１１）参照。）。Ｈｅｐｃｉｄｉｎは主に肝臓で産生されるペプチドホルモンであり、消化管に発現している鉄吸収に関わるトランスポーター（Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ）の分解を制御している（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６，５７０４（２００４）参照。）。Ｈｅｐｃｉｄｉｎの機能阻害または発現量を抑制することはＦｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎの発現量増加を介して消化管からの鉄の取り込み促進につながることから、貧血の治療薬になる可能性が報告されている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｒ，１４６（２０１５）参照。）。したがって、本発明の抗体は肝臓におけるＨｅｐｃｉｄｉｎの発現抑制を介し、鉄の吸収を増加させることにより、鉄欠乏性の貧血の治療及び／又は予防剤としても用いることができる。
　或いは、本発明の抗体は、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤としても用いることができる。ＤＩＰＧは、脳幹部の橋に集中してみられるびまん性（浸潤性）の星細胞系腫瘍であり、小児脳幹腫瘍の約７５～８０％を占めると言われており、脳幹が呼吸などの必須機能を制御しているために生存率は２年で１０％程度まで下がるとの報告がある（Ｋｈｕｏｎｇ－Ｑｕａｎｇ　Ｄ－Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ　１２４：４３９-４４７，２０１２）。本発明の抗体は、ＤＩＰＧの治療及び／又は予防剤としても用いることができる。
　上記の医薬としての抗ＡＬＫ２抗体の例として、Ａ２－１５Ａ抗体、Ａ２－２７Ｄ抗体、Ａ２－１１Ｅ抗体、又はＡ２－２５Ｃ抗体から「４．抗ＡＬＫ２抗体の製造」に記載の方法によって作製されたキメラ抗体又はヒト化抗体を挙げることができる。また、Ａ２－１５Ａ抗体、Ａ２－２７Ｄ抗体Ａ２－１１Ｅ抗体、及び／又はＡ２－２５Ｃ抗体と同じエピトープを有するキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体も医薬として使用可能である。
　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗ＡＬＫ２抗体によるＡＬＫ２の生物活性（ＢＭＰシグナル阻害活性）は、例えば、ＢＭＰ応答配列を挿入したレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼ・アッセイ、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化、ＢＭＰ標的遺伝子の発現解析、又はＢＭＰリガンドによる刺激によって骨芽細胞への分化を誘導させたマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定することで確認できる。
　Ｉｎ　ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗ＡＬＫ２抗体の異所性骨化又は骨形成異常に対する治療又は予防効果は、例えば、マウスの筋肉にＢＭＰリガンド含有ペレットを移植した異所性骨化誘導モデル、又は変異ＡＬＫ２を導入したＦＯＰモデルマウスに対して抗ＡＬＫ２抗体を皮下または静脈投与し、異所性骨の形成を解析することで確認することができる。
　このようにして得られた抗ＡＫＬ２抗体は、医薬として、特に進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）等の異所性骨化の治療又は予防を目的とした医薬組成物として有用である。
　抗ＡＬＫ２抗体は、一つの例としては、異所性骨化の治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の異所性骨化治療剤と併用して投与することができる。また一つの例として、抗ＡＬＫ２抗体は治療上有効な量の治療剤と併用して投与することができる。抗ＡＬＫ２抗体と併用して投与できる他の異所性骨化治療剤としては、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニスト等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　抗炎症剤としては、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、メトトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、インフリキシマブ、エタネルセプト等を挙げることができ、好ましくはインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、又はセレコキシブである。
　ステロイド剤としては、プレドニゾロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルチカゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン等を挙げることができ、好ましくはプレドニゾロンである。
　ビスフォスフォネートとしては、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ピリドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ゾレドロネート等を挙げることができ、好ましくはパミドロネート、又はゾレドロネートである。
　筋弛緩剤としては、シクロベンザプリン、メタキサロン、バクロフェン等を挙げることができ、好ましくはバクロフェンである。
　レチノイン酸受容体γアゴニストとしては、Ｐａｌｏｖａｒｏｔｅｎｅ等を挙げることができる。
　異所性骨化の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗ＡＬＫ２抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗ＡＬＫ２抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の薬剤と抗ＡＬＫ２抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、あるいは抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の異所性骨化治療剤の遺伝子と抗ＡＬＫ２抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
　抗ＡＬＫ２抗体、あるいはそのフラグメントに対し異所性骨化治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、ＡＬＫ２の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、抗体及び該フラグメントを使用することができる。抗ＡＬＫ２抗体又は該抗体のフラグメントとＦＯＰ治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　（２００１）５３，１７１－２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗ＡＬＫ２抗体と異所性骨化治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、異所性骨化治療剤がリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、異所性骨化治療剤が水溶性高分子（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と異所性骨化治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９５）１２２，　５５－１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｔｏ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。異所性骨化治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ　Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又は該フラグメント）と蛋白質性の異所性骨化治療剤（又は該フラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
　本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗ＡＬＫ２抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
　本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗ＡＬＫ２抗体と治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの異所性骨化治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
　本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＡＬＫ２抗体の重量に対して０．０１～１００倍、特に０．１～１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
　医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０－８．５のＴｒｉｓバッファー、ｐＨ４．０－５．５の酢酸バッファー、ｐＨ３．０－６．２のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗ＡＬＫ２抗体を含む医薬組成物並びに、抗ＡＬＫ２抗体及び少なくとも一つの異所性骨化治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗ＡＬＫ２抗体を含む医薬組成物並びに、抗ＡＬＫ２抗体及び少なくとも一つの異所性骨化治療剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
　本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗ＡＬＫ２抗体のＡＬＫ２に対する親和性、即ち、ＡＬＫ２に対する解離定数（ＫＤ値）に対し、親和性が高い（ＫＤ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物のヒトに対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗ＡＬＫ２抗体をヒトに対して投与する際には、例えば約０．１～１００ｍｇ／ｋｇを１～１８０日間に１回又は複数回投与すればよい。しかし、投与量や投与回数は、一般に、患者の性別、体重、年齢、症状、重篤度、副作用などを考慮して決定されるべきものであるので、上記の用量や用法には限定されないものとする。
　本発明の医薬組成物の形態としては、非限定的に、例えば点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。投与経路は、経口経路又は非経口経路であり、非経口経路には、非限定的に、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、直腸内、経粘膜内、皮内などの経路が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
＜実施例１＞
ラット抗ＡＬＫ２抗体（１１Ｅ２、１５Ａ６、２５Ｃ１１、および２７Ｄ１１：以下、Ａ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄと略す）の作製
１）-１　抗原の調製
　抗原となるｍＡＬＫ２-Ｆｃは、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．社製のマウスＡＬＫ２-Ｈｉｓ＆Ｆｃ（Ｃａｔ．＃５０２９７-Ｍ０３Ｈ）を用いた。
１）-２　動物の免疫
　１ｍｇ／ｍＬのマウスＡＬＫ２-Ｈｉｓ＆ＦｃとＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ　（ＴｉｔｅｒＭａｘ、ＵＳＡ）を等量混合しエマルジョンを作製した。６週齢のＷｉｓｔｅｒ雌ラット、２匹に、１匹あたり１００μｇの抗原をアジュバントと共に、２回に分けて皮下投与した。１～２週間後に抗原溶液のみを４０μｇ皮下投与し、３日後に抗体産生細胞として脾臓細胞と各種リンパ節を無菌的に摘出し、以下の細胞融合に供した。
１）-３　骨髄腫細胞との細胞融合
　上記の抗体産生細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた株化骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１細胞）と５：１～１０：１の割合に調整し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用いて３分間融合させ、その後、６分間かけて希釈した。融合した細胞は、ラット１匹あたり１０枚の９６穴プレートを用いて、フィーダー細胞（胸腺細胞）と共に播種した。培地として、ＨＡＴサプリメントを含む１５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン含有）で培養した。
１）-４　ハイブリドーマの選択
　細胞融合から１週間後、それぞれの培養上清を用いて、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で、抗原として用いたマウスＡＬＫ２-Ｈｉｓ＆Ｆｃを認識するクローンを選択し、さらに、ヒトＦｃ（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．社製）のみを認識するクローンを除外した。ＥＬＩＳＡは以下のように行った。
　まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ社製、Ｃａｔ．＃４４２４０４）に、１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈した抗原を、室温で２時間、または４℃で一晩、固相化した。固相化液を取り除き、ＰＢＳに溶解した０．５％スキムミルク溶液で、室温で３０分間のブロッキングを行った。次に、上記ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で１時間静置した。プレートを洗浄後、０．５％スキムミルクで１：２５００に希釈したＡＬＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＳＢＡ社製）を加え、さらに、室温で１時間静置した。プレートを洗浄後、フェニルリン酸系基質を室温で２０分反応させた後、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
　選択したハイブリドーマについて、限界希釈法で２回以上のクローニングを行った。以上の操作により、モノクローナル抗体Ａ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄを産生するハイブリドーマ株を単離した。
　結果を図１に記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、それぞれマウスＡＬＫ２-Ｈｉｓ＆Ｆｃを認識し、ヒトＦｃには結合しないことが示された。
＜実施例２＞
ラット抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ評価
２）-１　フローサイトメトリー法による抗体スクリーニング
２）-１-１　マウスおよびヒトＡＬＫ２発現細胞の調製
　ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、３×１０４細胞／ｃｍ２となるように１００ｍｍディッシュに播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／マウスＡＬＫ２（ＷＴ）-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２（ＷＴ）-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２（Ｒ２０６Ｈ）-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３を、それぞれＨＥＫ２９３Ａ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入し、さらに一晩培養した。翌日、１×１０６細胞／ｍＬとなるように調整した細胞懸濁液を、１００μＬずつ１．５ｍＬ微量遠心管に分注し、５００ｇで５分間遠心した後に上清を除去した。細胞に、１μｇ／ｍＬに希釈した精製ＩｇＧ１００μＬを加え、４℃で３０分間静置した。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、１：２００に希釈したＡｌｅｘａ　ｆｌｏｕｒ　６４７　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ-Ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１００μＬを加え、さらに４℃で３０分間静置した。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ：ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で蛍光を検出した。データはＢＤ　Ｄｉｖａ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析し、細胞の発現するＥＧＦＰの強度と、染色されたＡｌｅｘａ　ｆｌｏｕｒ　６４７の蛍光強度をプロットした。
　結果を図２Ａ～図２Ｄに記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体はそれぞれ、蛍光タンパク質ＥＧＦＰ発現細胞（図２Ａ）を認識しないが、マウスＡＬＫ２発現細胞（図２Ｂ）と、野生型およびＦＯＰのヒトＡＬＫ２発現細胞（それぞれ、図２Ｃ及び図２Ｄ）を特異的に認識することが確認された。この結果は、ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＡＬＫ２の細胞外領域に結合する抗体であることを示している。
２）-２　免疫染色法による抗体スクリーニング
２）-２-１　ヒトＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６発現細胞の調製
　マウスＣ２Ｃ１２細胞を５×１０３細胞／穴となるように、９６穴プレート（グライナー社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ１-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ３-ＥＧＦＰ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ６-ＥＧＦＰ、およびコントロールのｐｃＤＥＦ３を、それぞれＣ２Ｃ１２細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入し、さらに一晩培養した。
２）-２-２　ヒトＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６の蛍光免疫染色
　Ｃ２Ｃ１２細胞を、１０％中性ホルマリン（ナカライテスク社製、日本）で、室温、２０分間固定後、１０％ヤギ正常血清で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング液を除去した後、ブロッキング液で１０μｇ／ｍＬに希釈した精製ＩｇＧを加え、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング液で１：１０００に希釈したＧｏａｔ　Ａｌｅｘａ５９４-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ-ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、１０％中性ホルマリンで室温、１５分固定し、ＤＡＰＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて核染色を施した。蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡ＢＺ-９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて観察した。
　結果を図３に記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、ＡＬＫ２発現細胞のみを特異的に認識し、ＡＬＫ１、ＡＬＫ３、ＡＬＫ６発現細胞は認識しないことが確認された。この結果は、ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、ＡＬＫ２に特異的に結合する抗体であることを示している。
２）-２-３　ＦＯＰで同定されたＡＬＫ２変異体発現細胞の調製
　マウスＣ２Ｃ１２細胞を０．５×１０３細胞／穴となるように、９６穴プレート（グライナー社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３に組み込んだヒトＡＬＫ２　ｃＤＮＡの野生型、およびｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｌ１９６Ｐ、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｐ１９７＿Ｆ１９８ｄｅｌｉｎｓＬ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｒ２０２Ｉ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｒ２０６Ｈ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｑ２０７Ｅ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｒ２５８Ｓ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｇ３２５Ａ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｇ３２８Ｅ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｇ３２８Ｒ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｇ３２８Ｗ，ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｇ３５６Ｄ，およびｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２―Ｒ３７５Ｐの各ＦＯＰで同定された変異体、およびコントロールのｐｃＤＥＦ３を、それぞれＣ２Ｃ１２細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入し、さらに一晩培養した。
２）-２-４　ＦＯＰで同定されたＡＬＫ２変異体の蛍光免疫染色
　Ｃ２Ｃ１２細胞を、１０％中性ホルマリン（ナカライテスク社製、日本）で、室温、２０分間固定後、１０％ヤギ正常血清で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング液を除去した後、ブロッキング液で１０μｇ／ｍＬに希釈した精製ＩｇＧを加え、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング液で１：１０００に希釈したＧｏａｔ　Ａｌｅｘａ５９４-ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ-ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて、室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、１０％中性ホルマリンで室温、１５分固定し、ＤＡＰＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて核染色を施した。蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡ＢＺ-９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて観察した。
　結果を図４に記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、野生型のＡＬＫ２発現細胞に加え、ＦＯＰで同定された１２種類のＡＬＫ２変異体発現細胞を認識することが確認された。この結果は、ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄが産生するモノクローナル抗体は、野生型ＡＬＫ２、およびＦＯＰの各ＡＬＫ２変異体に結合する抗体であることを示している。
２）-３　ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイによる抗体スクリーニング
　モノクローナル抗体のＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて解析した。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（グライナー社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２（ＷＴ）-Ｖ５-Ｈｉｓ、またはｐｃＤＥＦ３／ヒトＡＬＫ２（Ｒ２０６Ｈ）-Ｖ５-Ｈｉｓ、ｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ-ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））、ｐｈＲＬ　ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入した。２．５時間後、培地を新鮮なＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換し、さらに１時間培養した。その後、段階希釈したモノクローナル抗体と１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）、または０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉに交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ-Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、Ｆｉｒｅｆｌｙ、およびＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）で測定した。
　結果を図５に記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、ＡＬＫ２の野生型およびＲ２０６Ｈ変異型を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ａ細胞において、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を、用量依存的に抑制することが確認された。
２）-４　ＢＭＰの骨芽細胞分化誘導アッセイによる抗体スクリーニング
　モノクローナル抗体の内在性ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰによるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化誘導活性に対する効果で解析した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、０．５×１０３細胞／穴となるように、９６穴プレート（グライナー社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、段階希釈したモノクローナル抗体と２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（コアフロント社製）、２００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）、または２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ２／ＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉに交換し、さらに３日間培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞の培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５０μＬ／穴の氷冷したアセトン：エタノール（１：１）溶液で１分間処理し、さらに３回、ＰＢＳで洗浄した。骨芽細胞用細胞への分化の指標として、ＡＬＰ活性を測定した。ＡＬＰ活性の測定は、１００μＬ／穴の基質溶液（１　ｍｇ／ｍＬ　４-Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍ　Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）-ＨＣｌ，ｐＨ１０．０）を加え、室温で１５-３０分間、撹拌振盪機上で反応させた。反応は、５０μＬの３Ｍ　ＮａＯＨを添加して停止させ、波長４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ５０（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて測定した。
　結果を図６及び図７に記載する。ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、ＢＭＰ２が誘導するＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化をほとんど抑制しなかったが（図６）、ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９が誘導するＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化は、用量依存的に抑制することが確認された（図７）。この結果は、ハイブリドーマＡ２-１１Ｅ、Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２５Ｃ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体が、Ｃ２Ｃ１２細胞が生理的に発現する内在性ＡＬＫ２を抑制する抗体であることを示している。
＜実施例３＞
ラット抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２－１１Ｅ，Ａ２－１５Ａ，Ａ２－２５Ｃ，Ａ２－２７Ｄ）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１　Ａ２－１１Ｅの可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１－１　Ａ２－１１Ｅ産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　Ａ２－１１Ｅの可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、Ａ２－１１Ｅ産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－１－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－１－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。
３）－１－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－１１Ｅの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　Ａ２－１１Ｅの重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ　（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号８８）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＡ２－１１Ｅの重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　シークエンスプライマーとして、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
　５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号８８）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ　（Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）を用いた。
　シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０ｘｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
　決定されたＡ２－１１Ｅの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示した。
３）－１－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－１１Ｅの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　Ａ２－１１Ｅの軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ　（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ　Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号８９）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
　このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＡ２－１１Ｅの軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
　シークエンスプライマーとして、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。
　５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号８９）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ　（Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに付属）を用いた。
　シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３０ｘｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
　決定されたＡ２－１１Ｅの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。
３）－２　Ａ２－１５Ａの可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－２－１　Ａ２－１５Ａ産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　Ａ２－１５Ａの可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、Ａ２－１５Ａ生産ハイブリドーマより実施例３）－１－１と同様の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－２－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－２－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇを用い、実施例３）－１－２と同様の方法で実施した。
３）－２－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－１５Ａの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－２－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－３と同様の方法でＡ２－１５Ａの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－１５Ａの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示した。
３）－２－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－１５Ａの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－２－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－４と同様の方法でＡ２－１５Ａの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－１５Ａの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示した。
３）－３　Ａ２－２５Ｃの可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－３－１　Ａ２－２５Ｃ産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　Ａ２－２５Ｃの可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、Ａ２－２５Ｃ生産ハイブリドーマより実施例３）－１－１と同様の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－３－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－３－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇを用い、実施例３）－１－２と同様の方法で実施した。
３）－３－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－２５Ｃの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－３－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－３と同様の方法でＡ２－２５Ｃの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－２５Ｃの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号９に示し、アミノ酸配列を配列番号１０に示した。
３）－３－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－２５Ｃの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－３－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－４と同様の方法でＡ２－２５Ｃの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－２５Ｃの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１２に示した。
３）－４　Ａ２－２７Ｄの可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－４－１　Ａ２－２７Ｄ産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの調製
　Ａ２－２７Ｄの可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、Ａ２－２７Ｄ生産ハイブリドーマより実施例３）－１－１と同様の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。
３）－４－２　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成
　ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－４－１で調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの１μｇを用い、実施例３）－１－２と同様の方法で実施した。
３）－４－３　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－２７Ｄの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－４－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－３と同様の方法でＡ２－２７Ｄの重鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－２７Ｄの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示した。
３）－４－４　５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによるＡ２－２７Ｄの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
　実施例３）－４－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例３）－１－４と同様の方法でＡ２－２７Ｄの軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。
　決定されたＡ２－２７Ｄの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表の配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示した。
＜実施例４＞
ラット抗ＡＬＫ２抗体（Ａ２-１５Ａ、およびＡ２-２７Ｄ）のｉｎ　ｖｉｖｏ評価
４）－１　ハイブリドーマ培養上清の調製
　実施例１）－４で得られた１．０×１０６個のハイブリドーマを１０％ＦＢＳ含有ＴＩＬハイグルコース培地で培養し（Ｔ７５フラスコ）、その後ＩＮＴＥＧＲＡ　ＣＬ１０００にて高密度培養を行った（１０％ＦＢＳ培地）。次に培地を無血清に置換し、さらにＩＮＴＥＧＲＡ　ＣＬ１０００での培養を行った後に必要量のハイブリドーマ培養上清を取得した。取得したハイブリドーマ培養上清は精製に供するまで２～８℃で保存した。
４）－２　ハイブリドーマ培養上清からの抗体の精製
　実施例４）－１で得られた培養上清から抗体をＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇアフィニティークロマトグラフィー（４～６℃下）一段階工程で精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４～６℃下で実施した。最初に、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が充填されたカラムにハイブリドーマの培養上清をアプライした。培養上清液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に０．１　Ｍグリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調製した後に、透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａ，Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ　ヒスチジン／５％　ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を８ｍｇ／ｍｌ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
４）-３　ＢＭＰ移植による異所性骨化誘導モデル
　モノクローナル抗体の骨格筋組織における異所性骨化の抑制活性は、マウスにおけるＢＭＰによる異所性骨誘導実験で解析した。ＢＭＰ含有ペレットは、１μｇのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）、または１μｇのＧＤＦ２／ＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を、直径４ｍｍに調整したＩ型コラーゲンスポンジ（Ｃｏｌｌａｔａｐｅ、Ｚｉｍｍｅｒ　Ｄｅｎｔａｌ社製）に染み込ませ、一晩、凍結乾燥機（ＦＤＵ-８１０、東京理科器械社製、日本）にて凍結乾燥して作製した。８-１０週令のＣ５７ＢＬ／６マウスを、小動物実験用簡易吸入麻酔装置（夏目製作所社製、日本）および２％イソフルラン（和光純薬工業社製、日本）を用いて全身麻酔し、左右下肢の大腿筋組織内にＢＭＰ含有ペレットを１個ずつ移植した。ハイブリドーマＡ２-１５Ａ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体を、移植１週間前から、１０ｍｇ／ｋｇ、１回／週、皮下投与し、移植後２週目まで、同様に抗体を投与しながら飼育した。対照群には、等量の溶媒（２５ｍＭ　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ／５％Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，ｐＨ６．０）を投与した。ＢＭＰ含有ペレット移植２週間後、大腿骨とともに移植したＢＭＰ含有ペレットを摘出し、マイクロＣＴ（μＣＴ３５，ＳＣＡＮＣＯ社製）で異所性骨の形成を解析した。
　結果を図８に記載する。ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９を移植しｖｅｈｉｃｌｅで処理したマウスでは、マイクロＣＴ解析で大腿骨の右側に異所性骨が誘導された。一方、ハイブリドーマＡ２-１５Ａ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体を投与したマウスでは、ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９を移植しても異所性骨は検出されなかった。したがって、ハイブリドーマＡ２-１５Ａ、およびＡ２-２７Ｄの産生するモノクローナル抗体は、ＢＭＰ７およびＧＤＦ２／ＢＭＰ９が誘導する骨格筋組織における異所性骨誘導を抑制することが確認された。
＜実施例５＞
ヒトキメラ化抗ＡＬＫ２抗体（ｃＡ２－１５Ａ、ｃＡ２－２７Ｄ）の作製
５）－１キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
　プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号１７に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
　ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’－ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ－３’（３．３－Ｆ１；配列番号９０）
５’－ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ－３’（３．３－Ｒ１；配列番号９１）
５）－２　キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
　ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号１８に示すヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。
５）－３　ｃＡ２－１５Ａ重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－２－３で得られたＡ２－１５Ａの重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＡ２－１５Ａ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＡ２－１５Ａ」と命名した。ｃＡ２－１５Ａ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示した。
ｃＡ２－１５Ａ重鎖用プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧ－３’（Ａ２－１５ＡＨ－Ｆ；配列番号９２）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ－３’（Ａ２－１５ＡＨ－Ｒ；配列番号９３）
５）－４　ｃＡ２－１５Ａ軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－２－４で得られたＡ２－１５Ａの軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＡＮ断片を増幅し、キメラ及びヒト化軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＡ２－１５Ａの軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＡ２－１５Ａ」と命名した。ｃＡ２－１５Ａの軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号２１に示し、アミノ酸配列を配列番号２２に示した。
ｃＡ２－１５Ａ軽鎖用プライマーセット
５’－ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣ－３’（Ａ２－１５ＡＬ－Ｆ；配列番号９４）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧ－３’（Ａ２－１５ＡＬ－Ｒ；配列番号９５）
５）－５　ｃＡ２－２７Ｄ重鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－４－３で得られたＡ２－２７Ｄの重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＡ２－２７Ｄ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＡ２－２７Ｄ」と命名した。ｃＡ２－２７Ｄ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号２３に示し、アミノ酸配列を配列番号２４に示した。
ｃＡ２－２７Ｄ重鎖用プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧ－３’（Ａ２－２７ＤＨ－Ｆ；配列番号９６）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧ－３’（Ａ２－２７ＤＨ－Ｒ；配列番号９７）
５）－６　ｃＡ２－２７Ｄ軽鎖発現ベクターの構築
　実施例３）－４－４で得られたＡ２－２７Ｄの軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＡＮ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＡ２－２７Ｄ抗体の軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＡ２－２７Ｄ」と命名した。ｃＡ２－２７Ｄ抗体の軽鎖のヌクレオチド配列を配列表の配列番号２５に示し、アミノ酸配列を配列番号２６に示した。
ｃＡ２－２７Ｄ軽鎖用プライマーセット
５’－ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣ－３’（Ａ２－２７ＤＬ－Ｆ；配列番号９８）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧ－３’（Ａ２－１５ＡＬ－Ｒ；配列番号９５）
５）－７　ｃＡ２－１５Ａ及びｃＡ２－２７Ｄの生産
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社、日本）を用いて調製したＨ鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及びＬ鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ－ＣＥＬＬ　ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ　Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　（Ａｄｖａｎｔｅｃ　＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。
　ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＡ２－１５ＡとｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＡ２－１５Ａとの組合せによって取得されたラット抗体Ａ２－１５Ａのキメラ抗体を「ｃＡ２－１５Ａ」と命名し、ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＡ２－２７ＤとｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＡ２－２７Ｄとの組合せによって取得されたラット抗体Ａ２－２７Ｄのキメラ抗体を「ｃＡ２－２７Ｄ」と命名した。
５）－８　ｃＡ２－１５Ａ及びｃＡ２－２７Ｄの二段階工程精製
　実施例５）－７で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の二段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は４－６℃下で実施した。ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）に培養上清をアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ　ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した抗体溶液を、５ｍＭ　ＮａＰｉ／５０ｍＭ　ＭＥＳ／３０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ―１　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａ，Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ　ヒスチジン／５％ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍｌ以上に調整した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
＜実施例６＞
ヒトキメラ化抗ＡＬＫ２抗体（ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性評価
６）－１　ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイによる抗体評価
　作製したヒトキメラ化抗体のＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて解析した。ＨＥＰＧ２細胞を、１×１０４細胞／穴となるように、ルシフェラーゼ・アッセイ用９６穴白色プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ-ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入した。２．５時間後、培地を新鮮なＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換し、さらに３時間培養した。その後、段階希釈したモノクローナル抗体と１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）を含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉに交換し、さらに一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ-Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性をプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。
　結果を図９に記載する。キメラ化抗体ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄは、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性に対して、それぞれのラットモノクローナル抗体Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２７Ｄと同等の阻害活性を示すことが確認された。
６）－２　ＢＭＰの骨芽細胞分化誘導アッセイによる抗体評価
　作製したヒトキメラ化抗体の内在性ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰによるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化誘導活性に対する効果で解析した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、５×１０３細胞／穴となるように、９６穴プレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、培地を新鮮なＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換し、段階希釈したモノクローナル抗体と２　ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ２／ＢＭＰ９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉに交換し、さらに３日間培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞の培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５０μＬ／穴の氷冷したアセトン：エタノール（１：１）溶液で１分間処理し、さらに３回、ＰＢＳで洗浄した。骨芽細胞用細胞への分化の指標として、ＡＬＰ活性を測定した。ＡＬＰ活性の測定は、１００　μＬ／穴の基質溶液（１　ｍｇ／ｍＬ　４-Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍ　Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製）-ＨＣｌ，ｐＨ１０．０）を加え、室温で１５-３０分間、撹拌振盪機上で反応させた。反応は、５０　μＬの３　Ｍ　ＮａＯＨを添加して停止させ、波長４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
　結果を図１０に記載する。キメラ化抗体ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄは、ＢＭＰによって誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を、用量依存的に抑制することが確認された。この結果は、キメラ化抗体ｃＡ２-１５Ａ、ｃＡ２-２７Ｄが、Ｃ２Ｃ１２細胞が生理的に発現する内在性ＡＬＫ２を抑制する抗体であることを示している。また、その阻害活性は、それぞれのラットモノクローナル抗体Ａ２-１５Ａ、Ａ２-２７Ｄと同等であることが確認された。
＜実施例７＞
抗ＡＬＫ２抗体Ａ２－１５Ａ、および　Ａ２－２７Ｄのヒト化体デザイン
７）－１　ヒト化ｈＡ２－１５Ａの設計
７）－１－１　Ａ２－１５Ａの可変領域の分子モデリング
　Ａ２－１５Ａの可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定されたＡ２－１５Ａの可変領域と比較した。結果として、３ＫＹＭと３Ｓ３５がそれぞれＡ２－１５Ａの重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、Ａ２－１５Ａの重鎖及び軽鎖に対応する３ＫＹＭ及び３Ｓ３５の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
　最後に、エネルギーの点でＡ２－１５Ａの可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。
７）－１－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａに対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａの構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
　Ａ２－１５Ａのフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されたヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ４のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。ヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ４のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、Ａ２－１５Ａについてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＡ２－１５Ａの三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＡ２－１５Ａの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
７）－２　Ａ２－１５Ａ重鎖のヒト化
７）－２－１　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖
　配列番号２０に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号６１（スレオニン）をグリシンに、アミノ酸番号９４（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０３（アスパラギン酸）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１１６（スレオニン）をアラニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に記載されている。配列番号２８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７に記載されている。配列番号２７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２７のヌクレオチド配列及び配列番号２８のアミノ酸配列は、図１５にも記載されている。
７）－２－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖
　配列番号２０に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号６１（スレオニン）をグリシンに、アミノ酸番号１０３（アスパラギン酸）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に記載されている。配列番号３０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列、１４３乃至４７２番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９に記載されている。配列番号２９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列、４２７乃至１４１６番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２９のヌクレオチド配列及び配列番号３０のアミノ酸配列は、図１６にも記載されている。
７）－３　Ａ２－１５Ａ軽鎖のヒト化
７）－３－１　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖
　配列番号２２に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）をメチオニンに、アミノ酸番号２９（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号２９－３０の間（欠損残基）をセリンに、アミノ酸番号３６（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号４１（セリン）をアスパラギンに、アミノ酸番号６６（リジン）をプロリンに、アミノ酸番号８１（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号８３（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９９（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１００（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１０１（バリン）をロイシンに、アミノ酸番号１０４（アスパラギン酸）をグルタミン酸に、アミノ酸番号１０６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０８（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２３（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２７（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２９（ロイシン）をイソロイシンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に記載されている。配列番号３２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１に記載されている。配列番号３１のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなる配列、４２５乃至７３９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３１のヌクレオチド配列及び配列番号３２のアミノ酸配列は、図１７にも記載されている。
７）－３－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖
　配列番号２２に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号２９－３０の間（欠損残基）をセリンに、アミノ酸番号３６（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号４１（セリン）をアスパラギンに、アミノ酸番号９９（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１００（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１０８（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２３（アラニン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に記載されている。配列番号３４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３に記載されている。配列番号３３のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなる配列、４２５乃至７３９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３３のヌクレオチド配列及び配列番号３４のアミノ酸配列は、図１８にも記載されている。
７）－３－３　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６タイプ軽鎖
　配列番号２２に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号２９－３０の間（欠損残基）をセリンに、アミノ酸番号３６（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号４１（セリン）をアスパラギンに、アミノ酸番号７９（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号９９（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１００（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１０８（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２３（アラニン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に記載されている。配列番号３６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５に記載されている。配列番号３５のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなる配列、４２５乃至７３９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３５のヌクレオチド配列及び配列番号３６のアミノ酸配列は、図１９にも記載されている。
７）－３－４　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７タイプ軽鎖
　配列番号２２に示されるキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号２９－３０の間（欠損残基）をセリンに、アミノ酸番号３６（グルタミン）をグルタミン酸に、アミノ酸番号４１（セリン）をアスパラギンに、アミノ酸番号７０（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号９９（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号１００（プロリン）をセリンに、アミノ酸番号１０８（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２３（アラニン）をグルタミンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に記載されている。配列番号３８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７に記載されている。配列番号３７のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなる配列、４２５乃至７３９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３７のヌクレオチド配列及び配列番号３８のアミノ酸配列は、図２０にも記載されている。
７）－４　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＡ２－１５Ａの設計
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１／Ｌ１」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１／Ｌ４」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ１」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ４」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ７」（「ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ７」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例８に準じて作製し、実施例２及び４に準じて評価することができる。
７）－５　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄの設計
７）－５－１　Ａ２－２７Ｄの可変領域の分子モデリング
　Ａ２－２７Ｄの可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定されたＡ２－２７Ｄの可変領域と比較した。結果として、３ＥＹＱと４Ｉ９ＷがそれぞれＡ２－２７Ｄの重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、Ａ２－２７Ｄの重鎖及び軽鎖に対応する３ＥＹＱ及び４Ｉ９Ｗの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
　最後に、エネルギーの点でＡ２－２７Ｄの可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。
７）－５－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄに対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄの構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
　Ａ２－２７Ｄのフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，　ＭＤ．　（１９９１））において既定されたヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ４のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。ヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ３のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、Ａ２－２７Ｄについてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＡ２－２７Ｄの三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
７）－６　Ａ２－２７Ｄ重鎖のヒト化
７）－６－１　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号５６（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号６８（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９４（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９５（アルギニン）をリジンに、アミノ酸番号１０３（スレオニン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１１７（アラニン）をアルギニンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（バリン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１５Ａ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に記載されている。配列番号４０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９に記載されている。配列番号３９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３９のヌクレオチド配列及び配列番号４０のアミノ酸配列は、図２１にも記載されている。
７）－６－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号６８（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９４（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９５（アルギニン）をリジンに、アミノ酸番号１０３（スレオニン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（バリン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４２に記載されている。配列番号４２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４１に記載されている。配列番号４１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４１のヌクレオチド配列及び配列番号４２のアミノ酸配列は、図２２にも記載されている。
７）－６－３　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号９４（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９５（アルギニン）をリジンに、アミノ酸番号１０３（スレオニン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１１２（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１３２（プロリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１３５（バリン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４４に記載されている。配列番号４４のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４３に記載されている。配列番号４３のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４３のヌクレオチド配列及び配列番号４４のアミノ酸配列は、図２３にも記載されている。
７）－６－４　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号９４（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号９５（アルギニン）をリジンに、アミノ酸番号１０３（スレオニン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１０７（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１３５（バリン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４６に記載されている。配列番号４６のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４５に記載されている。配列番号４５のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４５のヌクレオチド配列及び配列番号４６のアミノ酸配列は、図２４にも記載されている。
７）－６－５　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５タイプ重鎖
　配列番号２４に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸番号３５（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（ロイシン）をアラニンに、アミノ酸番号９５（アルギニン）をリジンに、アミノ酸番号１０３（スレオニン）をアスパラギンに、アミノ酸番号１３５（バリン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ重鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５タイプ重鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４８に記載されている。配列番号４８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号４８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４７に記載されている。配列番号４７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４７のヌクレオチド配列及び配列番号４８のアミノ酸配列は、図２５にも記載されている。
７）－７　Ａ２－２７Ｄ軽鎖のヒト化
７）－７－１　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニンをグリシンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号３３（アラニン）をロイシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４２（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号５９（セリン）をプロリンに、アミノ酸番号６１（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号６２（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号６４（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号６６（トリプトファン）をロイシンに、アミノ酸番号７７（バリン）をイソロイシンに、アミノ酸番号７９（アスパラギン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号８９（セリン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９０（チロシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号９１（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９３（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアルギニンに、アミノ酸番号９７（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号９９（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０２（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１０４（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０に記載されている。配列番号５０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４９に記載されている。配列番号４９のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなる配列、４１３乃至７２７番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号４９のヌクレオチド配列及び配列番号５０のアミノ酸配列は、図２６にも記載されている。
７）－７－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニンをグリシンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号３３（アラニン）をロイシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４２（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号５９（セリン）をプロリンに、アミノ酸番号６１（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号６４（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号７９（アスパラギン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号８９（セリン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９０（チロシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号９１（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９３（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアルギニンに、アミノ酸番号９７（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号９９（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０２（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１０４（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１２０（アラニン）をグルタミンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５２に記載されている。配列番号５２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号５２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５１に記載されている。配列番号５１のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなる配列、４１３乃至７２７番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５１のヌクレオチド配列及び配列番号５２のアミノ酸配列は、図２７にも記載されている。
７）－７－３　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニンをグリシンに、アミノ酸番号３１（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号３２（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号３３（アラニン）をロイシンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号３９（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４２（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号５９（セリン）をプロリンに、アミノ酸番号６４（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号７９（アスパラギン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号８９（セリン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９１（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９３（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアルギニンに、アミノ酸番号９７（メチオニン）をロイシンに、アミノ酸番号９９（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０２（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１２４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１２６（ロイシン）をイソロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５４に記載されている。配列番号５４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号５４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５３に記載されている。配列番号５３のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなる配列、４１３乃至７２７番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５３のヌクレオチド配列及び配列番号５４のアミノ酸配列は、図２８にも記載されている。
７）－７－４　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニンをグリシンに、アミノ酸番号３２（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（アスパラギン）をセリンに、アミノ酸番号５９（セリン）をプロリンに、アミノ酸番号６４（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号７９（アスパラギン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号８９（セリン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号９１（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９３（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアルギニンに、アミノ酸番号９９（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０２（バリン）をフェニルアラニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５６に記載されている。配列番号５６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号５６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５５に記載されている。配列番号５５のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなる配列、４１３乃至７２７番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５５のヌクレオチド配列及び配列番号５６のアミノ酸配列は、図２９にも記載されている。
７）－７－５　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５タイプ軽鎖
　配列番号２６に示されるキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸番号２９（スレオニンをグリシンに、アミノ酸番号３２（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号３８（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号９１（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号９３（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号９６（セリン）をアルギニンに、アミノ酸番号９９（アラニン）をプロリンに、アミノ酸番号１０２（バリン）をフェニルアラニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２７Ｄ軽鎖を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５タイプ軽鎖」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５８に記載されている。配列番号５８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号５８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５７に記載されている。配列番号５７のヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなる配列、８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなる配列、４１３乃至７２７番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５７のヌクレオチド配列及び配列番号５８のアミノ酸配列は、図３０にも記載されている。
７）－８　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＡ２－２７Ｄの設計
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ１」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ２」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ３」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ１」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ３」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ１」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ２」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ３」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ３」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ４」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ５」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４／Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５／Ｌ４」（「ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例８に準じて作製し、実施例２及び４に準じて評価することができる。
＜実施例８＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体の発現ベクターの構築と抗体の調製
８）－１　ヒト化Ａ２－１５Ａの重鎖発現ベクターの構築
８）－１－１　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号２７に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４３に示されるヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社、日本）と下記のプライマーセットでヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１」と命名した。
プライマーセット
５’－ＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣ－３’（ＥＧ－Ｉｎｆ－Ｆ；配列番号９９）
５’－ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣ－３’（ＥＧ１－Ｉｎｆ－Ｒ；配列番号１００）
８）－１－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号２９に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４４３に示されるヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４」と命名した。
８）－２　ヒト化Ａ２－１５Ａの軽鎖発現ベクターの構築
８）－２－１　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３１に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＸｂａＩおよびＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１」と命名した。
プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ－３’（ＣＭ－ｉｎｆ－Ｆ；配列番号１０１）
５’－ＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣ－３’（ＣＭ－ｉｎｆ－Ｒ；配列番号１０２）
８）－２－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３３に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４」と命名した。
８）－２－３　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３５に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６」と命名した。
８）－２－４　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号３７に示すヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７」と命名した。
８）－３　ヒト化Ａ２－２７Ｄの重鎖発現ベクターの構築
８）－３－１　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号３９に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１」と命名した。
８）－３－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号４１に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２」と命名した。
８）－３－３　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号４３に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３」と命名した。
８）－３－４　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号４５に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４」と命名した。
８）－３－５　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号４７に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５」と命名した。
８）－４　ヒト化Ａ２－２７Ｄの軽鎖発現ベクターの構築
８）－４－１　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号４９に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１」と命名した。
８）－４－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号５１に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２」と命名した。
８）－４－３　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号５３に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３」と命名した。
８）－４－４　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号５５に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４」と命名した。
８）－４－５　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号５７に示すヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　遺伝子合成サービス）。実施例８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５」と命名した。
８）－５　ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）の調製
８）－５－１　ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）の生産
　実施例５）－７と同様の方法で生産した。すなわち、実施例８）－１－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４と実施例８）－２－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６を取得した。実施例８）－３－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２と実施例８）－４－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２を取得した。実施例８）－３－３で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３と実施例８）－４－４で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４の組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４を取得した。
８）－５－２　ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）の二段階工程精製
　実施例８）－５－１で得られた培養上清を、実施例５）－８と同様の方法で精製した。
＜実施例９＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性評価
９）－１　ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイによる抗体評価
　実施例８）－５で作製したヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２、及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４のＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて解析した。実施例６）－１と同様の方法でＨＥＰＧ２細胞に対してｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ-ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））を導入し、３時間後に培地を新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換した。その後、ヒト化抗体と１０　ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）を添加し、翌日にルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図３１に記載する。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２、及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４は、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を、用量依存的に抑制することが確認された。
＜実施例１０＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１）のヒトＡＬＫ２に対する結合性評価
　実施例８）－５で作製したヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６、ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４と抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＡＬＫ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗原をリガンドとして固定化し、抗体をアナライトとして測定した。抗原は、１．２５μｇ／ｍＬにて６０秒間添加し、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗原を固定化したチップ上に、抗体の希釈系列溶液（０．２－５０ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き１８００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、１０ｍＭ　グリシン塩酸溶液ｐＨ１．５を流速１０μｌ／分で３０秒間、２回添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）のＢｉｖａｌｅｎｔ結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例１１＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）の調製
１１）－１　ヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ２の構築
　実施例５）－１で構築したｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、ヒト重鎖分泌シグナル配列及びヒトＩｇＧ２定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１０３）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ２を構築した。
１１）－２　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例８）－１－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、ヒト化ＩｇＧ２タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ２を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプ発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ２／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号１０４に示し、アミノ酸配列を配列番号１０５に示した。配列番号１０４のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなる配列、４２７乃至１４０４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０５のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる配列、１４３乃至４６８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１０４のヌクレオチド配列及び配列番号１０５のアミノ酸配列は、図３２にも記載されている。
ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプ重鎖用プライマーセット
５’－ＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣ－３’（１５Ａ－Ｈ４－Ｆ；配列番号１３０）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＧＴＧＣＣ－３’（１５Ａ－Ｈ４－Ｒ；配列番号１３１）
１１）－３　ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）の生産
　実施例５）－７と同様の方法で生産した。実施例１１）－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ２／ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４と実施例８）－２－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６との組合せによって取得されたヒト化Ａ２－１５Ａ抗体を「ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）」と命名した。
１１）－４　ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）の二段階工程精製
　実施例１１）－３で得られた培養上清を、実施例５）－８と同様の方法で精製した。
＜実施例１２＞
ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）の調製
１２）－１　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例８）－３－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２をテンプレートとし、下記プライマーセットとＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、変異を導入することによりｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡ」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号１０６に示し、アミノ酸配列を配列番号１０７に示した。配列番号１０６のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０７のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１０６のヌクレオチド配列及び配列番号１０７のアミノ酸配列は、図３３にも記載されている。
プライマーセット：
５’－ＧＣＧＧＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣ－３’（ＬＡＬＡ－Ｆ；配列番号１３２）
５’－ＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧ－３’（ＬＡＬＡ－Ｒ；配列番号１３３）
１２）－２　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
　実施例８）－３－３で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３をテンプレートとし、実施例１２）－１と同様の方法でｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡ」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡタイプ重鎖のヌクレオチド配列を配列番号１０８に示し、アミノ酸配列を配列番号１０９に示した。配列番号１０８のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０９のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１０８のヌクレオチド配列及び配列番号１０９のアミノ酸配列は、図３４にも記載されている。
１２）－３　ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）の生産
　実施例５）－７と同様の方法で生産した。実施例１２）－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡと実施例８）－４－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２の組合せによって取得されたヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）」と命名し、実施例１２）－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡと実施例８）－４－４で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４の組合せによって取得されたヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体を「ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）」と命名した。
１２）－４　ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）の二段階工程精製
　実施例１２）－３で得られた培養上清を、実施例５）－８と同様の方法で精製した。
＜実施例１３＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性評価
１３）－１　ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイによる抗体評価
　実施例１１）－４で作製したヒト化Ａ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）、実施例１２）－４で得られたヒト化Ａ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）のＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、ＢＭＰ特異的なルシフェラーゼ・レポーターを用いて解析した。実施例６）－１と同様の方法でＨＥＰＧ２細胞に対してｐＧＬ４．２６／Ｉｄ１ＷＴ４Ｆ-ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，７，９４９（２００２））を導入し、３時間後に培地を新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に交換した。その後、ヒト化抗体と２．５　ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ９を添加し、実施例６）－１と同様に翌日にルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図３５に記載する。ヒト化Ａ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）、ヒト化Ａ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）は、ＢＭＰ７が誘導するＢＭＰ特異的ルシフェラーゼ活性を、用量依存的に抑制することが確認された。
＜実施例１４＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）のヒトＡＬＫ２に対する結合性評価
１４）－１　ヒトＡＬＫ２細胞外ドメインの発現精製
　ヒトＡＬＫ２細胞外ドメイン（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１０９６のアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド）をコードするＤＮＡをベクターｐＥＴ－２８ｂ（＋）（ノバジェン社、カタログ番号：６９８６５）に組み込み、Ｃ末端側にＨｉｓタグ配列を連結した蛋白を発現させるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いて、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７（ニューイングランドバイオラボ社、カタログ番号：Ｃ３０２９Ｈ）を形質転換し、ＴＢ培地（シグマアルドリッチ社、カタログ番号：Ｔ０９１８）で培養した。培養後、超音波破砕した菌体を遠心分離し、上清をＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ　ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７－５２８６－０１）で精製した。その後、ＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：２８－９８９３－３６）を用いて、電気泳動で分子量１２ｋＤａの単一バンドになるまでヒトＡＬＫ２細胞外ドメインを精製した。
１４）－２　ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）を用いた抗原結合能の測定
　実施例１１）－４で作製したヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）、実施例１２）－４で作製したヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）　及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３／Ｌ４（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）と抗原（実施例１４）－１にて調製したヒトＡＬＫ２細胞外ドメイン）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）、日本）を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））は、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へアミンカップリング法にて約１０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を約１分間添加した後、抗原の希釈系列溶液（０．７８－２００ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ塩化マグネシウム溶液を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
　結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例１５＞
ヒト化Ａ２－１５Ａ抗体（ＩｇＧ２）、ヒト化Ａ２－２７Ｄ抗体（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）のｉｎ　ｖｉｖｏ活性評価
　実施例１１）－４で作製したヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）、及び実施例１２）－４で作製したヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）の異所性骨化に対する抑制活性はマウスを用いたＢＭＰ７の移植による異所性骨化モデルを用いて解析した。４ｍｍ径の円形に切り取ったＣｏｌｌａＴａｐｅ（Ｚｉｍｍｅｒ　Ｄｅｎｔａｌ社製）にＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）を２．５マイクロＧ（μｇ）染み込ませたものを－８０℃で一晩凍結させた後に真空乾燥させた。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６：８－９週齢）の大腿骨近傍の皮膚の毛を除毛し、イソフルラン吸引麻酔下で切開し、凍結乾燥させた濾紙を骨格筋内に移植した。移植してから２週間後に異所性骨化をマイクロＣＴ（Ｃｏｍｓｃａｎ社製）にて石灰化した異所性骨の解析を行い、その後に骨格筋内の異所性骨を取り出し、重量を測定した。抗体の投与は１週間に１回（移植日をＤａｙ０としてＤａｙ－１，　Ｄａｙ６）皮下投与にて実施した。投与抗体の濃度は１，３，１０ｍｇ／ｋｇとなるように溶媒（ＨＢＳｏｒ）で希釈を行った。コントロール群のマウスに対してはＩｇＧ（ＪＡＣＫＳＯＮ　ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を１０ｍｇ／ｋｇとなるように溶媒で調製して投与を行った。
　結果を図３６に記載する。ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４／Ｌ６（ＩｇＧ２）、及びヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２／Ｌ２（ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ）は、ＢＭＰ７が誘導するマウスの骨格筋組織における異所性骨誘導を抑制することが確認された。
＜実施例１６＞
Ａ２－２７Ｄ抗体のエピトープ解析
１６）－１　ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄ　Ｆａｂフラグメントの作製
　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｆａｂ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用して実施例５）－８で得られたヒトキメラｃＡ２－２７Ｄ抗体からＦａｂフラグメントを作製した。
１６）－２　ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄ　ＦａｂフラグメントとＡＬＫ２－ＥＣＤ複合体の結晶化と構造解析
　１６）－１で得られたヒトキメラｃＡ２－２７Ｄ　Ｆａｂフラグメントと実施例１４に準じて調製したＡＬＫ２－ＥＣＤ複合体を２．４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に用いた。結晶化には蒸気拡散法を用いた。タンパク質溶液０．５μＬに沈殿剤溶液（２％（ｖ／ｖ）Ｔａｃｓｉｍａｔｅ　ｐＨ７．０，１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５，２０％（ｗ／ｖ）Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ３，３５０）を等量加えた溶液を、５０μＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２０℃で静置した。３日後に０．１ｍｍ×０．１ｍｍ×０．１ｍｍの単結晶が得られた。得られた結晶を２０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えた沈殿剤溶液に浸し、続いて液化窒素で凍結した。高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設のＢＬ１Ａにて９５Ｋ窒素気流下でＸ線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアＸＤＳ（Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．（２０１０）．Ｄ６６，１２５－１３２）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は体心単斜晶系で空間群はＣ１２１、結晶の単位格子はａ＝ｃ＝１１９．３９Å、ｂ＝３７．３２Å，β＝９２．５４であった。得られた構造因子とＦａｂ（過去に結晶構造解析した抗体構造を利用）の三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアｐｈａｓｅｒ　（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｎｏ．４）を使用した。結晶は非対称単位に１つの複合体を含んでいた。ソフトウェアｒｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４）を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、２．６Å分解能で最終のＲ値２２．３％、ｆｒｅｅＲ値２６．７％を得た。モデルは１つの複合体から成り、Ａ２－２７Ｄ　ＦａｂのＬ鎖アミノ酸残基１-２１１、Ｈ鎖アミノ酸残基１-１３４と１４１－２２３、ＡＬＫ２－ＥＣＤのアミノ酸残基１１－８９、及び６１個の水分子を含む。決定されたＡ２－２７Ｄ　Ｆａｂから４Å以内にあるＡＬＫ２－ＥＣＤのアミノ酸残基は以下の通りである：　Ｇｌｕ１８，Ｇｌｙ１９，Ｉｌｅ３９，Ａｓｎ４０，Ａｓｐ４１，Ｇｌｙ４２，Ｐｈｅ４３，Ｈｉｓ４４，Ｖａｌ４５，Ｔｙｒ４６，Ａｓｎ８２，Ｔｈｒ８４，Ｇｌｎ８６，Ｌｅｕ８７。図３７に複合体全体のリボンモデルを示した。
＜実施例１７＞
ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体のデザイン
１７）－１　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅの設計
１７）－１－１　Ａ２－１１Ｅの可変領域の分子モデリング
　Ａ２－１１Ｅの可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定されたＡ２－１１Ｅの可変領域と比較した。結果として、３ＢＮ９がＡ２－１１Ｅの重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、３ＢＮ９の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
　最後に、エネルギーの点でＡ２－１１Ｅの可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー最小化計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。
１７）－１－２　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅに対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅの構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
　Ａ２－１１Ｅのフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．　（１９９１））において既定されたヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。ヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ１のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、Ａ２－１１Ｅについてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＡ２－１１Ｅの三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
１７）－２　Ａ２－１１Ｅ重鎖のヒト化
１７）－２－１　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖
　配列表の配列番号２に示されるＡ２－１１Ｅ重鎖のアミノ酸番号７（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号１６（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号１９（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号２３（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号４８（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号６１（プロリン）をアラニンに、アミノ酸番号６９（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号７５（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号７６（グルタミン酸）をリジンに、アミノ酸番号８８（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号９３（スレオニン）をバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１１Ｅ重鎖を「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１１に記載されている。配列番号１１１のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる配列、１３８乃至４６７番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１０に記載されている。配列番号１１０のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなる配列、４１２乃至１４０１番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１０のヌクレオチド配列及び配列番号１１１のアミノ酸配列は、図３８にも記載されている。
１７）－２－２　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖
　配列表の配列番号２に示されるＡ２－１１Ｅ重鎖のアミノ酸番号７（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号１６（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号１９（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号２３（バリン）をアラニンに、アミノ酸番号６９（アラニン）をスレオニンに、アミノ酸番号７５（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号７６（グルタミン酸）をリジンに、アミノ酸番号８８（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号９３（スレオニン）をバリンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１１Ｅ重鎖を「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１３に記載されている。配列番号１１３のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる配列、１３８乃至４６７番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１１３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１２に記載されている。配列番号１１２のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなる配列、４１２乃至１４０１番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１２のヌクレオチド配列及び配列番号１１３のアミノ酸配列は、図３９にも記載されている。
１７）－３　Ａ２－１１Ｅ軽鎖のヒト化
１７）－３－１　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖
　配列表の配列番号４に示されるＡ２－１１Ｅ軽鎖のアミノ酸番号１０（ロイシン）をセリンに、アミノ酸番号２１（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号２２（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号４０（ロイシン）をプロリンに、アミノ酸番号４２（グルタミン酸）をリジンに、アミノ酸番号５８（イソロイシン）をバリンに、アミノ酸番号８３（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号８７（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号９９（プロリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０５（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１０８（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１１Ｅ軽鎖を「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１５に記載されている。配列番号１１５のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる配列、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１１５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１４に記載されている。配列番号１１４のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなる配列、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１４のヌクレオチド配列及び配列番号１１５のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
１７）－３－２　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖
　配列表の配列番号４に示されるＡ２－１１Ｅ軽鎖のアミノ酸番号１０（ロイシン）をセリンに、アミノ酸番号２１（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号２２（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号４０（ロイシン）をプロリンに、アミノ酸番号４２（グルタミン酸）をリジンに、アミノ酸番号８３（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号８７（フェニルアラニン）をチロシンに、アミノ酸番号９９（プロリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０５（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１０８（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１１Ｅ軽鎖を「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１７に記載されている。配列番号１１７のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる配列、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１６に記載されている。配列番号１１６のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなる配列、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１６のヌクレオチド配列及び配列番号１１７のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
１７）－３－３　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖
　配列表の配列番号４に示されるＡ２－１１Ｅ軽鎖のアミノ酸番号１０（ロイシン）をセリンに、アミノ酸番号２１（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号４０（ロイシン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（バリン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号１０３（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０５（ロイシン）をイソロイシンに、アミノ酸番号１０８（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－１１Ｅ軽鎖を「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１１９に記載されている。配列番号１１９のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなる配列、１２９乃至２３３番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１１９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１１８に記載されている。配列番号１１８のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなる配列、３８５乃至６９９番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１１８のヌクレオチド配列及び配列番号１１９のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
１７）－４　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＡ２－１１Ｅの設計
ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ２」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ３」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ４」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ２」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ３」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ４」（「ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例１８に準じて作製し、実施例２及び４に準じて評価することができる。
１７）－５　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃの設計
１７）－５－１　Ａ２－２５Ｃの可変領域の分子モデリング
　Ａ２－２５Ｃの可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定されたＡＡ２－２５Ｃの可変領域と比較した。結果として、３ＢＮ９がＡ２－２５Ｃの重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、３ＢＮ９の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
　最後に、エネルギーの点でＡ２－２５Ｃの可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー最小化計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。
１７　）－５－２　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃに対するアミノ酸配列の設計
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃの構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。
　Ａ２－２５Ｃのフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、ＫＡＢＡＴ　ｅｔ　ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されたヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。ヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ１のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、Ａ２－２５Ｃについてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築されたＡ２－２５Ｃの三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
１７）－６　Ａ２－２５Ｃ重鎖のヒト化
１７）－６－１　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖
　配列表の配列番号１０に示されるＡ２－２５Ｃ重鎖のアミノ酸番号１９（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号３８（システイン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（スレオニン）をグリシンに、アミノ酸番号６３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号７５（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号８４（アスパラギン酸）をアスパラギンに、アミノ酸番号８８（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号９３（スレオニン）をバリンに、アミノ酸番号１１２（バリン）をスレオニンに、アミノ酸番号１１３（メチオニン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２５Ｃ重鎖を「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２１に記載されている。配列番号１２１のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる配列、１３８乃至４６７番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１２１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２０に記載されている。配列番号１２０のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなる配列、４１２乃至１４０１番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１２０のヌクレオチド配列及び配列番号１２１のアミノ酸配列は、図４３にも記載されている。
１７）－６－２　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖
　配列表の配列番号１０に示されるＡ２－２５Ｃ重鎖のアミノ酸番号１９（リジン）をアルギニンに、アミノ酸番号３８（システイン）をアルギニンに、アミノ酸番号４２（スレオニン）をグリシンに、アミノ酸番号６３（スレオニン）をセリンに、アミノ酸番号７５（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号８４（アスパラギン酸）をアスパラギンに、アミノ酸番号８８（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号１１３（メチオニン）をロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２５Ｃ重鎖を「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２３に記載されている。配列番号１２３のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなる配列、１３８乃至４６７番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２２に記載されている。配列番号１２２のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなる配列、４１２乃至１４０１番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１２２のヌクレオチド配列及び配列番号１２３のアミノ酸配列は、図４４にも記載されている。
１７）－７　Ａ２－２５Ｃ軽鎖のヒト化
１７）－７－１　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖
　配列表の配列番号１２に示されるＡ２－２５Ｃ軽鎖のアミノ酸番号９（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号１５（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１６（グルタミン酸）をグリシンに、アミノ酸番号１７（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号１８（イソロイシン）をアルギニンに、アミノ酸番号４３（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号４５（グルタミン）をリジンに、アミノ酸番号６６（アルギニン）をグリシンに、アミノ酸番号７０（グルタミン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号７１（チロシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号７２（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号７４（リジン）をスレオニンに、アミノ酸番号７７（アルギニン）をセリンに、アミノ酸番号７９（アルギニン）をグルタミンに、アミノ酸番号８０（バリン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（イソロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号８４（グリシン）をアラニンに、アミノ酸番号８５（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１００（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１０４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２５Ｃ軽鎖を「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２５に記載されている。配列番号１２５のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１２５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２４に記載されている。配列番号１２４のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１２４のヌクレオチド配列及び配列番号１２５のアミノ酸配列は、図４５にも記載されている。
１７）－７－２　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖
　配列表の配列番号１２に示されるＡ２－２５Ｃ軽鎖のアミノ酸番号９（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号１５（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１６（グルタミン酸）をグリシンに、アミノ酸番号１７（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号１８（イソロイシン）をアルギニンに、アミノ酸番号４３（セリン）をアラニンに、アミノ酸番号４５（グルタミン）をリジンに、アミノ酸番号７０（グルタミン）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号７２（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号７４（リジン）をスレオニンに、アミノ酸番号７７（アルギニン）をセリンに、アミノ酸番号７９（アルギニン）をグルタミンに、アミノ酸番号８０（バリン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（イソロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号８４（グリシン）をアラニンに、アミノ酸番号８５（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１００（セリン）をグルタミンに、アミノ酸番号１０４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２５Ｃ軽鎖を「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２７に記載されている。配列番号１２７のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２６に記載されている。配列番号１２６のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１２６のヌクレオチド配列及び配列番号１２７のアミノ酸配列は、図４６にも記載されている。
１７）－７－３　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖
　配列表の配列番号１２に示されるＡ２－２５Ｃ軽鎖のアミノ酸番号９（アラニン）をセリンに、アミノ酸番号１５（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１６（グルタミン酸）をグリシンに、アミノ酸番号１７（グルタミン酸）をアスパラギン酸に、アミノ酸番号１８（イソロイシン）をアルギニンに、アミノ酸番号４５（グルタミン）をリジンに、アミノ酸番号７２（セリン）をスレオニンに、アミノ酸番号７４（リジン）をスレオニンに、アミノ酸番号７７（アルギニン）をセリンに、アミノ酸番号７９（アルギニン）をグルタミンに、アミノ酸番号８０（バリン）をプロリンに、アミノ酸番号８３（イソロイシン）をフェニルアラニンに、アミノ酸番号８４（グリシン）をアラニンに、アミノ酸番号８５（イソロイシン）をスレオニンに、アミノ酸番号１０４（ロイシン）をバリンに、アミノ酸番号１０９（アラニン）をスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＡ２－２５Ｃ軽鎖を「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖」と命名した。
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１２９に記載されている。配列番号１２９のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１２９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１２８に記載されている。配列番号１２８のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１２８のヌクレオチド配列及び配列番号１２９のアミノ酸配列は、図４７にも記載されている。
１７）－８　重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＡ２－２５Ｃの設計
　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ１（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ２」（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－１２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ３」（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ１」（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ２」（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖及びヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ３」（「ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例１８に準じて作製し、実施例２及び４に準じて評価することができる。
＜実施例１８＞
ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）のベクターの構築と調製
１８）－１　ヒト化Ａ２－１１Ｅの重鎖発現ベクターの構築
１８）－１－１　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号１１０に示すヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２８に示されるヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３」と命名した。
１８）－１－２　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号１１２に示すヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２８に示されるヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４」と命名した。
１８）－２　ヒト化Ａ２－１１Ｅの軽鎖発現ベクターの構築
１８）－２－１　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１１４に示すヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至３９９に示されるヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、実施例５）－１で構築したキメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２」と命名した。
プライマーセット
５’－ＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣ－３’（ＣＭ－ＬＫＦ；配列番号１３４）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧ－３’（ＫＣＬ－Ｉｎｆ－Ｒ；配列番号１３５）
１８）－２－２　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１１６に示すヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至３９９に示されるヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例１８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３」と命名した。
１８）－２－３　ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１１８に示すヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至３３９に示されるヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例１８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４」と命名した。
１８）－３　ヒト化Ａ２－２５Ｃの重鎖発現ベクターの構築
１８）－３－１　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号１２０に示すヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２８に示されるヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３」と命名した。
１８）－３－２　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４タイプ重鎖発現ベクターの構築
　配列番号１２２に示すヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４２８に示されるヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例８）－１－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４」と命名した。
１８）－４　ヒト化Ａ２－２５Ｃの軽鎖発現ベクターの構築
１８）－４－１　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１２４に示すヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例１８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１」と命名した。
１８）－４－２　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１２６に示すヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例１８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２」と命名した。
１８）－４－３　ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
　配列番号１２８に示すヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社　人工遺伝子合成サービス）。実施例１８）－２－１と同様の方法でヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３」と命名した。
１８）－５　ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）の小スケール生産
　ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。
　対数増殖期の１×１０７個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で９．６ｍＬに希釈した後に、３０ｍＬ　Ｓｑｕａｒｅ　Ｓｔｏｒａｇｅ　Ｂｏｔｔｌｅ（Ｎａｌｇｅｎｅ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５）３０μｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００μＬに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した軽鎖発現ベクター（６μｇ）及び重鎖発現ベクター（４μｇ）を２００μＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２００μＬに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２００μＬを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）、ろ過して評価用のサンプルとした。
　実施例１８）－１－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３と実施例１８）－２－１で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ２を取得した。実施例１８）－１－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３と実施例１８）－２－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ３を取得した。実施例１８）－１－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３と実施例１８）－２－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３／Ｌ４を取得した。実施例１８）－１－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４と実施例１８）－２－１で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ２を取得した。実施例１８）－１－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４と実施例１８）－２－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ３を取得した。実施例１８）－１－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４と実施例１８）－２－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４との組み合わせによって、ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４／Ｌ４を取得した。
　実施例１８）－３－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３と実施例１８）－４－１で構築したｐＣＭＡ－／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ１を取得した。実施例１８）－３－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３と実施例１８）－４－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ２を取得した。実施例１８）－３－１で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３と実施例１８）－４－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３／Ｌ３を取得した。実施例１８）－３－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４と実施例１８）－４－１で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ１を取得した。実施例１８）－３－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４と実施例１８）－４－２で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ２を取得した。実施例１８）－３－２で構築したｐＣＭＡ－Ｇ１／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４と実施例１８）－４－３で構築したｐＣＭＡ／ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３との組合せによって、ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４／Ｌ３を取得した。
＜実施例１９＞
ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）のｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性評価
１９）－１　ＢＭＰの骨芽細胞分化誘導アッセイによる抗体評価
　実施例１８）－５で作製したヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）の内在性ＡＬＫ２を介した細胞内シグナルの阻害活性は、実施例６）－２と同様にＢＭＰによるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化誘導活性に対する効果で解析した。分化誘導には２．５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ２／ＢＭＰ９（ＲＤ‐ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いた。
　結果を図４８に記載する。ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）は、ＢＭＰによって誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞への分化を、用量依存的に抑制することが確認された。
＜実施例２０＞
ヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）のヒトＡＬＫ２に対する結合性評価
　実施例１８）－５で作製したヒト化Ａ２－１１Ｅ抗体（ＩｇＧ１）、及びヒト化Ａ２－２５Ｃ抗体（ＩｇＧ１）と抗原（実施例１４）－１にて調製したヒトＡＬＫ２細胞外ドメイン）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ｋｉｔ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））は、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へアミンカップリング法にて約１０００ＲＵ共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を含む培養上清を約１分間添加した後、抗原の希釈系列溶液（０．７８－２００ｎＭ）を流速３０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ　ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
　結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例２１＞
Ａ２－２５Ｃ抗体のエピトープ解析
２１）－１　ヒトキメラｃＡ２－２５Ｃ　Ｆａｂフラグメントの作製
　実施例５）－８と同様に調製したヒトキメラｃＡ２－２５Ｃを　Ｐａｐａｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに切断し、これをＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＨＰカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。フロースルー画分にて回収されたＦａｂフラグメントを濃縮した。
２１）－２　ヒトキメラｃＡ２－２５Ｃ　ＦａｂフラグメントとＡＬＫ２－ＥＣＤ複合体の結晶化と構造解析
　実施例２１）－１で得られたキメラＡ２－２５Ｃ　Ｆａｂフラグメントと実施例１４に準じて調製したＡＬＫ２－ＥＣＤ複合体を３．８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に用いた。結晶化には蒸気拡散法を用いた。タンパク質溶液０．５μＬに沈殿剤溶液（０．１５Ｍ　Ｌｉ２ＳＯ４，０．１Ｍ　ＮａＣｉｔｒａｔｅ　ｐＨ３．４，１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６，０００，２０％（ｖ／ｖ）Ｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ）を等量加えた溶液を、５０μＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２０℃で静置した。３日後に０．１ｍｍ×０．０５ｍｍ×０．０２ｍｍの単結晶が得られた。得られた結晶を液化窒素で凍結し、ＳＰｒｉｎｇ８のＢＬ４１ＸＵにて９５Ｋ窒素気流下でＸ線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアｍｏｓｆｌｍ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｎｏ．４）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は直方晶系で空間群はＰ２１２１２１、結晶の単位格子はａ＝７４．４９Å，ｂ＝１２８．０５Å、ｃ＝１４７．７３Åであった。得られた構造因子とＦａｂ（過去に結晶構造解析した抗体構造を利用）の三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアｐｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｎｏ．４）を使用した。結晶は非対称単位に２つの複合体を含んでいた。ソフトウェアｒｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４）を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、２．１Å分解能で最終のＲ値２２．４％、ｆｒｅｅＲ値２５．３％を得た。モデルは２つの複合体から成り、Ａ２－２５Ｃ　ＦａｂのＬ鎖アミノ酸残基１-２１２、Ｈ鎖アミノ酸残基１-２１９、ＡＬＫ２－ＥＣＤのアミノ酸残基１２－５２および６６－８８、及び４１１個の水分子を含む。決定された２つのＡ２－２５Ｃ　Ｆａｂから共通して４Å以内にあるＡＬＫ２－ＥＣＤのアミノ酸残基は以下の通りである：Ｇｌｕ１８，Ｇｌｙ１９，Ｌｅｕ２０，Ｉｌｅ３９，Ａｓｐ４１，Ｇｌｙ４２，Ｐｈｅ４３，Ｈｉｓ４４，Ｖａｌ４５，Ｔｙｒ４６，Ｔｈｒ８４。図４９に複合体全体のリボンモデルを示した。
＜実施例２２＞
様々な変異ＡＬＫ２に対するＡ２-２７Ｄの阻害活性評価
　これまでにＦＯＰ症例から同定された１３種類の変異体（Ｌ１９６Ｐ、ｄｅｌＰ１９７＿Ｆ１９８ｉｎｓＬ、Ｒ２０２Ｉ、Ｒ２０６Ｈ、Ｑ２０７Ｅ、Ｒ２５８Ｓ、Ｒ２５８Ｇ、Ｇ３２５Ａ、Ｇ３２８Ｅ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ３２８Ｗ、Ｇ３５６Ｄ、及びＲ３７５Ｐ）、および野生型ＡＬＫ２に対するＡ２-２７の阻害活性は、実施例２）-３と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いたＢＭＰ特異的なＩｄ１ＷＴ４Ｆ-ｌｕｃルシフェラーゼ・レポーターで解析した。遺伝子導入後、２．５時間後に培地を１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７（Ｍｉｌｔｅｎｅｙ社製）と、３μｇ／ｍＬのラットＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、またはＡ２-２７Ｄを含む新鮮なＯＰＴＩ-ＭＥＭ　Ｉ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に交換して一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ-Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図５０に記載する。モノクローナル抗体Ａ２-２７Ｄは、ＢＭＰ７によって誘導されるルシフェラーゼ活性を、野生型および１３種類すべての変異体で抑制することが確認された（図５０）。
　本発明のキメラ又はヒト化抗ＡＬＫ２抗体は、ＡＬＫ２を介したＢＭＰシグナル伝達の抑制作用を有し、該抗ＡＬＫ２抗体を含む医薬組成物は異所性骨化及び／又は骨形成異常、貧血、或いはびまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療又は予防剤となり得る。
配列番号１：Ａ２－１１Ｅの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：Ａ２－１１Ｅの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：Ａ２－１１Ｅの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：Ａ２－１１Ｅの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：Ａ２－１５Ａの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６：Ａ２－１５Ａの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号７：Ａ２－１５Ａの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号８：Ａ２－１５Ａの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：Ａ２－２５Ｃの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１０：Ａ２－２５Ｃの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：Ａ２－２５Ｃの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１２：Ａ２－２５Ｃの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：Ａ２－２７Ｄの重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１４：Ａ２－２７Ｄの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１５：Ａ２－２７Ｄの軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号１６：Ａ２－２７Ｄの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１７：ヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号１８：ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号１９：ヒトキメラｃＡ２－１５Ａの重鎖のヌクレオチド配列
配列番号２０：ヒトキメラｃＡ２－１５Ａの重鎖のアミノ酸配列
配列番号２１：ヒトキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号２２：ヒトキメラｃＡ２－１５Ａの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２３：ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のヌクレオチド配列
配列番号２４：ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄの重鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号２６：ヒトキメラｃＡ２－２７Ｄの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２７：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１のヌクレオチド配列
配列番号２８：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号２９：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４のヌクレオチド配列
配列番号３０：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４のアミノ酸配列
配列番号３１：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号３２：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号３３：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号３４：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ４のアミノ酸配列
配列番号３５：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号３６：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６のアミノ酸配列
配列番号３７：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号３８：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ７のアミノ酸配列
配列番号３９：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１のヌクレオチド配列
配列番号４０：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号４１：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２のヌクレオチド配列
配列番号４２：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号４３：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３のヌクレオチド配列
配列番号４４：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号４５：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４のヌクレオチド配列
配列番号４６：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ４のアミノ酸配列
配列番号４７：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５のヌクレオチド配列
配列番号４８：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ５のアミノ酸配列
配列番号４９：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５０：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号５１：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５２：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号５３：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５４：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号５５：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５６：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ４のアミノ酸配列
配列番号５７：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号５８：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｌ５のアミノ酸配列
配列番号５９：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号６０：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号６１：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号６２：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号６３：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号６４：Ａ２－１５ＡのＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号６５：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号６６：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号６７：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号６８：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号６９：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号７０：Ａ２－２７ＤのＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｌ６のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号７２：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号７３：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号７４：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号７５：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号７６：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号７７：Ａ２－１１ＥのＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号７８：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号７９：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＨ２のアミノ酸配列
配列番号８０：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号８１：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号８２：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号８３：Ａ２－２５ＣのＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号８４：ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列
配列番号８５：ヒトＡＬＫ２のヌクレオチド配列
配列番号８６：マウスＡＬＫ２のアミノ酸配列
配列番号８７：マウスＡＬＫ２のヌクレオチド配列
配列番号８８～１０２：プライマー
配列番号１０３：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ２定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号１０４：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプのヌクレオチド配列
配列番号１０５：ヒト化ｈＡ２－１５Ａ－Ｈ４　ＩｇＧ２タイプのアミノ酸配列
配列番号１０６：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡのヌクレオチド配列
配列番号１０７：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ２－ＬＡＬＡのアミノ配列
配列番号１０８：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡのヌクレオチド配列
配列番号１０９：ヒト化ｈＡ２－２７Ｄ－Ｈ３－ＬＡＬＡのアミノ配列
配列番号１１０：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３のヌクレオチド配列
配列番号１１１：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１１２：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４のヌクレオチド配列
配列番号１１３：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｈ４のアミノ酸配列
配列番号１１４：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２のヌクレオチド配列
配列番号１１５：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１１６：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３のヌクレオチド配列
配列番号１１７：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１１８：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４のヌクレオチド配列
配列番号１１９：ヒト化ｈＡ２－１１Ｅ－Ｌ４のアミノ酸配列
配列番号１２０：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３のヌクレオチド配列
配列番号１２１：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１２２：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４のヌクレオチド配列
配列番号１２３：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｈ４のアミノ酸配列
配列番号１２４：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１のヌクレオチド配列
配列番号１２５：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１２６：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２のヌクレオチド配列
配列番号１２７：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１２８：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３のヌクレオチド配列
配列番号１２９：ヒト化ｈＡ２－２５Ｃ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１３０～１３５：プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (66)

  1. 　以下の（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列における少なくとも７アミノ酸からなるポリペプチド配列と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
    （ａ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列
    （ｂ）配列番号８４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
    （ｃ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列
    （ｄ）配列番号８６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
    （ｅ）（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列に１乃至数アミノ酸残基の置換、欠失又は付加を伴うアミノ酸配列
  2. 　以下の（ｆ）乃至（ｊ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における少なくとも７アミノ酸からなるポリペプチド配列と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片。
    （ｆ）配列番号８５に示されるヌクレオチド配列
    （ｇ）配列番号８５に示されるヌクレオチド配列の７２８乃至１０３６番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列
    （ｈ）配列番号８７に示されるヌクレオチド配列
    （ｉ）配列番号８７に示されるヌクレオチド配列の７２８乃至１０３６番目のヌクレオチド残基からなるヌクレオチド配列
    （ｊ）（ｆ）乃至（ｉ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
  3. 　前記ポリペプチド配列が、ＡＬＫ２細胞外領域内の配列である、請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  4. 　前記抗体が、野生型ＡＬＫ２蛋白質及び変異型ＡＬＫ２蛋白質に結合する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  5. 　前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  6. 　前記抗体及び前記抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  7. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、並びに配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つの抗体と前記ポリペプチドへの結合に対し交差競合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  8. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体、並びに配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体からなる群から選択される少なくともいずれか一つの抗体が結合するエピトープに結合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  9. 　配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、８２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）、８６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）、８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）、及び８９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基を含むエピトープに結合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  10. 　配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、８２番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）、８６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）、８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）、８８番目のプロリン（Ｐｒｏ）、及び８９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基との間で相互作用距離を有することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  11. 　配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、２０番目のロイシン（Ｌｅｕ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、及び８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基を含むエピトープに結合することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  12. 　配列番号８４に示されるアミノ酸配列中の１８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）、１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）、２０番目のロイシン（Ｌｅｕ）、３９番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）、４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、４１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）、４２番目のグリシン（Ｇｌｙ）、４３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、４４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）、４５番目のバリン（Ｖａｌ）、４６番目のチロシン（Ｔｙｒ）、及び８４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）の各残基との間で相互作用距離を有することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  13. 　相互作用距離が６オングストローム以下である、請求項１０又は１２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  14. 　相互作用距離が４オングストローム以下である、請求項１０又は１２に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  15. 　重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号７３に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号７５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  16. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  17. 　重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号５９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号６３又は配列番号７１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  18. 　配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  19. 　重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号７９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号８０に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号８１に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号８３に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする、請求項１乃至１０、１３乃至１４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  20. 　配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  21. 　重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号６５に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号６７に示されるアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号６９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする、請求項１乃至８、１１乃至１４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  22. 　配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域配列及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  23. 　Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合断片。
  24. 　ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載の抗体。
  25. 　キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  26. 　ヒト化されていることを特徴とする、請求項１乃至２２のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  27. 　重鎖がヒト免疫グロブリンＧ１重鎖、ヒト免疫グロブリンＧ２重鎖、又はヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 　重鎖がヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の定常領域を含む、請求項２７に記載の抗体。
  29. 　ヒト免疫グロブリンＧ１重鎖の２３４番目のロイシン（Ｌｅｕ）がアラニン（Ａｌａ）により置換され、２３５番目のロイシン（Ｌｅｕ）がアラニン（Ａｌａ）により置換された、請求項２８に記載の抗体。
  30. 　重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含む、請求項２７に記載の抗体。
  31. 　重鎖がヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の定常領域を含む、請求項２７に記載の抗体。
  32. 　ヒト免疫グロブリンＧ４重鎖の２４１番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）により置換された、請求項３１に記載の抗体。
  33. 　ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
    （ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
    ａ１）　配列番号２８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２）　配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３）　配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ４）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ５）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ６）　ａ１）乃至ａ３）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
    （ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
    ｂ１）　配列番号３２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２）　配列番号３４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３）　配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４）　配列番号３８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
    を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  34. 　配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４２番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３３に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  35. 　配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３３に記載の抗体。
  36. 　配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３３に記載の抗体。
  37. 　ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
    （ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
    ａ１）　配列番号４０に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２）　配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３）　配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ４）　配列番号４６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ５）　配列番号４８に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ６）　配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ７）　配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ８）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ９）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ１０）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
    （ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
    ｂ１）　配列番号５０に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２）　配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３）　配列番号５４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４）　配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ５）　配列番号５８に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
    を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  38. 　配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３７に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  39. 　配列番号４２に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号４４に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３７に記載の抗体。
  40. 　配列番号１０７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号１０９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５６に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる抗体である、請求項３７に記載の抗体。
  41. 　ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
    （ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
    ａ１）　配列番号１１１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２）　配列番号１１３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ４）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ５）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
    （ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
    ｂ１）　配列番号１１５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２）　配列番号１１７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３）　配列番号１１９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
    を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  42. 　ＡＬＫ２蛋白質の細胞外領域と特異的に結合し、かつＡＬＫ２を介するＢＭＰシグナル伝達を抑制する抗体又は該抗体の抗原結合断片であって、
    （ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列：
    ａ１）　配列番号１２１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２）　配列番号１２３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ４）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ａ５）　ａ１）又はａ２）のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
    （ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列：
    ｂ１）　配列番号１２５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２）　配列番号１２７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３）　配列番号１２９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
    を含むことを特徴とする、抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  43. 　カルボキシル末端の１乃至数個のアミノ酸が欠失した重鎖を含む抗体である、請求項１乃至４２のいずれか一項に記載の抗体。
  44. 　重鎖又は軽鎖のアミノ末端のアミノ酸残基がピログルタミル化されている抗体である、請求項１乃至４３のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  45. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
  46. 　異所性骨化の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニストからなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防用医薬組成物。
  48. 　異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であることを特徴とする、請求項４６又は４７に記載の医薬組成物。
  49. 　異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であることを特徴とする、請求項４６又は４７に記載の医薬組成物。
  50. 　貧血の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  51. 　びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項４５に記載の医薬組成物。
  52. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項４５乃至４９のいずれか一項に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防方法。
  53. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項４５乃至４９のいずれか一項に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、抗炎症剤、ステロイド剤、ビスフォスフォネート、筋弛緩剤、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）γアゴニストからなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後して投与することを特徴とする、異所性骨化の治療及び／又は予防方法。
  54. 　異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、進行性骨異形成（ＰＯＨ）、外傷性の異所性骨化、又は人工関節置換術後の異所性骨化であることを特徴とする、請求項５２又は５３に記載の治療及び／又は予防方法。
  55. 　異所性骨化が、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）であることを特徴とする請求項５２又は５３に記載の治療及び／又は予防方法。
  56. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、或いは請求項４５又は５０に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、貧血の治療及び／又は予防方法。
  57. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、或いは請求項４５又は５１に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、びまん性橋膠腫（ＤＩＰＧ）の治療及び／又は予防方法。
  58. 　請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  59. 　（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ａ１）　配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ２）　配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ３）　配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ４）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ５）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ６）　ａ１）乃至ａ３）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ａ７）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
    （ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ｂ１）　配列番号３１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ２）　配列番号３３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ３）　配列番号３５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ４）　配列番号３７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ４）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
    を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  60. 　（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ａ１）　配列番号３９に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ２）　配列番号４１に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ３）　配列番号４３に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ４）　配列番号４５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ５）　配列番号４７に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ６）　配列番号１０６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ７）　配列番号１０８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ８）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ９）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ１０）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ａ１１）　ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
    （ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ｂ１）　配列番号４９に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ２）　配列番号５１に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ３）　配列番号５３に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ４）　配列番号５５に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ５）　配列番号５７に示されるヌクレオチド配列の８６乃至４１２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ８）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ｂ９）　ｂ１）乃至ｂ５）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
    を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  61. 　（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ａ１）　配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ２）　配列番号１１２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
    （ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ｂ１）　配列番号１１４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ２）　配列番号１１６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ３）　配列番号１１８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
    を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  62. 　（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ａ１）　配列番号１２０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ２）　配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ３）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ４）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ａ５）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ａ６）　ａ１）又はａ２）のヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び／或いは
    （ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ｂ１）　配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ２）　配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ３）　配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ４）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ５）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を持つヌクレオチド配列；
    ｂ６）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ｂ７）　ｂ１）乃至ｂ３）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
    を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  63. 　請求項５８乃至６２のいずれか一項に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
  64. 　請求項５８乃至６２のいずれか一項に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
  65. 　請求項６３に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
  66. 　請求項６４又は６５に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の抗体の生産方法。
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