CN110229784A - 一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，属于肝细胞分离与纯化技术领域。该分离液是在William’sE培养基中添加以下成分：0.1％v/v‑1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L‑2.5mmol/L的L‑谷氨酰胺、1μg/L‑20μg/L的表皮生长因子、15mg/L‑20mg/L的氢化可的松、35μg/L‑45μg/L的***、0.5％v/v‑1％v/v的青链霉素、1％v/v‑10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL‑0.5g/mL的Nycodenz。本发明具有维持肝细胞正常渗透压、修复部分受损肝细胞和为肝细胞提供营养需求的优点。

Description

一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，属于肝细胞分离与纯化技术领域。
背景技术
原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可广泛用于基础研究与药物研发，包括肝脏研究、肝炎病毒研究，药物代谢及毒性研究。然而，分离原代肝细胞时，细胞活力受多种条件影响，包括肝组织新鲜程度、灌注时间、灌注溶液组成等，存在较大的批次差异。现有技术分离的原代肝细胞的细胞活力为45％-95％，这严重影响了基于原代肝细胞的实验研究及药物研发。
目前，去除死肝细胞的常规方法有两种，具体如下：
第一种方法，低速离心法。该方法的原理是基于活肝细胞与死细胞、细胞碎片的质量与密度不同，通过低速离心(约离心加速度50g)，活肝细胞以沉淀形式与上清中的细胞碎片和死细胞分离开。上述方法是肝细胞分离过程中常规的步骤，可以去除一部分的细胞渣和少量的死细胞，但是此方法去除效果有限而造成肝细胞活力偏低。
第二种方法，利用离心介质——Percoll或Ficoll400，将细胞悬液加到Percoll或Ficoll400之上，通过离心力，将活细胞沉降到梯度底部，死细胞留在介质之上。上述方法的原理是：只有活细胞有穿过介质的能力，然而死细胞会在样品与介质之间形成死细胞层，阻止活细胞的穿过。对于细胞量大、细胞活率低的样品，该方法去除死肝细胞的效率相对低。
鉴于此，有必要提供一种新的去除死肝细胞的分离液及利用其去除死肝细胞的方法，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，提供一种去除死肝细胞的分离液。本发明的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、***、青链霉素、胎牛血清和Nycodenz，具有维持肝细胞正常渗透压、修复部分受损肝细胞、为肝细胞提供营养需求的优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：0.1％v/v-1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、1μg/L-20μg/L的表皮生长因子、15mg/L-20mg/L的氢化可的松、35μg/L-45μg/L的***、0.5％v/v-1％v/v的青链霉素、1％v/v-10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL-0.5g/mL的Nycodenz。
本发明的各个原料介绍：
1、William’s E培养基，即威廉姆斯E培养基。现有技术中，William’s E培养基，主要用于肝细胞的长期细胞培养与分化状态维持。在本发明中，William’s E培养基作为基础培养基。
上述William’s E培养基可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为12551032；或者购自美国Sigma公司，货号为W1878；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-WE001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
2、ITS通用型培养添加剂
ITS是Insulin,Transferrin,SeleniumSolution的缩写，是一种通用型培养添加剂，含有胰岛素、人转运铁蛋白和***，可以促进多种细胞在低血清或无血清环境下的增殖。
5L当量含有：25mg胰岛素、25mg转运蛋白和25μg***。
20L当量含有：100mg胰岛素、100mg转运蛋白和100μg***。上述ITS通用型培养添加剂可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为41400045；或者购自美国Sigma公司，货号为I3146-5mL；或者购至立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-ITS001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
3、L-谷氨酰胺，英文名称为L-Glutamine，简称L-Gln，是谷氨酸的酰胺。谷氨酰胺可用于治疗胃及十二指肠溃疡、胃炎及胃酸过多，也用于改善脑功能。在本发明中，谷氨酰胺是重要的能量来源，参与蛋白合成与核酸代谢，可提高肝细胞活力与促进细胞生长。
上述谷氨酰胺可以市售购买，如购自美国ThermoFisher Scientific公司，货号为25030081；或者购自美国Sigma公司，货号为G7513；或者购自上海源培生物科技股份有限公司，货号为S210JV。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
4、表皮生长因子，英文名称为Epidermal Growth Factor，简称EGF，是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。表皮生长因子是一种小肽，由53个氨基酸残基组成。在本发明中，表皮生长因子用作促进肝细胞生长。
上述表皮生长因子可以市售购买，如购自美国R&D Systems公司，货号为236-EG；或者购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为PHG0311；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-EGF001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
5、氢化可的松，英文名称为Cortisol，是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，抗炎作用为可的松的1.25倍，也具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等。在本发明中，氢化可的松用作维持肝细胞分化状态。
上述氢化可的松可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-N0583；或者购自美国Sigma公司，货号为H0888。以上市售产品成分一样，可以达到同等效果。
6、***，英文名称是Dexamethasone，简称DXMS，又名氟美松、氟甲强的松龙、德沙美松，是糖皮质类激素。其衍生物有氢化可地松、***等，其药理作用主要是抗炎、抗毒、抗过敏、抗风湿，临床使用较广泛。在本发明中，***用作维持肝细胞分化状态。
上述***可以市售购买，如购自中国MCE公司，货号为HY-14648；或者购自美国Sigma公司，货号为D4902。以上市售产品成分一样，可以达到同等效果。
7、青链霉素，是青霉素和链霉素二者的混合物。青霉素和链霉素可分别作用于革兰阳性和革兰阴性细菌，其配合使用可预防细胞培养物的细菌污染。青霉素最初从青霉属真菌中纯化而来，通过直接干扰细菌细胞壁的周转，间接触发酶的释放，从而进一步改变细胞壁。链霉素最初从链霉菌中纯化而来。链霉素通过与细菌核糖体30S亚基结合，从而抑制蛋白质合成并导致细菌死亡。在本发明中，青链霉素用作抑制或杀死细菌。
上述青链霉素可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为15140163；或者购自美国Sigma公司，货号为V900929；或者购自以色列BiologicalIndustries公司，货号为03-031-1B。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
8、胎牛血清，英文全称是fetal calf serum，简称FBS，是血清中的一种，主要是来自剖腹产的胎牛。胎牛血清是在屠宰怀孕母牛的时候，通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛血清采自出生10至14天的小牛。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少；牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有如下作用：(1)提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。(2)提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。(3)有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。(4)是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。(5)起酸碱度缓冲液作用。(6)提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。在本发明中，胎牛血清用作为肝细胞提供短暂的营养支持，保护或修复肝细胞。
上述胎牛血清可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为10091148；或者购自以色列Biological Industries公司，货号为04-001-1A；或者购自美国Hyclone公司，货号为SH30079.03。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等效果。
9、Nycodenz
Nycodenz的中文名称为尼克登，其分子量为821，是非离子型的、对细胞无毒性的化合物，可用于细胞、细胞器、生物大分子、病毒等各种生物物质的分离或提纯。Nycodenz可进入死细胞内部，从而增加死细胞的密度，而活细胞的细胞膜完整，经过离心后，死细胞沉降到离心管底部，活细胞被排挤到到离心介质上方。目前仅有少量利用Nycodenz分离纯化活细胞的方法，但此类方法是否适用于活肝细胞分离及其效率尚无文献报道，有没有更为优异的分离液组成尚不得而知。
上述Nycodenz粉末可以市售购买，如购自挪威Axis-Shield公司，货号为1002424-1。
本发明的原理是：
本发明在William’s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、***、青链霉素、胎牛血清和Nycodenz。上述几种组分按照相应的配比进行组合，共同达到高效去除死肝细胞、维持肝细胞渗透压、为肝细胞提供短暂的营养支持、增加肝细胞活力、促进细胞生长、维持肝细胞分化状态、抑制或杀死细菌、保护或修复受损肝细胞等功效。
本发明的去除死肝细胞的分离液，相对于现有技术的低速离心法、Percoll法、Ficoll400法和常规Nycodenz法，可显著提升活肝细胞的回收效率、细胞活力以及肝细胞培养状态。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、1％v/v的青链霉素、5％v/v的胎牛血清和0.3g/mL的Nycodenz。
采用上述进一步的有益效果是：上述为最佳参数。采用上述参数得到的分离液的去除死肝细胞的效果最好。
进一步，所述William’s E培养基配方具体如下[1]：
采用上述进一步的有益效果是：William’s E培养基作为基础培养基，既为肝细胞提供基础的营养物质，也有利于维持肝细胞的渗透压。
更进一步，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
进一步，所述1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺由1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代。
采用上述进一步的有益效果是：较之L-谷氨酰胺，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的性能更稳定。
上述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽可以市售购买，如购自美国Thermo FisherScientific公司，货号为35050079。
进一步，所述1％v/v-10％v/v的胎牛血清由1％v/v-10％v/v的人血白蛋白替代。
采用上述进一步的有益效果是：采用人血白蛋白，可以替代胎牛血清的作用，起到稳定渗透压，保护细胞的作用，同时排除一些使用胎牛血清引入的不安全因素，如朊病毒、PERV病毒、人畜共患病原体、支原体、过敏源等。
上述人血白蛋白可以市售购买，如购自深圳市卫光生物制品股份有限公司，国药准字S20033032。
本发明的目的之二，提供利用上述去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法。本发明利用上述去除死肝细胞的分离液，进行去除死肝细胞的方法，具有细胞活力高、细胞得率高、处理细胞量大、细胞贴壁情况优异、肝细胞形态维持好的优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用上述去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心；
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力；
步骤5：原代肝细胞活细胞纯化
选取细胞活力小于80％的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL权利要求1-5任一项所述的去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
本发明的步骤4中，检测细胞活力的方法是：取20μL步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液，迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板***计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。采用台酚蓝染色液的原理是：死细胞的细胞膜不完整，台酚蓝可以进入，将死细胞染成蓝色；而活细胞的细胞膜完整，台酚蓝不能进入，因此活细胞不着色。
上述计数仪及可以市售购买，如购自美国ALIT Life Science公司，型号为BioTech。上述计数板为上述BioTech的配套耗材。
上述计数步骤也可利用血球计数板进行，血球计数板可以市售购买，如购自上海市求精生化试剂仪器有限公司，型号为量制沪字02270113。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述肝组织来源于鱼类、禽类、啮齿类动物、兔子、猪、狗、树鼩、猴子或者人体捐献材料中的一种或多种。
更进一步，所述鱼类为斑马鱼，所述禽类为鸡、鸭、鹅，所述啮齿类动物为大鼠、小鼠或豚鼠。
进一步，步骤1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。
进一步，步骤1中，所述灌注溶液II是在William’s E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/L Ⅳ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。
上述Ⅳ型胶原酶可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为C5138。
进一步，步骤2中，所述细胞筛的孔径为70μm；所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
采用上述进一步的有益效果是：细胞筛采用上述孔径，可以得到单细胞悬液。采用上述离心条件，可以沉降活肝细胞，去除一部分死肝细胞、肝非实质细胞及细胞碎片。
进一步，步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v-10％v/v胎牛血清；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
更进一步，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
更进一步，所述5％v/v-10％v/v胎牛血清由1％v/v-10％v/v人血白蛋白替代。
进一步，步骤4中，所述0.4％台酚蓝染色液是将0.4g台酚蓝固体溶解到100mL磷酸缓冲液中所得。
更进一步，所述磷酸缓冲液是由8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH值为7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存所得。
上述磷酸缓冲液溶液英文缩写为PBS，可以市售购买，如购自美国Hyclone公司，货号为SH30256.01。
进一步，步骤5中，所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为300g-800g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为50g-300g，温度为4℃，时间为5min。
更进一步，所述1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺由1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代。
更进一步，所述1％v/v-10％v/v的胎牛血清由1％v/v-10％v/v的人血白蛋白替代。
本发明的有益效果：
(1)本发明的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、***、青链霉素、胎牛血清和Nycodenz。上述几种组分按照相应的配比进行组合，共同达到高效去除死肝细胞、维持肝细胞渗透压、为肝细胞提供短暂的营养支持、增加肝细胞活力、促进细胞生长、维持肝细胞分化状态、抑制或杀死细菌、保护或修复受损肝细胞等功效。
(2)本发明利用上述去除死肝细胞的分离液进行死肝细胞的去除，具有细胞活力高、细胞得率高、处理细胞量大、细胞贴壁情况优异、肝细胞形态维持好的优点。
(3)本发明的去除死肝细胞的分离液，相对于Percoll法、Ficoll400法和常规Nycodenz法，可显著提升活肝细胞的回收效率、细胞活力以及肝细胞培养状态。
(4)本发明的去除死肝细胞的分离液，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
附图说明
图1为采用本发明实施例2的去除死肝细胞的方法，得到的肝细胞贴壁图。其中，细胞比例尺为50μm。
图2为对比例1中，采用现有技术的Ficoll400法，得到的肝细胞贴壁图。其中，细胞比例尺为50μm。
图3为对比例2中，采用现有技术的Percoll法，得到的肝细胞贴壁图。其中，细胞比例尺为50μm。
图4为对比例3中，采用现有技术的常规Nycodenz法，得到的肝细胞贴壁图。其中，细胞比例尺为50μm。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：0.1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、1μg/L的表皮生长因子、20mg/L的氢化可的松、35μg/L的***、1％v/v的青链霉素和0.25g/mL的Nycodenz，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
本实施例的利用上述去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的树鼩肝组织，用灌注溶液I灌注10min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在William’s E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.0，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心。其中，所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v胎牛血清；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液，迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板***计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。
步骤5：原代肝细胞活细胞纯化
分别选取细胞活力为约70％的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
其中，所述70％的单细胞悬液肝细胞的活细胞数不超过1×108个；活细胞数超过1×108个时，分离液体积等比例增加。所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为300g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
实施例2
本实施例的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/l的L-谷氨酰胺、10μg/l的表皮生长因子、18mg/l的氢化可的松、40μg/l的***、1％v/v的青链霉素、5％v/v的胎牛血清和0.3g/mL的Nycodenz，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
本实施例的利用上述去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的大鼠肝组织，用灌注溶液I灌注20min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注22min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在William’s E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心。其中，所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和8％v/v胎牛血清；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液，迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板***计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。
步骤5：原代肝细胞活细胞纯化
选取细胞活力为约60％的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
其中，所述70％的单细胞悬液肝细胞的活细胞数不超过1×108个；活细胞数超过1×108个时，分离液体积等比例增加。所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、0.8％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为500g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为200g，温度为4℃，时间为5min。
实施例3
本实施例的去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/l的L-谷氨酰胺、20μg/l的表皮生长因子、15mg/l的氢化可的松、45μg/l的***、0.5％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和0.5g/mL的Nycodenz，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
本实施例的利用上述去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的鸡肝组织，用灌注溶液I灌注30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在William’s E培养基中添加2mM氯化钙、15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.2，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心。其中，所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和10％v/v胎牛血清；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液，迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板***计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。
步骤5：原代肝细胞活细胞纯化
选取细胞活力为约50％的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
其中，所述70％的单细胞悬液肝细胞的活细胞数不超过1×108个；活细胞数超过1×108个时，分离液体积等比例增加。所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、20μg/L的表皮生长因子、20mg/L的氢化可的松、45μg/L的***、1％v/v的青链霉素和10％v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为800g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为300g，温度为4℃，时间为5min。
对比例1：与现有技术的Ficoll400法作对比
分别采用现有技术的Ficoll400法与本发明实施例2的方法，对原代肝细胞活细胞进行纯化，进行细胞活力与细胞得率的比较。
与本发明实施例2不同的是，现有技术的Ficoll400法的步骤5中，分离液是采用Ficoll400溶液，其它步骤均相同。该Ficoll400溶液是采用PBS配制的质量百分数为15％的Ficoll400溶液。
现有技术的Ficoll400法的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力约为60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液，分别轻轻加到9mL、15mL、30mL的质量百分数为15％的Ficoll400溶液之上，形成明显的两层溶液，离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。其中，所述离心的重力加速度为75g，温度为4℃，时间为5min。其中，所述15％Ficoll400溶液的配置方法为:称取15gFicoll400粉末(购置美国Sigma公司)，溶解到100mL的PBS溶液中，过滤除菌，4℃保存。
本发明实施例2的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力为约60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
将采用实施例2和现有技术的Ficoll400法得到的纯化后的活肝细胞，分别以1.5×105个细胞总数/cm2，接种到胶原包被的细胞培养皿中，培养6小时后，将铺板培养液去掉，加入肝细胞维持培养液，拍照。
实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的Ficoll法处理不同细胞量的细胞活力、细胞得率以及细胞培养状态的比较，如表1所示、图1和图2所示。
由表1可知，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于现有技术的Ficoll法，在细胞处理量、最终细胞活力、细胞得率上，具有显著的效果。
由图1和图2所示，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于现有技术的Ficoll法，细胞渣更少(见无细胞的空白处)、细胞贴壁能力显著提高，肝细胞形态的极化特性更明显。
表1实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的Ficoll法
处理不同细胞量的细胞活力与细胞得率的比较
备注：1、细胞活力：活细胞与总细胞的比例；2、细胞得率：纯化前的活细胞与纯化后的活细胞比例；3、所有数值为3次独立重复实验中的平均值±标准差。
对比例2：与现有技术的Percoll法作对比
分别采用现有技术的Percoll法与本发明实施例2的方法，对原代肝细胞活细胞进行纯化，进行细胞活力与细胞得率的比较。
与本发明实施例2不同的是，现有技术的Percoll法的步骤5中，分离液是采用Percoll溶液，其它步骤均相同。该Percoll溶液是采用PBS配制的质量百分数为33％的Percoll溶液。
现有技术的Percoll法的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力约为60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液，分别轻轻加到9mL、15mL、30mL质量百分数为33％的Percoll溶液之上，形成明显的两层溶液，离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。其中，所述离心的重力加速度为350g，温度为4℃，时间为25min。所述33％的Percoll溶液的配置方法是：量取33mL100％Percoll母液(购置于美国GE公司)，利用PBS溶液定容至100mL中，过滤除菌，4℃保存。
本发明实施例2的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力为约60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
将采用实施例2和现有技术的Percoll法得到的纯化后的活肝细胞，分别以1.5×105个细胞总数/cm2，接种到胶原包被的细胞培养皿中，培养6小时后，将铺板培养液去掉，加入肝细胞维持培养液，拍照。
实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的Percoll法处理不同细胞量的细胞活力、细胞得率以及细胞培养状态的比较，如表2所示、图1和图3所示。
由表2可知，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于现有技术的Percoll法，在细胞处理量、最终细胞活力、细胞得率上，具有显著的提高效果。
由图1和图3所示，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于现有技术的Percoll法，细胞渣更少(见无细胞的空白处)、细胞贴壁能力显著提高，肝细胞形态的极化特性更明显。
表2实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的Percoll法
处理不同细胞量的细胞活力与细胞得率的比较
备注：1、细胞活力：活细胞与总细胞的比例；2、细胞得率：纯化前的活细胞与纯化后的活细胞比例；3、所有数值为3次独立重复实验中的平均值±标准差。
对比例3：与现有技术的常规Nycodenz法(尼可登法)作对比
分别采用现有技术的常规Nycodenz法与本发明实施例2的方法，对原代肝细胞活细胞进行纯化，进行细胞活力与细胞得率的比较。
与本发明实施例2不同的是，现有技术的Nycodenz的步骤5中，分离液是采用Nycodenz溶液，其它步骤均相同。该Nycodenz溶液是：称取15gNycodenz用稀释液溶解后定容到50mL(30％Nycodenz)，0.22μm过滤，可4℃保存。所述稀释液成分为：0.85％(w/v)NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.4。。
现有技术的常规Nycodenz法的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力为约60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，，加入10mL 0.3g/mL Nycodenz溶液(30％的Nycodenz溶液)，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取0.3g/mL Nycodenz溶液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为800g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为300g，温度为4℃，时间为5min。
本发明实施例2的步骤5具体是：分别选取10mL细胞活力为约60％且细胞密度为2×105个/mL、2×106个/mL、2×107个/mL的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL上述去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
将采用实施例2和现有技术的常规Nycodenz法得到的纯化后的活肝细胞，分别以1.5×105个细胞总数/cm2，接种到胶原包被的细胞培养皿中，培养6小时后，将铺板培养液去掉，加入肝细胞维持培养液，拍照。
实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的常规Nycodenz法处理不同细胞量的细胞活力、细胞得率以及细胞培养状态的比较，如表3所示、图1和图4所示。
由表3可知，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于Nycodenz法，在最终细胞活力、细胞得率上，具有显著的提高效果。
由图1和图4所示，本发明实施例2的去除死肝细胞的方法相比于尼可登法，细胞渣更少(见无细胞的空白处)，说明细胞破碎少。
另外，目前仅有少量利用Nycodenz分离纯化活细胞的方法，但是否适用于活肝细胞分离及其效率尚无文献报道。可参考百度学术、pubmed、Soopat等学术和专利搜索引擎的搜索结果，目前尚无利用Nycodenz用于活肝细胞纯化的方法。而本发明实施例2在William’s E培养基中添加了ITS通用型培养添加剂、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、氢化可的松、***、青链霉素、胎牛血清和Nycodenz。上述几种组分按照相应的配比进行组合，共同达到高效去除死肝细胞、维持肝细胞渗透压、为肝细胞提供短暂的营养支持、增加肝细胞活力、促进细胞生长、维持肝细胞分化状态、抑制或杀死细菌、保护或修复受损肝细胞等功效。
表3实施例2的去除死肝细胞的方法与现有技术的常规Nycodenz法
处理不同细胞量的细胞活力与细胞得率的比较
备注：1、细胞活力：活细胞与总细胞的比例；2、细胞得率：纯化前的活细胞与纯化后的活细胞比例；3、所有数值为3次独立重复实验中的平均值±标准差。
总结：由对比例1-3可知，本发明的去除死肝细胞的分离液，相对于现有技术的Percoll法、Ficoll400法和常规Nycodenz法，可显著提升活肝细胞的回收效率、细胞活力以及肝细胞培养状态。
参考文献：
[1].Williams,G.M.and Gunn,J.M.(1974)Long term cell culture of adultrat liver epithelial cells.Exp.Cell Res.,89:139.
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种去除死肝细胞的分离液，其特征在于，是在William’s E培养基中添加以下成分：0.1％v/v-1.5％v/v的ITS通用型培养添加剂、1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺、1μg/L-20μg/L的表皮生长因子、15mg/L-20mg/L的氢化可的松、35μg/L-45μg/L的***、0.5％v/v-1％v/v的青链霉素、1％v/v-10％v/v的胎牛血清和0.25g/mL-0.5g/mL的Nycodenz。
2.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述去除死肝细胞的分离液，是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、1％v/v的青链霉素、5％v/v的胎牛血清和0.3g/mL的Nycodenz。
3.根据权利要求1或2所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
4.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-谷氨酰胺由1.5mmol/L-2.5mmol/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代。
5.根据权利要求1所述的去除死肝细胞的分离液，其特征在于，所述1％v/v-10％v/v的胎牛血清由1％v/v-10％v/v的人血白蛋白替代。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述的去除死肝细胞的分离液去除死肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并第一次离心；
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的第一次离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，第二次离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力；
步骤5：原代肝细胞活细胞纯化
选取细胞活力小于80％的单细胞悬液肝细胞，进行第三次离心，去掉上清，加入10mL权利要求1-5任一项所述的去除死肝细胞的分离液，轻轻重悬，再轻轻加入5mL铺板培养基，形成明显的两层溶液，第四次离心，取分离液与铺板培养基层之间的白色细胞层至50mL离心管中，加铺板培养基至50mL，轻轻颠倒混匀，第五次离心，取沉淀，即为纯化后的活肝细胞。
7.根据权利要求6所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤1中，所述肝组织来源于鱼类、禽类、啮齿类动物、兔子、猪、狗、树鼩、猴子或者人体捐献材料中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得；所述灌注溶液II是在William’sE培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min-60min，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。
9.根据权利要求6所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤2中，所述细胞筛的孔径为70μm；所述第一次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v-10％v/v胎牛血清；所述第二次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
10.根据权利要求6所述的去除死肝细胞的方法，其特征在于，步骤5中，所述铺板培养基是在William’s E培养基中添加以下成分：1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的***、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清；所述第三次离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min；所述第四次离心的重力加速度为300g-800g，温度为4℃，时间为20min；所述第五次离心的重力加速度为50g-300g，温度为4℃，时间为5min。
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