CN107164319A

CN107164319A - 一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN107164319A
Application number: CN201710380720.9A
Authority: CN
Inventors: 王丙云; 詹小舒; 詹贝莹; 陈志胜; 计慧琴; 陈胜锋
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Weisai (Foshan) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107164319B

Abstract

本发明提供了一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法。所述间充质干细胞来源于新生犬脐带，来源广泛，材料易得，使后期该细胞的大量生产和临床应用成为可能。本培养方法操作简单、重复性好，从中可获得较少的杂细胞和无污染的纯净间充质干细胞。培养方法中使用的胶原酶消化方法温和，对细胞的损害较少，能获得大量的具有较强增殖能力的间充质干细胞，可用于后续该细胞的建系、干细胞特性与治疗疾病等。

Description

一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化能力的成体干细胞，在特定条件下可定向分化为肌肉、软骨、血管、内皮和神经等多种细胞，是目前最具有临床应用前景的一类成体干细胞，已有多项研究证明其在心血管疾病、血液疾病、关节损伤等疾病的治疗中具有显著作用。而脐带来源的间充质干细胞具有材料易得、免疫原性低的优点，并且在疾病治疗中避免了伦理和道德上的争议，具有广阔的市场前景。犬作为日渐受人们欢迎的宠物，其疾病的治疗技术发展迅速，然而对于如关节炎、神经损伤和肾脏损伤等疾病目前仍无有效治疗药物，间充质干细胞的治疗为此提供了一个新的思路。

目前，对人类间充质干细胞的研究较为深入，但对犬脐带间充质干细胞的研究却鲜有报道。为深入研究犬脐带间充质干细胞在重大疾病治疗上的应用，高效的分离和培养方法显得尤为重要。

发明内容

为了克服常见方法分离间充质干细胞过程中的缺点和不足，本发明提供一种分离和培养犬脐带间充质干细胞的方法，为其体外培养、建系和应用奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1)新生犬脐带的采集：

在幼犬刚从母体生出时用无菌器械剥离胎衣，剪取脐带，立即将脐带放入含10％双抗溶液的PBS缓冲溶液中；

2)从脐带中分离出富含间充质干细胞的胶质组织：

剪开脐带被膜，暴露出中间的管状结构，剔去动脉和静脉，剩余不含血液的中空乳白色管即为所需的管状组织；

3)清洗和剪碎组织块：

将分离到的管状组织依次分别置于含10％、5％、1％双抗溶液的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，然后转移到容器中，用组织剪将其剪至1mm³大小；

4)胶原酶消化：

向含有组织块的容器中加入约10倍体积的1％Ⅰ型胶原酶，置于37℃培养箱中消化12h以上；

5)扩增培养：

将消化后的液体用脐带间充质干细胞培养液稀释后过200目筛网，1200rpm离心5分钟，弃上清，加脐带间充质干细胞培养液吹打均匀后转移至培养皿中，以5％CO₂浓度、37℃环境于培养箱中培养。

进一步，还包括步骤：6)培养24h和72h后分别进行脐带间充质干细胞培养液换液，并根据间充质干细胞生长状况进行传代。

其中，步骤5所述的脐带间充质干细胞培养液由体积比为88％的人脐带间质干细胞完全培养基、10％的胎牛血清、1％的双抗溶液、1％的谷氨酰胺溶液组成。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中间充质干细胞来源于新生犬脐带，来源广泛，材料易得，使后期该细胞的大量生产和临床应用成为可能；

(2)本发明操作简单、重复性好，从中可获得较少的杂细胞和无污染的纯净间充质干细胞；

(3)本发明使用的胶原酶消化方法温和，对细胞的损害较少，能获得大量的具有较强增殖能力的间充质干细胞，可用于后续该细胞的建系、干细胞特性与治疗疾病等。

附图说明

图1是实施例4所得的生长曲线图；

图2是实施例5所得的鉴定结果图；

图3是实施例6所得的分化结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：(胶原酶法)

1)新生犬脐带的采集：

2)从脐带中分离出富含间充质干细胞的胶质组织：

3)清洗和剪碎组织块：

(3-1).将分离到的管状组织置于含10％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

(3-2).将步骤(3-1)中取出的管状组织置于含5％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

(3-3).将步骤(3-2)中取出的管状组织置于含1％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

(3-4).将步骤(3-2)中取出的管状组织转移到无菌100mL小烧杯中，用组织剪剪至1mm³大小；

4)胶原酶消化：

加入约10倍体积的1％Ⅰ型胶原酶，置于37℃培养箱中消化12h以上，至基本没有肉眼可见组织块；

5)扩增培养：

用脐带间充质干细胞培养液稀释后过200目筛网，1200rpm离心5分钟，弃上清，加脐带间充质干细胞培养液吹打均匀后转移至培养皿中，以5％CO₂浓度、37℃环境于培养箱中培养。

本实施例中所使用的试剂包括：

PBS缓冲溶液的配制配方为：

人脐带间质干细胞完全培养基购于Cyagen公司，商品号为：HUXUC-03011-440，根据使用说明将其配成脐带间充质干细胞培养液，配方为：

双抗溶液、血清均购于Hyclone公司

Ⅰ型胶原酶购于SIGMA公司。

实施例2：(胰蛋白酶法)

本实施作为对照例之一，其培养方法与实施例1的区别在于：

步骤4)加入约5倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃水浴锅中消化30min，不时摇晃，使消化液与组织块充分反应。

所述胰蛋白酶购于Hyclone公司。

实施例3：(组织块法)

本实施作为对照例之一，其培养方法与实施例1的区别在于，步骤4)和5)：

4-1)将剪细的脐带组织块切面朝下均匀铺于T25培养瓶底，然后底面朝上置于5％CO₂、37℃培养箱中培养30min；

4-2)取出培养瓶，加入1ml脐带间充质干细胞培养液(刚好没过瓶底，避免让组织块悬浮)，底面朝下置于5％CO₂、37℃培养箱中培养2h；

4-3)取出培养瓶，再加入2ml脐带间充质干细胞培养液，完全浸没组织块，底面朝下置于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

实施例4：绘制细胞生长曲线

(1)从实施例1～3中分别取生长良好的第三代犬间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

(2)将细胞稀释至3×10⁴/mL接种至24孔板中，每孔0.5mL，置于含5％CO₂，37℃培养箱中培养；

(3)每天同一时间随机抽取3孔细胞，用胰蛋白酶消化制成悬液后计数，每孔计三次取平均值；

(4)连续计数八天，根据计数结果，以细胞密度为纵坐标(个/mL)，时间为横坐标，绘制得到如图1所示的生长曲线图。

实施例5：免疫荧光鉴定：

(1)从实施例1～3中分别选取生长良好的第三代间充质干细胞，接种在明胶包被过的培养板上，使细胞贴壁12h，弃去培养基，用含5％FBS的PBS洗涤2次；

(2)加入4％多聚甲醛室温固定30分钟，去掉固定液，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(3)加入透化剂(0.2％Triton×100)，冰上孵育20分钟，弃去后用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(4)加入封闭液(含10％FBS的PBS)，37℃封闭1h，去掉封闭液，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(5)分别加入CD44、CD34、CD90三种表面标记蛋白的一抗，4℃避光孵育过夜，弃去液体后用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(6)分别加入FITC标记的相对应的二抗，4℃避光孵育30分钟，弃去液体，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(7)加入1μg/mL DAPI避光复染5分钟，弃去液体，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(8)加入抗荧光淬灭剂，在倒置荧光显微镜下观察染色结果并拍照得到如图2所示的鉴定结果图。

实施例6：选取生长状态良好的细胞进行成脂和成骨诱导分化

本实施例所需的试剂包括：

犬脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基配方：

犬间充质干细胞成脂诱导分化培养基配方：

(一)诱导成脂分化步骤：

(1)取按照实施例1方法制备的犬脐带间充质干细胞，待其培养至80％融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

(2)将细胞密度调整至2×104/cm²，加到六孔板中，每孔加2ml细胞悬液；

(3)置于37℃、5％CO₂条件下培养细胞，每3天换一次液；

(4)细胞达到100％汇合时，弃去孔内的培养基，用PBS冲洗2次，每孔加入2ml A液；

(5)培养三天后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入2ml B液

(6)培养24小时后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入2ml A液

(7)重复步骤(5)和(6)3-5次，最后将细胞养在B液中7天，每3天换一次液；

(8)油红O染色分析：弃去孔中培养液，用PBS清洗2次，加入2ml 4％甲醛溶液固定细胞30分钟；然后弃去液体，PBS清洗2次，用1ml油红O工作液染色30分钟后用PBS清洗2次，显微镜下观察并拍照。

(二)诱导成骨分化步骤：

(1)犬UC-MSC培养至80％融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

(2)将细胞密度调整至3×104/cm2，加到六孔板中，每孔加2ml细胞悬液；

(3)置于37℃、5％CO₂条件下培养24h后弃去原培养液，用PBS清洗2次后加入2ml成骨分化培养液；

(4)以后每3天换一次液，直至2-3周后进行茜素红染色分析；

(5)茜素红染色分析：弃去原有培养液，用PBS清洗2次后每孔加入2ml 4％甲醛溶液固定30分钟；然后弃去液体用PBS洗2次，加入1ml茜素红工作液反应五分钟后用PBS清洗2次，在光学显微镜下观察并拍照，得到如图3所示的分化结果图。

Claims

1.一种原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)新生犬脐带的采集：

2)从脐带中分离出富含间充质干细胞的胶质组织：

3)清洗和剪碎组织块：

将分离到的管状组织依次分别置于含10％、5％、1％双抗溶液的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，然后转移到烧杯中，用组织剪将其剪至1mm³大小；

4)胶原酶消化：

加入约10倍体积的1％Ⅰ型胶原酶，置于37℃培养箱中消化12h以上；

5)扩增培养：

2.根据权利要求1所述的原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤5所述的脐带间充质干细胞培养液由体积比为88％的人脐带间质干细胞完全培养基、10％的胎牛血清、1％的双抗溶液和1％的谷氨酰胺溶液组成。

3.根据权利要求1所述的原代培养犬脐带来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤5后还包括步骤：6)培养24h和72h后分别进行脐带间充质干细胞培养液换液，并根据间充质干细胞生长状况进行传代。