CN115197894A - 一种采用血清替代物培养cho细胞的方法 - Google Patents

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张文学
陈太标
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Abstract

本发明涉及一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，通过培养发现使用含血清替代物的培养基进行细胞培养，与传统的使用含血清培养基进行细胞培养相比，细胞在形态、倍增数、活率等方面都基本相同，能够达到细胞培养的要求；此外，本发明中所采用的血清替代物为非动物来源，其具有更好的安全性和稳定性，成本低，成分稳定可控，且不受国内外环境影响，能够保障稳定供货；同时其不仅能够避免血清不同批次间的质量差异，提高细胞培养实验结果的一致性；而且能够有效的避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，利于细胞生长和高效表达，表达水平能达到40‑60mg/ml；同时其与血清相比更利于下游纯化和加工，使得产品易于分离纯化，产品质量更高。

Description

一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法。
背景技术
目前已知的研究中，血清中虽然含有大量对细胞生长起作用的微量成分，这些成分包括营养物质(氨基酸、核苷、糖等)、肽生长因子、激素、无机物、脂类，但是它们的含量和作用还没有完全确定。此外，血清的具体成分还不明确，不能排除其中含有易变物质，使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态；且血清中还可能含有促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)的物质；亦或是含有一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；同时在血清取材过程中还可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，导致实验失败或实验结果不可靠性。
此外，血清制作过程复杂、批间差异大，成分不能保持一致使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品在生产中分离纯化工作很难完成。
因此找到一种有利于细胞培养的血清替代物至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的采用血清替代物培养CHO细胞的方法。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
本发明提供一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其包括如下步骤：
步骤(1)：在IMDM培养基内添加血清替代物，混匀后使用0.22um的滤器除菌过滤，得到无血清培养基；
步骤(2)：从工作细胞库中取1支CHO细胞液，置于水浴中摇动直至CHO细胞液全部融化；
步骤(3)：将融化的CHO细胞液在无菌条件下，加入到盛有预热的所述无血清培养基的离心管中，离心后，弃上清液，而后加入所述无血清培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液，并将细胞悬浮液加入到方瓶中，再加入所述无血清培养基进行培养。
步骤(4)：培养2-3天，达到细胞贴壁率以及细胞数量要求后，按一定传代比例进行传代至方瓶中。
优选的，所述步骤(1)中，所述无血清培养基的组分为：16-18g/L IMDM、4-5％血清替代物、(1-3)x10-6MMTX(注射用甲氨蝶呤)、2-4g/L碳酸氢钠。
优选的，所述血清替代物为充质干细胞。
优选的，所述步骤(2)中水浴温度为(37±1)℃。
优选的，所述步骤(2)中，CHO细胞液中工作细胞数量应达到(3-5)x106个。
优选的，所述步骤(3)中，预热的所述无血清培养基的用量为8-12ml。
优选的，所述步骤(3)中，进行细胞培养过程中，所述无血清培养基的用量为20-50ml。
优选的，所述步骤(3)中，离心机转速为800-1000rpm，离心时间为5-7分钟。
优选的，所述步骤(4)中，细胞贴壁率要求＞90％，细胞数量要求达到1x107个。
优选的，所述步骤(4)中，所述传代比例为1：5。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过培养发现使用含血清替代物的培养基进行细胞培养，与传统的使用含血清培养基进行细胞培养相比，细胞在形态、倍增数、活率等方面都基本相同，能够达到细胞培养的要求；此外，本发明中所采用的血清替代物为非动物来源，其具有更好的安全性和稳定性，成本低，成分稳定可控，且不受国内外环境影响，能够保障稳定供货；同时其不仅能够避免血清不同批次间的质量差异，提高细胞培养实验结果的一致性；而且能够有效的避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，利于细胞生长和高效表达，表达水平能达到40-60mg/ml；同时其与血清相比更利于下游纯化和加工，使得产品易于分离纯化，产品质量更高。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明提供的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其具体包括如下步骤：
步骤(1)：在IMDM培养基内添加血清替代物，混匀后使用0.22um的滤器除菌过滤，得到无血清培养基；其中，所述无血清培养基中的组分为：16-18g/LIMDM、4-5％血清替代物、(1-3)x10-6MMTX、2-4g/L碳酸氢钠；所述血清替代物具体为充质干细胞。
步骤(2)：从工作细胞库中取1支CHO细胞液，置于温度为(37±1)℃的水浴中摇动直至CHO细胞液全部融化；此时，CHO细胞液中工作细胞数量应达到(3-5)x106个。
步骤(3)：将融化的CHO细胞液在无菌条件下，加入到盛有预热的所述无血清培养基的离心管中，离心后，弃上清液，而后加入所述无血清培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液，并将细胞悬浮液加入到方瓶中，再加入所述无血清培养基进行培养；其中预热的所述无血清培养基的用量为8-12ml；进行细胞培养过程中，所述无血清培养基的用量为20-50ml；离心机转速为800-1000rpm，离心时间为5-7分钟。
步骤(4)：培养2-3天，细胞贴壁良好，细胞贴壁率＞90％，细胞数量达到1x107个后，按一定传代比例进行传代至方瓶中。
实验部分
步骤(1)：将IMDM培养基按17g/L浓度配置后，添加3g/L碳酸氢钠和2x10-6MMTX，再加入4％血清替代物，混匀后用0.22um滤器除菌过滤，得到无血清培养基。
步骤(2)：从工作细胞库中取1支CHO细胞液，立即置于37℃水浴，摇动直至全部融化；
步骤(3)：将融化的CHO细胞液在无菌条件下，快速加入到盛有10倍体积预热无血清培养基的15ml离心管中，立即以800-1000rpm的转速离心5-7分钟，弃上清液，而后加入无血清培养基重悬浮细胞，并将细胞悬浮液加入到T75方瓶中，再加入40ml无血清培养基进行培养；培养条件：方瓶置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养；
步骤(4)：培养2-3天，细胞贴壁面积达到90％传代，此时细胞数量能达到1x10*7个、按1：5传代比例进行传代至T75方瓶A\B。A瓶中加入含4％血清的含血清培养基进行培养，B瓶中加5％充质干细胞的无血清培养基进行培养；其中含血清培养基中除去血清外的其他组分，与本发明的无血清培养基除去充质干细胞外的组分均相同。
每天对A瓶和B瓶中的细胞形态进行拍照、贴壁90％进行传代计数，结果如下表1所示。
表1
Figure BDA0003737136350000041
Figure BDA0003737136350000051
通过上述表1的结果可知，通过培养发现使用血清替代物能够达到含血清培养在细胞形态、倍增数、活率基本相同，由此说明该血清替代物能够代替血清进行细胞培养。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。

Claims (10)

1.一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(1)：在IMDM培养基内添加血清替代物，混匀后使用0.22um的滤器除菌过滤，得到无血清培养基；
步骤(2)：从工作细胞库中取1支CHO细胞液，置于水浴中摇动直至CHO细胞液全部融化；
步骤(3)：将融化的CHO细胞液在无菌条件下，加入到盛有预热的所述无血清培养基的离心管中，离心后，弃上清液，而后加入所述无血清培养基重新悬浮细胞，得到细胞悬浮液，并将细胞悬浮液加入到方瓶中，再加入所述无血清培养基进行培养。
步骤(4)：培养2-3天，达到细胞贴壁率以及细胞数量要求后，按一定传代比例进行传代至方瓶中。
2.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述无血清培养基的组分为：16-18g/L IMDM、4-5％血清替代物、(1-3)x10- 6MMTX、2-4g/L碳酸氢钠。
3.根据权利要求1或2所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述血清替代物为充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中水浴温度为(37±1)℃。
5.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，CHO细胞液中工作细胞数量应达到(3-5)x106个。
6.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，预热的所述无血清培养基的用量为8-12ml。
7.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，进行细胞培养过程中，所述无血清培养基的用量为20-50ml。
8.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，离心机转速为800-1000rpm，离心时间为5-7分钟。
9.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，细胞贴壁率要求＞90％，细胞数量要求达到1x107个。
10.根据权利要求1所述的一种采用血清替代物培养CHO细胞的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述传代比例为1：5。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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