CN107430117A - 检测和定量IL‑13的方法和在诊断和治疗Th2相关疾病中的用途 - Google Patents

检测和定量IL‑13的方法和在诊断和治疗Th2相关疾病中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测和定量IL‑13的方法。施用还提供了诊断、选择和鉴定Th2相关疾病(2型相关疾病)患者的方法，该患者采用Th2途径抑制剂的某些治疗药(2型途径抑制剂)治疗。

Description

检测和定量IL-13的方法和在诊断和治疗Th2相关疾病中的 用途
相关申请的交叉引用
本申请权利要求2015年3月16提交的美国临时申请号62/133,693的优先权益，该申请在此完整引入作为参考。
序列表
本申请含有已经通过EFS网提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2016年3月9日创建的所述ASCII副本命名为P32675-WO_SL.txt并且大小为20,272比特。
技术领域
提供了检测和定量IL-13的方法。还提供了诊断、选择和鉴定Th2相关疾病患者的方法，该患者使用作为Th2途径抑制剂的某些治疗药治疗。
背景技术
白介素(IL)-13被视为是辅助T细胞2型(Th2)炎症的关键中介物，并且升高的IL-13水平已与多种疾病相关，包括但不限于哮喘、炎症性肠病、特发性肺纤维化(IPF)，慢性阻塞性肺病(COPD)和特应性皮炎和其他(Oh CK等人,Eur Respir Rev 19:46–54(2010)；FahyJV等人,Nat Rev Immunol 15:57-65[2015])。IL-13由许多细胞类型产生，包括Th2细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞以及气道上皮细胞和2型天然淋巴样细胞。IL-13与异二聚体受体IL-4Rα/IL-13Rα1结合，所述异二聚体受体也是IL-4的受体，并且激活STAT-6信号传导途径(Hershey GK,J Allergy Clin Immunol 111(4):677-90[2003])。在某些情况下，IL-13已经与哮喘的临床表现相关联，包括产生黏液、表皮下纤维化、产生IgE、平滑肌增生以及召集和活化炎性细胞(Hershey GK,J Allergy Clin Immunol 111(4):677-90[2003]；Fahy JV等人,Nat Rev Immunol 15:57-65[2015])。因为Th2炎症涉及除Th2细胞之外的几种细胞类型(包括2型天然淋巴样细胞(ILC2))的活性，“Th2炎症”最近在科学文献中更称作“2型炎症”。除Th2细胞之外，还已经将ILC2鉴定为重要的细胞因子(如IL-5和IL-13)源。因此，先前已经被鉴定为Th2细胞因子的细胞因子如IL-13和IL-5现在科学文献中也称作2型细胞因子。同样地，与这类细胞因子相关的疾病状态现在也称作2型驱动的疾病或2型相关疾病。参见，例如，Noonan等人,J.Allergy Clin Immunol.,132(3):567-574(2013)；Hanania等人,Thorax 70(8):748-56(2015)；和Cai等人,Bioanalysis 8(4):323-332(2016)。例如，科学文献中术语“2型哮喘”的使用反映了对哮喘理解的演化过程，并且以肺组织中高水平的白介素(包括IL-5和IL-13)为特征。因此，“Th2”和“2型”在本文中互换地使用。
IPF是病因学未知的特定形式的纤维化间质性肺炎，限于肺部并且以程度不同的间质纤维化为特征(Raghu G等人,Am J Respir Crit Care Med 183:788-824[2011])。多项观察支持IL-13在IPF病理学中的作用(Zhu Z等人,J Clin Invest 103:779-88[1999]；Lee CG等人,J Exp Med 194:809-22[2001]；Park SW等人,J Korean Med Sci 24:614-20[2009]；Chandriani S等人,J Immunol 193:111-9[2014])。相对于健康对照，来自IPF患者的肺组织和支气管肺泡灌洗液(BAL)中IL-13及IL-13受体的表达增加(Jakubzick C等人,Am J Pathol 164:1989-2001[2004]；Park SW等人,J Korean Med Sci 24:614-20[2009])。
IL-13作为关键病理遗传学组分的另一种Th2炎症相关疾病是特应性皮炎(AD)。一直在AD皮肤中报道IL-13的表达增加(Hamid Q等人,J Allergy Clin Immunol 98:225-31[1996]；Jeong CW等人,Clin Exp Allergy 33:1717-24[2003]；Tazawa T等人,ArchDermatol Res 295:459-64[2004]；Neis MM等人,J Allergy Clin Immunol 118:930-7[2006]； M等人,J Allergy Clin Immunol 132:361-70[2013]；ChoyDF等人,J Allergy Clin Immunol.130:1335-43[2012])并且一些报道提出IL-13表达和疾病严重程度之间的关系(La Grutta S等人,Allergy 60:391-5[2005])。因此，IL-13和其受体已经变成治疗哮喘、IPF和AD以及其他Th2相关疾病的治疗靶标(Corren J等人,N Eng JMed 365:1088-98[2011]；Scheerens H等人,Clin Exp Allergy 44:38–46[2014]；Beck LA等人,N Eng J Med 371:130-9[2014])。
IL-13已经在哮喘、IPF和AD的作用部位检出，所述的作用部位包括支气管活检样品、肺活检样品、诱导痰、BAL、鼻灌洗液、鼻咽抽吸物和皮肤活检样品。结果显示Th2炎症相关疾病患者中IL-13水平升高，并且这类升高的IL-13水平使这些患者与健康对照相区分(Fitzpatrick AM等人,J Allergy Clin Immunol 125；851–7.e18[2010]；Becker AB,JAllergy Clin Immunol 109；S533–8[2002]；Jakubzick C等人,Am J Pathol 164:1989-2001[2004]；Noah TL等人,Ann Allergy Asthma Immunol 96:304–10[2006]；Feleszko W等人,J Allergy Clin Immunol 117:97–102[2006]；Eickmeier O等人,Cytokine 50:152–157[2010])。然而，直接气道和皮肤采样需要侵入性或不便的采集手术。相反，外周血是轻易可及的组织并且采集它的过程侵入性更低的过程。因为IL-13的循环水平一般低并且因为难以测量这些低水平，故而缺少对循环型IL-13水平如何与疾病作用部位的水平相关的理解。因此，需要高度灵敏的和高度特异的血清IL-13测定法，以表征Th2-驱动的疾病中的循环型IL-13水平，旨在促进我们对IL-13促成疾病机制的理解。
用于治疗哮喘和其他Th-2相关疾病的大量药物已上市或处于开发中。哮喘和Th2相关疾病的靶标包括细胞因子如IL-13、IL-17、IL-5和IL-4及其受体以及与过敏相关的靶标如IgE。治疗哮喘的示例性上市治疗性分子和处于开发中的治疗性候选物包括但不限于奥马珠单抗(靶向可溶性IgE)(参见，例如，Chang等人,J Allergy ClinImmunol.117(6):1203–12(2006)；Winchester等人,N.Engl.J.Med.355(12):1281–2(2006)；Brodlie等人,Arch Dis Child.97(7):604–9(2012)；Bousquet等人,Chest 125(4):1378–86(2004)；Schulman,ES,Am J Respir Crit Care Med.164(8Pt 2):S6–11(2001)；Chang等人,Adv Immunol.93:63–119(2007)),lebrikizumab(靶向IL-13)(参见，例如，Corren等人(2011)N Engl J Med 365:1088-98；Scheerens等人(2012)Am J RespirCrit Care Med 185:A3960；Jia等人(2012)J Allergy Clin Immunol 130:647-654 e10；WO 2012/083132),mepolizumab(靶向IL-5)(参见，例如，Haldar等人,N Engl JMed.2009Mar 5；360(10):973-84；Nair等人,N Engl J Med.2009 Mar 5；360(10):985-93；Pavord等人,Lancet 380(9842):651–659,doi:10.1016/S0140-6736(12)60988-X)、quilizumab(靶向膜结合型IgE)(参见，例如，美国专利公开号2013/0243750)和dupilimab(靶向IL-4Rα受体)(参见，例如，Beck LA等人,N Eng J Med 371:130-9[2014])。
尽管人哮喘常视作特征为气道中2型细胞因子表达和嗜酸粒细胞性炎症的过敏性疾病，但就气道炎症而言，它明确地不均一。基因组方法已经鉴定了哮喘性气道中与2型细胞因子表达和嗜酸粒细胞性炎症的程度相对应的不均一基因表达模式。这些基因表达模式已经导致鉴定不需要支气管镜检查或痰诱导的嗜酸粒细胞性气道炎症的候选生物标志物。参见，例如，WO 2009/124090、WO 2012/083132和PCT/US2014/061759。近年来，靶向2型气道炎症的中介物的候选生物制品疗法已经在中度-重度哮喘患者中通过临床研究取得进展。血清骨膜蛋白(periostin)、呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide，FENO)和血液嗜酸性粒细胞计数属于已经作为潜在预示性和药效动力学生物标志物出现的那些生物标志物，所述生物标志物可以在靶向IL-13、IL-5和IgE的生物制品疗法的临床研究中就临床获益而富集。Arron等人,2013,DOI:10.1513/AnnalsATS.201303-047AW。
尽管如上文讨论的这类生物标志物已经展示出鉴定或许更可能对特定治疗性疗法有反应的哮喘患者的潜力，但迄今没有一个这类生物标志物已经过验证并由监管当局批准用于这种用途。此外，先前鉴定的生物标志物可能具有与其使用相关的某些实际局限性和混杂因素，如需要测量生物标志物的特殊装置、显著的患者内或患者间变异性，或生物标志物水平可能在发育期间(例如与成人水平相比，儿童水平)变动或可能随伴同用药变动。另外，尚未鉴定到经临床验证的诊断标志物，例如，生物标志物，所述标志物使得临床医务人员或其他人能够精确地确定哮喘和其他Th2相关疾病的病理生理方面、临床活动度、预测治疗反应、预后或疾病形成风险。因此，随着哮喘患者和Th2相关疾病患者寻求治疗，目前存在涉及探究有效用于特定患者的治疗药的可观试验和误差。这类试验和误差经常涉及可观的患者风险和不适，旨在找到最有效的疗法。
因此，持续需要鉴定新的生物标志物，所述生物标志物有效确定哪些哮喘患者和患有其他Th2相关疾病例如但不限于、特应性皮炎、变应性鼻炎、鼻息肉病、嗜酸性粒细胞食管炎、高嗜酸性粒细胞综合征、COPD或IBD的患者将对哪种治疗有反应并持续需要将这类决定并入哮喘患者和其他Th2相关疾病患者的更有效治疗方案。此外，可以利用有统计学和有生物学意义和可重复的关于这类生物标志物与疾病状态的信息，作为鉴定特定患者亚群的努力的组成部分，其中预期所述的特定患者亚群将从特定治疗药的治疗显著获益，例如，其中该治疗药在这个特定患者亚群中具有治疗益处或已经在临床研究中显示其具有治疗益处。
如上文提到，IL-13的循环水平(血清水平)通常低并且因此，难以用目前可用的方法测量。目前可用的方法包括多种不同的免疫测定方法，如市售的酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于珠的多重测定法，包括使用被描述为超灵敏的平台的二种测定法：来自的的平台(Alameda,CA)和来自QuanterixTM的SimoaTM平台(Lexington,MA)(Fischer等人,AAPS Journal 17:93-101[2015])。使用此类测定法，科学文献报道了用于特应性个体、哮喘个体和健康对照的广泛类型的循环IL-13水平，报道范围从低pg/mL至亚pg/mL水平。此外，关于Th2炎性疾病患者中相对于健康对照而言IL-13水平是否彼此间相似(Silvestri等人,Clin.Exp.Allergy 36:1373[2006]；Pukelsheim K等人,PLoS One 5:e14299[2010]；Doucet J等人,Dis Markers 35:465-74[2013])或升高(Lee YC等人,J Asthma 38:665-71[2001]；Gauvreau GM等人,Am J Resp Crit Care 183:1007–14[2011]；Doucet J等人,Dis Markers 35:465-74[2013])，存在矛盾的数据。
一种血清IL-13测定法由St.Ledger等人,J.Imm.Methods 350:161-70(2009)描述并且最初报告为高度灵敏。从按商品名称市售的这种免疫测定方法使用专有的单克隆抗IL-13抗体、顺磁微粒子和集成检测单个分子的数字式计数***的专化仪器平台(上文)。然而，一份后续出版物显示， IL-13免疫测定方法受基质干扰影响并且基质干扰的程度显著地影响灵敏度以及特异性。Fraser S等人,Bioanalysis6:1123-9(2014)。这份后续报道提供了0.3pg/mL的修订定量下限(LLOQ)(上文)，大约五倍距初始报告的灵敏度差异。最近已经市售了 IL-13测定法的新版本，2版，据报道所述测定法具有0.04pg/mL的LLOQ( IL-13(v2)免疫测定试剂盒，目录号03-0109-xx，产品信息表在www.singulex.com可获得)。然而，不可公开获得涉及特异性的信息。另外，使用定制测定体系的研究者报道了0.1pg/mL的LLOQ，但在20-60％的受验哮喘样品和健康对照样品中不能检出IL-13。Gaye等人,J.Immunol.Methods 426:82-85(2015)。此外，SimoaTM IL-13免疫测定法的产品说明报道了0.0114pg/mL的LLOQ，但是没有提供关于特异性的信息(SimoaTM IL-13免疫测定法产品信息表，在www.quanterix.com可获得)。本领域公认，必须仔细评价超灵敏平台如和SimoaTM平台的特异性。参见上文和Fisher等人,AAPS Journal 17:93-101(2015)。特别地对于超灵敏平台，需要确保检测到的信号是分析物的“真实”量值。因此，重要的是通过竞争或免疫耗竭步骤展示信号的特异性并显示抑制特异性信号的能力。Fisher等人,AAPSJournal 17:93-101(2015)。因此，仍需要IL-13测定法既高度灵敏，又高度特异。
本文所述的本发明符合上述某些需求并提供其他益处。
本文中提到的全部参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用的方式完整并入本文用于任何目的。
概述
如本文所述，本发明至少部分地提供IL-13免疫测定方法，所述免疫测定方法高度灵敏，在超过98％的受检样品中检出飞克(femtogram)/mL水平的IL-13，并且高度特异。本文中还提供这样的方法，所述方法使用这类高度灵敏和高度特异的免疫测定方法以选择或鉴定血清IL-13水平升高的患者，所述患者更可能对作为Th2途径抑制剂(也称作2型途径抑制剂)的治疗性疗法有反应，以及鉴定更可能遭受重度加重(exacerbation)的哮喘患者。
因此，在一个方面，提供用于检测和定量样品中IL-13的高灵敏度和高特异性免疫测定方法。在某些实施方案中，样品是生物样品。在某些实施方案中，样品是血清。在某些实施方案中，样品是人血清。在一些实施方案中，确定灵敏度作为定量下限(LLOQ)。在某些实施方案中，LLOQ在0.1fg/mL和35fg/mL之间或在约0.1fg/mL和约35fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在1fg/mL和30fg/mL之间或在约1fg/mL和约30fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在5fg/mL和25fg/mL之间或在约5fg/mL和约25fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在10fg/mL和20fg/mL之间或在约10fg/mL和约20fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ是14fg/mL或约14fg/mL。
在另一个方面，提供夹心免疫测定方法，所述方法包括特异性结合IL-13的第一单克隆捕获抗体和特异性结合IL-13的第二单克隆检测抗体，其中第一抗体与第二抗体结合不同的表位。在一些实施方案中，通过抗原耗竭方法(也称作免疫耗竭方法)确定特异性，其中耗竭方法包括在进行免疫测定方法之前将样品与过量的第一抗体温育。在某些这类实施方案中，彻底地耗竭样品中的抗原，因而产生低于免疫测定方法中LLOQ的信号。在一些实施方案中，样品包含可溶性IL-13Rα2，可溶性IL-13Rα2不干扰免疫测定方法的灵敏度或特异性。
在又一个方面，免疫测定方法包含第一抗体，所述第一抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L3。在一些实施方案中，第一抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。在某些实施方案中，第一抗体是抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为F(ab’)2或Fab的抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为Fab、F(ab’)2、Fab'或Fv的抗体片段。在一些实施方案中，免疫测定方法包含第二抗体，所述第二抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:13的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。在一些实施方案中，第二抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区。
在又一个方面，免疫测定方法还包含第三抗体，其中第三抗体与第二抗体特异性结合并且可检测地标记。在一些实施方案中，第二抗体用半抗原标记并且第三抗体是抗半抗原抗体。在一些实施方案中，半抗原是洋地黄毒甙(digoxigenen)并且抗半抗原抗体是与萦光乳胶缀合的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。
如本文中提供的方法和诊断治疗可以应用于患有哮喘、嗜酸粒细胞性疾病、呼吸***疾病、IL-13介导的疾病、Th2相关疾病和/或IgE介导的疾病，或与这些疾病相关的症状的患者。可以根据本文提供的方法治疗患有哮喘样症状的患者，包括尚未诊断患有哮喘的患者。
根据一个实施方案，根据本文提供的方法治疗的患者患有哮喘、嗜酸粒细胞性疾病、呼吸***疾病，IL-13介导的疾病、Th2相关疾病(2型相关病症)和/或IgE介导的疾病、或与这些疾病相关的症状。根据另一个实施方案、根据本文提供的方法治疗的患者罹患哮喘、嗜酸粒细胞性疾病、呼吸***疾病、IL-13介导的疾病、Th2相关疾病和/或IgE介导的疾病或与这些疾病相关的症状，并且年龄是2岁或更大、12岁或更大、18岁或更大、19岁或更大、在2岁和18岁之间、在2岁和17岁之间、在12-17岁之间、在12岁和18岁之间、在2岁和75岁之间、在12岁和75岁之间或在18岁和75岁之间。
在一些实施方案中，提供了鉴定哮喘患者或Th2相关疾病(2型相关疾病)患者的方法，所述患者可能对Th2途径抑制剂治疗有反应。在一些实施方案中，该方法包括与参比水平相比，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，确定患者是否具有升高的IL-13水平，其中升高的IL-13表示患者可能对Th2途径抑制剂治疗有反应。
在一些实施方案中，提供了鉴定可能遭受重度加重的哮喘患者或呼吸***疾病患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括与参比水平相比，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，确定患者是否具有升高的IL-13水平，其中升高的IL-13表示患者可能遭受重度加重加重。在一些实施方案中，这些方法包括：从患者获得生物样品，测量IL-13水平，将样品中检测到的IL-13水平与参比水平比较，当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比升高时，预测患者可能遭受重度加重。在一些实施方案中，这些方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中的IL-13；(b)将(a)中测量的IL-13水平与参比水平比较；和(c)当(a)中测量的IL-13水平高于参比水平时，鉴定患者为更可能遭受重度加重。在一些实施方案中，参比水平是参比群体中IL-13的中位水平。
在一些实施方案中，提供了监测正在用Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)治疗的哮喘患者或Th2相关疾病(2型相关疾病)患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，确定患者是否具有升高的IL-13水平。在一些实施方案中，该方法还包括确定Th2途径抑制剂的治疗方案。在一些此类实施方案中，确定IL-13水平提示继续Th2途径抑制剂疗法或停止Th2途径抑制剂疗法。
在本文所述的任何实施方案中，方法可以包括以下步骤：a)使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，确定从患者获得的样品中IL-13的水平；和b)将步骤a)中确定的IL-13水平与参比水平比较。在一些实施方案中，这些方法还包括c)基于步骤b)中获得的比较结果，将所述患者分层为反应者或非反应者类别。在一些实施方案中，一种方法还包括如果患者是反应者，则选择包含Th2途径抑制剂的疗法。
在一些实施方案中，提供了预测患有哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的患者对疗法的反应的方法，所述疗法包含Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)。在一些实施方案中，该方法包括从患者获得生物样品并使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，测量样品中的IL-13水平。在一些实施方案中，该方法包括将样品中检测到的IL-13水平与参比水平比较。在一些实施方案中，该方法包括当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比升高时，预测患者将对疗法有反应，并且当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比降低时，预测患者将对疗法无反应。
在一些实施方案中，提供了预测哮喘患者或Th2相关疾病(2型相关疾病)患者对Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)治疗的反应性的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，测量来自患者的生物样品中的IL-13水平。在一些实施方案中，与参比水平相比，升高的IL-13水平鉴定患者为一名可能对Th2途径抑制剂治疗有反应的患者。
在一些实施方案中，提供了将患有哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的患者鉴定为可能对包含Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)的疗法有反应的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，测量来自患者的生物样品中的IL-13水平。在一些实施方案中，该方法还包括将测量的IL-13水平与参比水平比较。在一些实施方案中，该方法包括当测量的IL-13水平高于参比水平时，鉴定患者为更可能对包含Th2途径抑制剂的疗法有反应。
在一些实施方案中，提供了治疗患有哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的患者的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，测量来自患者的生物样品中的IL-13水平。在一些实施方案中，该方法包括将测量的IL-13水平与参比水平比较。在一些实施方案中，该方法包括当测量的IL-13水平高于参比水平时，鉴定患者为更可能对包含Th2途径抑制剂的疗法有反应。在一些实施方案中，该方法包括当测量的IL-13水平高于参比水平时，施用该疗法，因而治疗哮喘或Th2相关疾病。
在一些实施方案中，一种治疗患者的哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的方法包括向患者施用治疗有效量的Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)，其中使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，已经确定从患者获得的生物样品具有升高的IL-13水平。
在一些实施方案中，一种治疗患者的哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的方法包括向患者施用治疗有效量的Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)，其中使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，已经基于从患者获得的生物样品中升高的IL-13水平选择患者用于治疗。
在本文所述的任何实施方案中，参比水平可以是参比群体中IL-13的中位数(median)、平均值(mean)或平均水平。在本文所述的任何实施方案中，参比水平可以是参比群体中IL-13的中位水平。在本文所述的任何实施方案中，参比水平可以是参比群体中IL-13的平均值水平。在本文所述的任何实施方案中，参比水平可以是参比群体中IL-13的平均水平。非限制性示例性参比群体包括哮喘患者、中度至重度哮喘患者、特发性肺纤维化患者、特应性皮炎患者、健康个体和包括健康个体和任何前述患者的组。在一些实施方案中，参比群体包含中度至重度哮喘患者。其他的非限制性示例性参比群体包括患有Th2相关疾病如哮喘、特应性皮炎、特发性肺纤维化、变应性鼻炎、纤维化、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克隆病、慢性阻塞性肺病和肝纤维化的患者。
在一些实施方案中，如果IL-13的水平高于参比水平，则将患者分层为反应者类别。
在一些实施方案中，生物样品选自血液、血清、血浆。在一些实施方案中，生物样品是血清。在一些实施方案中，生物样品是血浆。在一些实施方案中，生物样品从哮喘患者获得。在某些实施方案中，根据上文所述方法的患者正罹患中度至重度哮喘。在某些实施方案中，哮喘或呼吸***疾病在使用皮质类固醇时未得到控制。在某些实施方案中，皮质类固醇是吸入型皮质类固醇。在某些实施方案中，吸入型皮质类固醇是 或在一个实施方案中，还正在用第二控制剂治疗患者。在某些实施方案中，第二控制剂是长效支气管扩张剂(LABD)。在某些实施方案中，LABD是长效β-2激动剂(LABA)、白三烯受体拮抗剂(LTRA)、长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA)、茶碱或口服皮质类固醇(OCS)。在某些实施方案中，LABD是PerforomistTM或
在本文所述的任何实施方案中，患者可以是0-17岁、2-17岁、2-6岁、6-11岁、8-17岁、12-17岁、2岁或更大、6岁或更大、或12岁或更大。在一些实施方案中，患者为18岁或更大。在本文所述的任何实施方案中，患者可以是人。
在本文所述的任何实施方案中，Th2途径抑制剂可以抑制以下靶标：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗(mepolizumab)，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab，INN编号910649-32-0)；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如，XOLAIR、QGE-031；MEDI-4212；quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，或者是CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。
在本文所述的任何实施方案中，Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)是IL-13抑制剂、抑制IL-13和IL-4二者的药剂、抑制IL-13和IL-17二者的药剂或抗IgE结合剂。在本文所述的任何实施方案中，Th2途径抑制剂是抗IL-13抗体。在某些实施方案中，抗IL-13抗体是包含VH和VL的抗体，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；是包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13抗体，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗(lebrikizumab)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，向患者每四周施用固定剂量(flat dose)为37.5mg、或125mg或250mg的抗IL-13抗体或来金珠单抗。在一些实施方案中，皮下施用抗IL-13抗体。在一些实施方案中，使用预充式注射器或自动注射器装置施用抗IL-13抗体。
在某些实施方案中，抗IL-13抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗IL-13抗体是还结合IL-4的双特异性抗体。在某些实施方案中，抗IL-13抗体是还结合IL-17的双特异性抗体。在一些实施方案中，抗IL-13双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；或包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案中，Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)是抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体。在一些实施方案中，抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列；和包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-17VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的氨基酸序列；和包含含有VH和VL的抗IL-17VH/VL单元，所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案中，Th2途径抑制剂可以是抗IgE抗体。在某些实施方案中，抗IgE抗体是(i)抗体或(ii)包含重链可变区和轻链可变区的抗IgE抗体，其中重链可变区是SEQ ID NO:22和轻链可变区是SEQ ID NO:23。
在一个实施方案中，用本发明Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)治疗的患者还用一种、两种、三种或更多种治疗药治疗。在一个实施方案中，患者是哮喘患者。根据一个实施方案，用Th2途径抑制剂和一种、两种、三种或更多种治疗药治疗患者，其中除Th2抑制剂之外，至少一种治疗药是皮质类固醇、白三烯拮抗剂、LABA、皮质类固醇/LABA联用组合物、茶碱、色甘酸钠、奈多罗米钠、奥马佐单抗、LAMA、MABA、5-脂加氧酶活化蛋白(FLAP)抑制剂或酶PDE-4抑制剂。根据本发明的一个方面，将Th2途径抑制剂施用至诊断为具有升高的IL-13的哮喘患者，其中诊断包括使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法。在又一个实施方案中，在治疗之前，哮喘患者在使用皮质类固醇时未得到控制。在另一个实施方案中，还正在用第二控制剂治疗哮喘患者。在一个实施方案中，第二控制剂是皮质类固醇、LABA或白三烯拮抗剂。在又一个实施方案中，哮喘患者正罹患中度至重度哮喘。因此，在一个实施方案中，用Th2途径抑制剂待治疗的患者是用Th2途径抑制剂治疗之前使用皮质类固醇时未控制并且随后用Th2途径抑制剂和一种、两种、三种或更多种控制剂治疗的中度至重度哮喘患者。在一个实施方案中，至少一种控制剂是皮质类固醇。在又一个实施方案中，用Th2途径抑制剂、皮质类固醇和另一个控制剂治疗这种患者。在另一个实施方案中，该患者患有轻度哮喘，但是并未正在用皮质类固醇治疗。应当理解，各治疗药可以具有与Th2抑制剂相比而不同的治疗周期，并且因此与Th2抑制剂相比，可以在不同时间施用作为患者治疗的部分。因此，根据一个实施方案，本发明的治疗方法包括步骤：向患者施用Th2途径抑制剂和任选地，施用至少一种、两种或三种额外的治疗药。在一个实施方案中，Th2途径抑制剂存在于含有另一种治疗药的组合物中。在另一个实施方案中，Th2途径抑制剂不存在于含有另一种治疗药的组合物中。
根据另一个实施方案，本发明包含一种用于治疗哮喘的方法，所述方法包括将抗IL-13抗体作为固定剂量施用，所述抗IL-13抗体包含VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。在一个实施方案中，将抗IL-13抗体按37.5mg的固定剂量(即，不依赖体重)或125mg的固定剂量或250mg的固定剂量通过皮下注射施用，每4周一次。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者诊断为具有升高的IL-13。在一些实施方案中，将患者额外地诊断为具有一种或多种Th2相关生物标志物的升高水平，所述生物标志物选自骨膜蛋白、FeNO、嗜酸性粒细胞和IgE。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者诊断为具有升高的IL-13和升高的血液嗜酸性粒细胞水平。在一些实施方案中，确定血液嗜酸性粒细胞水平为300个细胞/微升或以上。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者诊断为具有升高的IL-13、升高的血清骨膜蛋白和升高的血液嗜酸性粒细胞水平。在一些实施方案中，确定血液嗜酸性粒细胞水平为300个细胞/微升或以上。
根据另一个实施方案，将抗IL-13抗体按足以减少患者随时间推移加重的比率或改善FEV1的治疗有效量施用以治疗哮喘，所述抗IL-13抗体包含VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。在又一个实施方案中，本发明包含一种用于治疗哮喘的方法，所述方法包括将抗IL-13抗体作为37.5mg的固定剂量(即，不依赖体重)、或125mg的固定剂量、或250mg的固定剂量施用，所述抗IL-13抗体包含VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。在某些实施方案中，通过每4周一次皮下注射，施用该剂量，持续一段时间。在某些实施方案中，该时间段是6个月、一年、两年、五年、十年、15年、20年或患者终生。在某些实施方案中，哮喘是重度哮喘并且患者在使用吸入型皮质类固醇加第二控制药物未充分得到控制或未控制。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者诊断为具有升高的IL-13并且选择该患者以便用如上文所述的抗IL-13抗体治疗。在另一个实施方案中，该方法包括用如上文所述的抗IL-13抗体治疗哮喘患者，其中使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，事先诊断所述患者具有升高的IL-13。在一些实施方案中，将患者额外地事先诊断为具有一种或多种Th2相关生物标志物的升高水平，所述生物标志物选自骨膜蛋白、FeNO、嗜酸性粒细胞和IgE。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者事先诊断为具有升高的IL-13和升高的血液嗜酸性粒细胞水平。在一些实施方案中，确定血液嗜酸性粒细胞水平为300个细胞/微升或以上。在一些实施方案中，使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者事先诊断为具有升高的IL-13、升高的血清骨膜蛋白和升高的血液嗜酸性粒细胞水平。在一些实施方案中，确定血液嗜酸性粒细胞水平为300个细胞/微升或以上。
本发明提供作为Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)的治疗药用于治疗患者的哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)，其中患者具有通过使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法所确定的升高的IL-13水平。在一些实施方案中，Th2途径中要抑制的靶标选自：IL-9、IL-5、IL-13、IL-4、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体、IL-4受体α、IL-13受体α1和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2、FcεRI和FcεRII/CD23(IgE的受体)。在一个实施方案中，根据本发明方法待治疗的患者正罹患轻度至重度哮喘，任选地中度至重度哮喘，并且其哮喘在使用皮质类固醇时未得到控制。
在另一个方面，提供了测量从哮喘患者获得的样品中IL-13水平的试剂盒将哮喘患者分层/分类为针对Th2途径抑制剂治疗性疗法的可能反应者和非反应者的用途。在某些实施方案中，该用途包括步骤：(a)使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法确定从哮喘患者获得的样品中IL-13的水平；(b)将步骤(a)中确定的IL-13水平与参比水平比较；和(c)基于步骤(b)中获得的比较结果，将所述患者分层为反应者或非反应者类别。
在某些实施方案中，根据上文使用的Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)抑制以下靶标：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗(mepolizumab)，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab，INN编号910649-32-0)；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如，XOLAIR、QGE-031；MEDI-4212；quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，或者是CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。
在又一个方面，提供了测量从哮喘患者或Th2相关疾病(2型相关疾病)患者获得的生物样品中IL-13水平的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含指令，所述指令用于(i)使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法测量IL-13水平，(ii)将IL-13的水平与参比水平比较，和(iii)基于比较结果，将所述患者分层为反应者或非反应者类别。在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种或至少三种抗体。在一些实施方案中，试剂盒包含特异性结合IL-13的第一单克隆捕获抗体和特异性结合IL-13的第二单克隆检测抗体，其中第一抗体与第二抗体结合不同的表位。在一些实施方案中，试剂盒包含第一抗体，所述第一抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L3。在一些实施方案中，第一抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。在某些实施方案中，第一抗体是抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为F(ab’)2或Fab的抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为Fab、F(ab’)2、Fab'、或Fv的抗体片段。在一些实施方案中，免疫测定方法包含第二抗体，所述第二抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。在一些实施方案中，第二抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ IDNO:12的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区。在一些实施方案中，试剂盒包含包含第三抗体，其中第三抗体与第二抗体特异性结合并且可检测地标记。在一些实施方案中，第二抗体用半抗原标记并且第三抗体是抗半抗原抗体。在一些实施方案中，半抗原是洋地黄毒甙并且抗半抗原抗体是与萦光乳胶缀合的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。在某些实施方案中，试剂盒包含包装插页，所述包装插页含有描述上文所提供用途的信息。
在又一个方面，提供了诊断患者中哮喘亚型的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法确定从患者获得的血清样品中IL-13的水平；和(2)用于测量血清样品中IL-13水平的指令，其中升高的IL-13表达水平表示哮喘亚型。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于确定哮喘患者或Th2相关疾病(2型相关疾病)患者是否具有升高的IL-13水平的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于确定哮喘患者或Th2相关疾病患者是否可能对Th2途径抑制剂有反应的包装插页。在某些实施方案中，试剂盒还包含包装插页，所述包装插页含有描述上文所提供的任何用途的信息。在一些实施方案中，试剂盒还包含容纳生物样品的空容器。在一些实施方案中，试剂盒包含用于确定IL-13水平的试剂。
在又一个方面，提供了治疗患有哮喘或Th2相关疾病(2型相关疾病)的患者的方法，所述方法包括向诊断为具有升高的循环型IL-13水平的患者施用Th2途径抑制剂(2型途径抑制剂)。在某些实施方案中，这些方法包括以下步骤：使用上文概述部分中描述的任意IL-13免疫测定方法，将患者诊断为具有升高的IL-13水平。在某些实施方案中，这些方法还包括步骤：如果确定患者具有升高的循环型IL-13水平，则用Th2途径抑制剂再治疗该患者。在某些实施方案中，来自患者的血清或血浆用来确定患者是否具有升高的循环型IL-13水平。
在本文所述的任何实施方案中，除IL-13水平之外，确定一种或多种Th2相关生物标志物(类2型相关生物标志物)的水平。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是骨膜蛋白。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是血清骨膜蛋白。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是FeNO。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是血液嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，额外的Th2相关生物标志物是IgE。
附图简述
图1.如实施例2中所述那样评估 IL-13测定法的灵敏度和特异性。与过量分析用捕获抗体预温育(右侧)或不预温育(左侧)的情况下，测量来自哮喘患者的血清样品(n＝10)。与过量分析用捕获抗体预温育的情况下，更高的IL-13值(n＝4)保持高于LLOQ。点线表示生产商推荐的LLOQ，0.39pg/mL。
图2A和图2B。如实施例2中所述，测定法改良措施改善了 IL-13免疫测定法的特异性，但未改善其灵敏度。图2A显示遵循生产商的标准方案(图2A，左侧，HV)和与捕获抗体包被的过量微粒子预温育后(图2A，右侧，HV+捕获Ab)测量的三份健康志愿者(HV)血清样品。图2B显示用高盐缓冲液1:1(V/V)稀释后(图2B，左侧，HV)和与捕获抗体包被的过量微粒子预温育后(图2B，右侧，HV+捕获Ab)测量的相同三份HV血清样品。在图2A和图2B每一者中的短划线代表LLOQ。注意，与图2A中的LLOQ相比，修改了图2B中的LLOQ以解释样品的高盐缓冲液1:1(V/V)稀释。
图3.修改的分析条件改善了 IL-13免疫测定法的特异性，但削弱了检测人血清样品中天然IL-13的能力，如实施例2中所述。在不进行或进行捕获抗体包被的过量微粒子预温育的情况下，测量来自HV(n＝10)、哮喘患者(n＝10)和IPF患者(n＝10)的血清样品。点线显示修改的 IL-13免疫测定法的LLOQ为0.78pg/mL。
图4.如实施例3中所述的IMACT IL-13测定法的特异性。在与(右侧，血清+捕获Ab)或不与(左侧、血清)过量的分析用第一捕获抗体预温育的情况下，测量来自健康志愿者和不同Th2相关疾病患者(总计n＝101)的血清。点线显示IMPACT IL-13测定法的LLOQ为0.014pg/mL。
图5.依据如实施例3中所述的IMPACT IL-13测定法的血清IL-13水平。显示来自HV(N＝50)、哮喘患者(n＝34)、IPF患者(n＝32)和特应性皮炎患者(n＝25)的样品的各个值以及每个组的中位数。点线显示IMPACTIL-13测定法的LLOQ为0.014pg/mL。进行Mann-Whitney检验以分别比较HV和哮喘、IPF或特应性皮炎之间的均数。**表示每个比较的P值是<0.0001。
图6.如实施例4中所述的基线(第0周)血清IL-13水平与血液嗜酸性粒细胞计数、血清骨膜蛋白、FeNO和血清IgE水平的相关性。每个比较的斯皮尔曼等级相关系数(ρ)以相应的散布图指示。
图7A和图7B。如实施例4中所述，与FEV1基线相比依据IL-13状态的第12周时平均百分数变化。图7A显示血清IL-13高组中(血清IL-13处于或高于基线时中位数的那些个体)安慰剂和三个剂量组(每4周37.5mg来金珠单抗、每4周125mg来金珠单抗或每4周250mg来金珠单抗)每一者的结果；图7B显示血清IL-13低组中(血清IL-13低于基线时中位数的那些个体)安慰剂和三个剂量组(每4周37.5mg来金珠单抗、每4周125mg来金珠单抗或每4周250mg来金珠单抗)每一者的结果。
图8.如实施例4中所述，安慰剂对照时间期间血清IL-13高组(左侧4根条柱)中和血清IL-13低组(右侧4根条柱)中的哮喘加重率。灰色箭头显示三个剂量组(每4周37.5mg来金珠单抗、每4周125mg来金珠单抗或每4周250mg来金珠单抗)中每个组的来金珠单抗(LEB)相对于安慰剂所观测的加重率降低(百分数)(95％CI)。
发明详述
本文中提到的全部参考文献，包括专利申请和出版物，通过引用的方式完整并入本文用于任何目的。
除非另外定义，否则本文中所用的技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)为本领域技术人员提供了本申请中所用多个术语的一般性指南。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适宜的任何时候，以单数使用的术语还将包括复数形式并且反之亦然。在下文所述的任何定义与通过引用方式并入本文的任何文献矛盾的情况下，下文所述的定义应当为主。
除非上下文另外清楚地说明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，例如，对“一种蛋白质”或“一种抗体”的引用分别包括多种蛋白质或多种抗体；对“一个细胞”的指称包括包括细胞的混合物等。
本说明书和所附权利要求书中所提供的范围包括两个终点和这些终点之间的全部点。因此，例如，2.0至3.0的范围包括2.0、3.0和2.0和3.0之间的全部点。
术语“检测”在本文中以最广的含义用来包括靶标分子的定性和定量测量。检测包括鉴定样品中靶标分子的单纯存在以及确定靶标分子是否在样品中以可检测水平存在。
“捕获抗体”指与样品中靶标分子特异性结合的抗体。在某些条件下，捕获抗体与靶标分子形成复合物，从而抗体-靶标分子复合物可以与样品的其余部分分离。在某些实施方案中，这种分离可以包括洗去样品中不结合捕获抗体的物质或材料。在某些实施方案中，捕获抗体可以接合至固相支持物表面，如，例如但不限于平板或珠。
“检测抗体”指与样品中或样品-捕获抗体组合材料中，靶标分子特异性结合的抗体。在某些条件下，检测抗体与靶标分子或靶标分子-捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够通过可以被放大的标记物直接检出，或例如通过使用经标记(例如，可检测标记)并结合检测抗体的另一种抗体间接地检出。对于直接标记，检测抗体一般与通过某些手段(例如包括但不限于生物素或钌)，与可检测的部分缀合。
术语“标记物”或“可检测标记物”指可以与待检测或定量的物质(例如，抗体)连接的任何化学基团或部分。一般而言，标记物是适于灵敏检测或定量物质的可检测标记物。可检测标记物的例子包括但不限于发光标记物，例如，萦光、磷光、化学发光、生物发光和电化学发光标记物、放射性标记物、酶、颗粒、磁性物质、电活性种类等。备选地，可检测标记物可以通过参与特异性结合反应，表示其存在。这类标记物的例子包括半抗原、抗体、生物素、链霉抗生物素蛋白、his标签、氨三乙酸、谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽等。
术语“检测手段”指用来通过测定法中随后读出的信号报告过程，检测可检测抗体存在的部分或技术。一般，检测手段利用放大固定化标记物如微量滴定板上捕获到的标记物(例如，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白-HRP)的试剂。
“光致发光”指某材料吸收光后该材料藉此发光的过程(又称作电磁辐射)。萦光和磷光是二个不同类型的光致发光。“化学发光”过程包括通过化学反应产生发光种类。“电化学发光”或“ECL”是某个种类(例如，抗体)在该种类在适宜的周围化学环境下暴露于电化学能量时籍此发光的过程。
术语“灵敏度”指测定法检出分析物的能力。在一个实施方案中，灵敏度由“定量下限”或LLOQ定义。LLOQ是样品中可以按合适精度和准确度定量测定的分析物的最低量。如本文所用，“高灵敏度”意指测定法能够检出亚pg/mL水平的分析物。在一个实施方案中，测定法能够检测fg/mL水平的分析物。
术语“特异性”指测定法在相似或相关分子存在下仅检出目的分析物的能力。如本文所用，在实施如本文所述的测定法之前进行抗原竞争或免疫耗竭时，当某测定法中至少10份样品受检、或至少20份样品受检、或至少30份样品受检、或至少50份样品受检并且受检的全部样品中至少90％、或至少95％、或100％的分析信号处于或低于LLOQ时，该测定法具有“高特异性”。在一些实施方案中，测定法能够在一种或多种不相关分子存在下仅检出目的分析物，其中所述不相关分子与目的分析物相比，可以按更高浓度存在。
在某些实施方案中，术语“处于参比水平”指来自个体或患者的样品中基本上与参比水平相同或与下述水平相同的生物标志物水平，所述水平与参比水平差异直至1％、直至2％、直至3％、直至4％、直至5％。在一些实施方案中，参比水平是参比群体中生物标志物的中位水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均值水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均水平。非限制性示例性参比群体包括哮喘患者、中度至重度哮喘患者、特发性肺纤维化患者、特应性皮炎患者、健康个体和包括健康个体和任何前述患者的组。
在某些实施方案中，术语“高于参比水平”指如与参比水平相比，通过本文所述的方法确定，来自个体或患者的样品中高于参比水平至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％或更多的生物标志物水平。在一些实施方案中，参比水平是参比群体中的中位水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均值水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均水平。非限制性示例性参比群体包括哮喘患者、中度至重度哮喘患者、特发性肺纤维化患者、特应性皮炎患者、健康个体和包括健康个体和任何前述患者的组。
在某些实施方案中，术语“低于参比水平”指如与参比水平相比，通过本文所述的方法确定，来自个体或患者的样品中低于参比水平至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％或更多的生物标志物水平。在一些实施方案中，参比水平是参比群体中的中位水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均值水平。在一些实施方案中，标志物的参比水平是参比群体中标志物的平均水平。非限制性示例性参比群体包括哮喘患者、中度至重度哮喘患者、特发性肺纤维化患者、特应性皮炎患者、健康个体和包括健康个体和任何前述患者的组。
术语“标志物”和“生物标志物”互换地用来指分子、包含基因、蛋白质、糖类结构、或糖脂、代谢物、mRNA、miRNA、蛋白质、DNA(cDNA或基因组DNA)、DNA拷贝数、或表观改变，例如，增加、减少、或改变DNA甲基化(例如，胞嘧啶甲基化、或CpG甲基化、非-CpG甲基化)；组蛋白改良(例如，(去)乙酰化、(去)甲基化、(去)磷酸化、遍在蛋白化、小遍在蛋白化修饰(SUMOylation)、ADP-核糖基化)；改变核小体定位、可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测哺乳动物组织或细胞中的或其上的表达或存在，并且其可以是哺乳动物细胞或组织对基于Th2途径抑制的治疗方案的敏感性的预测，诊断和/或预后，使用例如本文所述的Th2途径抑制剂。生物标志物也可以是可在获自个体的生物样品测量的生物学或临床属性，例如，但不限于血细胞计数，例如血液嗜酸性粒细胞计数、FEV1或FeNO。在某些实施方案中，确定这种生物标志物的水平高于或低于参比群体的观测水平。在某些实施方案中，血液嗜酸性粒细胞计数是200/μl、或250/μl、或300/μl、或400/μl。
术语“比较”指比较来自个体或患者的样品中的生物标志物水平与本说明书中他处指定的生物标志物参比水平。应当理解，比较通常指比较相应的参数或值，例如，将绝对量与绝对参比量比较，同时将浓度与参比浓度比较，或从样品中生物标志物获得的强度信号比较与从参比样品获得的相同类型的强度信号比较。可以手工地实施比较或借助计算机辅助进行比较。因此，可以通过计算装置(例如，本文公开的***)实施比较。来自个体或患者的样品中测量或检测到的生物标志物水平和参比水平的值可以例如彼此比较并且可以通过计算机程序执行用于该比较的算法，自动地实施所述比较。实施所述评价的计算机程序将以合适的输出格式提供所需的评估。对于计算机辅助比较，可以将所确定量的值与对应于合适参比的值比较，所述参比由计算机程序存储在数据库中。计算机程序还可以评价比较的结果，即自动地以合适的输出格式提供所需的评估。对于计算机辅助比较，可以将所确定量的值与对应于合适参比的值比较，所述参比由计算机程序存储在数据库中。计算机程序还可以评价比较的结果，即自动地以合适的输出格式提供所需的评估。
术语“测量”生物标志物的水平指使用本文他处描述的适宜检测方法，对生物标志物定量，例如旨在确定样品中生物标志物的水平。
术语“监测疗法的有效性”用来表示，在疗法之前和/或接受疗法时至少一次从患者获得(包括连续获得)样品，并且测量其中的一种或多种生物标志物以获得该疗法有效与否的指示。
在监测疗法的有效性时，测量一种或多种生物标志物的水平并且在一些实施方案中将其与生物标志物的参比水平比较，或在一些实施方案中，与较早时间点获自相同患者的样品中生物标志物的水平比较。在一些实施方案中，在所述患者中启用疗法之前，将一种或多种生物标志物的当前水平与获自相同患者的样品中生物标志物的水平比较。
短语“推荐治疗”指使用生成的信息或数据确定某患者为适合用Th2途径抑制剂治疗或不适合用其治疗，其中所述信息或数据与该患者的样品中本文所述的一种或多种生物标志物的水平或存在相关。短语“推荐治疗”可以指使用针对患者提议或选择包含Th2途径抑制剂的疗法所生成的信息或数据，其中将所述患者鉴定为或选择为或多或少可能对包含Th2途径抑制剂疗法有反应。使用或生成的信息或数据可以处于任何形式，书面、口头或电子形式。在一些实施方案中，使用生成的信息或数据包括通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合。在一些实施方案中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由计算装置、分析装置或其组合执行。在一些其他实施例中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由实验室或医学专业人员执行。在一些实施方案中，信息或数据包括本文所述的一种或多种标志物的水平与参比水平的比较。在一些实施方案中，信息或数据包括以下指示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂的疗法治疗，在一些情况下包括这样的提示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂(如抗IL-13抗体或抗IgE抗体)的疗法治疗。
短语“选择患者”或“鉴定患者”指使用生成的信息或数据确定或选择患者为更可能从包含Th2途径抑制剂的疗法获益或更不可能从其中获益，其中所述信息或数据与患者的样品中本文所述的一种或多种标志物的水平相关。使用或生成的信息或数据可以处于任何形式，书面、口头或电子形式。在一些实施方案中，使用生成的信息或数据包括通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合。在一些实施方案中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由计算装置、分析装置或其组合执行。在一些其他实施例中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由实验室或医学专业人员执行。在一些实施方案中，信息或数据包括本文所述的一种或多种标志物的水平与参比水平的比较。在一些实施方案中，信息或数据包括以下指示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂的疗法治疗，在一些情况下包括这样的提示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂(如抗IL-13抗体或IgE抗体)的疗法治疗。
短语“选择疗法”指使用生成的信息或数据确定或选择患者的疗法，其中所述信息或数据与患者的样品中本文所述的一种或多种标志物的水平或存在相关。在一些实施方案中，疗法可以包含Th2途径抑制剂。使用或生成的信息或数据可以处于任何形式，书面、口头或电子形式。在一些实施方案中，使用生成的信息或数据包括通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合。在一些实施方案中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由计算装置、分析装置或其组合执行。在一些其他实施例中，通报、呈递、报告、存储、发送、转移、供应、传输、分配或其组合由实验室或医学专业人员执行。在一些实施方案中，信息或数据包括以下指示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂的疗法治疗，在一些情况下包括这样的提示：患者适合或不适合用包含Th2途径抑制剂(如抗IL-13抗体或IgE抗体)的疗法治疗。
术语“生物样品”包括但不限于、血清、血浆、外周血单核细胞(PBMC)、痰、组织活检样品(例如，肺样品)和鼻样品，包括鼻拭子或鼻息肉。样品可以在治疗之前、治疗期间或治疗后取得。样品可以取自疑似患有或诊断为患有哮喘或Th2相关疾病并且因此或许需要治疗的患者或取自不怀疑患有任何病症的正常个体。在一些实施方案中，生物样品是血清。在一些实施方案中，生物样品是血浆。
FENO测定法指测量FENO(吸入的一氧化氮级分)水平的测定法。可以例如使用手持式便携式装置NIOX (Aerocrine,Solna,瑞典)，根据美国胸科学会(ATS)2005年公开的指南，评价这类水平。FENO可以按相似方式标注，例如，FeNO或FENO，并且应当理解全部这类相似的变型具有相同的意思。
根据本文提供的方法待检验或治疗的患者的年龄包括：全部年龄。在一些实施方案中，岁龄是18+岁。在一些实施方案中，岁龄是12+岁。在一些实施方案中，岁龄是2+岁。在一些实施方案中，岁龄是2-18岁、12-18岁、18-75岁、12-75岁或2-75岁。
“哮喘”是一种复杂病症，其特征在于可能与基础性炎症相关或可能与之不相关的可变和复发症状、可逆性气流阻塞(例如，由支气管扩张剂可逆转)和支气管高反应性。哮喘的例子包括阿司匹林敏感性/恶化的哮喘、特应性哮喘、严重哮喘、轻度哮喘、中度至重度哮喘、未用过皮质类固醇的哮喘、慢性哮喘、皮质类固醇耐药性哮喘、皮质类固醇难治性哮喘、新诊断和未治疗过的哮喘、因吸烟所致的哮喘、皮质类固醇无法控制的哮喘和如J AllergyClin Immunol(2010)126(5):926-938中所提到的其他哮喘。
IL-13介导的疾病意指与过量的IL-13水平或活性相关的疾病，其中非典型症状可以因IL-13水平或活性在体内局部和/或全身性表现。IL-13介导的疾病的例子包括：癌(例如，非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克隆病)、肺炎性疾病(例如，肺纤维化如IPF)、COPD、肝纤维化。
IL-4介导的疾病意指与过量的IL4水平或活性相关的疾病，其中非典型症状可以因IL4水平或活性在体内局部和/或全身性表现。IL4介导的疾病的例子包括：癌(例如，非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克隆病)、肺炎性疾病(例如，肺纤维化如IPF)、COPD、肝纤维化。
IL-5介导的疾病意指与过量的IL5水平或活性相关的疾病，其中非典型症状可以因IL5水平或活性在体内局部和/或全身性表现。IL5介导的疾病的例子包括：癌(例如，非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克隆病)、肺炎性疾病(例如，肺纤维化如IPF)、COPD、肝纤维化。
IL-9介导的疾病意指与过量的IL9水平或活性相关的疾病，其中非典型症状可以因IL9水平或活性在体内局部和/或全身性表现。IL9介导的疾病的例子包括：癌(例如，非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克隆病)、肺炎性疾病(例如，肺纤维化如IPF)、COPD、肝纤维化。
TSLP介导的疾病意指与过量的TSLP水平或活性相关的疾病，其中非典型症状可以因TSLP水平或活性在体内局部和/或全身性表现。TSLP介导的疾病的例子包括：癌(例如，非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤)、特应性皮炎、变应性鼻炎、哮喘、纤维化、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克隆病)、肺炎性疾病(例如，肺纤维化如IPF)、COPD、肝纤维化。
IgE介导的疾病意指与过量的IgE水平相关的疾病，其中非典型症状可以因IgE水平在体内局部和/或全身性表现。这疾病包括哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎、纤维化(例如，肺纤维化，如IPF)。
哮喘样症状包括选自以下的症状：气短、咳嗽(痰产量和/或痰性质和/或咳嗽频率的变化)、哮鸣、胸闷、支气管收缩和归因于上述症状之一或这些症状组合的夜间苏醒(Juniper等人(2000)Am.J.Respir.Crit.CareMed.,162(4),1330-1334)。
术语“呼吸道疾病”包括但不限于，哮喘(例如，变应性和非过敏性哮喘(例如，归因于感染，例如，因呼吸道合胞体病毒(RSV)，例如，在幼儿中))；支气管炎(例如，慢性支气管炎)；慢性阻塞性肺病(COPD)(例如，气肿(例如，香烟所致气肿))；涉及气道炎症、嗜酸粒细胞增多症、纤维化和过多粘液产生的病状，例如，囊性纤维化、肺纤维化和变应性鼻炎。可以依据气道炎症、气道分泌物过多和气道阻塞特征的疾病的例子包括哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张症和囊性纤维化。
加重(常称作哮喘发作或急性哮喘)是发生以下病状的新近或进行性增加发作：气短、咳嗽(痰产量和/或痰性质和/或咳嗽频率的变化)、哮鸣、胸闷、归因于上述症状之一或这些症状组合的夜间苏醒。加重经常以呼气流量(PEF或FEV1)下降为特征。然而，PEF变异性通常在加重期间不增加，不过它可以增加，从而导致加重至多或从加重恢复期间。加重的严重程度是从轻微至危及生命并且可以基于症状和肺功能来评价。如本文所述的重度哮喘加重包括导致以下任一项或其组合的加重：住院接受哮喘治疗、使用大剂量皮质类固醇(例如，连续三天或更长时间每日皮质类固醇总剂量加四倍或每日总剂量大于或等于500微克FP或等同物)，或使用口服/肠胃外皮质类固醇。
Th2途径抑制剂，也称作2型途径抑制剂，是抑制Th2途径的药剂。Th2途径抑制剂的例子包括选自以下的任一种靶标的活性的抑制剂：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗(mepolizumab)，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab、INN编号910649-32-0；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33、可溶性IgE(例如，XOLAIR、QGE-031；MEDI-4212)和膜结合型IgE(quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)和CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。前述靶标的抑制剂的例子在例如，WO2008/086395；WO2006/085938；US 7,615,213；US 7,501,121；WO2006/085938；WO 2007/080174；US 7,807,788；WO2005007699；WO2007036745；WO2009/009775；WO2007/082068；WO2010/073119；WO2007/045477；WO2008/134724；US2009/0047277；和WO2008/127,271)中公开。
本文中提供的治疗药包括可以与上文所鉴定的靶标结合的药剂结合，该药剂例如可以与蛋白质或核酸分子结合的多肽(例如，抗体、免疫黏附素或肽体(peptibody))、适体或小分子，所述蛋白质或核酸分子可以与编码本文中鉴定的靶标的核酸分子结合(即，siRNA)。
“抗IL-13/IL4途径抑制剂”指抑制IL-13和/或IL-4信号传导的治疗药。抗IL-13/IL4途径抑制剂的例子包括IL-13和/或IL4与其受体相互作用的抑制剂，这类抑制剂包括但不限于抗IL-13结合剂、抗IL4结合剂、抗IL3/IL4双特异性结合剂、抗IL4受体α结合剂、抗IL-13受体α1结合剂和抗IL-13受体α2结合剂。特别包括可以结合IL-13、IL4(包括具有结合IL-13的单结构域和结合IL4的单结构域的双特异性抗体)、IL-13Rα1、IL-13Rα2或IL-4Rα的单结构域抗体作为抑制剂。应当理解，包括可以结合多于一种靶标的分子。
“抗IL4结合剂”指与人IL-4结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，结合剂以1uM–1pM之间的亲和力与人IL-4序列结合。抗IL4结合剂的具体例子可以包括可溶性IL4受体α(例如，与人Fc区融合的IL4受体胞外结构域)、抗IL4抗体和可溶性IL-13受体α1(例如，与人Fc区融合的IL-13受体α1胞外结构域)。
“抗IL4受体α结合剂”指与人IL4受体α结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，结合剂以1uM–1pM之间的亲和力与人IL-4受体α序列结合。抗IL4受体α结合剂的具体例子可以包括抗IL4受体α抗体。
“抗IL-13结合剂”指与人IL-13结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，结合剂以1uM–1pM之间的亲和力与人IL-13序列结合。抗IL-13结合剂的具体例子可以包括抗IL-13抗体、与人Fc融合的可溶性IL-13受体α2、与人Fc融合的可溶性IL4受体α、与人Fc融合的可溶性IL-13受体α。根据一个实施方案，抗IL-13抗体包含VH和VL，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3，其中相应的HVR具有SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是来金珠单抗。根据一个实施方案，抗体是IgG1抗体。根据另一个实施方案，抗体是IgG4抗体。根据一个实施方案，IgG4抗体在其恒定结构域中包含S228P突变。在一个实施方案中，抗IL-13抗体在其重链可变区包含Q1E突变。在一个实施方案中，抗IL-13抗体在其轻链可变区包含M4L突变。
抗IL-13受体α1结合剂”指与人IL-13受体α1特异性结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，结合剂以1uM–1pM之间的亲和力与人IL-13受体α1序列结合。抗IL-13受体α1结合剂的具体例子可以包括抗IL-13受体α1抗体。
“抗IL-13受体α2结合剂”指与人IL-13受体α2特异性结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，结合剂以1μM–1pM之间的亲和力与人IL-13受体α2序列结合。抗IL-13受体α2结合剂的具体例子可以包括抗IL-13受体α2抗体。
“抗IgE结合剂”指与人IgE特异性结合的药剂。这类结合剂可以包括小分子、适体或多肽。这类多肽可以包括但不限于选自免疫黏附素、抗体、肽体和肽的多肽。根据一个实施方案，抗IgE抗体包含重链可变区和轻链可变区的，其中重链可变区是SEQ ID NO:22和轻链可变区是SEQ ID NO:23。。根据一个实施方案，抗IgE抗体是抗体。
“Th2相关疾病”在本文中与“2型相关疾病”互换使用并且是这样的一种疾病，其涉及辅助T细胞2型(Th2)和炎症并且可以包括其他病理学特征和临床特征如纤维化或产生黏液，与Th2细胞因子例如包括(但不限于IL-4、IL-5、IL-9、和IL-13)相关。这类细胞产生的额外免疫和/或炎性细胞和细胞因子、酶和其他炎症介质(例如，组胺、类胰蛋白酶、白三烯、IgE)可能有助于炎症和/或疾病体征和症状。这类额外的免疫和/或炎性细胞包括但不限于Th17细胞、2型天然淋巴样细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和产生IgE的B细胞。Th2相关疾病(本文也称作2型相关疾病)的例子包括哮喘、特应性哮喘、过敏性哮喘、重度哮喘、特应性皮炎、变应性鼻炎(包括季节性变应性鼻炎)、食物超敏反应、荨麻疹、大疱性皮肤病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性支气管肺曲霉菌病、小肠吸收不良(celiac disease)、Churg-Strauss综合征(结节性动脉周围炎伴特应性)、嗜酸粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸性粒细胞综合征、水肿反应(包括发作性血管水肿)、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性胃炎、嗜酸粒细胞性胃肠炎、嗜酸粒细胞性肠炎和嗜酸粒细胞性结肠炎、显微镜下鼻息肉和息肉病、炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克隆病)、硬皮病、纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肺炎性疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝纤维化、心内膜心肌纤维化、慢性支气管炎、支气管扩张症、囊性纤维化和恶性肿瘤，例如，与Th2细胞因子如IL-13异常表达相关的癌或肿瘤。
术语“小分子”指具有50道尔顿至2500道尔顿之间分子量的有机分子。
术语“抗体”以最广意义使用并且具体覆盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体、单链抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。这类抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和合成抗体。
术语“未控制”或“不可控制的”指治疗方案不足以最大限度减少疾病症状。如本文所用，术语“未控制”和“未充分控制”可以互换使用并且意指相同的状态。患者的控制状态可以由主治医生基于多种因素确定，所述因素包括患者的临床史、对治疗的反应性和的开具的当前治疗的水平。例如，医师可以考虑多种因素，如FEV1<75％预测或个人最佳值、过去2-4周中需要SABA的频率(例如，大于或等于二剂/周)、过去2-4周中夜间苏醒/症状(例如，小于或等于2晚/周)、过去2-4周中对活动的限制、过去2-4周中白天症状。
术语“治疗药”指用来治疗疾病的任何药物。
术语“控制药”或“预防药”指用来控制哮喘炎症的任何治疗药。控制药的例子包括皮质类固醇类、白三烯受体拮抗剂(例如，抑制白三烯类合成或活性，如孟鲁司特、齐留通、普仑司特、扎鲁司特)、LABA、皮质类固醇/LABA联用组合物、茶碱(包括氨茶碱)、色甘酸钠、奈多罗米钠、奥马珠单抗、LAMA、MABA(例如，双官能毒蕈碱拮抗剂-β2激动剂)、5-脂加氧酶活化蛋白(FLAP)抑制剂和酶PDE-4抑制剂(例如，罗氟司特)。“第二控制药”一般指与第一控制药不相同的控制药。
术语“皮质类固醇节省”或“CS”意指在服用皮质类固醇以治疗该疾病的患者中因施用另一种治疗药而减少用来治疗疾病的皮质类固醇的频率和/或数量或消除之。“CS药”指可以在服用皮质类固醇的患者中造成CS的治疗药。
术语“皮质类固醇”包括但不限于氟替卡松(包括丙酸氟替卡松(FP))、倍氯米松、布***、环索奈德、莫米松、氟尼缩松、倍他米松和曲安西龙。“吸入性皮质类固醇”意指适于通过吸入递送的皮质类固醇。示例性吸入性皮质类固醇是氟替卡松、丙酸倍氯米松、布***、糠酸莫米松、环索奈德、氟尼缩松、曲安奈德和目前可用或未来可用的任何其他皮质类固醇。可以吸入并且与长效β2-激动剂组合的皮质类固醇的例子包括但不限于布***/福莫特罗和氟替卡松/沙美特罗。
皮质类固醇/LABA组合药物的例子包括氟替卡松糠酸酯/苯乙酸维兰特罗和茚达特罗/莫米松。
术语“LABA”意指长效β-2激动剂，所述激动剂例如包括沙美特罗、福莫特罗、班布特罗(bambuterol)、沙丁胺醇(albuterol)、茚达特罗、阿福特罗和克仑特罗。
术语“LAMA”意指长效毒蕈碱拮抗剂，所述拮抗剂包括：噻托溴铵。
LABA/LAMA组合的例子包括但不限于：奥达特罗噻托溴铵(BoehringerIngelheim’s)和茚达特罗格隆(Novartis)
术语“SABA”意指短效β-2激动剂，所述激动剂包括但不限于、沙丁胺醇、左沙丁胺醇、非诺特罗、特布他林、吡布特罗、丙卡特罗(procaterol)、比托特罗(bitolterol)、利米特罗、卡布特罗(carbuterol)、妥洛特罗和瑞普特罗。
白三烯受体拮抗剂(有时称作leukast)(LTRA)是抑制白三烯的药物。白三烯抑制剂的例子包括孟鲁司特、齐留通、普仑司特和扎鲁司特。
术语“FEV1”指用力呼气第一秒内呼出的气体量。它是气道阻塞的度量。所述引起FEV1下降20％所需的乙酰甲胆碱刺激性浓度(PC20)是气道高反应性的度量。FEV1可以按相似方式标注，例如，FEV1，并且应当理解全部这类相似的变型具有相同的意思。
术语“FEV1的相对变化”＝(治疗第12周时的FEV1–治疗启动前的FEV1)除以FEV1。
术语“轻度哮喘”指通常出现症状或一周加重少于两次、一个月夜间症状少于两次并且在加重之间无症状的患者。轻度、断续性哮喘经常在之间的加重采用以下方式治疗：采用吸入型支气管扩张剂(短效吸入型β2-激动剂)；避开已知的触发源；进行年度流感接种；每6年至10年进行肺炎球菌接种和在一些情况下在暴露于确定的触发源之前采用吸入型β2-激动剂、色甘酸、或奈多罗米。如果患者具有日益增加的短效β2-激动剂需求(例如，因急性加重1天内使用短效β2-激动剂超过三次至四次或一个月针对症状使用超过一罐)，该患者可以需要递增治疗药。
术语“中度哮喘”通常指这样的哮喘，其中患者出现加重一周超过两次并且加重影响睡眠和活动的；该患者出现因哮喘所致的夜间苏醒一个月超过两次；患者出现每日或每隔一天需要短效吸入型β2-激动剂的慢性哮喘症状；及该患者的治疗前基线PEF或FEV1是预测的％60至80％并且PEF变异性是20％至30％。
术语“重度哮喘”通常这样的哮喘，其中患者几乎出现连续症状、频繁加重、因哮喘所致的夜间苏醒频繁、活动受限、PEF或FEV1基线小于预测的60％并且PEF变异性为20％至30％。
挽救投药法的例子包括沙丁胺醇、万托林和其他。
“耐药性”指在治疗药治疗后显示微弱或不显示有临床意义改善的疾病。例如，下述哮喘经常视为重度顽固性哮喘，所述哮喘需要用大剂量ICS(例如，连续三天或更长时间，每日皮质类固醇总剂量加四倍或每日总剂量大于或等于500微克FP或等同物)治疗或全身性皮质类固醇持续两周试用，以确立哮喘是否仍未控制或FEV1未改善。
如本文中提供的治疗药可以通过任何合适的手段施用，所述手段包括胃肠道外，皮下、腹膜内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。在一个实施方案中，吸入治疗药。根据另一个实施方案，通过注射，例如，静脉内或皮下注射给予剂量。在又一个实施方案中，使用注射器(例如，预充式或非预充式)或自动注射器施用治疗药。
为了预防或治疗疾病，适宜剂量的治疗药可能取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和过程、治疗药是否出于预防或治疗目的施用，既往疗法，患者的临床史和对治疗药的反应以及主治医师的决定。将治疗药适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。治疗药组合物将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。
来金珠单抗给药、Th2相关疾病(包含哮喘)给药和使用Th2疗法治疗其他疾病的给药：来金珠单抗可以按0.1mg/kg至100mg/kg患者体重施用。在一个实施方案中，向患者施用的剂量在0.1mg/kg和20mg/kg患者体重之间。在另一个实施方案中，该剂量是1mg/kg至10mg/kg患者体重。
在一个备选实施方案中，来金珠单抗可以按固定剂量施用。在一个实施方案中，将来金珠单抗按125-1000mg之间的固定剂量(即，不依赖体重)、或37.5mg固定剂量、或125mg固定剂量、或250mg固定剂量、或500mg固定剂量，通过皮下注射或通过静脉内注射，按选自以下次数频率施用：每2周、每3周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周、每11周、每12周、每13周、每14周、每15周、每16周、每1个月、每2个月、每3个月或每4个月。在另一个实施方案中，如果患者超重，则来金珠单抗可以例如按125-250mg以每月3次的频率施用。在一个实施方案中，将来金珠单抗按每4周125mg、250mg或500mg的固定剂量施用。在另一个实施方案中，将来金珠单抗在>40kg的患者中按每4周37.5mg、125mg、250mg或500mg的固定剂量施用。
在一个实施方案中，患者是18岁或以上。在一个实施方案中，哮喘患者是12至17岁并且将来金珠单抗按250mg的固定剂量或125mg的固定剂量施用。在一个实施方案中，哮喘患者是6至11岁并且将来金珠单抗按125mg的固定剂量施用。
可以使用显示患者获益的任何终点评估针对某治疗药的“患者反应”或“反应”(和其语法变型)，所述终点包括而不限于(1)一定程度地抑制病情进展，包括减慢和完全制止；(2)减少疾病发作和/或症状的次数；(3)减少损害尺度；(4)抑制(即，减少、减慢或完全制止)免疫或炎型细胞向相邻外周器官和/或组织浸润；(5)抑制(即减少、减慢或完全制止)疾病扩散；(6)减少自身免疫反应，这可以、但不必然导致疾病损害的消退或消除；(7)一定程度地减轻一种或多种与疾病相关的症状；(8)治疗后无疾病表现的时长增加；和/或(9)治疗后给定时间点的死亡率降低。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间总计非共价相互作用的强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原结合臂)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
如本文所用的术语“抗靶标抗体”和“与靶标结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体能够以足够亲和力结合靶标，从而抗体可用作靶向该靶标的诊断药和/或治疗药。在一个实施方案中，抗靶标抗体与不相关的非靶标蛋白结合的程度小于该抗体与靶标结合的程度约10％，如通过放射免疫测定(RIA)或biacore测定法所测量。在某些实施方案中，与靶标结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，一种抗靶标抗体与不同物种之间保守的靶标的表位结合。
“抗体片段”指除完整抗体之外包含括完整抗体的一部分的分子，所述部分结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于单链Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“与参考抗体结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。用于实施竞争测定法的各种方法是本领域熟知。
出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。
术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EUindex。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸内容物方面不完全与亲本细胞相同，反而可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述区域的每一个，所述区域在序列上高变和/或形成结构确定的环(“高变环”)。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者一般具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。如本文所用的HVR区域包含任何数目位于以下位置内部的残基：24-36(对于HVRL1)、46-56(对于HVRL2)、89-97(对于HVRL3)、26-35B(对于HVRH1)、47-65(对于HVRH2)和93-102(对于HVRH3)。
“个体”或“患者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或患者或个体是人。在一些实施方案中，本文中的“个体”或“患者”或“个体“是符合治疗资格的任何单一人类个体，所述人类个体正出现或已经出现哮喘或呼吸道病状的一种或多种体征、症状或其他适应症。作为个体，意在纳入涉及临床研究试验的未显示出疾病的任何临床体征的任何个体、或涉及流行病学研究的个体或曾经作为对照使用的个体。个体可以具有先前用Th2途径抑制剂或另一种药物治疗过或尚未如此治疗过。当本文中的治疗本启动时，个体可以相对于Th2抑制剂未曾用药，即，个体可以在“基线”时(即，在本文治疗方法中施用第一剂Th2抑制剂之前的设定时间点，如在治疗启动之前筛选个体的当日)先前尚未用例如，Th2抑制剂治疗过。这类“未曾用药”的个体通常视为这类药物治疗的候选者。
“儿童”个体或患者或个体是从出生至18岁大(或0至18岁)的人。在一些实施方案中，儿童个体或患者或个体是2至6、2至17、6至11、6至18、6至17、8至17、12至17或12至18岁。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“编码抗靶标抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本文中提供的方法待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子其中：变动结构物。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法，剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。术语“包装插页”是还用来指习惯上在诊断产品的商业包装物中包含的说明书，所述说明书含有关于预期用途、检验原理、配制和处置试剂、标本采集和制备、测定法校正和分析流程、性能和精度数据如测定法灵敏度和特异性的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作***(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y，其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的个体不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对个体无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另外说明，否则如本文所用，术语术语“靶标”指来自任何脊椎动物来源的任何天然分子，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。本术语涵盖“全长”、未加工的靶标以及因细胞中加工而产生的任何形式的靶标。本术语还涵盖靶标的天然存在变体，例如，剪接变体或等位变体。
如本文所用，术语“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
术语“载体”指能够增殖已经与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
组合物和方法
如本文所述，本发明至少部分地提供IL-13免疫测定方法，所述免疫测定方法高度灵敏，在超过98％的受检样品中检出飞克/mL水平的IL-13，并且高度特异。本文中还提供这样的方法，所述方法使用这类高度灵敏和高度特异的免疫测定方法以选择或鉴定血清IL-13水平升高的患者，所述患者更可能对作为Th2途径抑制剂的治疗性疗法有反应，以及鉴定更可能遭受重度加重的哮喘患者。
示例性抗体
抗IL-13抗体
在一个方面、本发明提供与人IL-13结合的分离的抗体。
示例性抗IL-13抗体是已知的并且例如包括但不限于来金珠单抗、IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab、INN编号910649-32-0；QAX-576)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)。这类抗IL-13抗体和IL-13的其他抑制剂的例子例如在WO 2005/062967、WO2008/086395、WO2006/085938、US 7,615,213、US 7,501,121、WO2007/036745、WO2010/073119、WO2007/045477、WO2014/165771中公开。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是人源化IgG4抗体。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是来金珠单抗。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种重链HVR：HVR-H1(SEQ ID NO.:5)、HVR-H2(SEQ ID NO.:6)和HVR-H3(SEQ ID NO.:7)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种轻链HVR：HVR-L1(SEQ ID NO.:8)、HVR-L2(SEQ ID NO.:9)和HVR-L3(SEQ ID NO.:10)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种重链HVR和三种轻链HVR：HVR-H1(SEQ ID NO.:5)、HVR-H2(SEQ ID NO.:6)、HVR-H3(SEQ ID NO.:7)、HVR-L1(SEQ ID NO.:8)、HVR-L2(SEQ ID NO.:9)和HVR-L3(SEQ ID NO.:10)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含重链可变区VH，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO.1、3和24的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含轻链可变区VL，所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO.2、4和25的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO.1、3和24的氨基酸序列，所述轻链可变区具有选自SEQ IDNO.2、4和25的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:25。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:25。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:2。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:4。在另一个实施方案中，抗体包含可变区序列SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
在以上实施方案的任一项中，抗IL-13抗体可以人源化。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含如以上实施方案的任一项中的HVR，并且还包含接纳体人类构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。
在另一个方面，抗IL-13抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与人IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:1中置换、改变、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:1中的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:3中的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:24中的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗IL-13抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:2中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:2中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:4中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:25中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗IL-13抗体，其中该抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和如上文提供的任一个实施方案中的VL。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供一种抗体，所述抗体结合至与抗IL-13抗体相同的表位或可以由该抗体竞争性抑制，所述抗IL-13抗体包含列SEQ ID NO:1的VH序和SEQ IDNO:2的VL序列。
在本发明的又一个方面，根据上文任一实施方案的抗IL-13抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如，完整IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。根据另一个实施方案，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含上文描述的HVR或包含上文描述的VH区和VL区。
在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种重链HVR：HVR-H1(SEQ ID NO.:13)、HVR-H2(SEQ ID NO.:14)和HVR-H3(SEQ ID NO.:15)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种轻链HVR：HVR-L1(SEQ ID NO.:16)、HVR-L2(SEQ ID NO.:17)和HVR-L3(SEQ ID NO.:18)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含三种重链HVR和三种轻链HVR：HVR-H1(SEQ IDNO.:13)、HVR-H2(SEQ ID NO.:14)、HVR-H3(SEQ ID NO.:15)、HVR-L1(SEQ ID NO.:16)、HVR-L2(SEQ ID NO.:17)和HVR-L3(SEQ ID NO.:18)。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含重链可变区VH，所述重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:12。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含轻链可变区VL，所述轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，所述轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO:11。
在以上实施方案的任一项中，抗IL-13抗体可以人源化。在一个实施方案中，抗IL-13抗体包含如以上实施方案的任一项中的HVR，并且还包含接纳体人类构架，例如人免疫球蛋白构架或人共有构架。
在另一个方面，抗IL-13抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与人IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQID NO:12中置换、改变、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:12中的VH序列，包含该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗IL-13抗体，其中该抗体包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、***或缺失，但是包含该序列的抗IL-13抗体保留与IL-13结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:11中置换、***和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、***或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗IL-13抗体包含SEQ ID NO:11中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗IL-13抗体，其中该抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和如上文提供的任一个实施方案中的VL。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与本文提供的抗IL-13抗体结合相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供一种抗体，所述抗体结合至与抗IL-13抗体相同的表位或可以由该抗体竞争性抑制，所述抗IL-13抗体包含列SEQ ID NO:12的VH序和SEQ IDNO:11的VL序列。
在本发明的又一个方面，根据上文任一实施方案的抗IL-13抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗IL-13抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如，完整IgG1或IgG4抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。根据另一个实施方案，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含上文描述的HVR或包含上文描述的VH区和VL区。
在又一个方面，根据以上任一个实施方案的抗IL-13抗体可以并入单独或组合如以下第1-7部分中所述的任何特征：
抗IgE抗体
在一个方面，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的抗IgE抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。根据一个实施方案，抗IgE抗体是抗体。
双特异性抗体
在一个方面，本发明提供一种包含与IL-4和IL-13特异性结合的抗原结合结构域的双特异性抗体。WO 2014/165771中描述了这类抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体。
在另一个方面，本发明提供一种包含与IL-13和IL-17特异性结合的抗原结合结构域的双特异性抗体。PCT/US2015/017168和美国申请号14/629,449中描述了这类种抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体。在一些实施方案中，抗IL-17抗体结合IL-17A同型二聚体、IL-17F同型二聚体和IL-17AF同型二聚体。
在又一个方面，抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ IDNO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列；和包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-17VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ IDNO.:31的氨基酸序列。
在又一个方面，抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的氨基酸序列；和包含含有VH和VL的抗IL-17VH/VL单元，所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在又一个方面，根据以上任一个实施方案的抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体可以并入单独或组合如以下第1-7部分中所述的任何特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10- 13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射标记抗原结合测定法(RIA)测量Kd，所述测定法用目的抗体的Fab形式和其抗原如以下测定法所述那样进行。通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125I)的标记抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立该测定法的条件，将多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/mL抗Fab捕获抗体(Cappel Labs)包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭二至五小时。在非吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物(例如，与Presta等人,CancerRes.57:4593-4599(1997)中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)混合。随后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温温育(例如，一小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择产生小于或等于20％最大结合作用的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定法中。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃采用固定抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)，测量Kd。简而言之，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。抗原用10mM乙酸钠，pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μl/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中Fab的二倍连续稀释物(例如，0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型( 评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用萦光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述萦光猝灭技术在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗原抗体(Fab形式)的萦光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,引自Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
如本文所述，可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人类抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法在例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中综述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(参见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中总体上描述了人抗体。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，和描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人,引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自免疫来源的文库在不要求构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对IL-13，并且另一种特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与IL-13的两个不同表位结合。双特异性抗体也可以用来使细胞毒性剂局限于细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305:537(1983)、WO93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结-扣”工程化(例如，参见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb”或“DAF”，其包含与IL-13以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基***所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、***和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
置换变体、***变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“保守性置换”标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体并且筛选产物的所需活性，例如，保留/改善的抗原结合作、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 保守性置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性的亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基)(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人，引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、***或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以在HVR“热点”或SDR的外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶标残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列***包括长度从一个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。例如参见，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖类结构的抗体变体，所述糖类结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖类结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内部Asn 297处岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸附近，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108 A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人,特别地在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
还可以为抗体变体提供双分低聚糖，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供低聚糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S)中描述。
Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗竭。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或另外，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(见，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能减少的抗体包括置换了一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在US 2005/0014934A1(Hinton等人)中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
还见涉及Fc区变体其他例子的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如美国专利号7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗体的分离核酸。这种核酸可以编码构成抗体VL的氨基酸序列和/或构成抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如，已经用其转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码构成抗体的VL的氨基酸序列和构成抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码构成抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码构成抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体条件下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并***一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)在表达后，可以将抗体从细菌细胞糊状物分离于可溶性级分中并且可以进一步纯化抗体。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
用于诊断和检测的方法和组合物
本发明至少部分地基于IL-13免疫测定方法，所述免疫测定方法高度灵敏，在超过98％的受检样品中检出飞克/mL水平的IL-13，并且高度特异，如本文所述。本文中还提供这样的方法，所述方法使用这类高度灵敏和高度特异的免疫测定方法以选择或鉴定血清IL-13水平升高的患者，所述患者更可能对作为Th2途径抑制剂的治疗性疗法有反应，以及鉴定更可能遭受重度加重的哮喘患者。
因此，在一个方面，提供用于检测和定量样品中IL-13的高灵敏度和高特异性免疫测定方法。在某些实施方案中，样品是生物样品。在某些实施方案中，样品是血清。在某些实施方案中，样品是人血清。在一些实施方案中，确定灵敏度作为定量下限(LLOQ)。在某些实施方案中，LLOQ在0.1fg/mL和35fg/mL之间或在约0.1fg/mL和约35fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在1fg/mL和30fg/mL之间或在约1fg/mL和约30fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在5fg/mL和25fg/mL之间或在约5fg/mL和约25fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ在10fg/mL和20fg/mL之间或在约10fg/mL和约20fg/mL之间。在某些实施方案中，LLOQ是14fg/mL。
在另一个方面，提供夹心免疫测定方法，所述方法包括特异性结合IL-13的第一单克隆捕获抗体和特异性结合IL-13的第二单克隆检测抗体，其中第一抗体与第二抗体结合不同的表位。在一些实施方案中，通过抗原耗竭方法(也称作免疫耗竭方法)确定特异性，其中耗竭方法包括在进行免疫测定方法之前将样品与过量的第一抗体温育。在某些这类实施例中，彻底地耗竭样品中的抗原，因而产生低于免疫测定方法中LLOQ的信号。在一些实施方案中，样品包含可溶性IL-13Rα2并且可溶性IL-13Rα2不干扰免疫测定方法的灵敏度或特异性。
在又一个方面，免疫测定方法包含第一抗体，所述第一抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L3。在一些实施方案中，第一抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。在某些实施方案中，第一抗体是抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为F(ab’)2或Fab的抗体片段。在某些实施方案中，第一抗体是作为Fab、F(ab’)2、Fab'、或Fv的抗体片段。在一些实施方案中，免疫测定方法包含第二抗体，所述第二抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQID NO:13的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。在一些实施方案中，第二抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区。
在又一个方面，免疫测定方法还包含第三抗体，其中第三抗体与第二抗体特异性结合并且可检测地标记。在一些实施方案中，第二抗体用半抗原标记并且第三抗体是抗半抗原抗体。在一些实施方案中，半抗原是洋地黄毒甙并且抗半抗原抗体是与萦光乳胶缀合的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。
本发明是还至少部分地基于使用循环型IL-13鉴定或多或少可能对Th2途径抑制剂治疗性疗法有反应的个体。因此，所公开的方法提供了便利、高效和可能有成本效益的手段以获得可用于评估适宜或有效疗法以治疗患者的数据和信息。例如，样品可以从哮喘患者或Th2相关疾病患者获得，并且样品可以由本文所述的高度灵敏和高度特异的IL-13测定法检查，以测量IL-13并且确定如与参比群体中的表达水平相比，IL-13的表达水平是否已经增加或减少。在一些实施方案中，如果从患者获得的样品中循环型IL-13的表达水平大于或等于健康个体中的表达水平，则患者是可能从Th2途径抑制剂治疗获益。
在某些实施方案中，将样品针对所分析的蛋白质的量和所用蛋白质样品的质量的变异性和各分析试验之间的变异性归一化。每位患者每份受检样品的蛋白质的归一化表达水平可以表述为参考集合中所测量的表达水平的百分数。在待分析的特定患者样品中测量的表达水平将落在这个范围内部的某个百分位数，这可以通过本领域已知的方法确定。
可以通过本领域已知的方法获得包含生物标志物的生物样品。此外，可以通过检验这类身体样品的靶标基因或基因产物，更容易监测地疗法的进展。
两种一般方法可用于免疫测定检测：直接测定法和间接测定法。根据第一测定法，直接测定抗体与靶标抗原的结合。这种直接测定法使用标记的试剂，如萦光标签或酶标记的第一抗体，所述第一抗体可以在无其他抗体相互作用的情况下可视化。在常见的间接测定法中，未缀合的第一抗体与抗原结合并且随后标记的第二抗体与第一抗体结合。在第二抗体与酶标记物缀合的情况下，添加生色或萦光底物以提供抗原的可视化。信号放大出现，原因是几种第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应。
第一和/或第二抗体一般将用可检测部分标记。许多标记物是可用的，它们通常可以划分成以下类别：
(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I。例如，使用Current Protocols inImmunology,第1和第2卷,Coligen等人编著,Wiley-Interscience，New York,New York,Pubs.(1991)中所述的技术，可以用放射性同位素标记抗体，并且可以使用闪烁计数法测量放射性活度。
(b)胶体金粒子。
(c)萦光标记物，包括但不限于稀土元素螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、萦光素、丹磺酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻青蛋白、或市售萦光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或前述任一者或多者的衍生物。使用在例如上文CCurrent Protocols in Immunology中公开的技术，可以使萦光标记物与抗体缀合。萦光可以使用萦光计定量。
(d)多种酶-底物标记物是可获得的并且美国专利号4,275,149提供了其中某些的综述。酶通常催化生色底物的化学改变，其中可以使用多种技术测量所述化学改变。例如，酶可以催化底物中可以按分光光度形式测量的颜色变化。备选地，酶可以改变底物的萦光或化学发光。上文描述了用于量化萦光变化的技术。化学发光底物因化学反应被电子激发并且可以随后发射(例如使用化学发光计)可测量的光或馈赠能量至萦光受体。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于酶与抗体缀合的技术在O’Sullivan等人(1981)“Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”,引自Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编著),Academic press,New York,73:147-166中描述。
例如，酶组合的例子包括：
(i)以过氧化氢作为底物的辣根过氧化物酶(HRPO)，其中所述过氧化氢氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)连同对-硝基苯磷酸酯作为生色底物；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)连同生色底物(例如，对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或萦光底物(例如，4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)。
众多其他的酶-底物组合是本领域技术人员可获得的。关于这些组合的一般综述，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。有时，标记物间接地与抗体缀合。技术人员将知晓实现这种缀合的多种技术。例如，抗体可以与生物素缀合并且上文提到的四大类别标记物中任一者可以与其中抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，并且因而，标记物可以与抗体以这种间接方式缀合。备选地，为了实现标记物与抗体间接缀合，将抗体与小型半抗原缀合并且上文提到的不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体缀合。因此，可以实现标记物与抗体的间接缀合。
在任选的封闭步骤后，样品按足够的时间段和合适条件下暴露于第一抗体，从而第一抗体与样品中的靶标蛋白抗原结合。可以通过例行实验确定实现这种结合的适宜条件。通过使用上文讨论的任一种可检测标记物、确定抗体与样品结合的程度。在某些实施方案中，标记物是催化生色底物如3,3’-二氨基联苯胺生色原发生化学改变的酶标记物(例如，HRPO)。在一个实施方案中，酶标记物与特异性结合至第一抗体的抗体缀合(例如，第一抗体是兔多克隆抗体并且第二抗体是驴抗山羊抗体)。
在一些实施方案中，样品可以与所述生物标记物特异的抗体在足以形成抗体-生物标记物复合物的条件下接触，并且随后检测所述复合物。可以按许多方式检出生物标志物的存在，如通过分析多种类型组织和样品(包括血浆或血清)的蛋白质印迹法和(ELISA)法检出。广泛类型的使用这种分析模式的免疫分析技术可获得，参见，例如，美国专利号4,016,043；4,424,279；和4,018,653。这些方法包括非竞争性类型以及在传统竞争性结合分析中的单位点和双位点或“夹心”测定法。这些测定法也包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。
夹心测定法属于最有用和常用的测定法。存在夹心分析技术的多种变型并且它们全部意在由本发明涵盖。简而言之，在常见的正向测定法中，将未标记的抗体固定在固态基材上并且使待测试的样品与结合的分子接触。在温育合适时间(持续足以允许抗体-抗原复合物形成的时间)后，随后添加经能够产生可检测信号的报道分子标记的抗原特异性第二抗体并且温育，持续允许足以形成另一种抗体-抗原-标记抗体复合物的时间。洗去任何未反应的物质，并且通过观察到报道分子产生的信号，确定抗原的存在。通过单纯观察到可见信号，结果可以定性的，或通过比较与含有已知量的生物标志物的对照样品，结果可以是定量的。
正向测定法的变型包括同时测定法，其中向结合的抗体同时添加样品和标记的抗体。这些技术是本领域技术人员已知的，如将轻易显而易见，包括任何细微变异。在常见的正向夹心测定法中，对生物标志物具有特异性的第一抗体共价地或被动地与固态表面结合。固态表面一般是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物可以处于管、珠、微量平板的圆盘或适于实施免疫测定法的任何其他表面形式。结合过程是本领域熟知并且通常由交联、共价结合或物理吸附组成，在制备中洗涤聚合物-抗体复合物供测试样品用。随后将等分试样的待测试样品添加至固相复合物并且持续一段足以允许结合抗体中存在的任何亚基的时间(例如，2-40分钟或如果更便利，过夜)及在允许结合抗体中存在的任何亚基的合适条件下(例如，从室温至40℃，如在25℃和32℃(含)之间)温育。在温育时间后，将抗体亚单位固相洗涤及干燥并且与对生物标记物的一部分特异的第二抗体温育。第二抗体与用来显示第二抗体与分子标记结合的报道分子连接。
备选方法涉及固定样品中的靶标生物标志物并且随后使固定的靶标暴露于特异性抗体，所述特异性抗体抗体可以或可以不经报道分子标记。取决于靶标的量和报道分子信号的强度，结合的靶标可以是通过抗体直接标记可检出的。备选地，对第一抗体特异性的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物，以形成靶标-第一抗体-第二抗体三元复合物。通过报道分子发射的信号检测该复合物。如本说明书中所用，“报道分子”意指借助其化学性质提供允许检测抗原-结合抗体的分析可辨认信号的分子。这种类型的测定法中最常使用的报道分子是酶、萦光团或含有放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定情况下，酶与第二抗体缀合，通常借助戊二醛或高碘酸盐缀合。然而，如将轻易地认识到，存在多种类型的不同缀合技术，它们是技术人员轻易地可获得。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶及其他。通常选择与特定酶一起待使用的底物，以在受相应的酶水解时产生可检测的颜色变化。合适酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可能利用萦光底物，所述萦光底物产生萦光产物而非上文所示的生色底物。在全部情况下，添加酶标记的抗体至第一抗体-分子标记复合物，允许结合并且随后洗去过量试剂。随后将含有适宜底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体的复合物。底物将与连接至第二抗体的酶反应，产生定性目视信号，可以进一步定量所述的目视信号，通常以分光光度方式定量，以产生样品中存在的生物标志物的量指示。备选地，萦光化合物，如萦光素和罗丹明，可以化学地偶联至抗体，而不改变其结合能力。当通过特定波长的光照射激活时，萦光物质标记的抗体吸附光能，在分子中诱导至激发的状态，随后按照以光学显微镜目视可检测的特征性颜色发射光。如EIA中，允许萦光标记的抗体与第一抗体-分子标记复合物结合。在洗涤未结合的试剂后，剩余的三元复合物随后暴露于适宜波长的光，观察到的萦光提示存在目的分子标记。本领域中非常充分地建立了免疫萦光技术和EIA技术。但是，也可以使用其他报道分子，如放射性同位素、化学发光分子或生物发光分子。
可以在一份报告中提供患者基于检验结果的IL-13状态(例如，升高、高于参比或低于参比)。该报告可以处于任何书面材料形式(例如，处于纸质或数字形式、或在互联网上或口头陈述)(例如，亲自(直播)或作为记录)。该报告还可以向卫生专业人员(例如，医师)提示该患者可能从干扰素抑制剂治疗中获益或可能对其有反应。
本发明的试剂盒具有多种实施方案。在某些实施方案中，试剂盒包含容器、所述容器上的标签和含于所述容器内部的组合物；其中组合物包括一种或多种第一抗体与一个或多个对应于一种或多种生物标志物(包括IL-13)的靶标多肽序列结合，容器上的标签表明组合物可以用来评价至少一个类型的哺乳动物细胞中一种或多种靶标蛋白的存在，以及使用这些抗体评价一种或多种靶标蛋白在至少一个类型的哺乳动物细胞中存在的说明。试剂盒还可以包含用于制备组织样品及施加抗体和探针至相同的组织样品切片的指令集和材料。试剂盒可以包括第一和第二抗体，其中第二抗体与标记物(例如，酶标记物)缀合。
术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如血清、血浆、鼻拭子和痰。
药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的抗IL-13抗体或其他Th2途径抑制剂的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水质抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些有效成分。例如，可能想要进一步提供含Th2途径抑制剂的控制剂。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
治疗方法和组合物
嗜酸粒细胞性炎症与多种变应性和非变应性疾病相关(Gonlugur(2006)Immunol.Invest.35(1):29-45)。炎症是活组织对损伤的恢复性反应。炎症反应的一个特征是白细胞因组织自身中产生的某些化学物而积累于受损组织中。嗜酸性白细胞在广泛类型的病症如过敏性疾病、蠕虫感染和肿瘤疾病中积累(Kudlacz等人,(2002)Inflammation26:111-119)。嗜酸性粒白细胞(免疫***的一种组分)是粘膜表面的防御性单元。它们不仅对抗原反应，还对寄生虫、化学品和创伤反应。
组织嗜酸性粒细胞出现在在皮肤疾病如湿疹、天疱疮、急性荨麻疹和中毒性表皮坏死松解症中以及在特应性皮炎中(Rzany等人,Br.J.Dermatol.135:6-11(1996))。嗜酸性粒细胞积累在组织中并且在IgE介导的变应性皮肤反应中排空颗粒状蛋白质(Nielsen等人,Ann.AllergyAsthma Immunol.,85:489-494(2001))。与肥大细胞结合的嗜酸性粒细胞是关节炎症的可能病因(Miossec,J.Clin.Rheumatol.3:81-83(1997))。嗜酸粒细胞性炎症有时伴随关节创伤。滑液嗜酸粒细胞增多症可能与多种疾病相关，如类风湿性关节炎、寄生虫病、高嗜酸性粒细胞综合征、莱姆病和变应性过程以及关节积血和关节造影术(Atanes等人,Scand.J.Rheumatol.,25:183-185(1996))。嗜酸粒细胞性炎症也可以影响骨(Yetiser等人,Int.J.Pediatr.Otorhinolaryngol.,62:169-173(2002))。嗜酸粒细胞性肌肉疾病的例子包括嗜酸粒细胞性肌周炎、嗜酸粒细胞性多发性肌炎和局灶性嗜酸粒细胞性肌炎(Lakhanpal等人,Semin.Arthritis Rheum.,17:331-231(1988))。侵袭骨骼肌的嗜酸性粒细胞炎性症可能与寄生虫感染或药物或嗜酸粒细胞增多症(例如，特发性高嗜酸性粒细胞综合征和嗜酸性粒细胞-肌痛综合征)的一些全身性病症的特征相关。嗜酸性粒细胞参与针对自身免疫抗体识别的表位的炎症反应(Engineer等人,Cytokine,13:32-38(2001))。***病可以导致嗜中粒细胞性、嗜酸粒细胞性或淋巴细胞性血管炎症(Chen等人,J.Am.Acad.Dermatol.,35:173-182(1996))。组织和外周血嗜酸粒细胞增多症可以在活动性风湿性疾病中出现。强直性脊柱炎(一个种类的***病)中的血清ECP水平升高表明嗜酸性粒细胞还参与作为基础的过程(Feltelius等人,Ann.Rheum.Dis.,46:403-407(1987))。韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)可能罕见地随肺结节、胸腔积液和外周血嗜酸粒细胞增多症一起出现(Krupsky等人,Chest,104:1290-1292(1993))。
至少400/mm3的外周血嗜酸粒细胞增多症可以在7％的全身性硬化症病例、31％的局限化硬皮病病例和61％的嗜酸粒细胞性筋膜炎病例中出现(Falanga等人,J.Am.Acad.Dermatol.,17:648-656(1987))。硬皮病产生与与麦氏神经丛和奥氏神经丛极其相似的炎症过程并且由胃肠***中的肥大细胞和嗜酸性白细胞组成。嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素可以促进胃肠道运动功能障碍，如在硬皮病中出现那样(DeSchryver-Kecskemeti等人Arch.Pathol.Lab Med.,113:394-398(1989))。
嗜酸性粒细胞可以伴随局限化(Varga等人,Curr.Opin.Rheumatol.,9:562-570(1997))或全身性(Bouros等人,Am.J.Respir.Crit.Care Med.,165:1581-1586(2002))***增生。它们可以通过抑制成纤维细胞中的蛋白聚糖降解，激起纤维化(Hernnas等人,Eur.J.Cell Biol.,59:352-363(1992))，并且成纤维细胞通过分泌GM-CSF，介导嗜酸性粒细胞存活(Vancheri等人,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,1:289-214(1989))。嗜酸性粒细胞可以存在于中鼻组织(Bacherct等人,J.allergy Clin.Immunol.,107:607-614(2001))、支气管组织(Arguelles等人,Arch.Intern.Med.,143:570-571(1983))和胃肠道息肉组织中(Assarian等人,Hum.Pathol.,16:311-312(1985))。同样地，嗜酸性粒细胞可以局限于炎性假肿瘤(肌成纤维细胞性肿瘤)。嗜酸性粒细胞经常伴随眼眶区域内的炎性假肿瘤，在所述病例中该病状可以模拟血管性水肿或变应性鼻结膜炎(Li等人,Ann.Allergy,69:101-105(1992))。
嗜酸粒细胞性炎症可以存在于组织创伤中(例如，因手术或损伤所致)。嗜酸粒细胞性炎症也可以与心血管疾病(例如，嗜酸粒细胞性心肌炎、嗜酸粒细胞性冠状动脉炎、局部缺血性心脏病、急性心肌梗死、心脏破裂)相关。坏死性炎症过程也可以涉及嗜酸粒细胞性炎症(多发性肌炎、冠状动脉夹层，神经-Behcet病的坏死性病灶、痴呆、脑梗死)。
在Th2驱动型/嗜酸粒细胞性哮喘亚表型的非侵入性生物标志物当中有血清骨膜蛋白、呼出型一氧化氮级分(FeNO)和外周血嗜酸性粒细胞计数。参见Arron等人,(2013)AdvPharmacol 66:1-49。这些标志物当中，已经提出血清骨膜蛋白作为来金珠单抗的预测性判断，因为它是BOBCAT重度哮喘观察研究中气道嗜酸性粒细胞状态的最佳单一预测指标(如通过痰和组织嗜酸粒细胞增多症的组合所确定)(Jia等人(2012)J Allergy Clin Immunol130:647-654e10)，它在MILLY研究中跨二次给药前随访显示出大幅度小于FeNO或血液嗜酸性粒细胞的患者内变异性(Corren等人(2011)N Engl J Med 365:1088-98)，并且可以用于标准化、广泛可获得的分析平台上，所述分析平台不需要专门化特化即时仪器(如FeNO)，也不依赖于现有临床实验室之间未广泛标准化的自动化细胞计数器(如血液嗜酸性粒细胞)。尽管血清骨膜蛋白似乎是成人哮喘Th2/嗜酸粒细胞性亚型的稳健和一致的生物标志物，未知它是否可以适用于儿童哮喘。
在MILLY研究中，基线时血清骨膜蛋白水平高于50ng/ml，即便采用ICS但哮喘仍控制仍不良的成人，在来金珠单抗治疗12周后，显示出血清骨膜蛋白平均降低14.4％(p＝0.001)，而基线血清骨膜蛋白水平低于50ng/ml的患者在治疗阶段期间显示出不显著的2.9％的血清骨膜蛋白降低(p＝0.3)。参见Scheerens等人(2012)Am J Respir Crit CareMed 185:A3960。在来金珠单抗治疗12周后哮喘患者中血清骨膜蛋白水平的分布与健康对照成人中血清骨膜蛋白水平的分布重叠(Arron等人,Annals Am.Thoracic Soc.,待发表(2013),DOI:10.1513/AnnalsATS.201303-047 AW)。这些结果表明，在血清骨膜蛋白高的成人哮喘患者中，高于背景水平的过量骨膜蛋白归因于气道中IL-13的活性，并且这种过量构成约10-15％的总全身性骨膜蛋白。
起初鉴定骨膜蛋白为成骨细胞(铺设骨基质的细胞)的产物。参见Horiuchi等人(1999)J Bone Miner Res 14:1239-49。解剖学上，骨中的骨膜蛋白表达局限于发育期间软骨内和膜内骨化的部位，这显示骨膜蛋白表达水平可能与骨生长速率相关。在未成年小鼠中，全身性骨膜蛋白水平和骨转换的标志物升高，随动物成熟而减少并从8周龄期达到相对稳定的水平贯穿整个成年期。参见Contie等人(2010)Calcif Tissue Int 87:341-5。在人类中，尽管儿童群体中哮喘比成人中更常见地与特应性和2型炎症相关，哮喘儿童中仍存在嗜酸粒细胞性和非嗜酸粒细胞性气道炎性亚群的证据。参见Baraldo等人(2011)EurRespir J 38:575-83。因此，鉴定到Th2/嗜酸粒细胞性气道炎症增加的哮喘儿童的生物标志物可能用于实现选择患者以展示来自抗IL-13和靶向2型炎症的其他治疗药的临床获益。
本文中提供了通过使用本文所述的IMPACT IL-13测定法测量来自患者的生物样品中IL-13的水平，鉴定循环型IL-13水平升高的患者的方法，所述升高预示性对Th2途径抑制剂治疗有反应(或将对其有反应)。
本文中还提供了治疗哮喘、Th2相关疾病、IL-13介导的疾病、IL4介导的疾病、IL9介导的疾病、IL5介导的疾病、IL33介导的疾病、IL25介导的疾病、TSLP介导的疾病、IgE介导的疾病或哮喘样症状的方法，所述方法包括向具有升高的循环型IL-13水平的患者施用Th2途径抑制剂，其中使用如本文所述的IMPACT IL-13测定法诊断该患者。
还提供治疗哮喘的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗导致大于5％的FEV1相对变化。在另一个实施方案中，FEV1大于6％、7％、8％、9％或10％的FEV1。在另一个实施方案中，已经使用IMPACT IL-13测定法，诊断患者为具有升高的循环型IL-13。
在某些实施方案中，提供治疗哮喘的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗导致加重率降低大于35％(在其他实施方案，大于36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、多达85％；另一个实施方案，其中已经诊断该患者为具有升高的循环型IL-13水平)。
在某些实施方案中，提供治疗哮喘的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗导致夜间苏醒减少。在一个实施方案中，使用IMPACT IL-13测定法，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。在另一个实施方案中，患者的哮喘在使用皮质类固醇时未得到控制。在另一个实施方案中，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。
还提供治疗哮喘的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗改善哮喘控制。在一个实施方案中，使用IMPACT IL-13测定法，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。在另一个实施方案中，患者的哮喘在使用皮质类固醇时未得到控制。在另一个实施方案中，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。
在某些实施方案中，提供治疗哮喘(或呼吸***疾病)的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗导致肺中的炎症减少。在一个实施方案中，使用IMPACT IL-13测定法，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。在另一个实施方案中，患者的哮喘在使用皮质类固醇时未得到控制。在另一个实施方案中，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。
在某些实施方案中，提供在患有Th2相关疾病并正在用皮质类固醇治疗的患者中治疗Th2相关疾病的方法，所述方法包括向哮喘患者施用治疗有效量的来金珠单抗，其中治疗导致减少或消除用来治疗该疾病的皮质类固醇治疗(其量或频率)。在一个实施方案中，使用IMPACT IL-13测定法，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。在另一个实施方案中，患者的哮喘在使用皮质类固醇时未得到控制。在另一个实施方案中，诊断患者为具有升高的循环型IL-13水平。
还提供治疗患有哮喘(或Th2相关疾病)的患者的方法，所述方法包括使用IMPACTIL-13测定法，将患者诊断为有升高的IL-13水平，向哮喘患者施用治疗有效量的Th2途径抑制剂，判断患者的IL-13状态并且如果IL-13状态升高或高于参比水平，则用Th2途径抑制剂再治疗该患者。可以单独或与FENO水平、骨膜蛋白水平、血液嗜酸性粒细胞水平或IgE组合使用免疫测定法(例如，IMPACT IL-13)，进行诊断。
本文中提供的任何Th2途径抑制剂可以用于本文所述的治疗方法，尤其用于哮喘中。在一个实施方案中，哮喘患者正在用皮质类固醇治疗，并且已经使用本文所述的免疫测定法，判断为对Th2途径抑制剂有反应。在又一个实施方案中，哮喘患者正罹患中度至重度哮喘。在另一个实施方案中，该患者患有轻度哮喘，但是并未正在用皮质类固醇治疗。
本发明的抗体(和任何额外的治疗药)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、推注施用和冲击输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程、抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的一个示例性剂量将处于约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每三周(例如，从而，患者接受约两剂至约二十剂或例如约六剂抗体)。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
在某些实施方案中，将本发明的抗体按37.5mg的固定剂量(即，不依赖体重)或125mg的固定剂量或250mg的固定剂量施用。在某些实施方案中，通过每4周一次皮下注射，施用该剂量，持续一段时间。在某些实施方案中，该时间段是6个月、一年、两年、五年、十年、15年、20年或患者终生。在某些实施方案中，哮喘是重度哮喘并且患者在使用吸入型皮质类固醇加第二控制药物未充分得到控制或未控制。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明免疫缀合物替代抗靶标抗体或除抗靶标抗体之外，还使用本发明免疫缀合物来实施。
制品
在本发明的另一个方面，提供一种制品，所述制品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制品包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或药品说明书说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性剂或治疗药。在本发明的这个实施方案中制品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的药品说明书。备选或额外地，该制品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料、包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代抗靶标抗体或除此之外，前述任一者制品可以包含免疫缀合物。
实施例
实施例1–免疫测定方法
人血清样品：如下文所示，对于实施例1-3中描述的实验，我们使用来自健康志愿者(HV)的血清样品表征市售的 IL-13免疫测定法或IMPACT IL-13测定法。这些健康志愿者样品从内部血液捐赠程序获得(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,美国；Roche Professional Diagnostics,Penzberg,德国)。此外，如下文所示，来自哮喘、IPF或特应性皮炎患者的血清样品购自BioreclamationIVT(New York,美国)。
先前已经描述免疫学多参数芯片技术(IMPACT)平台。参见，例如，WO 2007/039280和Claudon等人,Clinical Chemistry 54(9):1554-1563。下文是该平台和一般方法的简要总体描述，随后描述IMPACT IL-13测定法。
IMPACT技术基于使用链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用制造的表面积约2.5x6mm的黑色聚苯乙烯芯片。芯片表面用链霉抗生物素蛋白层包被，其中使用喷墨技术，将第一生物素酰化捕获抗体(其与分析物特异性结合)点到所述链霉抗生物素蛋白层上。每个点的直径是约150μM。在测定法期间，将芯片与含有分析物的标本样品和表位特异性不同于第一抗体并特异性结合分析物的第二洋地黄毒甙化单克隆抗体温育。第三检测抗体是与萦光乳胶缀合物偶联的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。先前报道(Claudon等人,ClinicalChemistry 54(9):1554-1563)，使用这种标记物，可以在单个点中检出小于十个独立结合事件，产生极高灵敏度。将芯片转运入检测单元并且电荷耦合元件(CCD)照相机生成图像，其中使用专用软件，将所述图像变换成信号强度。各个点自动地定位在预定位置并通过图像分析定量。已经使用IMPACT平台成功地检出和定量分析物，所述分析物包括抗CCP抗体、抗核抗体、I型胶原蛋白的血清C末端交联端肽、I型胶原蛋白的N末端前肽、骨钙蛋白和完整甲状旁腺激素。作为单次测定法运行时，这些分析物的报告灵敏度(作为LLOQ报告)是0.087μg/L(0.087ng/mL)至4.9ng/L(4.9pg/mL)(上文)。
我们将二种不同的专有(专利)抗IL-13抗体分别作为捕获试剂和检测试剂，用于IMPACT IL-13测定法。第一抗IL-13抗体(“捕获抗体”)是先前已经描述的来金珠单抗(也称作MILR1444A)。参见，例如，WO 2005/062967和Ultsch等人,J.Mol.Biol.425:1330-9(2013)。第二抗IL-13抗体(“检测抗体”)是先前也已经描述的11H4，参见，例如，WO 2014/165771。使用本领域已知的标准程序，制备并生物素酰化F(ab’)2来金珠单抗。将生物素酰化的来金珠单抗F(ab’)2点到如上文所述的链霉抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯芯片上，每芯片具有直径160μM的60个相同点。为了启动测定法，将样品用含有75mM磷酸氢二钾、25mM磷酸二氢钾、150mM NaCl、0.01％甲基异噻唑啉酮、0.01％0.16％20、0.08％聚多卡醇、2mM EDTA、2％BSA、1％牛IgG、5％马血清(Sigma，目录号H1470)的样品缓冲液(样品缓冲液(pH 7.25)稀释。将12μL样品用28μL样品缓冲液稀释并且在36℃与芯片温育18分钟。通过用0.8mL洗涤缓冲液洗涤芯片5秒终止反应(洗涤缓冲液的组成如下：10mM Tris-Cl、pH 8.0、0.001％盐酸甲基异噻唑(MIT)、0.001％Oxy-Pyrion、0.01％聚多卡醇)。使用本领域熟知的标准方法，用洋地黄毒甙标记第二抗IL-13抗体，全长11H4(IgG1)。为了检测，依次添加洋地黄毒甙化的抗IL-1311H4抗体和与萦光标签标记的乳胶缀合的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。通过用2.0mL洗涤缓冲液洗涤芯片10秒，终止反应，随后使用抽吸过程干燥10秒。使用CCD-检测器检测萦光强度并使用如上文所述的专利软件定量。重组人IL-13(R&D Systems,MN，目录号213-ILB/CF)用来产生量程从2-1000pg/ml的标准曲线；在以下缓冲液中制得重组人IL-13稀释物：20mM磷酸钾pH 7.35、50mM NaCl、4.0％蔗糖、2.0％BSA、0.2％牛IgG、0.01％MIT、0.01％0.2％
还使用一种用于检测并定量人血清和血浆中IL-13水平的市售IL-13测定法的。这种市售IL-13测定法是 IL-13免疫测定试剂盒从#来自(Alameda，CA)(第1版(目录号03-0069-00)不再可获得；市售的第2版(目录号03-0109-xx)未用于本文所述的实验中并且具有0.04pg/mL的报道LLOQ[ IL-13(v2)免疫测定试剂盒，目录号03-0109-xx，产品信息表在www.singulex.com可获得])。除非指明，否则根据生产商的说明执行 IL-13免疫测定法第1版。
实施例2–市售IL-13测定法和优化工作
使用生产商的推荐分析条件，我们检验了来自哮喘患者的十份血清样品。这10份样品中9份(90％)具有高于LLOQ 0.39pg/mL的可检出IL-13水平，该LLOQ由生产商规定。定量的IL-13水平范围从0.64pg/mL至1.75pg/mL(图1)。通过样品与过量捕获抗体预温育检验IL-13的分析特异性。预温育在室温实施一小时。这称作评估特异性的竞争方法或免疫耗竭方法。使用这种方法，有效竞争来自六份哮喘血清样品的分析信号至低于LLOQ的水平(图1)。但是，未有效竞争来自IL-13水平较高的四份哮喘血清样品的分析信号，这表明缺少特异性。这些样品中明显非特异的信号似乎明显，生成范围从0.45pg/mL至1.28pg/mL的信号(图1)。
上文讨论的特异性评估的结果表明， IL-13免疫测定法的特异性并非最佳。因此，我们探索修改生产商推荐的样品稀释剂分析条件和要求的最低稀释度是否将改善特异性。分析来自三名HV的血清样品，根据生产商的推荐(纯粹)或备选地，将这些样品用生产商的高盐缓冲液1:1(V/V)稀释。图2A显示，遵循生产商的推荐，每份HV样品中的IL-13高于LLOQ，然而，不能通过与包被在微粒子珠上的过量捕获抗体(25μg捕获抗体/mg微粒子珠)预温育，竞争含有最高IL-13水平的HV样品。因此，这个结果与使用十份哮喘血清样品所获得的先前结果一致(比较图2A与图1)。与之相反，通过与包被在微粒子珠上的过量捕获抗体(25μg捕获抗体/mg微粒子珠)预温育，每份HV样品的1:1(V/V)高盐缓冲液稀释物展示有效竞争，因为检出的分析信号低于修改的分析LLOQ 0.78pg/mL(图2B，右侧)，显示高盐的确增加分析特异性。注意将LLOQ从0.39pg/mL修改至0.78pg/mL，以解释样品的两倍稀释物。但是，仅一份HV样品显示信号高于修改的分析LLOQ，从而表明以灵敏度为代价，获得了改善的特异性(图2B，左侧)。
接下来，使用修改的分析条件，我们测量了来自哮喘(n＝10)和IPF患者(n＝10)和HV(n＝10)的血清样品中的IL-13水平。在仅40％(n＝10)的哮喘患者样品、40％(n＝10)的IPF患者样品和10％(n＝10)的HV样品(图3)中可检测IL-13水平。通过测定法中检验之前与包被在微粒子珠上的过量捕获抗体(25μg捕获抗体/mg微粒子珠)预温育，证实了IL-13分析信号的特异性。哮喘患者样品中观测的IL-13水平在0.78pg/mL至1.05pg/mL之间、IPF患者样品中在0.89pg/mL至1.56pg/mL之间；仅一份HV样品具有可检测的IL-13水平：1.25pg/mL(图3)。
基于上述结果，我们得出结论： IL-13免疫测定法并不足够灵敏和特异以允许检测并精确定量患有多种Th-2相关疾病的大部分患者中的血清IL-13水平。如上文讨论，需要高度灵敏和高度特异的血清IL-13测定法，从而可以精确地定量健康个体中和各种Th-2相关疾病状态下的血清IL-13水平。精确定量血清IL-13水平将允许健康个体和各种Th-2相关疾病状态之间比较，这可以深入了解疾病机制和进展以及鉴定可能从靶向IL-13途径或Th2途径的治疗性干预获益最大的患者。精确定量血清IL-13水平将还促进研究某些靶向IL-13的治疗药以及某些针对Th2途径中其他靶标的治疗药的药效动力学作用。
实施例3–IMPACT IL-13测定法开发和表征
为了开发高度灵敏和高度特异的血清IL-13测定法，我们始于检验八种不同IL-13抗体的配对组合，这些抗体中一些为市售并且一些通由Genentech生产。下表2列出抗体对。对于56个配对组合中的每一者，使用样品缓冲液(参见实施例1样品缓冲液组成)中的100pg/mL重组IL-13，我们测定负(空白)信号和正(特异性)信号和正信号/负信号的比率。通过表2中的灰色框鉴定出提供最佳正信号/负信号比(即最高正信号[“Pos”]和最低负信号[“Neg”]或信/噪比)的抗体对组合，并且选择这种组合供进一步测定法优化。具体而言，这个最佳抗体对组合是MILR1444A作为捕获抗体和11H4作为检测抗体。
表2.针对负分析信号和正分析信号的抗IL-13抗体
a除非另外指明，否则全部抗体均为Genentech专有(专利)抗体。全部抗体均为鼠抗体，MILR1444A例外，其为人源化小鼠抗体。
b R&D Systems,MN,目录号MAB213
c R&D Systems,MN,目录号AF213-NA
如表2中所示，以228B/C作为捕获抗体的结果不同预以MILR1444A作为捕获抗体的结果。MILR1444A-11H4正/负比率是22,753并且228B/C-11H4正性/负比率是316.87。令人惊讶的是这些结果不同，因为MILR1444A是228B/C的人源化变体。这两种抗体不仅具有相同的CDR，还具有相似的IL-13亲和力(参见，例如，WO 2005/062967)，因此这表明捕获抗体对抗原和/或表位的亲和力不是分析正/负比率的唯一贡献因素。此外，我们观察到，当捕获抗体保持恒定时，检测抗体影响正/负比率。使用MILR1444A作为捕获抗体和以不同亲和力结合不同表位的不同检测抗体(即，14C9、4D7、8C11、MAB213和AF-213-NA)，产生了广泛类型的正/负比率(表2)。总之，表2中提出的捕获抗体和检测抗体的配对分析显示，在实施本实验之前，并不能从抗体的已知信息(例如，表位、亲和力)预测捕获抗体和检测抗体的最佳组合。
在以下实验中，我们使用样品缓冲液(参见实施例1样品缓冲液组成)和检测缓冲液(组成(pH 8.5)包含80mM TAPS、500mM氯化钠、0.01％甲基异噻唑啉、0.01％0.08％0.04％聚多卡醇、0.3％BSA、0.25％牛IgG和0.1％酪蛋白)。如上文所述，确定最佳的抗IL-13抗体对是来金珠单抗(也称作MILR1444A)，其中对于第一(捕获)抗体，在一些实施方案中，所述单抗是F(ab’)2并且在一些实施方案中其为Fab，并且对于第二检测抗体，其为11H4。
在已经选择最佳抗IL-13抗体对后，如下文描述，我们继续确定分析内精度、分析间精度、LLOQ、准确度和线性度/平行性和来自可溶性IL-13Rα2的干扰。对于这些评估，我们使用来自健康志愿者的血清样品表征IMPACT IL-13测定法。这些健康志愿者样品从内部血液捐赠程序获得(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,美国；Roche ProfessionalDiagnostics,Penzberg,德国)。
通过在12次重复测定中测量样品，评估分析内精度，所述重复测定分布在三台不同仪器上进行的持续时间至少八小时的试验内部。使用天然IL-13水平在0.17pg/mL和7.5pg/mL之间的六份人血清样品。使用重组IL-13作为标准品，获得这些值。两份额外血清用重组人IL-13内标以检查2位数字和3位数字pg/mL浓度范围的精度。分析内精度范围从1.5％-3.8％CV并且分析间精度范围从3.1-5.1％(表3)。
表3.IMPACT IL-13分析性能总结
a除非另外指明，否则使用含有天然IL-13的血清样品
b含有天然IL-13血清样品用重组IL-13内标
c天然IL-13的平均观测浓度水平(n＝24次试验)
dN.D.；未测定
通过使用下述稀释系列的分析间精度(一式两份测量样品，n＝8次试验，使用三台不同仪器)表征，确定定量下限(LLOQ)，所述稀释系列含有来自不同供体并按0.002-0.11pg/mL浓度范围，具有不可检出IL-13水平的流体(马血清，样品稀释剂)内标的内源IL-13。LLOQ定义为变异系数(CV)小于或等于20％的IL-13最低浓度。为了确定测定法的LLOQ，评估天然IL-13样品和重组IL-13样品的量值的精度。通过分析间精度确定LLOQ并且发现其为0.014pg/mL，实现小于20％CV的IL-13最低浓度(表3)。
通过向哮喘患者血清样品内标30pg/mL重组人IL-13，评估准确度。将样品在室温温育1小时并且随后在如上文所述的IMPACT IL-13测定法中分析。通过用分析稀释剂进行哮喘血清样品的系列1:1(V/V)稀释，评估平行性。随后在如上文所述的IMPACT IL-13测定法中分析稀释的样品。在34/35份受检哮喘样品中，回收率是87-102％(表3)。使用样品稀释剂，通过分析稀释系列中的5份样品评估平行性。回收率在95-105％之间，显示平行性可接受(表3)。
科学文献中关于外周血内存在或不存在某形式的IL-13Rα2受体的报道是矛盾的，其中如果存在，所述受体可能潜在地干扰IL-13测定法。Kasaian等人,J.Immunol.187:561-9(2011)；O’Toole等人,Clin Exp Allergy 38:594-601(2008)。通过添加2-1000pg/mLsIL-13Rα2(R&D Systems,MN,目录号614-INS)至健康对照血清样品，评估sIL-13Rα2干扰IL-13检测的可能性。将样品在室温温育1小时并且随后在如上文所述的IMPACT IL-13测定法中检验。在2-1000pg/mL sIL-13Rα2存在下未检测到对检测IL-13的能力的显著干扰(数据未显示)。
IMPACT IL-13分析特异性和来自哮喘患者、IPF患者和特应性皮炎患者的血清中 的IL-13水平。
使用IMPACT IL-13测定法，测定来自哮喘患者或IPF患者和来自健康志愿者(哮喘n＝34，IPF n＝32，和HV n＝10)的血清样品中的IL-13水平。除哮喘患者样品和IPF患者样品(也使用 IL-13免疫测定法检查所述样品)之外，还在IMPACT IL-13测定法中检查来自特应性皮炎患者(n＝25)的血清。全部受检样品均具有可检测的IL-13水平，无论它们是否从Th2相关疾病患者或从健康志愿者获得，水平为0.11pg/mL至4.22pg/mL(图4)。这个样品集合中检出的最低IL-13水平是0.11pg/mL，高于LLOQ超过9倍。
鉴于随如上文所述的 IL-13免疫测定法观察到的特异性问题，我们评价IMPACT IL-13测定法的特异性。通过以下方式评估特异性：将血清样品与过量水平(100μμg/mL)的捕获抗体(第一抗体)在室温预温育一小时，之后，在如上文所述的标准条件下进行IMPACT IL-13测定法。如图4中所示，有效耗竭来自全部受检样品(n＝101)的IL-13分析信号至LLOQ水平以下，从而证实IL-13量值的特异性。
检出和定量的血清IL-13水平范围和中位值如下：在健康志愿者中，该范围是0.11pg/mL至2.25pg/mL并且中位数是0.36pg/mL(n＝50)；在哮喘患者中，该范围是0.16pg/mL至2.73pg/mL并且中位数是0.64pg/mL(n＝34)；在IPF患者中，该范围是0.24pg/mL至2.15pg/mL并且中位数是0.71pg/mL(n＝32)；在特应性皮炎患者中，该范围是0.17pg/mL至4.22pg/mL并且中位数是0.82pg/mL(n＝25)(参见图5)。尽管健康志愿者中的血清IL-13水平与Th2相关疾病中的水平重叠，但每份哮喘、IPF和特应性皮炎血清样品的中位血清IL-13水平高于健康志愿者的对应水平。进行Mann-Whitney检验以分别比较HV和哮喘、IPF或特应性皮炎之间的均数。每个比较的P值<0.0001。(图5，表4)。
表4.通过IMPACT IL-13测定法测定血清IL-13水平。
IL-13免疫测定法和IMPACT IL-13测定法之间的比较
鉴于 IL-13免疫测定法使用的抗IL-13抗体不同于随IMPACT IL-13测定法所用的那些，我们不能直接比较平台和IMPACT平台的分析性特征。例如，随 IL-13免疫测定法观察到的明显基质干扰作用(Fraser S等人,Bioanalysis6:1123-9[2014])可能是捕获和检测的抗体试剂的反映。可能的是，如果IMPACT IL-13测定法已经使用与 IL-13免疫测定法相同的分析试剂，则可能已经观察到相似的特异性问题。
然而，生物标志物免疫测定方法的重要方面是检出大部分疾病状态样品中天然生物标志物的能力。因此，直接比较两种测定法的务实替代性方案是比较两种方法检测相同患者样品组中天然形式的生物标志物的能力。用修改的 IL-13免疫测定法和用IMPACT IL-13测定法共同检验的30份血清样品(HV[n＝10]、哮喘患者[n＝10]和IPF患者[n＝10])当中，9样品显示高于两种测定法中相应LLOQ的可检测IL-13水平。比较通过每种测定法获得的IL-13水平，得出Pearson相关系数0.65，其中与修改的 IL-13免疫测定法相比，IMPACT IL-13提供相对较高的IL-13水平(数据未显示)。IL-13定量的差异可以是归因于方法中所用参比物质的差异。还可能的是，使用修改的 IL-13免疫测定法检测IL-13受sIL-13Rα2存在的干扰，即如上文所述，我们在受检浓度对IMPACT IL-13测定法排除的可能性。
我们还检验了利用夹心原理的不同市售免疫测定法(R&D Systems ELISA，人IL-13免疫测定法，目录号D1300B)，所述测定法据报道具有3.46-57.4pg/mL之间的血清中最低可检出IL-13量，其低于上文描述的原始IL-13免疫测定法或修改的 IL-13免疫测定法的灵敏度至少10倍至20倍。遵循生产商的说明，我们发现分析标准曲线精度是次优的，低于125pg/mL。另外，使用R&DSystems ELISA试剂盒时，IL-13信号在任何哮喘样品(0/25)中未检出，然而使用IMPACT IL-13测定法时，其在全部相同的哮喘样品中均可检出(25/25)(数据未显示)。
总之，我们开发了一种检测和定量血清IL-13的免疫测定法，其中令人惊讶地和不可预测地，所述免疫测定法既高度灵敏，又高度特异。我们证明这种测定法(IMPACT IL-13)能够特异性检出并精确定量血清中fg/mL水平的IL-13。我们认为这是具有如此高灵敏度和特异性的血清IL-13测定法的首次描述。IMPACT IL-13测定法中所用的分析试剂或许是分析灵敏度和特异性高的关键贡献因素，因为检验了众多不同的抗IL-13抗体对并且这些抗体对中仅一种符合所需的分析性能标准。
此外，使用IMPACT IL-13测定法，我们在健康志愿者和患有Th2相关疾病即哮喘、IPF和或特应性皮炎的患者中测量了循环型IL-13水平。我们发现，大部分健康志愿者具有的IL-13水平低于Th2相关疾病患者中存在的中位IL-13水平。因此，这个结果表明，将患者根据血清IL-13水平分层供靶向Th2途径的治疗药治疗可能是一种有用方法，这个假设在下述实施例中探索。
实施例4–血清IL-13水平预测对来金珠单抗治疗的反应性并预示哮喘加重
充分证实，不同的生物标志物血清骨膜蛋白、血液嗜酸性粒细胞、FeNO和血清IgE反映哮喘患者中Th2炎症的生物学。还已经显示在某些临床研究中，因源于治疗性干预Th2途径的临床获益和另外在某些病例中富集的每种生物标志物是反映药物有效性的预后生物标志物或药效动力学生物标志物(参见，例如，Arron JR等人,AnnalsATS 2013；10(增刊):S206-13[2013]；Nair等人,New Engl.J.Med.360(10):985-93[2009]；Pavord等人,Lancet 380(9842):651-9[2012]；Bel等人,New Engl.J.Med.371(13):1189-97[2014]；Ortega等人,New Engl.J.Med.371(13):1198-207[2014]；Castro等人,Lancet Resp.Med.2(11):879-90[2014])。使用上文描述的IMPACT IL-13测定法，我们力图评估外周IL-13水平和其他Th2哮喘生物标志物(血清骨膜蛋白、血液嗜酸性粒细胞、FeNO和血清IgE)之间的关系以及评价外周IL-13水平作为来金珠单抗预示性生物标志物和疾病预后性生物标志物。
来金珠单抗IIb期临床研究
实施两项IIb期研究，其为重复、随机分组、多中心、双盲、安慰剂对照研究。患者按1:1:1:1比率随机分配，以每4周皮下接受来金珠单抗37.5mg、125mg、250mg或安慰剂。随机分配依据基线血清骨膜蛋白、最近12个月内哮喘加重史和基线哮喘用药分层。全部患者将保持采用其医护标准疗法，所述疗法由500–2000μg/天ICS疗法(丙酸氟替卡松DPI或等同物)和第二种合格哮喘控制药物组成。Hanania等人,Journal of Allergy and ClinicalImmunology,第133卷,第2期,AB402(2014)(摘要)中更详细地描述了这些研究和结果。
尽管每天使用500–2000μg/日丙酸氟替卡松DPI或等同物和第二哮喘控制药物仍未控制的18–75岁患者，符合纳入研究的资格。合格的第二控制药物包括长效β激动剂、白三烯受体拮抗剂、长效毒蕈碱拮抗剂或茶碱。
纳入标准包括：哮喘诊断≥12个月；支气管扩张剂反应(≥12％相对改善)；支气管扩张剂前FEV1为预测值的40％–80％。未控制的哮喘是定义为哮喘控制调查问卷-5(ACQ-5)评分≥1.5和以下至少一者：症状>2天/周；夜间苏醒≥1次/周；使用短效β激动剂作为急救药物>2天/周；或干扰正常日常活动。如果患者已经在先前3个月内接受口服皮质类固醇维持治疗或在先前4周内因任何原因而接受全身性皮质类固醇治疗，则排除他们。排除标准包括：对生物药剂的重度过敏反应或超敏反应史或对来金珠单抗注射剂的任何成分的已知超敏反应史；口服皮质类固醇维持治疗，其定义为在访视1之前3个月内每日或隔日口服皮质类固醇维持疗法；在访视1之前4周内或在筛选阶段期间的任何时间因任何原因(包括急性加重事件)而用全身性(例如，口服、IV或IM)皮质类固醇类治疗或在访视1之前4周内或在筛选阶段期间的任何时间用关节内皮质类固醇类治疗；重大感染发作；已知的免疫缺陷，包括但不限于HIV感染；急性或慢性肝炎或已知肝硬化的证据；囊性纤维化史、COPD、和/或除哮喘之外的其他有临床意义的肺疾病；已知的当前恶性肿瘤或潜在恶性肿瘤的当前评价；当前吸烟者或吸烟史>10包年的前吸烟者；目前使用或在访视1之前3个月或5个药物半寿期内既往使用免疫调节/免疫抑制疗法；在访视1之前在6个月期间的任何时间使用生物治疗(包括奥马佐单抗)；在访视1之前4周期间的任何时间使用齐留通或罗氟司特；在访视1之前3个月内传统草药药物治疗变应性疾病或哮喘；在访视1之前3个月内启用或改变过敏原免疫治疗；用研究性药物治疗在访视1之前30天内(或研究性药物的5个半寿期，以较长者为准)；在访视1之前4周内接受减毒活疫苗；体质指数>38kg/m2；体重<40kg。
这些研究中评价以下疗效和安全性评估结果。主要终点是安慰剂对照时间期间的哮喘加重率。哮喘加重定义为导致全身性皮质类固醇治疗或住院的新发或增加的哮喘症状。全身性皮质类固醇治疗定义为口服、静脉内(IV)、或肌内(IM)皮质类固醇治疗≥3天或≥1剂IV或IM皮质类固醇类的急诊室就诊。在每次研究访视，由研究者使用直接提问以评估患者自最后访视以来是否已经出现任何哮喘加重，评估哮喘加重。预先规定，将在骨膜蛋白高组和骨膜蛋白低组中(基于50ng/mL血清骨膜蛋白的分界点)分别评价主要临床终点和全部次要临床终点。在这项研究期间自始至终评肺量测定法(支气管扩张剂前和后)。采集的肺量测定指标包括FEV1、FVC(以升计的体积)和PEF(升/分钟)。使用从如Hankinson等人,AmJ Respir Crit Care Med 159:179-87(1999)描述的国家健康和营养检查调查数据集衍生的等式，从这些体积量值导出预测的FEV1和FVC的百分数。数据的可接受性，包括方法(manuver)的图示，是由盲人监管判读者(over-reader)确定的。将可接受方法的重现性计算编程。末剂短效支气管扩张剂应当是在检验之前至少4小时，末剂LABA应当是在在检验之前至少12小时，并且末剂LAMA应当是在检验之前至少24小时。对于未正确准备好供检验的患者(例如，已经在抵达前服用支气管扩张剂)，重新安排访视。在一种计算机化肺量测定***，带6800肺量计的 (Vitalograph；Ennis，爱尔兰)上进行肺量测定法测量，所述***针对研究的要求和根据ATS/ERS公开的指南(肺量测定法标准化)(Miller等人,Eur Respir J 26:319-38[2005])设置。峰流量/电子日记装置用于每日一次测量最大呼气流量(PEF)(在早晨5点和11点之间)并记录哮喘急救药物治疗和控制剂使用情况。向患者提供一种手持式峰流量/日记装置2120 In2itive e-Diary(Vitalograph)，以便每日一次测量PEF和研究期间记录哮喘挽救和控制药物使用情况的电子日志。
预先指定的次要临床终点是支气管扩张剂前FEV1从基线至第52周的相对变化、安慰剂对照时间期间至首次哮喘加重的时间、从基线至第52周哮喘特异性健康相关生活质量量值的变化、哮喘生活质量问卷调查(标准化；[AQLQ(S)])、从基线至第52周的哮喘急救药物使用情况的变化、安慰剂对照时间期间哮喘相关的紧急卫生保健利用(即住院、急诊科就诊、和紧急护理就诊)比率。安全性终点是在安慰剂对照期和随访期的不良事件(AE)比率与严重程度和研究期间相对于基线的抗治疗性抗体(ATA)的发生率。使用滴定的ATA分析策略评估来金珠单抗的免疫原性。
如下实施生物标志物评估。使用手持式便携式装置(NIOX Aerocrine；Solna,瑞典)根据美国胸科学会指南(ATS/ERS建议,Am J Respir Crit Care Med 171:912-30[2005])，在基线时和在每次后续研究访视评估FeNO。在筛选、基线和每次后续研究访视时采集血清以评价骨膜蛋白水平。在Cobas e601平台上使用骨膜蛋白测定法(Roche Diagnostics,彭茨贝格,德国)测量骨膜蛋白，所述平台是利用夹心原理的电化学发光免疫测定法。研究期间，患者、医师和研究机构工作人员不知道FeNO值和骨膜蛋白值。使用中心实验室，在筛选时、基线和在每次后续研究访视(始于第4周)根据标准临床实验室程序进行血液学评估，包括外周血嗜酸性粒细胞计数和血清IgE水平，并且从随机分组起对研究机构设盲。
如Hanania等人,Journal of Allergy and Clinical Immunology,第133卷，第2期,AB402(2014)(摘要)报道、在尽管给予吸入性皮质类固醇治疗和额外的控制剂，但重度哮喘仍未控制的患者中，与骨膜蛋白高的患者中的安慰剂相比，每4周皮下施用的来金珠单抗降低哮喘加重率60％(95％CI 18,80)，并且与骨膜蛋白低的患者中的安慰剂相比，降低5％(95％CI 81,47)。此外，在骨膜蛋白高的患者中，来金珠单抗积极地影响肺功能，如依据FEV1的变化所测量。来金珠单抗总体上良好耐受并且未观察到临床上重要的安全性信号。这些结果扩展了先前描述的研究结果并且支持以下研究结果：基线骨膜蛋白水平可以预示来金珠单抗治疗益处。
相对于生物标志物FeNO、外周血嗜酸性粒细胞和血清骨膜蛋白，报告以下结果。在安慰剂组和来金珠单抗37.5mg组以及骨膜蛋白低的患者中，基线FeNO水平较低。在骨膜蛋白高的患者中第12周时相对于安慰剂的变化是不同来金珠单抗剂量组之间-3.9至-12.5/十亿份(ppb)。相对于安慰剂，第12周时骨膜蛋白低的患者中各FeNO均数之间的差异是各来金珠单抗给药组之间-8.9至-11.0ppb。外周血嗜酸性粒细胞的基线水平在各来治疗组组之间完全均衡。第12周时，随来金珠单抗、特别在骨膜蛋白高的个体中血液嗜酸性粒细胞绝对水平小幅增加。骨膜蛋白高的患者中，安慰剂修正的变化为0.29至0.56x103/μL并且在骨膜蛋白低的组中，为-0.01至0.07x103/μL。在骨膜蛋白高的组中，外周血嗜酸性粒细胞增加似乎为剂量依赖性，37.5mg显示最小变化。已经先前报道外周血嗜酸性粒细胞计数的变化(Corren J等人,N Engl J Med 365:1088-98[2011]；Scheerens H等人,[摘要]Am JRespir Crit Care Med 185:PA3960[2012])，并且这些变化可以反映IL-13活性的阻碍情况。血液中增加的嗜酸性粒细胞计数可以归因于从血液至气道的移行减少，归因于趋化减少(Blanchard C等人,Mucosal Immunol 1:289-96[2008]；Johansson MW等人,Am JRespir Cell Mol Biol 48:503-10[2013])。不同治疗组之间血清骨膜蛋白的基线水平也充分均衡，全部治疗组之间的中位(第7日)值为47.9ng/mL。在第12周，来金珠单抗治疗后，骨膜蛋白高的个体中存在安慰剂修正的骨膜蛋白下降3.7–8.3％并且骨膜蛋白低的个体中存在微小变化。不存在骨膜蛋白水平剂量依赖性变化的明确证据。
血清IL-13测量和分析
IMPACT IL-13测定法用来测定来自上文描述的IIb期研究的总计329份患者血清样品中基线时(第0周)的血清IL-13水平。遵循上文描述的IMPACT IL-13测定法，将每份血清样品一式两份测量。将每份样品中的最终IL-13水平报告为具有变异系数百分数(％CV)≤15％的重复量值的平均浓度。％CV>15％的重复量值视为无效并从分析排除。此外，评价每份样品的加标回收率。在分析程序之前，将30pg/mL重组人IL-13内标至每份内源样品等份中。加标回收率<80％的样品认定测量无效并从分析排除。
实施以下统计分析。使用JMP 10.0.2(SAS Institute,Cary,NC)进行基线时血清IL-13水平、血液嗜酸性粒细胞水平、血清骨膜蛋白水平、FeNO水平和血清IgE水平的非参数斯皮尔曼等级相关性分析。IL-13高亚组和IL-13低亚组依据所测量IIb期患者样品的中位血清IL-13水平分层。在第1、第4、第8和第12周根据研究组计算FEV1平均距基线变化(SE)百分数。第12周分析是用于FEV1药效评价。假设不等方差，通过t检验分别比较在每个治疗组和安慰剂组之间的平均距基线变化百分数。因此计算各均数之间的差异和相关的双侧95％置信区间。通过以下方式估计安慰剂对照的治疗阶段期间研究方案确定的加重哮喘率：治疗阶段期间这类加重的总数除以每个组中治疗阶段的总时间(年)。使用具有过度离散的泊松回归模型，分别比较每个治疗组和安慰剂组之间的加重率。报告治疗组和安慰剂组之间加重率减幅的双侧95％置信区间。对于预后分析，向泊松回归模型添加IL-13作为连续协变量，以针对来自安慰剂患者的数据拟合。对于这项分析，移除极端观察结果42.93pg/mL IL13以避免不当影响。一项移除另一个有影响力值8.5pg/mL的灵敏度分析产生始终如一的结果。
血清IL-13结果和与其他Th2生物标志物的相关性
如上文所述，我们测量了329份患者样品中的血清IL-13水平。四个样品具有无效量值并且从进一步分析排，具体而言，一份样品无可检出水平，一份具有重复量值之间超过15％的CV％并且二份具有小于80％的加标回收率。因此，IL-13检出速视为98.5％(324/329)。这324份患者样品中的血清IL-13水平为0.053至42.935pg/mL，中位数是0.785pg/mL。平均(95％CI)水平是1.172pg/mL(0.898,1.446)。(表5)。
表5.基线时IIb期研究中的生物标志物水平分布。
接下来，我们评估血清IL-13水平与其他Th2生物标志物(具体而言，血液嗜酸性粒细胞、血清骨膜蛋白、FeNO、血清IgE)的相关性。如图6中所示，基线时(第0周)，血清IL-13水平与血液嗜酸性粒细胞计数强相关，但与血清骨膜蛋白水平、FeNO水平和血清IgE水平弱相关。血清IL-13和血液嗜酸性粒细胞之间的斯皮尔曼等级相关系数(ρ)是0.66，而IL-13和血清骨膜蛋白、FeNO及血清IgE之间的斯皮尔曼ρ分别是0.36、0.31和0.36。尽管先前已经描述嗜酸性粒细胞、骨膜蛋白、FeNO和血清IgE之间的弱相关性并且因此预期如此，但是血清IL-13水平和血液嗜酸性粒细胞水平之间的强相关性令人惊讶并出人意料，并且就我们所知，先前尚未描述。这种强相关性表示，除单独的每种生物标志物之外，血清IL-13水平和血液嗜酸性粒细胞水平的组合尤其是提供信息的研究Th2相关疾病和Th2途径靶向治疗药的生物标志物。
基线血清IL-13水平预测对来金珠单抗治疗的反应性
使用血清IL-13中位数0.785pg/mL，将患者分层为血清IL-13高(血清IL-13≥0.785pg/mL)或血清IL-13低(血清IL-13<0.785pg/mL)。图7A(血清IL-13高)和图7B(血清IL-13低)显示与基线FEV1相比第12周时的平均FEV1变化百分数。在第12周，37.5mg和250mg来金珠单抗组中安慰剂归一化的平均FEV1距基线增加在血清IL-13高组中比血清IL-13低组中更大。对于37.5mg来金珠单抗组，血清IL-13高组中改善是3.51％(-4.98,12.00)，相比之下，血清IL-13低组中为-5.11％(-11.99,1.77)。对于250mg来金珠单抗组，血清IL-13高组中改善是9.04％(-0.54,18.62)，相比之下，血清IL-13低组中为1.05％(-7.00,9.11)。125mg来金珠单抗(lebribikizumab)组中的FEV1改善在血清IL-13高组和血清IL-13低组之间相似。(图7A和图7B、表6)。
表6.相对于安慰剂依据血清IL-13状态的第12周时FEV1中距基线变化的平均百分数。
IL-13高(≥0.785pg/mL) IL-13低(<0.785pg/mL)
LEB 37.5mg 3.51％(95％CI:-4.98,12.00) -5.11％(95％CI:-11.99,1.77)
LEB 125mg 1.82％(95％CI:-5.49,9.12) 2.33％(95％CI:-6.68,11.34)
LEB 250mg 9.04％(95％CI:-0.54,18.62) 1.05％(95％CI:-7.00,9.11)
图8显示，血清IL-13高组中安慰剂对照的治疗阶段期间估计的加重率减幅大于血清IL-13低组中。在血清IL-13高组中，37.5mg、125mg和250mg来金珠单抗组的加重率减幅分别是是70％(95％CI：-1％至93％)、38％(95％CI：-75％至80％)和11％(95％CI：-131％至67％)。同时在血清IL-13低组中，37.5mg、125mg和250mg来金珠单抗组的加重率减幅分别是10％(95％CI：-200％至74％)、-17％(95％CI：-263％至61％)和3％(95％CI：-223％至72％)。
我们还检验血清IL-13水平是否预示哮喘加重。血清IL-13高组中安慰剂组的加重率是0.76，并且在血清IL-13低组中是0.38(图8)。这个结果提示，在即便采用医护标准，但哮喘仍未控制的患者中，基线血清IL-13水平是加重的预后生物标志物。为了证实这个结论，将允许过度离散的泊松回归对来自安慰剂患者的数据拟合。这项分析对IL-13增加0.1pg/mL时的年度加重率增加产生因数1.03(95％CI：1.01至1.05)，这进一步支持血清IL-13水平预示加重的结论。
总之，使用IMPACT IL-13测定法测量了来自来金珠单抗IIb期临床研究的329名哮喘患者的样品中的基线血清IL-13水平。这些血清样品中的IL-13检出率是98.5％(324/329)。中位水平是0.785pg/mL。如上所述，基线血清IL-13水平与血液嗜酸性粒细胞计数强相关，并且与血清骨膜蛋白水平、FeNO水平和血清IgE水平弱相关。此外，血清IL-13水平预示患者对来金珠单抗治疗的反应性：与低血清IL-13组相比，高血清IL-13组中的患者展示从来金珠单抗治疗中临床获益更大，如依据加重率减幅和FEV1改善所评估。最后，我们还显示血清IL-13水平是安慰剂组患者的哮喘加重预后生物标志物，与安慰剂组、低血清IL-13组中的患者相比，高血清IL-13组显示更高的加重率。
鉴于与先前所述的Th2生物标志物评估相关的某些局限性和不便，开发了如本文所述的具有高灵敏度和高特异性的血清IL-13测定法并本文中证实血清IL-13水平预示靶向Th2途径的治疗药的治疗益处及还预示哮喘加重，它们代表了本领域的重要进展。
序列表

Claims (85)

1.用于检测和定量IL-13的免疫测定方法，其中方法能够以高灵敏度和高特异性检测和定量样品中的IL-13。
2.根据权利要求1所述的方法，其中确定灵敏度为定量下限(LLOQ)，其中LLOQ在0.1fg/mL和35fg/mL之间，或在1fg/mL和30fg/mL之间，或在5fg/mL和25fg/mL之间，或在10fg/mL和20fg/mL之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中LLOQ是14fg/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中方法是夹心免疫测定方法，并且包括特异性结合IL-13的第一单克隆捕获抗体和特异性结合IL-13的第二单克隆检测抗体，其中第一抗体与第二抗体结合不同的表位。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过抗原耗竭方法确定特异性，其中耗竭方法包括在进行免疫测定方法之前将样品与过量第一抗体温育。
6.根据权利要求5所述的方法，其中彻底耗竭样品中的抗原，因而产生低于免疫测定方法中LLOQ的信号。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中样品包含可溶性IL-13Rα2，并且可溶性IL-13Rα2不干扰免疫测定方法的灵敏度或特异性。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中第一抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HVR-L2和氨基酸序列SEQ ID NO:10的HVR-L3。
9.根据权利要求8所述的方法，其中第一抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的方法，其中第二抗体包含可变区，所述可变区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:13的HVR-H1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的HVR-H2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的HVR-H3，所述轻链可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:16的HVR-L1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HVR-L2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HVR-L3。
11.根据权利要求10所述的方法，其中第二抗体包含可变区，所述可变区包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:12的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的轻链可变区。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中第一抗体是抗体片段。
13.根据权利要求12所述的方法，其中抗体片段选自Fab、F(ab’)2、Fab’和Fv。
14.根据权利要求4-13中任一项所述的方法，还包括第三抗体，其中第三抗体与第二抗体特异性结合，并且第三抗体可检测地标记。
15.根据权利要求14所述的方法，其中第二抗体用半抗原标记，并且第三抗体是抗半抗原抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中半抗原是洋地黄毒甙，并且抗半抗原抗体是与萦光乳胶缀合的抗洋地黄毒甙单克隆抗体。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中样品是血清。
18.根据权利要求17所述的方法，其中样品是人血清。
19.预测患有哮喘或Th2相关疾病的患者对疗法的反应的方法，所述疗法包含Th2途径抑制剂，所述方法包括：
从患者获得生物样品，
使用权利要求1-18中任一项所述的方法测量IL-13的水平，
将样品中检测到的IL-13水平与参比水平比较，
并且
当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比升高时，预测患者将对疗法有反应，或当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比降低时，预测患者将对疗法无反应。
20.预测患有哮喘或Th2相关疾病的患者对疗法的反应性的方法，所述疗法包含Th2途径抑制剂，所述方法包括使用根据权利要求1-18中任一项所述的方法，测量来自患者的生物样品中的IL-13水平，其中与参比水平相比，升高的IL-13水平鉴定患者为一名可能对Th2途径抑制剂治疗有反应的患者。
21.鉴定患有哮喘或Th2相关疾病的患者为可能对疗法有反应的患者的方法，所述疗法包含Th2途径抑制剂，所述方法包括：
(a)使用根据权利要求1-18中任一项所述的方法，测量来自患者的生物样品中的IL-13水平；
(b)将(a)中测量的IL-13水平与参比水平比较，并且
(c)当(a)中测量的IL-13水平高于参比水平时，鉴定患者为更可能对包含Th2途径抑制剂的疗法有反应。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是以下对象的抑制剂：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab，INN编号910649-32-0)；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如，QGE-031；MEDI-4212；quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，或者是CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是IL-13途径抑制剂或抗IgE结合剂。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是抗IL-13抗体或抗IL-13双特异性抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗IL-13抗体是包含VH和VL的抗体，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；和
所述抗IL-13抗体是包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13抗体，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ IDNO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。
26.根据权利要求24所述的方法，其中抗IL-13双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；或包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ IDNO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列。
27.根据权利要求24所述的方法，其中抗IL-13双特异性抗体是抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体，或抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-17VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ IDNO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包括包含含有VH和VL的抗IL-17VH/VL单元，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
30.根据权利要求23所述的方法，其中Th2途径抑制剂是抗IgE抗体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中抗IgE抗体是(i)抗体或(ii)包含重链可变区和轻链可变区的抗IgE抗体，其中重链可变区是SEQ ID NO:22和轻链可变区是SEQID NO:23。
32.治疗患有哮喘或Th2相关疾病的患者的方法，所述方法包括：
(a)使用根据权利要求1-18中任一项所述的方法，测量来自患者的生物样品中IL-13的水平；
(b)将(a)中测量的IL-13水平与参比水平比较；
(c)当(a)中测量的IL-13水平高于参比水平时，鉴定患者为更可能响应包含Th2途径抑制剂的疗法；并且
(d)当(a)中测量的IL-13水平高于参比水平时，施用该疗法，因而治疗哮喘或Th2相关疾病。
33.治疗患者的哮喘或Th2相关疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的Th2途径抑制剂，其中与参比群体中的IL-13水平相比，已经确定从患者获得的生物样品具有升高的IL-13水平，其中已经通过权利要求1-18中任一项所述的方法确定IL-13的水平。
34.治疗患者的哮喘或Th2相关疾病的方法，包括向患者施用治疗有效量的Th2途径抑制剂，其中与参比群体中的IL-13水平相比，已经基于从患者获得的生物样品中升高的IL-13水平选择患者用于治疗，其中已经通过权利要求1-18中任一项所述的方法确定IL-13水平。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的方法，其中参比水平是参比群体中IL-13的中位水平。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是以下对象的抑制剂：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab，INN编号910649-32-0)；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如，QGE-031；MEDI-4212；quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，或者是CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。
37.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是IL-13途径抑制剂或抗IgE结合剂。
38.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中Th2途径抑制剂是抗IL-13抗体或抗IL-13双特异性抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗IL-13抗体是包含VH和VL的抗体，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；
所述抗IL-13抗体是包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13抗体，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ IDNO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗IL-13双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；或所述抗IL-13双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ IDNO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列。
41.根据权利要求38所述的方法，其中抗IL-13双特异性抗体是抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体，或抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-17VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-17VH/VL单元，所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
44.根据权利要求37所述的方法，其中Th2途径抑制剂是抗IgE抗体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中抗IgE抗体是(i)抗体或(ii)包含重链可变区和轻链可变区的抗IgE抗体，其中重链可变区是SEQ ID NO:22和轻链可变区是SEQID NO:23。
46.根据权利要求19-45中任一项所述的方法，其中患者正罹患中度至重度哮喘。
47.根据权利要求19-46中任一项所述的方法，其中哮喘或Th2相关疾病在使用皮质类固醇时未得到控制。
48.根据权利要求47所述的方法，其中皮质类固醇是吸入型皮质类固醇。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中正在用第二控制剂治疗患者。
50.根据权利要求19-49中任一项所述的方法，其中患者是人。
51.根据权利要求19-50中任一项所述的方法，其中样品是血清或血浆。
52.试剂盒的用途，用于确定从哮喘患者或Th2相关疾病患者获得的生物样品中的IL-13水平，以将患者分层为针对Th2途径抑制剂治疗性疗法的可能反应者和非反应者，其中通过权利要求1-18中任一项所述的方法确定IL-13水平。
53.根据权利要求52所述的用途，其中试剂盒的用途包括：
a)测量从患者获得的样品中的IL-13水平；
b)将a)中IL-13的水平与参比水平比较，并且
c)基于步骤b)中获得的比较结果，将所述患者分层为反应者或非反应者类别。
54.根据权利要求53所述的用途，其中参比水平是参比群体中IL-13的中位水平。
55.根据权利要求54所述的用途，其中如果从患者获得的样品中IL-13的水平处于中位水平或高于中位水平，则用途包括选择包含Th2途径抑制剂的疗法。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的用途，其中患者正罹患中度至重度哮喘。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的用途，其中哮喘或Th2相关疾病在使用皮质类固醇时未得到控制。
58.根据权利要求57所述的用途，其中皮质类固醇是吸入型皮质类固醇。
59.根据权利要求52-58中任一项所述的用途，其中还正在用第二控制剂治疗患者。
60.根据权利要求52-59中任一项所述的用途，其中Th2途径抑制剂是以下对象的抑制剂：ITK、BTK、IL-9(例如，MEDI-528)、IL-5(例如，美泊利单抗，CAS编号196078-29-2；resilizumab)、IL-13(例如，IMA-026、IMA-638(也称作，anrukinzumab，INN编号910649-32-0)；QAX-576；IL4/IL-13trap)、tralokinumab(也称作CAT-354，CAS编号1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)、IL-4(例如，AER-001、IL4/IL-13trap)、IL-17、OX40L、TSLP、IL-25、IL-33和IgE(例如，QGE-031；MEDI-4212；quilizumab)；和受体，例如IL-9受体、IL-5受体(例如，MEDI-563(benralizumab，CAS编号1044511-01-4)、IL-4受体α(例如，AMG-317、AIR-645、dupilumab)、IL-13受体α1(例如，R-1671)和IL-13受体α2、OX40、TSLP-R、IL-7Rα(TSLP的辅助受体)、IL17RB(IL-25的受体)、ST2(IL-33的受体)、CCR3、CCR4、CRTH2(例如，AMG-853、AP768、AP-761、MLN6095、ACT129968)、FcεRI、FcεRII/CD23(IgE的受体)、Flap(例如，GSK2190915)、Syk激酶(R-343、PF3526299)；CCR4(AMG-761)、TLR9(QAX-935)，或者是CCR3、IL5、IL3、GM-CSF的多重细胞因子抑制剂(例如，TPI ASM8)。
61.根据权利要求60所述的用途，其中Th2途径抑制剂是IL-13途径抑制剂或抗IgE结合剂。
62.根据权利要求60所述的用途，其中Th2途径抑制剂是抗IL-13抗体或抗IL-13双特异性抗体。
63.根据权利要求62所述的用途，其中所述抗IL-13抗体是包含VH和VL的抗体，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；
所述抗IL-13抗体是包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13抗体，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ IDNO.:9和SEQ ID NO.:10或来金珠单抗的氨基酸序列。
64.根据权利要求62所述的用途，其中所述抗IL-13双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的序列；或所述抗IL-13双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ IDNO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列。
65.根据权利要求62所述的用途，其中抗IL-13双特异性抗体是抗IL-4/抗IL-13双特异性抗体，或抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-13VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含HVRH1、HVRH2、HVRH3、HVRL1、HVRL2和HVRL3的抗IL-17VH/VL单元，其中相应的HVR具有SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:27、SEQ ID NO.:28、SEQ ID NO.:29、SEQ ID NO.:30和SEQ ID NO.:31的氨基酸序列。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-13VH/VL单元，所述VH包含选自SEQ ID NO:1、3和24的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:2、4和25的氨基酸序列；和
所述抗IL-13/抗IL-17双特异性抗体包含含有VH和VL的抗IL-17VH/VL单元，所述VH包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
68.根据权利要求61所述的用途，其中Th2途径抑制剂是抗IgE抗体。
69.根据权利要求68所述的用途，其中抗IgE抗体是(i)抗体或(ii)包含重链可变区和轻链可变区的抗IgE抗体，其中重链可变区是SEQ ID NO:22和轻链可变区是SEQID NO:23。
70.根据权利要求52-69中任一项所述的用途，其中患者是人。
71.根据权利要求52-70中任一项所述的用途，其中样品是血清或血浆。
72.将哮喘患者或Th2相关疾病患者分层的试剂盒，其中试剂盒包含：
a)测量从患者获得的样品中IL-13水平的试剂；和
b)说明书，其用于(i)根据权利要求1-18中任一项所述的方法测量IL-13水平，(ii)将测量的IL-13水平与参比水平比较，和(iii)基于比较结果，将所述患者分层为反应者或非反应者类别。
73.根据权利要求所述的试剂盒72，其中试剂盒包含用于确定患者是否可能对Th2途径抑制剂有反应的包装插页。
74.根据权利要求所述的试剂盒72或权利要求73，其中试剂盒还包含含有信息的包装插页，所述信息描述根据权利要求52-71中任一项所述的用途。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的试剂盒，还包含容纳生物样品的空容器。
76.鉴定哮喘患者为可能遭受重度加重的方法，所述方法包括：
从患者获得样品，
根据权利要求1-18所述的任一方法测量样品中IL-13的水平，将样品中检测到的IL-13水平与参比水平比较，
并且
当样品中测量的IL-13水平与参比水平相比升高时，预测患者可能遭受重度加重。
77.根据权利要求76所述的方法，其中参比水平是参比群体中IL-13的中位水平。
78.根据权利要求19-51或76-77中任一项所述的方法，或根据权利要求52-71中任一项所述的用途，或根据权利要求72-75中任一项所述的试剂盒，还包括测量一种或多种Th2相关生物标志物的水平，所述生物标志物选自骨膜蛋白、FeNO、嗜酸性粒细胞和IgE。
79.根据权利要求19-51或76-77中任一项所述的方法，或根据权利要求52-71中任一项所述的用途，或根据权利要求72-75中任一项所述的试剂盒，还包括测量血液嗜酸性粒细胞的水平。
80.根据权利要求19-45、47-51或78-79中任一项所述的方法，或根据权利要求52-55或57-71中任一项所述的用途，或根据权利要求72-75中任一项所述的试剂盒，其中Th2相关疾病选自哮喘、特应性皮炎、特发性肺纤维化、变应性鼻炎、纤维化、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克隆病、慢性阻塞性肺病和肝纤维化。
81.根据权利要求80所述的方法、用途或试剂盒，其中Th2相关疾病是特发性肺纤维化或特应性皮炎。
82.根据权利要求39所述的方法，其中施用步骤包括每四周施用37.5mg抗IL-13抗体，或每四周施用125mg抗IL-13抗体。
83.根据权利要求82所述的方法，还包括测量一种或多种Th2相关生物标志物的水平，所述生物标志物选自骨膜蛋白、FeNO、嗜酸性粒细胞和IgE。
84.根据权利要求83所述的方法，其中Th2相关生物标志物是血液嗜酸性粒细胞。
85.根据权利要求84所述的方法，其中确定血液嗜酸性粒细胞的水平为300个细胞/微升或以上。
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