CN106834220A - 一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法。本发明无血清软骨细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子24‑32ng/mL，聚赖氨酸7‑10mg/mL，花生四烯酸2‑5μM，维生素C10‑15μg/mL，银胶菊内酯5‑8μg/mL，丁二胺5‑9μM，胰岛素7‑9μg/mL，亚麻酸3‑6μM，黄酮14‑18μg/mL，转铁蛋白12‑16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20‑26μg/mL，胰高血糖素8‑13μg/mL和纤黏连蛋白20‑32ng/mL。本发明提供的无血清软骨细胞培养基不含血清，成本较低，有利于规模化应用。

Description

一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法。
背景技术
关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复移植一直以来是医学界的难题之一。近年来，随着组织工程技术的发展，自体软骨移植在软骨损伤的临床治疗在国内外都有应用。临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，所以对体外软骨细胞的培养和扩增成为目前要解决的关键。
中国专利申请CN104120105A公开了一种用于培养老龄人群软骨细胞的无血清培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂浓度成分为：233μM-287μM维生素C，3.7μM-8.9μM亚油酸，9μM-17μM胆固醇，6nM-15nM***，43μM-58μM乙酰半胱氨酸，18μg/mL-32μg/mL转铁蛋白，22nM-52nM***钠，13μM-24μM泛酸钠，28μM-43μM生物素，7μg/mL-18μg/mL胰岛素，2ng/mL-9ng/mL表皮生长因子，2ng/mL-9ng/mL成纤维生长因子，2ng/mL-9ng/mL血小板衍生生长因子，0.5％-2.5％人血清白蛋白。中国专利申请CN104480066A公开了一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法，该软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。
现有的适用于软骨细胞体外培养的培养基有的含有血清，因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝***因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。有的培养基虽然不含血清，但是，存在价格昂贵的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无血清软骨细胞培养基及其制备方法。本发明提供的无血清软骨细胞培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染，提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间，本发明提供的无血清软骨细胞培养基的成本较低，有利于规模化应用。
本发明的技术方案是：
一种无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子24-32ng/mL，聚赖氨酸7-10mg/mL，花生四烯酸2-5μM，维生素C10-15μg/mL，银胶菊内酯5-8μg/mL，丁二胺5-9μM，胰岛素7-9μg/mL，亚麻酸3-6μM，黄酮14-18μg/mL，转铁蛋白12-16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20-26μg/mL，胰高血糖素8-13μg/mL和纤黏连蛋白20-32ng/mL。
进一步地，所述无血清软骨细胞培养基包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，银胶菊内酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
进一步地，所述基础培养基为RMPI 1640或IMEM培养基。
进一步地，所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比8-10∶3-7∶1-3组成。
进一步地，所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比9∶5∶2组成。
本发明的另一目的是提供所述无血清软骨细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C、银胶菊内酯、丁二胺、胰岛素、亚麻酸、黄酮、转铁蛋白和纤黏连蛋白，搅拌20-40分钟，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，继续搅拌18-25分钟，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为4-7％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.0-7.3，灭菌温度为117-122℃，灭菌时间为18-23分钟，即得。
优选地，所述步骤S1搅拌26分钟。
优选地，所述步骤S1继续搅拌22分钟。
优选地，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6％的氢氧化钠溶液。
优选地，所述步骤S2调节培养基的pH至7.1。
优选地，所述步骤S2灭菌温度为120℃。
优选地，所述步骤S2灭菌时间为20分钟。
本发明提供的无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，添加的添加剂包括细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C和银胶菊内酯等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供软骨细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，细胞因子主要作为维持软骨细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子。在本发明中，聚赖氨酸和纤黏连蛋白共同作用，能够促进软骨细胞的粘附，及其贴壁生长。在本发明中，花生四烯酸是细胞膜的主要成分，决定着细胞膜的生物活性。在本发明中，维生素C作为营养剂能够参与细胞代谢，并且还起到抗氧化的作用。在本发明中，丁二胺能够提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质。在本发明中，胰岛素能够促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡。在本发明中，亚麻酸能够提供细胞膜合成所需的脂质，并且与本发明中的其他原料协同作用，能够促进细胞增殖，提高细胞产率。在本发明中，黄酮主要用作抗氧剂，能消除氧自由基对细胞的损害，另外，还能够与培养基中的其他原料协同作用，促进软骨细胞的增殖。在本发明中，转铁蛋白能够调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内；另外，它还可以与其他微量元素结合，从而调节软骨细胞的生长增殖与功能表达。在本发明中，聚乙烯吡咯烷酮能够吸收酚类物质，减轻酚类物质对细胞的毒害。在本发明中，胰高血糖素参与软骨细胞的糖代谢、脂类代谢等，能调节软骨细胞的增殖与功能表达。
研究发现，在无血清软骨细胞培养基中加入银胶菊内酯和黄酮，这两种成分能与其他成分间协同作用，使软骨细胞扩增速度得到进一步的提高。本发明无血清软骨细胞培养基搭配合理，各成分间相互协调，共同作用，提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间。
与现有技术相比，本发明提供的无血清软骨细胞培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的无血清软骨细胞培养基不含血清，排除了动物来源的病原体污染。
(2)本发明提供的是一种无动物源性成分、成分确定的无血清软骨细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。
(3)本发明提供的无血清软骨细胞培养基的成本较低，有利于规模化应用。
(4)本发明提供的无血清软骨细胞培养基提高了软骨细胞扩增速度，大大缩短了软骨细胞培养的时间。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中RMPI 1640培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，IMEM培养基可购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，胰高血糖素可购自Sigma公司，聚赖氨酸可购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司，黄酮可购自哈尔滨百爱科技有限公司，银胶菊内酯购自Sigma公司。
实施例1、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子24ng/mL，聚赖氨酸7mg/mL，花生四烯酸2μM，维生素C10μg/mL，银胶菊内酯5μg/mL，丁二胺5μM，胰岛素7μg/mL，亚麻酸3μM，黄酮14μg/mL，转铁蛋白12μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20μg/mL，胰高血糖素8μg/mL和纤黏连蛋白20ng/mL。
所述基础培养基为RMPI 1640培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比8∶7∶3组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C、银胶菊内酯、丁二胺、胰岛素、亚麻酸、黄酮、转铁蛋白和纤黏连蛋白，搅拌20分钟，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，继续搅拌18分钟，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为4％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.0，灭菌温度为117℃，灭菌时间为18分钟，即得。
实施例2、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子32ng/mL，聚赖氨酸10mg/mL，花生四烯酸5μM，维生素C15μg/mL，银胶菊内酯8μg/mL，丁二胺9μM，胰岛素9μg/mL，亚麻酸6μM，黄酮18μg/mL，转铁蛋白16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮26μg/mL，胰高血糖素13μg/mL和纤黏连蛋白32ng/mL。
所述基础培养基为IMEM培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比10∶3∶1组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C、银胶菊内酯、丁二胺、胰岛素、亚麻酸、黄酮、转铁蛋白和纤黏连蛋白，搅拌40分钟，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，继续搅拌25分钟，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为7％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.3，灭菌温度为122℃，灭菌时间为23分钟，即得。
实施例3、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，银胶菊内酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
所述基础培养基为IMEM培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比9∶5∶2组成。
制备方法：
S1向基础培养基中加入细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C、银胶菊内酯、丁二胺、胰岛素、亚麻酸、黄酮、转铁蛋白和纤黏连蛋白，搅拌26分钟，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，继续搅拌22分钟，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.1，灭菌温度为120℃，灭菌时间为20分钟，即得。
对比例1、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，连翘苷元6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
所述基础培养基为IMEM培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比9∶5∶2组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将银胶菊内酯替换为连翘苷元。
对比例2、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，银胶菊内酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，异黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
所述基础培养基为IMEM培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比9∶5∶2组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将黄酮替换为异黄酮。
对比例3、一种无血清软骨细胞培养基
所述无血清软骨细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，银胶菊内酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
所述基础培养基为IMEM培养基。
所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比1∶1∶1组成。
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比1∶1∶1组成。
试验例一、本发明无血清软骨细胞培养基对软骨细胞生长培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得无血清软骨细胞培养基基，以及对比例1-3所得无血清软骨细胞培养基
2、试验方法：
将获取的软骨组织切碎，然后在37℃用0.25％胰蛋白酶先消化40分钟，再用0.1％Ⅱ型胶原酶消化过夜。在1200r/min离心5分钟回收细胞，分别在本发明实施例1-3所得无血清软骨细胞培养基，以及对比例1-3所得无血清软骨细胞培养基中重悬。在培养基中生长的细胞以5000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在培养基中生长的细胞用PBS冲洗，收获细胞，计数并重接种。在每次传代结束时，测定细胞产率并计算群体倍增数。结果如表1和表2所示。
表1：不同培养基测得细胞产率比较
由表1可以得出，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3所得无血清软骨细胞培养基中的细胞产率，明显高于生长在对比例1-3所得无血清软骨细胞培养基中的细胞产率。
表2：不同培养基测得生长指数比较
由表2可以得出，在所有检测的传代中，生长在本发明实施例1-3所得无血清软骨细胞培养基中细胞的生长指数，明显大于生长在对比例1-3所得无血清软骨细胞培养基中细胞的生长指数。

Claims (10)

1.一种无血清软骨细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子24-32ng/mL，聚赖氨酸7-10mg/mL，花生四烯酸2-5μM，维生素C10-15μg/mL，银胶菊内酯5-8μg/mL，丁二胺5-9μM，胰岛素7-9μg/mL，亚麻酸3-6μM，黄酮14-18μg/mL，转铁蛋白12-16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20-26μg/mL，胰高血糖素8-13μg/mL和纤黏连蛋白20-32ng/mL。
2.如权利要求1所述的无血清软骨细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：细胞因子28ng/mL，聚赖氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，维生素C12μg/mL，银胶菊内酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰岛素8μg/mL，亚麻酸5μM，黄酮16μg/mL，转铁蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纤黏连蛋白25ng/mL。
3.如权利要求1或2所述的无血清软骨细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为RMPI 1640或IMEM培养基。
4.如权利要求1或2所述的无血清软骨细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比8-10∶3-7∶1-3组成。
5.如权利要求4所述的无血清软骨细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子由血清铺展因子、转化生长因子和表皮生长因子按重量比9∶5∶2组成。
6.如权利要求1-5任一所述的无血清软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入细胞因子、聚赖氨酸、花生四烯酸、维生素C、银胶菊内酯、丁二胺、胰岛素、亚麻酸、黄酮、转铁蛋白和纤黏连蛋白，搅拌20-40分钟，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，继续搅拌18-25分钟，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为4-7％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.0-7.3，灭菌温度为117-122℃，灭菌时间为18-23分钟，即得。
7.如权利要求6所述的无血清软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6％的氢氧化钠溶液。
8.如权利要求6所述的无血清软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2调节培养基的pH至7.1。
9.如权利要求6所述的无血清软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2灭菌温度为120℃。
10.如权利要求6所述的无血清软骨细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2灭菌时间为20分钟。
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