CN111575239A - 一种循环肿瘤细胞的富集方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞的富集方法及其装置，包括：将样本和可与白细胞结合的免疫磁珠混合孵育；向所述样本中加入红细胞裂解液进行孵育；将孵育后的所述样本进行稀释，然后依次进行磁分离、膜过滤；上述方法将阴性富集技术与膜过滤技术结合，综合了阴性富集和膜过滤的优势，在保证CTCs的高回收率同时又能保证CTC的纯度和活力，避免因离心、转移液体等步骤造成CTCs回收率降低和细胞破损活力降低，同时使用膜过滤截留循环肿瘤细胞去除其他杂质和细胞，尽可能的保留循环肿瘤细胞，并且流程简化，能够在2h内完成5ml全血的分离，实现90％以上CTC的捕获和95％以上的白细胞去除。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞的富集方法及其装置。
背景技术
1869年Thomas Ashworth首先发现了循环肿瘤细胞，伴随着重复性检测技术的发展，循环肿瘤细胞受到越来越多的重视。循环肿瘤细胞(CTCs)，是外周血中各种类型肿瘤细胞的统称，它们从原发性肿瘤组织中脱落并释放到血液中，并在远处发展成新的肿瘤从而实现转移。因此，CTCs被认为是肿瘤能够发生转移的必要前提，进而可以作为肿瘤疾病诊断、预后评估以及个性化单抗药物筛选的核心研究对象，成为转移性肿瘤的“液体活检”。然而，由于CTCs的极度稀有性和高度异质性，将其从全血中分离并检测存在着巨大挑战。因此，开发高效、高回收率和高纯度的CTC分离技术是未来的发展方向。
目前，已开发的有效分离和检测技术主要基于特定肿瘤标志物和物理性质，在CTCs捕获的背景下，根据分离是否基于亲和力，将这些方法分为“基于亲和力的策略”和“无标记策略”。基于亲和力的捕获取决于抗原抗体之间的免疫化学相互作用，例如在细胞表面表达的EpCAM和CD45抗原及其固定在磁珠或有图案的结构的相应抗体，如使用阳性(正向)选择通过靶向结合肿瘤相关生物标记物(EpCAM，CEA，EphB4，EGFR，PSA等)来捕获CTCs，或使用阴性(反向)选择通过靶向结合未在CTCs上表达的CD45消耗血细胞。阴性耗竭方法将去除“正常”细胞，包括红细胞、白细胞和血小板，保留“异常细胞”如CTCs，再进行进一步分析，如中国专利文献CN106635995B中公开的一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，采用淋巴细胞分离管基础上的密度梯度离心对血样进行前处理，简化了白细胞分离操作步骤，缩短了循环肿瘤细胞的富集时间，整个操作在2.5h内即可完成。上述方案中为涉及典型的阴性富集方法，通过化学裂解红细胞或梯度离心去除白细胞，然后进行免疫组化或分子分析以鉴定“异常细胞”。然而，上述阴性富集技术涉及多个步骤，例如RBC裂解和离心将会增加失去CTCs的风险并对目标细胞影响不利。
到目前为止，基于亲和力的策略的CellSearch是唯一获得FDA批准的乳腺癌、***癌和结肠直肠癌CTC检测平台，已成为CTC领域的金标准。在CellSearch***中，由抗EpCAM涂层的磁珠可以正向选择稀有CTC。但是最近研究显示，基于EpCAM的方法可能会显着低估CTCs的数量，因为正在经历上皮间质转化的CTCs可能会下调EpCAM的表达。
相比之下，无标记策略，包括离心偏转、介电泳分离和基于大小的过滤等物理方法，能够分离上皮和间充质表型，更适合于分析肿瘤异质性。然而，上述方法在技术上仍然存在不足，即通常很难在捕获效率、纯度和细胞活力之间进行权衡，而这些都是基础和临床研究的重要标准。例如，基于细胞大小的过滤技术存在的主要问题是：如果孔的尺寸足够小以达到高的肿瘤细胞捕获效率，则通常具有高的非肿瘤细胞保留率，即纯度不高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的循环肿瘤细胞的富集方法难以兼具高回收率、高纯度和高活力的缺陷，从而提供一种循环肿瘤细胞的富集方法及装置，能够获得同时具备高回收率、高纯度和高活力的循环肿瘤细胞。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法，包括：
将样本和可与白细胞结合的免疫磁珠混合孵育；
向所述样本中加入红细胞裂解液进行孵育；
将孵育后的所述样本进行稀释，然后依次进行磁分离、膜过滤。
优选的，所述样本以1/12ml/min-1/4ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤。
优选的，将所述样本稀释至原始体积的5-10倍。
进一步的，还包括利用缓冲液清洗滤膜的步骤，清洗体积10-15ml。
进一步的，膜过滤后，还包括对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记的步骤。
在所述染色标记的步骤中，在染色标记前，向富集循环肿瘤细胞的滤膜中加入封闭液进行封闭，然后清洗并抽干液体。
在所述染色标记的步骤中，在染色标记时，向富集循环肿瘤细胞的滤膜中加入细胞染色液，避光孵育，然后清洗并抽干液体；细胞染色液体积与滤膜直径的比例为100-150：13(μl:mm)。
在所述染色标记的步骤中，染色标记两次，第一次染色标记时使用细胞染色液A，于4℃避光孵育30-40分钟；第二次染色标记时使用细胞染色液B，于4℃避光孵育10分钟；
优选的，所述细胞染色液A中为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，优选的3.85％；EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％，优选的为0.77％；
优选的，所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI。
进一步的，膜过滤步骤中的滤膜选自聚碳酸酯膜(PC膜)或PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)；所述滤膜的孔径为0.65μm-8μm。优选的，为8μm。
所述红细胞裂解液中含有固定液成分。
所述免疫磁珠上偶联CD45抗体。
本发明你提供了一种循环肿瘤细胞的富集装置，包括：
样本收集器，顶端设有样本进口，底端设有样本出口；
分离柱，位于所述样本收集器下方，包括顶端开口和底端开口，顶端开口可与样本出口密封连接；
过滤器，位于所述分离柱下方；所述过滤器具有空腔，所述空腔顶端设有入口可与所述分离柱的底端开口密封连接，所述空腔底端设有出口；所述空腔内水平设置有滤膜，所述滤膜边缘与所述空腔内壁紧密连接。
进一步的，所述滤膜选自聚碳酸酯膜或PVDF膜；所述滤膜的孔径为0.65μm-8μm。优选的，为8μm。
进一步的，所述滤膜的直径为13mm-25mm。
进一步的，所述滤膜将所述空腔分割成上腔室和下腔室，所述上腔室容积≤300μl。
进一步的，所述分离柱的外部设有磁力装置。优选的，所述分离柱的内部填充有微铁珠。进一步优选的，所述微铁珠的直径为100μm。进一步优选的，相邻的两个所述微铁珠之间的间隙为200μm。进一步优选的，所述微铁珠为经亲水包被层处理的微铁珠，以保证其能溶解于溶液内。
进一步的，所述空腔底端的出口可与泵紧密连接。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，包括：将样本和可与白细胞结合的免疫磁珠混合孵育；向所述样本中加入红细胞裂解液进行孵育；将孵育后的所述样本进行稀释，然后依次磁分离、膜过滤；上述方法将阴性富集技术与膜过滤技术结合，综合了阴性富集和膜过滤的优势，在保证CTCs的高回收率同时又能保证CTCs的纯度和活力，避免因离心、转移液体等步骤造成CTCs回收率降低和细胞破损活力降低，同时使用膜过滤截留循环肿瘤细胞去除其他杂质和细胞，尽可能的保留循环肿瘤细胞，并且流程简化，能够在2h内完成5ml全血的分离，实现90％以上CTC的捕获和95％以上的白细胞去除。
2.本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，所述样本以1/12ml/min-1/4ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤，在研究中发现样本磁分离和膜过滤的流速是影响循环肿瘤细胞捕获效率(即回收率)的一个重要因素，在上述范围内的流速，能够获得较高的捕获效率。
3.本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，将所述样本稀释至原始体积的5-10倍，在研究中发现样本的稀释度是影响循环肿瘤细胞捕获效率(即回收率)的一个重要因素，在上述范围内的稀释倍数，能够获得较高的捕获效率。
4.本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，还包括利用缓冲液清洗滤膜的步骤，清洗体积10-15ml，在研究中发现在样本流速为0.25ml/min时，清洗体积控制在10-15ml时，能够获得较高的捕获效率。
5.本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，膜过滤后，还包括对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记的步骤，由于经过前述的步骤，直接在滤膜上进行染色，自动化程度高，无需转移液体和离心，节省步骤，效率高。
6、本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，在染色标记时，向富集循环肿瘤细胞的滤膜中加入细胞染色液，避光孵育，然后清洗并抽干液体；细胞染色液体积与滤膜直径的比例为100-150：13(μl:mm)；通过控制细胞染色液体积与滤膜直径的比例使得得到的染色图具有低背景干扰和高特异性的优势。
7、本发明提供的一种循环肿瘤细胞的富集方法，染色标记两次，所述细胞染色液A中为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％；所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI；通过选择上述细胞染色液A和B使得得到的染色图进一步具有低背景干扰和高特异性的优势。
8、本实施例提供了一种循环肿瘤细胞的富集装置，包括：样本收集器，顶端设有样本进口，底端设有样本出口；分离柱，位于所述样本收集器下方，包括顶端开口和底端开口，顶端开口可与样本出口密封连接；过滤器，位于所述分离柱下方；所述过滤器具有空腔，所述空腔顶端设有入口可与所述分离柱的底端开口密封连接，所述空腔底端设有出口；所述空腔内水平设置有滤膜，所述滤膜边缘与所述空腔内壁紧密连接。在上述的循环肿瘤细胞的富集装置中，在使用时出口紧密连接蠕动泵，样本收集器收集样本后，开启蠕动泵进行抽滤，样本以恒定的流速流经分离柱，分离柱在磁力装置配合下样本中的免疫磁珠被吸附到分离柱的内侧壁上，达到去除样本中的与免疫磁珠结合的细胞的目的，分离后的样本以恒定的流速进入过滤器中通过所述滤膜，样本中的循环肿瘤细胞被截留在所述滤膜上，其余杂细胞或杂质被去除。上述装置将阴性富集策略和膜过滤结合，综合了阴性富集和膜过滤的优势，兼顾了回收率、纯度和细胞活力，获得了高回收率、高纯度和高细胞活力的效果，具体的，所述装置可实现直接在装置中进行红细胞裂解、磁分离去除白细胞，实现了样本中非循环肿瘤细胞的去除，同时避免了在离心和转移样品过程中失去CTCs或细胞破损的缺陷，同时使用膜过滤截留循环肿瘤细胞去除其他杂质和细胞，尽可能的保留循环肿瘤细胞，并且流程简化，能够在2h内完成5ml全血的分离，实现90％以上CTC的捕获和95％以上的白细胞去除。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中循环肿瘤细胞的富集装置结构示意图；
图2是本发明实施例1中循环肿瘤细胞的富集装置富集细胞的原理示意图；
图3是本发明实验例中不同待检样本的荧光成像结果(比例尺：均为50μm)；
图4是本发明实验例中不同稀释倍数对捕获效率的影响结果；
图5是本发明实验例中不同流速对捕获效率的影响结果；
图6是本发明实验例中不同清洗体积对捕获效率和白细胞数量的影响结果；
图7是本发明实验例中含有不同A549细胞个数的血液样本在最佳条件下富集后回收的A549细胞数；
图8是本发明实验例中未进行磁分离和进行磁分离的荧光成像结果(比例尺：图(a)–图(b)均为100μm)；
图9是本发明实验例中使用不同滤膜的白细胞耗竭效果的定量评估结果；
图10是本发明实验例中在最佳条件下循环肿瘤细胞捕获性能综合评估结果。
附图标记：1-样本收集器；11-样本进口；12-样本出口；
2-分离柱；21-顶端开口；22-底端开口；23-微铁珠；
3-过滤器；31-空腔；32-入口；33-出口；34-滤膜；35-橡胶垫；36-凸起；
4-磁力装置；5-蠕动泵。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的一步裂解固定液购自eBioscienceTM1-step Fix/LyseSolution(10X)。JEG细胞购自上海冠导生物工程有限公司；CD45标记的免疫磁珠(直径50nm)溶液选自美天旎品牌(货号：130-045-801)；亲水包被层处理的微铁珠(直径100μm)购自选自美天旎品牌。
实施例1
本实施例提供了一种循环肿瘤细胞的富集装置，如图1所示，包括：
样本收集器1，顶端设有样本进口11，底端设有样本出口12；
分离柱2，位于所述样本收集器1下方，包括顶端开口21和底端开口22，顶端开口21可与样本出口12密封连接；
过滤器3，位于所述分离柱2下方；所述过滤器3具有空腔31，所述空腔31顶端设有入口32可与所述分离柱2的底端开口22密封连接，所述空腔底端设有出口33；所述空腔31内水平设置有滤膜34，所述滤膜34边缘与所述空腔31内壁紧密连接。
在上述的循环肿瘤细胞的富集装置中，如图2所示，在使用时出口33紧密连接蠕动泵，样本收集器1收集样本后，开启蠕动泵进行抽滤，样本以恒定的流速流经分离柱2，分离柱2在磁力装置配合下样本中的免疫磁珠被吸附到分离柱2的内侧壁上，达到去除样本中的与免疫磁珠结合的细胞的目的，分离后的样本以恒定的流速进入过滤器3中通过所述滤膜34，样本中的循环肿瘤细胞被截留在所述滤膜34上，其余杂细胞或杂质被去除。上述装置将阴性富集策略和膜过滤结合，综合了阴性富集和膜过滤的优势，兼顾了回收率、纯度和细胞活力，获得了高回收率、高纯度和高细胞活力的效果，具体的，所述装置可实现直接在装置中进行红细胞裂解、磁分离去除白细胞，实现了样本中非循环肿瘤细胞的去除，同时避免了在离心和转移样品过程中失去CTCs或细胞破损的缺陷，同时使用膜过滤截留循环肿瘤细胞去除其他杂质和细胞，尽可能的保留循环肿瘤细胞，并且流程简化，能够在2h内完成5ml全血的分离，实现90％以上CTC的捕获和95％以上的白细胞去除。
进一步的，所述滤膜选自聚碳酸酯膜或PVDF膜；所述滤膜的孔径为0.65μm-8μm，在本实施例中选择孔径为5μm的聚碳酸酯膜(PC膜)。
进一步的，所述滤膜34的直径为13mm-25mm，在本实施例中，滤膜的直径为13mm。
进一步的，所述滤膜34将所述空腔31分割成上腔室和下腔室。在本实施例中，所述过滤器3的上腔室和下腔室可拆卸连接，所述上腔室底部内侧壁上设有橡胶垫35用于压所述滤膜34，所述下腔室顶部内侧壁上设有凸起36用于支撑滤膜，所述滤膜34通过橡胶垫35和凸起36的配合紧密连接在所述过滤器34的侧壁上。
进一步的，所述上腔室容积≤300μl，在本实施例中，所述上腔室的容积为300微升，可以进行小体积免疫荧光染色。
进一步的，所述分离柱2的外部设有磁力装置，在本实施例中，选择在分离柱2的外部两侧分别设有N磁极和S磁极。
进一步的，所述分离柱2的内部填充有微铁珠23，相邻的两个所述微铁珠23的间隙为200μm，所述微铁珠23的直径为100μm，所述微铁珠23为经亲水包被层处理的微铁珠，所述微铁珠23本身无磁性，微铁珠23起到扩大磁场的作用，外加的磁场可以被填充后的分离柱2放大1000-10000倍，不需要过多的免疫磁珠结合白细胞即可分离不同细胞，同时在高效率去除白细胞的同时又能使CTCs流过进行后续连续操作。
进一步的，所述空腔31底端的出口33与蠕动泵紧密连接。
实施例2
本实施例提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤：
(1)取5ml新鲜的外周血样本与500μl的CD45标记的免疫磁珠溶液混合，4℃孵育0.5h；
(2)向步骤(1)中孵育后的外周血样本中加入15ml一步裂解固定液孵育15min；
(3)向步骤(2)孵育后的外周血样本中加入PBS缓冲液(pH7.2)进行稀释，稀释至所述外周血样本原始体积(5ml)的5倍，然后加载到实施例1的循环肿瘤细胞的富集装置中的样本收集器1，然后开启蠕动泵进行抽滤，所述样本以0.25ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤；
(4)当装置中的样本液面达到所述分离柱2上方时，加入PBS缓冲液(pH7.2)作为清洗液，清洗体积为10-15ml，在本实施例中选择10ml，继续以0.25ml/min的流速流经所述滤膜34；
(5)待液体过滤完后，关掉蠕动泵，对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记，首先取下所述分离柱2，向所述过滤器3中加入封闭液封闭所述滤膜34上富集的循环肿瘤细胞，在本实施例中，封闭液选择300μl的1wt％BSA溶液，封闭时间为15min，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；
(6)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择130ul)的细胞染色液A，于4℃避光孵育30-40分钟(在本实施例中选择35分钟)，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液A为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，本实施例中选择3.85％，EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％，本实施例中选择0.77％；
(7)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择130ul)的细胞染色液B，于4℃避光孵育10分钟，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI；
(8)取下滤膜34进行封装，然后利用高通量多色荧光成像***进行荧光成像与结果分析，最终确定循环肿瘤细胞数量。
实施例3
本实施例提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤：
(1)取5ml新鲜的外周血样本与500μl的CD45标记的免疫磁珠溶液混合，4℃孵育0.5h；
(2)向步骤(1)中孵育后的外周血样本中加入15ml一步裂解固定液孵育15min；
(3)向步骤(2)孵育后的外周血样本中加入PBS缓冲液(pH7.2)进行稀释，稀释至所述外周血样本原始体积(5ml)的10倍，然后加载到实施例1的循环肿瘤细胞的富集装置中的样本收集器1，然后开启蠕动泵进行抽滤，所述样本以1/12ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤；
(4)当装置中的样本液面达到所述分离柱2上方时，加入PBS缓冲液(pH7.2)作为清洗液，清洗体积为10-15ml，在本实施例中选择15ml，继续以1/12ml/min的流速流经所述滤膜34；
(5)待液体过滤完后，关掉蠕动泵，对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记，首先取下所述分离柱2，向所述过滤器3中加入封闭液封闭所述滤膜34上富集的循环肿瘤细胞，在本实施例中，封闭液选择300μl的1wt％BSA溶液，封闭时间为15min，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；
(6)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择100ul)的细胞染色液A，于4℃避光孵育30-40分钟(在本实施例中选择30分钟)，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液A为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，本实施例中选择3.33％，EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％，本实施例中选择0.67％；
(7)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择100ul)的细胞染色液B，于4℃避光孵育10分钟，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI；
(8)取下滤膜34进行封装，然后利用高通量多色荧光成像***进行荧光成像与结果分析，最终确定循环肿瘤细胞数量。
实施例4
本实施例提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法，包括如下步骤：
(1)取5ml新鲜的外周血样本与500μl的CD45标记的免疫磁珠溶液混合，4℃孵育0.5h；
(2)向步骤(1)中孵育后的外周血样本中加入15ml一步裂解固定液孵育15min；
(3)向步骤(2)孵育后的外周血样本中加入PBS缓冲液(pH7.2)进行稀释，稀释至所述外周血样本原始体积(5ml)的8倍，然后加载到实施例1的循环肿瘤细胞的富集装置中的样本收集器1，然后开启蠕动泵进行抽滤，所述样本以1/8ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤；
(4)当装置中的样本液面达到所述分离柱2上方时，加入PBS缓冲液(pH7.2)作为清洗液，清洗体积为10-15ml，在本实施例中选择13ml，继续以1/8ml/min的流速流经所述滤膜34；
(5)待液体过滤完后，关掉蠕动泵，对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记，首先取下所述分离柱2，向所述过滤器3中加入封闭液封闭所述滤膜34上富集的循环肿瘤细胞，在本实施例中，封闭液选择300μl的1wt％BSA溶液，封闭时间为15min，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；
(6)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择150ul)的细胞染色液A，于4℃避光孵育30-40分钟(在本实施例中选择40分钟)，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液A为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，本实施例中选择5％，EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％，本实施例中选择1％；
(7)关闭蠕动泵，向所述滤膜34上加入100-150ul(在本实施例中选择150ul)的细胞染色液B，于4℃避光孵育10分钟，然后用1ml的PBS溶液清洗并抽干液体；所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI；
(8)取下滤膜34进行封装，然后利用高通量多色荧光成像***进行荧光成像与结果分析，最终确定循环肿瘤细胞数量。
实验例
1、荧光成像与结果分析
待检样本：A阴性对照：外周血中不带有任何癌细胞；B：外周血红掺有A549细胞；C：外周血红掺有JEG细胞。
将上述待检样本分别按照实施例2实施，荧光成像结果如图3所示，CD45-FITC对白细胞染色，EpCAM-PE对CTCs染色，DAPI对细胞核染色，由上图可以得出本发明的循环肿瘤细胞的富集方法可行，染色清晰，背景干扰低，能够准确鉴定出CTCs并完成计数。
2、不同因素的捕获效率和白细胞污染以及在最佳条件下对CTC的灵敏度测试
2.1稀释倍数对捕获效率的影响
按照实施例2实施，在步骤(3)中，稀释倍数分别选择1、3、5、7、10，其余步骤均相同，考察捕获效率，捕获效率＝鉴定的循环肿瘤细胞个数/原始样本中循环肿瘤细胞总数。
结果如图4所示(误差棒代表三个独立实验的标准偏差)，稀释倍数为5-10，捕获效率高。
2.2流速对捕获效率的影响
按照实施例2实施，在步骤(3)中，所述样本分别以1/12、1/8、1/4、1/2、1ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤，考察捕获效率。
结果如图5所示(误差棒代表三个独立实验的标准偏差)，流速为1/12-1/4之间时，捕获效率高。
2.3清洗体积对捕获效率的影响
按照实施例2实施，在步骤(4)中，清洗体积分别选择1、5、10、15、20ml，其余步骤均相同，考察捕获效率和白细胞数量。
结果如图6所示(误差棒代表三个独立实验的标准偏差)，当清洗体积为10ml时，捕获效率高，白细胞数量低。
2.4在最佳条件下对CTC的灵敏度测试
分别在1ml血液中掺入的1、10、100、200个A549细胞，将上述血液样本按照实施例2实施，在步骤(3)中稀释倍数为5倍，样以0.25ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤，在步骤(4)中，清洗体积选择10ml，其余步骤相同，测定A549细胞个数。
结果如图7(每个样本进行平行3次试验)所示，得到本发明的循环肿瘤细胞的富集方法检测CTCs的灵敏度能达到1个/ml。
3、白细胞耗竭效果的定性和定量评估以及细胞捕获性能的综合评估
3.1白细胞耗竭效果的定性评估
按照实施例2实施，分别进行磁分离和不进行磁分离，所述滤膜选择0.65μm的PVDF膜，其余步骤均相同。
结果如图8所示，图8中(a)为未进行白细胞磁分离，(b)为进行白细胞磁分离，由(a)中显示大量的白细胞，而在(b)中只显示少量的白细胞，说明本发明的循环肿瘤细胞的富集方法能够去除样本中的白细胞，且从图中可以看到大约白细胞去除率达到95％以上。
3.2白细胞耗竭效果的定量评估
按照实施例2实施，所述滤膜分别选择0.65μm的PVDF膜、5μm的PVDF膜、5μm的PC膜和8μm的PC膜，分别未进行白细胞磁分离和进行白细胞磁分离，其余步骤均相同。
结果如图9所示，得到在相同类型和尺寸的膜上，经过白细胞磁分离的白细胞去除率比未经过白细胞磁分离的均要高。
3.3循环肿瘤细胞捕获性能综合评估
按照实施例2实施，其中在步骤(3)中稀释倍数为5倍，样以0.25ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤，在步骤(4)中，清洗体积选择10ml；使用的滤膜分别选择5μm的PVDF膜、5μm的PC膜和8μm的PC膜；其余步骤相同。
结果如图10所示，得到在经过磁分离和膜过滤后，5μm的PVDF膜的CTC捕获率能达到90％以上。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (18)
1.一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，包括：
将样本和可与白细胞结合的免疫磁珠混合孵育；
向所述样本中加入红细胞裂解液进行孵育；
将孵育后的所述样本进行稀释，然后依次进行磁分离、膜过滤。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，
所述样本以1/12ml/min-1/4ml/min的流速依次进行磁分离和膜过滤。
3.根据权利要求1或2所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，将所述样本稀释至原始体积的5-10倍。
4.根据权利要求1-3任一项所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，还包括利用缓冲液清洗滤膜的步骤，清洗体积10-15ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，膜过滤后，还包括对滤膜中富集的循环肿瘤细胞进行染色标记的步骤。
6.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述染色标记的步骤中，在染色标记前，向富集循环肿瘤细胞的滤膜中加入封闭液进行封闭，然后清洗并抽干液体。
7.根据权利要求5或6所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，在染色标记时，向富集循环肿瘤细胞的滤膜中加入细胞染色液，避光孵育，然后清洗并抽干液体；细胞染色液体积与滤膜直径的比例为100-150：13,比例关系为μl/mm。
8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，染色标记两次，第一次染色标记时使用细胞染色液A，于4℃避光孵育30-40分钟；第二次染色标记时使用细胞染色液B，于4℃避光孵育10分钟；
优选的，所述细胞染色液A中为含有CD45-FITC和EpCAM-PE，CD45-FITC的体积百分比为3.33％～5.00％，EpCAM-PE的体积百分比为0.67％～1.00％；
优选的，所述细胞染色液B中含有1/15ug/ml DAPI。
9.根据权利要求1-8任一项所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，
膜过滤步骤中的滤膜选自聚碳酸酯膜或PVDF膜；所述滤膜的孔径为0.65μm-8μm。
10.根据权利要求1-9任一项所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述红细胞裂解液中含有固定液成分。
11.根据权利要求1-10任一项所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述免疫磁珠上偶联CD45抗体。
12.一种循环肿瘤细胞的富集装置，其特征在于，包括：
样本收集器，顶端设有样本进口，底端设有样本出口；
分离柱，位于所述样本收集器下方，包括顶端开口和底端开口，顶端开口可与样本出口密封连接；
过滤器，位于所述分离柱下方；所述过滤器具有空腔，所述空腔顶端设有入口可与所述分离柱的底端开口密封连接，所述空腔底端设有出口；所述空腔内水平设置有滤膜，所述滤膜边缘与所述空腔内壁紧密连接。
13.根据权利要求12所述的富集装置，其特征在于，所述滤膜选自聚碳酸酯膜或PVDF膜；所述滤膜的孔径为0.65μm-8μm。
14.根据权利要求13所述的富集装置，其特征在于，所述滤膜的直径为13mm-25mm。
15.根据权利要求12-14任一项所述的富集装置，其特征在于，所述滤膜将所述空腔分割成上腔室和下腔室，所述上腔室容积≤300μl。
16.根据权利要求12-14任一项所述的富集装置，其特征在于，所述分离柱的外部设有磁力装置。
17.根据权利要求12-14任一项所述的富集装置，其特征在于，所述分离柱的内部填充有微铁珠，相邻的两个所述微铁珠之间的间隙为200μm，所述微铁珠的直径为100μm。
18.根据权利要求12-14任一项所述的富集装置，其特征在于，所述空腔底端的出口可与泵紧密连接。
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