CN106399251A - 一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法，属于纳米材料技术领域。所述仿生免疫磁球以水溶性Fe₃O₄纳米团簇为核，外包细胞膜，细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体。通过制备Fe₃O₄纳米团簇，即MNC；制备修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片，即M；将MNC和M反应得到仿生磁球，修饰基团与抗体反应得到带有环炔化修饰基团的抗体；将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体偶联获得本发明所述仿生免疫磁球。所述仿生免疫磁球分散性好且磁响应迅速，捕捉肿瘤细胞识别效率高且背景中几乎没有白细胞，捕捉到得肿瘤细胞活性好；所述制备方法原料来源广泛，在仿生免疫磁球构建上具有普适性。

Description

一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法，属于纳米材料技术领域。

背景技术

根据2014年世界卫生组织发布的《世界癌症报告》，2012年有1400万人被诊断患癌，预测到2035年这个数据将增至2400万。癌症已成为严重威胁人类生命健康的一类疾病，超过90％患者的死亡源于肿瘤转移。在肿瘤转移过程中，循环肿瘤细胞(CTC)扮演着非常重要的角色，这类丰度极低的癌细胞从肿瘤原发灶脱落并进入外周血循环。检测CTC可以为肿瘤转移、肿瘤预后、疗效监控提供参考。然而分离和检测CTC非常具有挑战性，CTC在血液中出现概率约为1个CTC/10⁹个血细胞(白细胞：3×10⁶mL^-1～10×10⁶mL^-1，红细胞：3×10⁹mL^-1～9×10⁹mL^-1，血小板：2.5×10⁸mL^-1～4×10⁸mL^-1)。

CTC富集技术主要包括免疫磁珠富集、密度梯度离心以及膜过滤等，其中，免疫磁珠富集技术应用最为广泛。与早期的微米磁珠相比，纳米磁珠比表面积高、分散性好，并且可以避免细胞活化，无需解离磁珠，可以直接进行后续实验。其中，超顺磁纳米磁珠在外加磁场作用下具有磁性，而在外加磁场移除后不具有磁性，这使得其在溶液中呈单分散态、不易团聚。超顺磁颗粒分散性好，是超顺磁纳米磁珠高效捕捉CTC的一大优势。为了保证磁颗粒的超顺磁性，传统的磁颗粒粒径小(约10nm)、磁性弱且难操纵，商业化***如(Veridex公司)和(德国美天旎公司)需要特殊的仪器来提高外加磁场强度，从而实现磁分离。此外，磁富集技术还存在白细胞的非特异性吸附问题。例如：***是唯一被食品药品监督局(FDA)批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌或***癌检测CTC的技术，通过结合特异性抗体的磁流体靶向CTC表面的EpCAM(上皮细胞黏附分子)抗原，然后在特定磁场的作用下分离CTC，但***对白细胞有明显的非特异性吸附(1000个～3000个/7.5mL)，不利于下游的CTC分析。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种偶联抗体的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球能在复杂的血液环境中高效捕捉极低丰度的循环肿瘤细胞、同时降低白细胞背景，为循环肿瘤细胞的检测、研究提供有力的手段。

本发明的目的之二在于提供一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法。

为实现本发明的目的，提供以下技术方案。

一种偶联抗体的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球以水溶性Fe₃O₄纳米团簇为核，其外包覆细胞膜，在细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体；

所述Fe₃O₄纳米团簇由Fe₃O₄纳米单晶和聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)组成，带正电荷，粒径为30nm～196nm；

所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；

所述修饰基团为DBCO-PEG_n-NHS，n＝1～2000，优选n＝4；

所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体上的氨基偶联。

其中，优选所述Fe₃O₄纳米团簇的粒径为81nm；

优选所述细胞膜为白细胞系J774A.1的细胞膜。

一种本发明所述偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，所述制备方法步骤如下：

步骤一、Fe₃O₄纳米团簇(简称为MNC)的制备

(1)在无氧环境下，将NaOH完全溶解到二乙二醇(Diethylene glycol,DEG)中，制备得到NaOH储存液；

其中，无氧环境可通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；

可加热至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热；

可将NaOH储存液保持在50℃～100℃下储存备用；

优选加热至120℃使NaOH完全溶解到DEG中；

优选将NaOH储存液保持在70℃下储存备用；

优选NaOH储存液采用如下方法制备：

将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中，同时加热，升温至120℃，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体保护，得浅黄色溶液为NaOH储存液，保持在70℃下储存备。

(2)将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min～30min，然后填充氩(Ar)气保护，加热至100℃～180℃，加入步骤一(1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mol/L～0.4mol/L，待溶液颜色变成黑色后加热至190℃～230℃，继续冷凝回流30min～2h，反应结束，得到含有带正电荷的MNC的反应液；

待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声洗涤，再磁分离，移去反应液，得到磁分离终产物为MNC，将MNC悬浮于去离子水中制备得到MNC溶液；

其中，所述溶剂为DEG，或DEG和乙二醇(Ethylene gl ycol,EG)的混合液，所述混合液中EG与DEG的体积比为1:14～1:4，优选为2:13；

所述铁源为含有Fe²⁺，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质，优选为FeSO₄·7H₂O或FeCl₂·4H₂O；

所述PEI作为交联剂和稳定剂使用；

铁源与PEI的质量比为1:60～128:60；

优选混合均匀后抽真空25min；

优选加热至160℃，再加入步骤一(1)所得的NaOH储存液；

优选加热至220℃继续冷凝回流1h，反应结束；

优选将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗涤；更优选在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次；

可根据需要，通过调节抽真空的时间或NaOH储存液加入量制备不同粒径大小的MNC。

步骤二、修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片(简称为M)的制备

将细胞在细胞培养完全培养基中培养20h～28h，换入含有0.1mM～0.4mM叠氮胆碱(N₃)的细胞培养完全培养基中培养22h～28h，收集细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀浆机对重新悬浮于缓冲溶液中的细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对所述间歇破碎后的细胞碎片进行分离提取，得到M；将M溶解于Hepes C缓冲液(购于赛默飞世尔科技公司)中，得到M溶液。

其中，优选在37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中培养；

优选在细胞培养完全培养基中培养24h；

优选换入含有N₃的细胞培养完全培养基中培养24h；

优选所述细胞培养完全培养基为内含10％体积分数胎牛血清(FBS)、60μg/mL青霉素和100μg/m链霉素的DMEM完全培养基；

优选含有N₃的细胞培养完全培养基中含有0.1mM的N₃；

优选用Dispersers and Shakers匀浆机2档对收集的细胞进行间歇破碎。

步骤三、偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将MNC溶液、M溶液和磷酸缓冲盐溶液(PBS)混合，用混悬仪于恒温培养箱中反应4h～24h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；

其中，M相对于MNC过量；

优选用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h；

仿生磁球溶液可于4℃保存待用。

(2)将修饰基团与抗体在PBS中混合得到混合液，将混合液孵育，除去未反应的修饰基团和抗体小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。

其中，修饰基团与抗体摩尔比为10:1～100:1，优选为50:1；

优选混合液在4℃孵育2h～12h；

除去未反应的修饰基团和抗体小分子可采用超滤或透析，优选在4℃，7000r/min下，在超滤管中超滤30min；

带有环炔化修饰基团的抗体的溶液可于4℃保存。

(3)将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体溶液在PBS中混合，并在4℃～37℃混悬1h～4h，发生点击化学反应，仿生磁球偶联上带有环炔化修饰基团的抗体，得到本发明所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球。

其中，环炔化修饰基团的抗体相对仿生磁球过量；

优选在37℃混悬1h。

有益效果

1.本发明提供了一种偶联抗体的仿生免疫磁球，所述仿生免疫磁球分散性好且磁响应迅速，膜流动性赋予其更高的识别效率。将所述仿生免疫磁球加入模拟血样中，37℃孵育15min，即可抓出约90％的肿瘤细胞且背景中几乎没有白细胞，捕捉到的细胞活性好，不需要释放磁球就可以用于后续培养和进一步研究；

2.本发明提供了一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，所述制备方法原料来源广泛，在仿生免疫磁球构建上具有普适性，可以制备针对不同细胞的仿生免疫磁球。

附图说明

图1为实施例2中M的共聚焦表征。

图2为实施例5步骤(1)制备得到的仿生磁球的表征结果：A为MNC的透射电子显微镜图；B为仿生磁球的透射电子显微镜图。

图3为实施例5步骤(2)中带有环炔化修饰基团的抗体的MALDI-TOF图。

图4为实施例5中的仿生磁球、偶联抗体的仿生免疫磁球的共聚焦验证。

图5为实施例9对实施例5制备得到的IMSs捕捉CTC的反应浓度(A)和时间(B)的优化结果。

图6为实施例9步骤(3)中IMSs在模拟血样中捕捉循环肿瘤细胞的免疫染色鉴定结果。

图7为实施例9步骤(4)中IMSs和商业化磁珠beads背对背比较结果。A捕捉率比较(肿瘤细胞浓度为10⁵个/mL，1ⅹPBS体系)；B灵敏度比较(肿瘤细胞浓度为5-1500个/mL，1ⅹPBS体系)；C白细胞背景比较。

图8为实施例9步骤(5)中用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和红色乙锭二聚体-1(EthD-1)对捕捉的肿瘤细胞的共聚焦图片。

具体实施方式

以下实例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为本发明的实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换。

以下所述磁分离具体采用方法为：使用磁吸附，将反应液用移液枪除去，获得剩余物质即为磁分离产物。

无定形碳膜铜网为D200，购自北京达济科仪科技有限公司；

Hepes B缓冲液和Hepes C缓冲液均购自赛默飞世尔科技公司；

蛋白酶抑制剂购自罗氏公司；

所述细胞培养完全培养基为内含10％体积分数胎牛血清(FBS)、60μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基，购自Gibco；

环炔化的染料DBCO-Fluor-525购自Click Chemistry Tools；

Anti-EpCAM抗体购自Biolegend；

FITC荧光标记的二抗购自Abcam公司；

PE标记的抗人(anti-human)CK18(肿瘤细胞标志物)抗体、FITC标记的抗人(anti-human)CD45(白细胞表面标志物)抗体购自Santa Cruze；

Hoechst 33342购自迈晨科技有限公司；

LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit购自Invitrogen；

透射电子显微镜(TEM)采用日本电子株式会社(JEOL)的JEM-2100F或JEM-1400；

能谱仪(EDS)采用牛津仪器公司的Aztec；

X射线衍射(XRD)仪采用XPert PRO MPD,PANalytical，荷兰；

红外光谱(FTIR)仪采用JASCO公司的FT/IR660；

匀浆机采用德国IKA公司的Dispersers and Shakers匀浆机，T18；

离心机和离心管均购自美国贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)，离心机采用Beckman Coulter L-100XP Ultracentrifuge；

MALDI-TOF采用AXIMA-Pertomance，SHIMADZU，日本；

激光共聚焦显微镜采用UltraVIEW VoX，PerkinElmer，美国；

流式细胞仪采用Beckman Coulter,cyan；

beads购自德国美天旎公司。

实施例1MNC的制备

(1)将DEG在Ar气的环境下，待氧气清除完全后，将固体NaOH溶解到DEG中，同时加热，升温至120℃，直到固体NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都用Ar气保护，制备得到浅黄色溶液，为NaOH储存液，浓度为1g/mL，保持在70℃下储存备用；

(2)将FeSO₄·7H₂O、PEI与DEG混合均匀后抽真空，之后填充Ar气保护；加热升温至160℃，加入步骤一(1)所得的NaOH储存液，至溶液中NaOH的摩尔浓度为0.03mol/L，约3min后溶液颜色变成黑色，然后升温至220℃，继续冷凝回流1h，反应结束，得到含有带正电荷的MNC的反应液；

待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物分散于无水乙醇中超声洗涤，反复3次，磁分离，将磁分离产物分散于去离子水中，超声洗涤5次，得到磁分离终产物，为MNC；将MNC溶解于10mL去离子水中，得到MNC溶液，浓度为0.0128g/mL；其中，FeSO₄·7H₂O与PEI的质量比为1:60。

可根据需要，在其他制备条件不变的情况下，通过调节抽真空的时间制备不同粒径大小的MNC，如表1所示：

表1

对制备得到的MNC溶液进行测试表征实验如下：

Ⅰ、分别取实施例1制得的不同粒径的MNC溶液各10μL，分别分散在1mL去离子水中，得到稀释后的MNC溶液，取10μL稀释后的MNC溶液分别滴在无定形碳膜铜网载体，经干燥后，通过透射电子显微镜(JEM-2100F)进行观察，可观察到在抽真空时间为30min、25min、20min、15min和5min时，获得MNC平均粒径依次为31nm、81nm、110nm、140nm和196nm；同时，可观察到所述MNC的分散性良好且粒径较均一；对平均粒径为81nm的MNC进行观察可知，平均粒径为81nm的MNC并不是一个完整的单晶颗粒，而是由许多粒径约为11nm的Fe₃O₄单晶构成的团簇，同时还可以观察到外部模糊的PEI层，通过测量相邻晶面的间距为0.29nm，与面心立方结构的Fe₃O₄晶体(220)晶面的晶格间距一致。

Ⅱ、将平均粒径为81nm的MNC用能谱仪分析，结果可见其元素组成为C、O、Fe，有未标出的峰来源于无定形碳膜铜网载体。

分别取实施例1制得的不同粒径的MNC各0.5g，分别采用X射线衍射(XRD)仪进行X射线衍射测试，采用波长为0.15406nm的Cu-Kα射线采集数据，衍射角2θ为25°～70°，得到相应的衍射图谱结果，结果显示平均粒径粒径为31nm、81nm、110nm、140nm和196nm的MNC衍射曲线中出现特征峰的2θ角依次分别为30.4°、35.6°、43.4°、53.4°、57.4°和62.7°，与JCPDS卡片对比后证明该所述特征峰的峰型为Fe₃O₄晶体的特征衍射峰，分别所对应的Fe₃O₄晶面依次为(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，没有杂峰，衍射峰较尖锐，表明所述MNC结晶度较高。

Ⅲ、将平均粒径为81nm的MNC经真空干燥，取少量与KBr晶体研磨，经压片处理后制得样品，将样品采用红外光谱(FTIR)仪进行红外光谱分析，由分析结果可知在波数为586.70cm^-1处有吸收峰，峰型尖锐，为Fe-O键特征吸收峰；1613.76cm^-1处为氨基中N-H键弯曲振动吸收峰，1053.07cm^-1为C-N键伸缩振动吸收峰；游离氨基在3500cm^-1～3400cm^-1处应有两条明显吸收带，但是在3418.20cm^-1处只有一个宽而强的吸收峰，证明PEI包裹在MNC表面致使其化变化而导致两条吸收峰变为一条。

Ⅳ、所述MNC具有很强的磁可操纵性，分别取所述不同粒径的MNC分散于水中，分别通过磁铁磁分离，仅约10s即可完全富集分离，溶液由黑色变澄清。

Ⅴ、常温下(300K)，将所述不同粒径的MNC，真空干燥后，进行振动样品磁强计(VSM)测试后得到磁化曲线，平均粒径为31nm、81nm、110nm、140nm和196nm的MNC所对应的比饱和磁化强度分别依次为61.99emu/g、71.39emu/g、73.05emu/g、76.37emu/g及80.78emu/g，数值随着平均粒径的增大而增大；同时可以看出磁化曲线都为“S”型，剩磁和矫顽力都为0，说明，常温下尽管MNC粒径在24.8nm以上，但仍表现超顺磁性。

实施例2M的制备

将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养24h，分别换入含有0.1mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养24h，收集白细胞，弃掉培养基。

将收集到的白细胞用pH 7.6的Hepes B缓冲液重新悬浮，加入10μL/mL的蛋白酶抑制剂，用匀浆机2档间歇破碎细胞，破碎2min，停1min，重复10次，然后1000r/min离心3min，收集上清，沉淀用加了10μL/mL蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液重新悬浮，用匀浆机破碎细胞，破碎2min，停1min，重复10次，然后1000r/min离心3min，收集上清，上清液同样悬浮于含蛋白酶抑制剂的Hepes B缓冲液中，两次上清液混入最后一次的细胞破碎液，得到在缓冲溶液中破碎后的白细胞碎片，采用蔗糖密度梯度离心进行分离提取，得到M，将M溶解于HepesC缓冲液，得到M溶液。

所述蔗糖密度梯度离心具体为：在离心管中，从下到上依次铺设质量分数分别为55％、40％和30％的蔗糖溶液，4℃静置4h；加入M溶液，使用离心机在4℃、28000g离心2h，离心管中出现三个梯度的条带，由上向下依次为质量分数为55％、40％和30％的条带，分别收集所述条带，分别用Hepes C缓冲液重新悬浮分离在质量分数为55％、40％和30％的蔗糖溶液中，用离心机在4℃，28000g离心30min进行脱糖处理，得到沉淀为M。

对M采用进行蛋白斑点杂交试验，具体方法为：将所述三个条带分别每个取5μL样品依次点在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，风干后用质量分数为1％的羊血清封闭过夜，将封闭好的PVDF膜浸泡至用PBS稀释过的一抗CD45溶液中，CD45与PBS的体积比为1:200，震荡孵育1h后取出，用Tris-Buffered Saline Tween-20(TBST)缓冲液震荡洗3次，再将PVDF膜浸泡至用PBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗溶液中，所述二抗与PBS的体积比为1:2000，震荡孵育1h后取出，用TBST缓冲液震荡洗3次，最后将PVDF膜浸泡在DAB溶液中震荡孵育10min～30min，之后取出PVDF膜，用去离子水冲洗后晾干，在凝胶成像仪上观察膜上的斑点。PVDF膜出现由上向下三个斑点，依次对应质量分数为55％、40％和30％的条带，可见质量分数为40％的条带对应斑点的颜色最深，效果最好，因此选择40％蔗糖浓度梯度分离提取的M包覆MNC。

对制备得到的M溶液进行测试表征实验如下：

Ⅰ、利用点击化学(Click)反应，使环炔化的染料(DBCO-Fluor-525)标记白细胞膜，通过激光共聚焦显微镜对所述J774A.1细胞的叠氮化进行表征，具体步骤如下：将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养24h，分别换入含有0.1mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基继续培养24h。

弃掉培养液，加入1mL的体积分数为4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗涤两次；之后加入10μM的DBCO-Fluor-525染料，37℃孵育1h后，倒掉染料，再PBS洗涤2次后，加入PBS获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像。

含有0.1mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基培养的细胞的细胞膜上的叠氮胆碱可与DBCO-Fluor-525发生点击化学反应，因此激光共聚焦荧光成像有红色荧光信号，如图1中的右图(N₃-J774A.1+DBCO-Fluor 525)所示。

对照实验1：将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养48h。

弃掉培养液，加入1mL的体积分数为4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗涤两次，加入PBS获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像及流式细胞仪表征荧光强度检测，结果显示，激光共聚焦荧光成像图无红色荧光信号，如图1中的左图(J774A.1)所示。

对照实验2：将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养48h。

弃掉培养液，加入1mL的体积分数为4％的多聚甲醛固定15min，除去多聚甲醛，用PBS洗涤两次；之后加入10μM的DBCO-Fluor-525染料，37℃孵育1h后，倒掉染料，再PBS洗涤2次后，加入PBS获得样品溶液，进行激光共聚焦荧光成像，结果显示因细胞膜上无叠氮胆碱，不能与DBCO-Fluor-525发生点击化学反应，但因DBCO-Fluor-525少量非特异吸附在细胞上，因此激光共聚焦荧光成像图有较弱的荧光信号，如图1中的中间图(J774A.1+DBCO-Fluor525)所示。

实施例3M的制备

将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养20h，换入含有0.1mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养22h，收集白细胞，弃掉培养基，其余制备方法及对照实验同实施例2。

对制备得到的M溶液和M-溶液进行测试表征实验及结果与实施例2类似。实施例4M的制备

将白细胞J774A.1细胞系置于37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中，用细胞培养完全培养基培养28h，换入含有0.1mM的叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中继续培养28h，收集白细胞，弃掉培养基，其余制备方法及对照实验同实施例2。

对制备得到的M溶液和M-溶液进行测试表征实验及结果与实施例2类似。实施例5偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将实施例1制得的平均粒径为81nm的MNC溶液(其中Fe含量为50μg)、实施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)将DBCO-PEG₄-NHS与anti-EpCAM抗体在PBS中混合得到混合液，将混合液在4℃孵育4h，然后在4℃，7000r/min下，在孔径为30KDa超滤管中超滤30min，除去未反应的DBCO-PEG₄-NHS与anti-EpCAM抗体小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。

其中，DBCO-PEG₄-NHS与anti-EpCAM抗体的摩尔比为50:1；

(3)将步骤(1)制得的仿生磁球溶液和步骤(2)带有环炔化修饰基团的抗体的溶液(其中抗体为6μg)在PBS中混合，并在37℃混悬1h，发生点击化学反应，仿生磁球偶联上带有环炔化修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)的抗体，得到一种偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球。

对制备得到的偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球进行测试表征实验如下:

Ⅰ、利用透射电子显微镜JEM-1400对制备得到的仿生免疫磁球进行表征，由图2A可看出，MNC表面凹凸不平，一旦包裹白细胞膜后，其边缘变得模糊，且周围明显多了一层透明状物质，如图2B所示。

Ⅱ、用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)来表征环炔化抗体的分子量，由图3可以看出，当NHS-PEG₄-DBCO与抗体的比例为50:1时，环炔化修饰的抗体平均分子量增加了840.6246，而DBCO-PEG₄-NHS的相对分子质量为649.68，所以平均每个抗体上连接了1～2个环炔分子，DBCO-Ab表示带有环炔化修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)的抗体(Ab)。

Ⅲ、将相同浓度(Fe含量：50μg)的仿生磁球、偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球分别和FITC荧光标记的二抗在室温避光以40r/min转速混悬2h，然后用PBS洗2次，磁分离后用200μL PBS重悬，加入共聚焦小皿，静置30min后在共聚焦显微镜下观察。由图4可知，只有偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球才能被FITC荧光标记的二抗识别和标记(图4右)，而仿生磁球不能和FITC荧光标记的二抗反应(图4左)，说明环炔化抗体确实偶联到了仿生磁球表面，偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球制备成功。

实施例6偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将实施例1制得的平均粒径为81nm的MNC溶液(其中Fe含量为50μg)、实施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)将DBCO-PEG₇₀-NHS与anti-EpCAM抗体在PBS中混合得到混合液，将混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔径为30KDa超滤管中超滤30min，除去多余的修饰基团小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。

其中，DBCO-PEG₇₀-NHS与anti-EpCAM抗体的摩尔比为50:1；

(3)将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体的溶液(其中抗体6μg)在PBS中混合，并在37℃混悬1h，发生点击化学反应，仿生磁球偶联上带有环炔化修饰基团(DBCO-PEG₇₀-NHS)的抗体，得到一种偶联anti-EpCAM抗体的仿生免疫磁球。

对制备得到的偶联抗体的仿生免疫磁球进行测试表征实验及结果与实施例5类似。

实施例7偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将实施例1制得的平均粒径为81nm的MNC溶液(其中Fe含量为50μg)、实施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)将修饰基团(DBCO-PEG₇₀-NHS)与anti-Her2在PBS中混合得到混合液，将混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔径为30KDa超滤管中超滤30min，除去多余的修饰基团小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。

其中，修饰基团(DBCO-PEG₇₀-NHS)与抗体(anti-Her2)的摩尔比为50:1；

(3)将仿生磁球溶液(Fe含量：50μg)和环炔化修饰基团(DBCO-PEG₇₀-NHS)的抗体(anti-Her2)的溶液(其中抗体为6μg)在PBS中混合，并在37℃混悬1h，发生点击化学反应，仿生磁球偶联上带有环炔化修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)的抗体(anti-Her2)，得到一种偶联抗体(anti-Her2)的仿生免疫磁球。

对制备得到的偶联抗体的仿生免疫磁球进行测试表征实验及结果与实施例5类似。

实施例8偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将实施例1制得的平均粒径为81nm的MNC溶液(其中Fe含量为50μg)、实施例2制得的M溶液200μL和PBS 2mL混合，用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在PBS中，得到仿生磁球溶液；

(2)将修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)与抗体(anti-Her2)在PBS中混合得到混合液，将混合液在4℃孵育4h孵育，然后在4℃，7000r/min下，在孔径为30KDa超滤管中超滤30min，除去多余的修饰基团小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液。

其中，修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)与抗体(anti-Her2)的摩尔比为100:1；

(3)将仿生磁球溶液(Fe含量：50μg)和环炔化修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)的抗体((anti-Her2))的溶液(其中抗体6μg)在PBS中混合，并在25℃混悬4h，发生点击化学反应，仿生磁球偶联上带有环炔化修饰基团(DBCO-PEG₄-NHS)的抗体(anti-Her2)，得到一种偶联抗体(anti-Her2)的仿生免疫磁球。

对制备得到的偶联抗体的仿生免疫磁球进行测试表征实验及结果与实施例5类似。

实施例9偶联抗体的仿生免疫磁球捕捉CTC

(1)将实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球进行反应浓度的优化

向浓度分别为10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL的实施例5制得的偶联抗体的仿生免疫磁球中投入约1×10⁵个MCF-7细胞(Hoechst 33342染核)，37℃，40r/min混悬1h；磁分离后，收集上清、用1mL PBS重悬底物，分别用细胞计数器计数上清和底物中的细胞。

(2)将实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球进行反应时间的优化

向50μg/mL实施例5制得的偶联抗体的仿生免疫磁球中投入约1×10⁵个MCF-7(人乳腺癌)细胞，在37℃，40r/min分别混悬不同时间：5min、15min、30min和60min。磁分离后，收集上清、用1mL PBS重悬底物，分别用细胞计数器计数上清和底物中的细胞。

(3)用实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球在模拟血样中捕捉并免疫染色鉴定循环和肿瘤细胞

将1000个MCF-7细胞分别加入1mL人全血中，向以上体系中加入实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球(Fe含量：50μg)，37℃下混悬孵育15min。磁分选并用PBS洗涤捕获的CTCs，用4％的多聚甲醛溶液37℃固定细胞10min。磁分选后向底物中加入体积分数0.1％Triton-X 100溶液在37℃通透细胞10min；磁分选后加入质量分数为1％BSA溶液37℃封闭细胞30min。磁分选后加入Hoechst33342、PE标记的抗人CK18抗体、FITC标记的抗人CD45抗体，在37℃下避光孵育30min，进行免疫细胞化学染色；磁分选并用PBS洗涤一次，最后将细胞重悬于300μL PBS中并置于共聚焦小皿中，在共聚焦荧光显微镜下对细胞进行观察。

(4)将实施例5中制备的偶联抗体仿生免疫磁球和商业化磁珠(beads)进行背对背比较，全面考察偶联抗体的仿生免疫磁球富集CTC的效果①CTCs捕捉率对比

beads用来捕捉10⁵个MCF-7细胞，具体操作步骤按产品说明书中给出的分选方法及MACS磁珠建议用量。

②CTCs检测限对比

将5～1500个的Dio标记的MCF-7细胞加入PBS中，分别用实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球、beads捕捉；磁分离，将捕捉到的细胞加入96孔板，通过转盘共聚焦对MCF-7进行计数。

③白细胞背景值对比

将大约10⁵个MCF-7细胞加入1mL的健康人裂解血中，用实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球、beads分别捕捉MCF-7细胞；磁分选并用PBS洗涤捕获的CTCs，用4％的多聚甲醛溶液在室温固定细胞20min。然后用0.1％Triton-X 100溶液在37℃通透细胞10min，随后用FITC标记的抗人CD45抗体和细胞在4℃孵育1h，用PBS洗涤细胞后再和PE标记的抗人CK18抗体在4℃孵育1h，最后将细胞重悬于500μL PBS中进行流式和共聚焦分析。

(5)用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit检测实施例5中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球捕捉到的MCF-7细胞的活性。先配制Calcein-AM/EthD-1染液：向1mL DPBS中加入4mM的Calcein AM solution 0.5μL和2mM的EthD-1solution 2μL。然后将染液和细胞在37℃作用20min。Calcein AM solution可以使活细胞发出绿色荧光(494/517nm)，EthD-1solution可以使死细胞发出红色荧光(528/617nm)。

对实施例5制备得到的偶联抗体的仿生免疫磁球(简称IMSs)捕捉CTC效果实验结果如下:

Ⅰ、由图5A可知，当IMSs浓度为50μg/mL时，捕捉率已达到90％以上，但当IMSs超过一定浓度时，捕捉率几乎没有变化。

Ⅱ、由图5B可以看出，IMSs和MCF-7反应15min后，捕捉率就达到了95.85％，继续延长孵育时间，捕捉率并没有明显提高，说明IMSs与MCF-7的结合速度非常快。

Ⅲ、CK18是肿瘤细胞标志物、CD45是白细胞表面标志物，只有CK18+/CD45-/Hoechst 33342+的细胞才能认为是CTCs，而CK18-/CD45+/Hoechst33342+的细胞是白细胞(Leukocytes)。将约1000个MCF-7细胞加入1mL人全血中，得到模拟临床样品。用IMSs捕捉其中的CTCs并进行ICC(three-color immunocytochemistry)鉴定。如图6所示，图6中，由左向右依次为Hoechst、CK18、CD45和Merge；其中，Hoechst图中有蓝色说明有细胞存在；CK18图中有绿色说明有CTCs存在，CD45中没有任何显示，说明没有白细胞存在，Merge为Hoechst、CK18和CD45的结果叠加显示，说明IMSs在人全血中能捕捉到CTCs，且视野中几乎没有白细胞，说明IMSs能在全血中高效捕捉CTCs并显著降低对白细胞的非特异性吸附。

Ⅳ、将10⁵个MCF-7细胞分散在PBS溶液中，分别用beads和偶IMSs进行富集，细胞的回收率分别为79.08％、95.85％，显然，IMSs具有更高的捕捉率，如图7A所示。

将5个～1500个的Dio标记的MCF-7细胞加入PBS中。分别用IMSs、beads捕捉。磁分离，将捕捉到的细胞加入96孔板，通过转盘共聚焦对MCF-7进行计数。临床中癌症病人血样中CTCs的数目通常为0～50个/mL。为了检测IMSs用于临床样本的可行性，将被Dio标记的MCF-7细胞加入PBS，制备浓度为5～1500个/mL细胞的系列样品，再分别用IMSs和beads捕捉其中的MCF-7，结果如图7B所示，IMSs在PBS中的回归方程为y＝0.9331x(R²＝1.000)，平均捕捉率为93.31％(范围：84.62％～100％)；beads在PBS中的回归方程为y＝0.6069x(R²＝0.9887)，平均捕捉率为60.69％(范围：25％～90％)，可见IMSs表现出更高的灵敏度。

beads富集细胞的纯度可以达到90％。为了更直观地评估IMSs降低白细胞背景的效果，在1mL健康人裂解血中投入10⁵个MCF-7细胞，分别用beads和IMSs富集，统计抓到相同数目MCF-7细胞时对应背景中的白细胞数目。由图7C可知，CK18+/CD45-为MCF-7细胞(绿色)，CK18-/CD45+为裂解血中的白细胞(黄色)。从流式定量结果可知，用beads捕捉到10329个MCF-7细胞时，检出的白细胞个数为340(即约3400个白细胞背景值/1mL裂解血样)。呈鲜明对比的是，用IMSs捕捉相同数目的MCF-7细胞时，没有检测到白细胞背景。共聚焦结果同样证明了IMSs显著降低了白细胞的背景。

Ⅵ、Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，进而脱去AM基，产生发强绿色荧光的Calcein(钙黄绿素)，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。而红色乙锭二聚体-1(EthD-1)不能透过活细胞膜，只能进入死细胞，与细胞内的基因片段结合后出现荧光，可用于检测死细胞。由图8可知，通过IMSs捕捉到的绝大多数细胞呈绿色荧光，说明细胞活性很好，IMSs对CTCs的机械损伤小。

实施例10偶联抗体的仿生免疫磁球捕捉CTC

(1)将实施例6中制备的仿生免疫磁球进行反应浓度的优化

偶联抗体的仿生免疫磁球为实施例6制得的，其余同实施例9步骤(1)

(2)将实施例6中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球进行反应时间的优化

偶联抗体的仿生免疫磁球为实施例6制得的，其余同实施例9步骤(2)

(3)用实施例6中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球在模拟血样中捕捉并免疫染色鉴定循环和肿瘤细胞

偶联抗体的仿生免疫磁球为实施例6制得的，其余同实施例9步骤(3)

(4)将实施例6中制备的偶联抗体的仿生免疫磁球和商业化磁珠(beads)进行背对背比较，全面考察偶联抗体的仿生免疫磁球富集CTC的效果

偶联抗体的仿生免疫磁球为实施例6制得的，其余同实施例9步骤(4)

(5)偶联抗体的仿生免疫磁球为实施例6制得的，其余同实施例9步骤(4)

对实施例6制备得到的偶联抗体的仿生免疫磁球进行捕捉CTC效果实验及结果与实施例9的效果实验及结果类似。

Claims (9)

1.一种偶联抗体的仿生免疫磁球，其特征在于：所述仿生免疫磁球以水溶性Fe₃O₄纳米团簇为核，其外包覆细胞膜，在细胞膜外共价偶联有具有修饰基团的抗体；

所述Fe₃O₄纳米团簇由Fe₃O₄纳米单晶和聚乙烯亚胺组成，带正电荷，粒径为30nm～196nm；

所述抗体为Fc端具有赖氨酸残基的抗体；

所述修饰基团为DBCO-PEG_n-NHS，n＝1～2000；

所述修饰基团通过环炔化修饰与抗体上的氨基偶联。

2.根据权利要求1所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球，其特征在于：所述修饰基团为DBCO-PEG_n-NHS，n＝4；所述Fe₃O₄纳米团簇的粒径为81nm；所述细胞膜为白细胞系J774A.1的细胞膜。

3.一种如权利要求1或2所述的偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：制备方法步骤如下：

步骤一、Fe₃O₄纳米团簇，即MNC的制备

(1)在无氧环境下，将NaOH完全溶解到DEG中，制备得到NaOH储存液；

(2)将铁源、PEI与溶剂混合均匀后抽真空5min～30min，然后填充氩气保护，加热至100℃～180℃，加入NaOH储存液，至溶液中NaOH的浓度为0.03mol/L～0.4mol/L，溶液颜色变成黑色后加热至190℃～230℃，继续冷凝回流30min～2h，得到含有带正电荷的MNC反应液；

待含有带正电荷的MNC的反应液冷却后，磁分离，移去反应液，将磁分离产物超声洗涤，再磁分离，移去反应液，得到磁分离终产物为MNC，将MNC悬浮于去离子水中制备得到MNC溶液；

其中，所述溶剂为DEG，或DEG和EG的混合液，所述混合液中EG与DEG的体积比为1:14～1:4；

所述铁源为含有Fe²⁺，常温下稳定、能够在所述溶剂中溶解且不发生反应的物质；

铁源与PEI的质量比为1:60～128:60；

步骤二、修饰有叠氮胆碱的细胞膜碎片，即M的制备

将细胞在细胞培养完全培养基中培养20h～28h，换入含有0.1mM～0.4mM叠氮胆碱的细胞培养完全培养基中培养22h～28h，收集细胞，重新悬浮于缓冲溶液中，用匀浆机对重新悬浮于缓冲溶液中的细胞进行间歇破碎，采用蔗糖密度梯度离心对所述间歇破碎后的细胞碎片进行分离提取，得到M；将M溶解于Hepes C缓冲液中，得到M溶液；

步骤三、偶联抗体的仿生免疫磁球的制备

(1)将MNC溶液、M溶液和磷酸缓冲盐溶液混合，用混悬仪于恒温培养箱中反应4h～24h，磁分离，弃掉反应液，将磁分离产物，即仿生磁球重悬在磷酸缓冲盐溶液中，得到仿生磁球溶液；

(2)将修饰基团与抗体在磷酸缓冲盐溶液中混合得到混合液，将混合液孵育，除去未反应的修饰基团和抗体小分子，制备得到带有环炔化修饰基团的抗体的溶液；

修饰基团与抗体摩尔比为10:1～100:1；

(3)将仿生磁球溶液和带有环炔化修饰基团的抗体溶液在磷酸缓冲盐溶液中混合，并在4℃～37℃混悬1h～4h，得到所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球。

4.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：步骤一中：

(1)无氧环境通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；

加热至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热；

(2)DEG和EG的混合液中，EG与DEG的体积比为2:13；

所述铁源为FeSO₄·7H₂O或FeCl₂·4H₂O；

混合均匀后抽真空25min；

加热至160℃，再加入步骤一(1)所得的NaOH储存液；

加热至220℃继续冷凝回流1h，反应结束；

将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗涤。

5.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：步骤二中：

在37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中培养；

在细胞培养完全培养基中培养24h；

换入含有N₃的细胞培养完全培养基中培养24h；

所述细胞培养完全培养基为内含10％体积分数胎牛血清、60μg/mL青霉素和100μg/m链霉素的DMEM完全培养基；

用Dispersers and Shakers匀浆机2档对收集的细胞进行间歇破碎。

6.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：步骤三中：

(1)用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h；

(2)修饰基团与抗体摩尔比为50:1；

混合液在4℃孵育2h～12h；

除去未反应的修饰基团和抗体小分子采用超滤或透析；

(3)在37℃混悬1h。

7.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：步骤一中：

(1)无氧环境通过采用惰性气体脱氧处理和保护实现；

加热至100℃～150℃使NaOH完全溶解到DEG中，NaOH完全溶解时停止加热；

(2)DEG和EG的混合液中，EG与DEG的体积比为2:13；

所述铁源为FeSO₄·7H₂O或FeCl₂·4H₂O；

混合均匀后抽真空25min；

加热至160℃，再加入步骤一(1)所得的NaOH储存液；

加热至220℃继续冷凝回流1h，反应结束；

将磁分离产物先分散于无水乙醇中超声洗涤，再分散于去离子水中超声洗涤；

步骤二中：

在37℃，CO₂浓度为5％的恒温培养箱中培养；

在细胞培养完全培养基中培养24h；

换入含有N₃的细胞培养完全培养基中培养24h；

所述细胞培养完全培养基为内含10％体积分数胎牛血清、60μg/mL青霉素和100μg/m链霉素的DMEM完全培养基；

用Dispersers and Shakers匀浆机2档对收集的细胞进行间歇破碎；

步骤三中：

(1)用混悬仪于4℃恒温培养箱中反应12h；

(2)修饰基团与抗体摩尔比为50:1；

混合液在4℃孵育2h～12h；

除去未反应的修饰基团和抗体小分子采用超滤或透析；

(3)在37℃混悬1h。

8.根据权利要求3所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：

步骤一中：

(1)将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中，同时加热，升温至120℃，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体保护，得NaOH储存液；

(2)在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次；

步骤二中：

含有N₃的细胞培养完全培养基中含有0.1mM的N₃；

步骤三中：

(2)在4℃，7000r/min下，在超滤管中超滤30min除去未反应的修饰基团和抗体小分子。

9.根据权利要求7所述的一种偶联抗体的仿生免疫磁球的制备方法，其特征在于：

步骤一中：

(1)将DEG在惰性气体的环境下做脱氧处理，待氧气清除完全后，将NaOH溶解到DEG中，同时加热，升温至120℃，直到NaOH完全溶解时停止加热，所述制备过程全程都需惰性气体保护，得NaOH储存液；

(2)在无水乙醇中反复超声洗涤3次，在去离子水中反复超声洗涤5次；

步骤二中：

含有N₃的细胞培养完全培养基中含有0.1mM的N₃；

步骤三中：

(2)在4℃，7000r/min下，在超滤管中超滤30min除去未反应的修饰基团和抗体小分子。