CN107389420A - 一种细胞富集分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞富集分离方法,包括:1)、将第一类磁珠和生物样本相结合,生物样本包含第一类细胞以及第二类细胞,第一类磁珠结合有第一类抗体,第一类细胞与第一类磁珠相结合;2)、将捕获磁头置于与第一类磁珠相结合的生物样本中,第一类细胞吸附在捕获磁铁装置上;3)、将第一类细胞从捕获磁头装置上释放,将生物样本中的第一类细胞清除;4)、将第二类磁珠加入到已清除第一类细胞的生物样本中,第二类细胞与第二类磁珠相结合;5)、将捕获磁头置于与第二类磁珠相结合的生物样本中,第二类细胞吸附在捕获磁铁装置上;6)、将第二类细胞从捕获磁头装置上释放。本发明检测灵敏度及纯度高,并可用于单细胞或少量细胞的多种基因标志物的分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞分离技术领域,尤其涉及一种细胞富集分离方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)是研究肿瘤扩散机理和肿瘤早期检测、预防和临床治理疗效的重要标志物,因为其存在于血液中的数量较少,对检测技术的要求很高,而现今市场上的技术在检测灵敏度和合理价格方面都不能满足市场上作为常规检测项目的要求。市场上较成熟的检测技术多是以阳性磁珠富集法或者阴性磁珠富集法单独使用,而其在检测灵敏度和细胞的后续基因分析方面均受到限制,例如,单一的阳性磁珠富集法的检测灵敏度受到限制以及捕获的靶细胞纯度不高,单独的阴性磁珠富集法在靶细胞的纯度方面同样受到非常大的限制。
发明内容
针对背景技术中的上述缺陷,本发明的主要目的在于提供一种细胞富集分离方法,将阳性磁珠富集法和阴性磁珠富集法相结合,提高了靶细胞检测灵敏度、纯度和检测的稳定性。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:一种细胞富集分离方法,所述方法包括:
1)、将第一类磁珠和生物样本相结合,所述生物样本包含第一类细胞以及第二类细胞,所述第一类磁珠结合有第一类抗体,通过所述第一类抗体将所述第一类细胞与第一类磁珠相结合;
2)、将捕获磁头置于与所述第一类磁珠相结合的生物样本中,所述第一类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
3)、将第一类细胞从捕获磁头装置上释放,清除所述生物样本中的第一类细胞;
4)、将第二类磁珠与已清除第一类细胞的生物样本相结合,所述第二类磁珠结合有第二类抗体,通过所述第二类抗体将所述第二类细胞与第二类磁珠相结合;
5)、将捕获磁头置于与所述第二类磁珠相结合的生物样本中,所述第二类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
6)、将第二类细胞从捕获磁头装置上释放;
所述第一类磁珠为阴性磁珠时,所述第二类磁珠为阳性磁珠,所述第一类细胞为非靶细胞,所述第二类细胞为靶细胞。
作为进一步的优选,所述步骤3)中,将第一类细胞从捕获磁头上释放后,将所述捕获磁铁再置于与所述第一类磁珠相结合的生物样本中,再次吸附所述第一类细胞。此操作可以重复多次,直至达成完全或接近完全清除第一类细胞的目的。
作为进一步的优选,所述步骤6)中,将第二类细胞从捕获磁头上释放后,将所述捕获磁铁再置于与所述第二磁珠相结合的第二类细胞中,再次吸附所述第二类细胞。此操作亦可重复多次,直至获得最大限度捕获第二类靶细胞。
作为进一步的优选,所述步骤3)或6)中,所述捕获磁头表面设置有磁套,所述第一或第二类细胞吸附在捕获磁头装置的磁套上。
作为进一步的优选,将经步骤5)捕获后剩余的细胞和阳性富集收集到的靶细胞分别收集到容器或载玻片上,作细胞鉴定、计数或基因杂交分析。
作为进一步的优选,将所述肿瘤靶细胞用于细胞计数以及单细胞或少量细胞的多基因标志物分析。
作为进一步的优选,所述生物样本为血液样本或生物体液,所述非靶细胞包括白细胞和红细胞,所述靶细胞包括循环肿瘤靶细胞。
作为进一步的优选,所述血液样本包括原血液样本、红细胞裂解的血液样本或密度梯度细胞分离处理除去红细胞后的血液样本。
作为进一步的优选,还包括:所述第一类磁珠为阳性磁珠时,所述第二磁珠为阴性磁珠,所述第一类抗体为靶细胞识别抗体,所述第二抗体为非靶细胞识别抗体。
作为进一步的优选,所述第一类抗体选自CD45、CD14以及红细胞抗体,所述第二类抗体选自EpCAM、Muc1及角蛋白抗体。
本发明的有益效果是:本发明将阴性磁珠富集法和阳性磁珠富集法相结合,可对生物样本先进行阴性磁珠富集后阳性磁珠富集,也可以是阳性磁珠富集后再进行阴性富集;例如:本发明先将阴性磁珠和生物样本相结合,使阴性磁珠上的第一类抗体和生物样本中的非靶细胞相结合,再利用捕获磁头吸附非靶细胞,将生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞充分分离;再将阳性磁珠加入到含有所述肿瘤靶细胞的生物样本中,培养后,阳性磁珠将和肿瘤靶细胞相结合,此时进行阳性磁珠富集,将获得更加纯的阳性肿瘤靶细胞。因此,本发明从生物样本中的大量细胞中,可除去非靶细胞,例如血细胞(白细胞和红细胞),再分离提取其中的肿瘤细胞,其背景细胞量大大减少,最终获得的肿瘤细胞的纯度将大副提高。使用此种产物作后续的细胞和基因分析,将有利于获得最佳的分析结果。因而本发明方法提高了靶细胞检测灵敏度、纯度和检测的稳定性。再比如:本发明可先将阳性磁珠和生物样本相结合,使阳性磁珠上的抗体和生物样本中的肿瘤靶细胞相结合,再利用捕获磁头吸附肿瘤靶细胞,以将生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞分离;再将阴性磁珠加入到所述非靶细胞中,阴性磁珠将和非靶细胞相结合,此时进行阴性磁珠富集,得到非靶细胞。上述阳性富集获得的靶细胞收集起来计数和进行细胞和基因分析,阴性富集和阳性富集剩余的细胞可作载玻片等的细胞和基因分析,这样可以起到全血细胞的无选择分析检测之功效。
附图说明
图1a-1b为本发明实施例1先阴性磁珠富集后阳性磁珠富集的细胞富集分离方法流程示意图。
图1c为肿瘤靶细胞多重标志物的分析示意图。
图2为本发明实施例2先阳性磁珠富集后阴性磁珠富集的细胞富集分离方法流程示意图。
图3a-3d为多次阴性富集清除磁物质的情况示意图。
图4a-4b为阴性富集单个细胞的情况示意图。
图5a-5b为阴性富集法对非磁物质的靶细胞的清除情况示意图。
具体实施方式
本发明通过提供一种细胞富集分离方法,克服了现有循环肿瘤细胞检测技术在检测灵敏度以及在靶细胞的纯度方面不高的缺陷。
为了解决上述问题,本发明实施例的主要思路是:
本发明实施例细胞富集分离方法,所述方法包括:
1)、将第一类磁珠和生物样本相结合,所述生物样本包含第一类细胞以及第二类细胞,所述第一类磁珠结合有第一类抗体,通过所述第一类抗体将所述第一类细胞与第一类磁珠相结合;
2)、将捕获磁头置于与所述第一类磁珠相结合的生物样本中,所述第一类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
3)、将第一类细胞从捕获磁头装置上释放,清除所述生物样本中的第一类细胞;
4)、将第二类磁珠与已清除第一类细胞的生物样本相结合,所述第二类磁珠结合有第二类抗体,通过所述第二类抗体将所述第二类细胞与第二类磁珠相结合;
5)、将捕获磁头置于与所述第二类磁珠相结合的生物样本中,所述第二类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
6)、将第二类细胞从捕获磁头装置上释放;
所述第一类磁珠为阴性磁珠时,所述第二类磁珠为阳性磁珠,所述第一类细胞为非靶细胞,所述第二类细胞为靶细胞。
一般情况下,血液样本经过阴性磁珠结合处理后,大部分的红细胞和白细胞都将结合被除去,本发明实施例可使用可重复的自动化仪器来操作上述捕获磁头多次吸附,可以达到完全彻底清除血液样本中的红细胞和白细胞的程度。这时,将阳性磁珠加入到阴性磁珠富集后的样本中,阳性磁珠结合到磁头上,或部分结合到细胞上然后再结合到磁头上,通过该磁头在样本溶液中的微速扫描运动,将样本溶液中的靶细胞吸附到磁头上来,并转移到特定的收集容器中,用于靶细胞计数和单细胞或少量细胞的多基因标志物分析。本发明实施例有多方面的优势,一是通过以上操作,对全血细胞作靶细胞的检测分析,检测的灵敏度非常高;另一方面,用于基因分析的细胞,由于是在阴性富集处理后,非特异性细胞数量已经非常少了甚至没有了,从其中再富集提取样阳性的靶细胞,其纯度非常高。阴性富集和阳性富集后的剩余细胞在作载玻片上的细胞分析,有防止了丢失阳性富集标志物遗漏的靶细胞。阳性富集提取到的细胞作计数和多基因检测分析,纯度高,分析结果更加可靠。综合阴性和阳性富集的结果,计数靶细胞和分析基因信息,可达到相当于全血细胞分析的完整效果。同时,靶细胞纯度的显著提高,对下游的基因等多重标志物的分析提供了更多的优越性。阴性处理后的样本,在经过阳性磁珠富集处理,剩余细胞中,也有可能存在不能被阳性磁珠抓获的靶细胞,这时,将这些为量不多的细胞全部离心到载玻片上,进行细胞和基因水平的分析,可获得更加全面的靶细胞(例如:血液循环肿瘤细胞等)信息。经阴性富集或阳性富集后会剩余一些游离磁珠,可采用过滤法清除所述游离磁珠。
本发明实施例方法,可用于样本中细胞的富集和分离,亦可用于其他生物分子成分(例如:核酸和蛋白质)的分离和提取。
为了更加清晰地理解本发明的目的、技术方案及优点,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体例子所涉及的具体数据仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
如图1a-1b所示,本发明实施例1细胞富集分离方法,包括以下步骤:
将阴性磁珠加入到生物样本溶液槽中,上述阴性磁珠结合有抗体,上述生物样本包含肿瘤靶细胞以及待捕获的非靶细胞,上述抗体与非靶细胞结合;上述生物样本为原血液样本,上述抗体为CD45,上述非靶细胞包括红细胞和白细胞;
将捕获磁头置于与上述阴性磁珠相结合的生物样本中,通过该磁头在样本溶液中的微速扫描运动,将样本溶液中的非靶细胞吸附到磁头上来,并转移到收集容器中;因而,上述生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞分离;另外,为了彻底清除血液样本中的红细胞和白细胞,可将上述捕获磁头多次置于生物样本中,重复多次吸附非靶细胞,例如可选为3次吸附;上述捕获磁头可通过磁捕仪、美光硅谷等自动化仪器来实现捕获磁铁的自动化操作,当然也可选用手工操作。可选用非磁性材料的套子套在上述捕获磁头上,避免磁珠、非靶细胞被捕获磁头的磁场吸附时直接接触到磁头上,这样可以达到即能有效收集非靶细胞,又不损伤非靶细胞的目的。
接下来再将阳性磁珠加入到上述清除了非靶细胞的生物样品溶液中,上述阳性磁珠结合有抗体分子EpCAM,同时将捕获磁头置于与上述生物样本溶液中,通过该磁头在样本溶液中的微速扫描运动,将样本溶液中的肿瘤靶细胞吸附到磁头上来,并转移到收集容器中,其可进一步用于靶细胞计数和单细胞或少量细胞的多基因标志物分析。阳性磁珠富集到的磁性物中的游离磁珠可使用过滤装置清除。
上述阳性磁珠富集得到的靶细胞,可通过基因扩增,分析DNA和RNA的多重基因标志物的分析,或直接进行细胞的蛋白质标志物的分析,细胞结构和物理特性的分析,外源体标志物的分析等,如图1c所示。
本实施例将样本与阴性磁珠混合处理,富集后可除去大部分阴性细胞,再在此基础上,阳性富集靶细胞,不仅可提高检测靶细胞灵敏度,同时阳性富集获得的靶细胞其纯度也会大幅提高,加上对富集后剩余的细胞进行计数和基因分析,弥补了因为阳性磁珠抗体的局限性,综合阳性磁珠富集结果和剩余细胞的分析结果,其计数和细胞分析、基因分析结果都更全面,接近全血细胞分析。
实施例2
如图2所示,本发明实施例2细胞富集分离方法,包括以下步骤:
将阳性磁珠加入到生物样本溶液槽中,上述阳性磁珠结合有抗体,上述生物样本包含肿瘤靶细胞以及待捕获的非靶细胞,上述抗体与肿瘤靶细胞结合;上述生物样本为原血液样本,上述抗体为Muc1上述非靶细胞包括红细胞和白细胞;
将捕获磁头置于与上述阳性磁珠相结合的生物样本中,通过该磁头在样本溶液中的微速扫描运动,将样本溶液中的肿瘤靶细胞吸附到磁头上来,并转移到收集容器中;获得的靶细胞收集起来计数和进行细胞和基因分析。因而,上述生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞分离;上述捕获磁头可通过磁捕仪、美光硅谷等自动化仪器来实现捕获磁铁的自动化操作,当然也可选用手工操作。
接下来再将阴性磁珠加入到上述除去了肿瘤靶细胞的生物样品溶液中,上述阴性磁珠结合有抗体CD14,同时将捕获磁头置于与上述生物样本溶液中,通过该磁头在样本溶液中的微速扫描运动,将样本溶液中的非靶细胞吸附到磁头上来,并转移到收集容器中,除去大部分非靶细胞后,余下的细胞可转移到载玻片上进行细胞和基因分析,同样可以起到全血细胞分析检测之功效。
实施例3
本实施例与实施例1类似,不同之处在于:生物样本为红细胞裂解的血液样本;阴性磁珠结合的抗体为红细胞抗体,阳性磁珠结合的抗体为角蛋白抗体。
实施例4
本实施例与实施例2类似,不同之处在于:生物样本为红细胞裂解的血液样本或密度梯度细胞分离处理除去红细胞后的血液样本。阴性磁珠结合的抗体为红细胞抗体,阳性磁珠结合的抗体为角蛋白抗体。
对比实施例1
将阴性磁珠放入到生物样本槽中,通过捕获磁头的多次循环吸附,以达到多次阴性富集处理,可消除绝大部分的磁物质,例如图3a-3d所示,经过3次阴性富集处理后,99.99%以上的磁物质被清除掉(3b-3d所示),另外,阴性富集处理后,样本中的磁物质基本上不会对后期的阳性富集造成任何影响。本实施例中可使用可重复的自动化仪器来操作上述捕获磁头多次吸附。
对比实施例2
图4a-4b为阴性富集单个细胞的情况示意图。将用阴性磁珠标记好的单个细胞放入到不同的样本槽中,通过阴性磁珠富集法,这些单个的细胞都能被清除,说明本实施例能够清除甚至单个的非特异性细胞,保证不被带到后续的处理步骤例如:阳性磁珠富集中,保证了阴性磁珠富集的彻底性。
对比实施例3
图5a-5b为阴性富集法对非磁物质的靶细胞的清楚情况示意图。将阴性磁珠和阳性细胞混合,原理上,磁珠不会和阳性细胞结合。通过阴性磁珠富集法,可以除去大部分磁珠,但不清除非此物质的细胞。因而,阴性磁珠富集只清除阴性磁珠结合的细胞和物质,而不影响阳性细胞,阴性富集法不清除非磁物质的靶细胞,如图5a-5b所示。
上述本申请实施例中的技术方案,至少具有如下的技术效果或优点:
本发明将阴性磁珠富集法和阳性磁珠富集法相结合,可对生物样本先进行阴性磁珠富集后阳性磁珠富集,也可以是阳性磁珠富集后再进行阴性富集;例如:本发明先将阴性磁珠和生物样本相结合,使阴性磁珠上的第一类抗体和生物样本中的非靶细胞相结合,再利用捕获磁头吸附非靶细胞,将生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞分离;再将阳性磁珠加入到所述肿瘤靶细胞中,培养后,阳性磁珠将和肿瘤靶细胞相结合,此时进行阳性磁珠富集,将获得更加纯的阳性肿瘤靶细胞。因此,本发明从生物样本中的大量细胞中,可除去非靶细胞,例如血细胞(白细胞和红细胞),再分离提取其中的肿瘤细胞,其背景细胞量大大减少,最终获得的肿瘤细胞的纯度将大副提高。使用此种产物作后续的细胞和基因分析,将有利于获得最佳的分析结果。因而本发明方法提高了靶细胞检测灵敏度、纯度和检测的稳定性。再比如:本发明可先将阳性磁珠和生物样本相结合,使阳性磁珠上的抗体和生物样本中的肿瘤靶细胞相结合,再利用捕获磁头吸附肿瘤靶细胞,以将生物样本中的非靶细胞与肿瘤靶细胞分离;再将阴性磁珠加入到所述非靶细胞中,阴性磁珠将和非靶细胞相结合,此时进行阴性磁珠富集,得到非靶细胞。上述阳性富集获得的靶细胞收集起来计数和进行细胞和基因分析,阴性富集得到的细胞可作载玻片等的细胞和基因分析,同样可以起到全血细胞分析检测之功效。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种细胞富集分离方法,其特征在于:所述方法包括:
1)、将第一类磁珠和生物样本相结合,所述生物样本包含第一类细胞以及第二类细胞,所述第一类磁珠结合有第一类抗体,通过所述第一类抗体将所述第一类细胞与第一类磁珠相结合;
2)、将捕获磁头置于与所述第一类磁珠相结合的生物样本中,所述第一类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
3)、将第一类细胞从捕获磁头装置上释放,清除所述生物样本中的第一类细胞;
4)、将第二类磁珠与已清除第一类细胞的生物样本相结合,所述第二类磁珠结合有第二类抗体,通过所述第二类抗体将所述第二类细胞与第二类磁珠相结合;
5)、将捕获磁头置于与所述第二类磁珠相结合的生物样本中,所述第二类细胞吸附在捕获磁铁装置上;
6)、将第二类细胞从捕获磁头装置上释放;
所述第一类磁珠为阴性磁珠时,所述第二类磁珠为阳性磁珠,所述第一类细胞为非靶细胞,所述第二类细胞为靶细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述步骤3)中,将第一类细胞从捕获磁头上释放后,将所述捕获磁铁再置于与所述第一类磁珠相结合的生物样本中,再次吸附所述第一类细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述步骤6)中,将第二类细胞从捕获磁头上释放后,将所述捕获磁铁再置于与所述第二磁珠相结合的第二类细胞中,再次吸附所述第二类细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述步骤3)或6)中,所述捕获磁头表面设置有磁套,所述第一或第二类细胞吸附在捕获磁头装置的磁套上。
5.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述方法还包括:将经步骤5)捕获后剩余的细胞和阳性富集收集到的靶细胞分别收集到容器或载玻片上,作细胞鉴定、计数或基因杂交分析。
6.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述方法还包括:将所述靶细胞用于细胞计数以及单细胞或少量细胞的多基因标志物分析。
7.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述生物样本为血液样本或生物体液,所述非靶细胞包括白细胞和红细胞,所述靶细胞包括肿瘤靶细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述血液样本包括原血液样本、红细胞裂解的血液样本或密度梯度细胞分离处理除去红细胞后的血液样本。
9.根据权利要求1所述的细胞富集分离方法,其特征在于:还包括:所述第一类磁珠为阳性磁珠时,所述第二磁珠为阴性磁珠,所述第一类抗体为靶细胞识别抗体,所述第二抗体为非靶细胞识别抗体。
10.根据权利要求1或9所述的细胞富集分离方法,其特征在于:所述第一类抗体选自CD45、CD14以及红细胞抗体,所述第二类抗体选自EpCAM、Muc1及角蛋白抗体。
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