CN107402295B - 循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片及其分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片及其分离纯化方法。循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片包括分离纯化室、分流柱以及微柱，分离纯化室具有样品入口、用于供靶标细胞流出的第一出口以及多个用于供非靶标细胞流出的第二出口。分离纯化室内具有两个微柱阵列，每个微柱阵列由多个微柱行组成，每个微柱行上具有多个微柱，微柱行上相邻的两个微柱之间具有间隙且该间隙形成非靶标细胞通道；两个微柱阵列之间具有间隙其该间隙形成用于供靶标细胞通过的靶标细胞通道，该靶标细胞通道的宽度大于非靶标细胞通道的宽度；微柱行与靶标细胞通道夹有锐角，该锐角朝向样品入口。循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片分离纯化纯度高。

Description

循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片及其分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片及其分离纯化方法。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是一类数量稀少却具有重要临床意义的稀有细胞，它是指从肿瘤病灶脱离并播散进入人外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。通常地，循环肿瘤细胞提示了人体内肿瘤的存在以及可能的转移。由于临床上超过90％的癌症死亡都是由转移造成的，而循环肿瘤细胞提供了人体内除了肿瘤病灶以外的肿瘤转移性病灶的来源，因此，从血液中捕获并检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。

然而，循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10mL血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此，从外周血中快速、高效的分离循环肿瘤细胞是后续对循环肿瘤细胞计数、以及分子、功能分析的前提。

基于微流控芯片分选和富集循环肿瘤细胞的原理主要分为4类：a.利用抗原抗体亲和性进行分选；b.利用细胞物理特征的不同进行分选，比如细胞大小、变形性以及不同大小的细胞在流场中的力学特性；c.利用免疫磁珠具有磁性兼连接抗体的作用进行分选；d.利用不同细胞的电学性能差异进行分选等。然而，已有的循环肿瘤细胞检测设备通常都是基于磁球分离技术，不但循环肿瘤细胞的捕获效率低，而且设备操作繁琐、复杂，更重要的是，这些设备和技术尚没有实现循环肿瘤细胞检测过程的自动化控制，即没有实现血液检测样品和试剂的自动化进样，细胞的自动化捕获及鉴定分析，由此，循环肿瘤细胞的检测存在过多的人为干预，使得循环肿瘤细胞的检测准确性低，检测成本过高。

目前，唯一通过美国食品和药品监督管理(FDA)认证的循环肿瘤细胞分离和计数***是Cellsearch，它是一个依赖于免疫磁珠原理的半自动化工作***，该***通过连接了抗上皮细胞黏附分子抗体EpCAM的磁珠和循环肿瘤细胞表面标志物EpCAM特异性结合，达到捕获循环肿瘤细胞的目的。循环肿瘤细胞的识别使用经典的免疫染色法。该***分选的循环肿瘤细胞效率为80％。尽管Cellsearch已通过FDA批准，但该***还存在一些缺陷，比如无法实现全自动分选、假阳性比率高、富集后的循环肿瘤细胞没有生物活性等，更为重要的是，Cellsearch捕获的循环肿瘤细胞仅仅是EpCAM阳性的类型，而许多恶性程度很高的循环肿瘤细胞并不表达EpCAM，从而无法被检测出来。

确定性侧向位移(DLD)是指在微柱阵列中超过临界半径的大体积物质碰撞后发生侧向位移向一侧汇聚，小体积物质按照其原流向流过阵列的现象。基于CTCs细胞尺寸(12～30μm)与血细胞尺寸(5～15μm)差异的物理特性，可以设计制作分选富集临界半径介于CTCs与血细胞间的DLD阵列微流控芯片。然而，血液中一些血细胞体积较大，与CTCs体积大小存在重叠，因此，目前使用DLD技术富集的CTCs中仍含有大量体积较大的血细胞，影响后续对CTCs蛋白和分子的相关研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够避免循环肿瘤细胞表面抗原差异表达而造成的假性结果并且分离纯化纯度高的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片。

一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，包括分离纯化室、分流柱以及微柱，所述分离纯化室具有样品入口

用于供靶标细胞流出的第一出口以及分布在所述第一出口两侧以用于供非靶标细胞流出的第二出口；

所述分离纯化室内具有两个微柱阵列，每个所述微柱阵列由多个微柱行组成，每个所述微柱行上具有多个所述微柱，每个所述微柱行上相邻的两个所述微柱之间具有间隙且该间隙形成用于供非靶标细胞通过的非靶标细胞通道，两个所述微柱阵列之间具有间隙且该间隙形成靶细胞通道，所述靶标细胞通道的宽度大于所述非靶标细胞通道的宽度；所述微柱行与所述靶标细胞通道夹有锐角，且该锐角朝向于所述样品入口；

所述分流柱设置在所述分离纯化室内且靠近于所述样品入口处，所述分流柱用于将所述样品分流至两侧的所述微柱阵列内。

在其中一个实施例中，还包括靶标细胞收集室，所述靶标细胞收集室连通于所述第一出口以用于收集流出的靶标细胞。

在其中一个实施例中，所述分流柱具有两个导流面，两个所述导流面由所述样品入口处分别延伸至两个所述微柱阵列处。

在其中一个实施例中，每个所述微柱阵列上的多个所述微柱行均平行。

在其中一个实施例中，所述非靶标细胞通道临界半径为6-20μm。

在其中一个实施例中，所述非靶标细胞通道的临界半径为10μm；

在其中一个实施例中，每个所述微柱阵列上，相邻的所述微柱行之间的间距为60-70μm。

在其中一个实施例中，每个所述微柱阵列上，相邻的所述微柱行之间的间距为65μm。

在其中一个实施例中，还包括抗原抗体捕获室，所述抗原抗体捕获室具有捕获通道，所述抗原抗体捕获室设置在所述分离纯化室与所述靶标细胞收集室之间，且所述捕获通道连通于所述第一出口与所述靶标细胞收集室，所述抗原抗体捕获室用于捕获混合在靶标细胞中的血细胞。

本发明的另一目的还在于提供一种循环肿瘤细胞自动分离纯化方法。

一种循环肿瘤细胞自动分离纯化方法，包括如下步骤：

将样品由分离纯化室的入口进样，进入所述分离纯化室内的所述样品经过分流柱分流至两侧的两个微柱阵列内；

所述样品通过所述微柱阵列的所述微柱之间的间隔以及两个所述微柱阵列之间具有的通道进行分离，半径小于微柱临界半径的非靶标细胞与微柱阵列碰撞后不发生侧向位移，按原来的流向通过所述微柱之间的间隔经所述分离纯化室的第二出口流出；半径大于微柱临界半径的细胞的靶标细胞与微柱阵列碰撞后发生侧向位移，逐步汇集进入两个所述微柱阵列之间具有的通道内，并经所述分离纯化室的第一出口流出，进入靶标细胞收集室。

本发明涉及的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，利用确定性侧向位移原理，根据血液中循环肿瘤细胞即靶标细胞与血液中非靶细胞体积大小的差异进行分离纯化，有效避免了循环肿瘤细胞表面抗原差异表达而造成的假阳性结果，同时分离纯化得到的循环肿瘤细胞纯度较高，理化性质不受影响，非常适用于后续分子或蛋白方面的研究。

本发明涉及的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片具有如下优点：

(1)本发明利用确定性侧向位移原理，根据循环肿瘤细胞与血液中非靶细胞体积大小的差异进行分离纯化，有效避免了循环肿瘤细胞表面抗原差异表达而造成的假性结果，同时分离纯化得到的循环肿瘤细胞纯度较高，理化性质不受影响，非常适用于后续分子或蛋白方面的研究。

(2)本发明采用圆角三角形的微柱，与一般所采用的三角形、圆形相比，其临界分离尺寸更加准确，待检测样品中体积大于临界半径的细胞的回收率可达97％；此外采用圆角三角形能有效避免在高流速情况对细胞的损伤。

(3)本发明将循环肿瘤细胞物理分选与抗原-抗体阴性分选方法相结合，通过物理分选的方法去除待检测样品中的大部分正常血细胞，再通过抗原-抗体特异性结合的阴性分选去除与循环肿瘤细胞体积相重叠的体积较大的正常血细胞，大大减少了常规抗原-抗体特异性结合阴性分选芯片中抗体的使用量，减少芯片的生产成本，同时可以有效解决现有循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片捕获循环肿瘤细存在的假阳性率高、纯度低等缺点。

(4)本发明的抗原-抗体捕获区域为纳米材料制备，在纳米材料上可以包被大量的正常血细胞特异性抗体，保证了芯片对非肿瘤细胞的去除效率。

(5)本发明所涉及的制备材料主要包括硅片、玻璃、PDMS，主要涉及的制备方式是微加工技术中成熟的干法、湿法刻蚀，强紫外键合等工艺，材料较为廉价，制造成本低。

附图说明

图1为本发明实施例1中循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A俯视剖面示意图；

图2为本发明实施例1中循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B俯视剖面示意图；

图3为本发明实施例1中循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片C俯视剖面示意图。

附图标记说明

10、循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片；100、分离纯化室；110、样品入口；120、第一出口；130、第二出口；200、分流柱；300、微柱；400、微柱阵列；500、通道；600、靶标细胞收集室；700、抗原抗体捕获室。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例提供了一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10。

参见图1所示，一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10，包括分离纯化室100、分流柱200、微柱300以及靶标细胞收集室600。此循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10记为循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A。

循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10的分离纯化室100由底片以及上盖键合而成。所述底片的材料包含但不限于：玻璃、PDMS、硅材料等；所述上盖的材料包含但不限于：玻璃、PDMS、硅材料等。循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10的厚度为30-100μm；更优选的是，所述循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10的厚度为75μm，也即下述的分离纯化室100内的两个所述微柱阵列400之间的通道500高度。所述分离纯化室100具有用于样品进样的入口、用于靶标细胞也即循环肿瘤细胞流出的第一出口120以及多个分布在所述第一出口120两侧以用于非靶标细胞和废液流出的第二出口130。

所述分离纯化室100内具有两个微柱阵列400。所述微柱阵列400由多个微柱行组成。每个所述微柱行上具有多个所述微柱300。每个所述微柱阵列400上的多个所述微柱行均平行。每个所述微柱阵列400上，相邻的所述微柱行之间的间距为60-70μm。在实施例中，每个所述微柱阵列400上，相邻的所述微柱行之间的间距为65μm。

所述微柱300的径向截面为圆角正三角形。圆角正三角形的直边长为20-40μm，圆角半径与直边的比为0.05-0.2。更优选的是，所述圆角三角形的直边为30μm，圆角半径与直边的比为0.12。

本实施例的微柱300采用径向截面为圆角三角形的微柱300，与一般文献所采用的三角形、圆形相比，其临界分离尺寸更加准确，待检测样品中体积大于临界半径的细胞的回收率可达97％；此外采用圆角三角形能有效避免在高流速情况对细胞的损伤。

每个所述微柱行上相邻的两个所述微柱300之间均具有间隙且该间隙形成用于非靶标细胞通过的非靶标细胞通道。每个所述微柱阵列400上，所述微柱行上相邻的所述微柱300之间的非靶标细胞通道临界半径为6-20μm。在实施例中，每个所述微柱阵列400上，所述微柱行上相邻的所述微柱300之间的非靶标细胞通道临界半径为10μm。

两个所述微柱阵列400之间具有间隙且该间隙形成用于供靶标细胞通过的靶标细胞通道500，也即微柱阵列400分布在靶标细胞通道500的两侧。所述微柱300的其中一个中线与上述的靶标细胞通道500平行。两个所述微柱阵列400的末端分别朝向于所述第二出口130。

参见图1所示，靶标细胞通道500的末端连通于所述第一出口120，且靶标细胞通道500的最小宽度大于所述微柱行上相邻的两个所述微柱300之间的间隔(非靶标细胞通道)。所述微柱行与所述靶标细胞通道500夹有锐角，且该锐角朝向于所述样品入口110。该锐角为1-5°，更优选的是，锐角为3°。

所述分流柱200设置在所述分离纯化室100内且靠近于所述样品入口110处。所述分流柱200呈正三角形状，分流柱200的其中一个尖部朝向于所述样品入口110，分流柱200的两个三角形斜边形成导流面。所述分流柱200用于将经所述样品入口110进入所述分离纯化室100内的所述样品分流至两侧的所述微柱阵列400内。所述靶标细胞收集室600连通于所述第一出口120以用于收集流出的靶标细胞也即循环肿瘤细胞。不难理解，分流柱还可以是椭圆形，圆形、梯形等。

参见图2及图3所示，进一步地，本实施例中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10还可以包括抗原抗体捕获室700。

参见图2所示，所述抗原抗体捕获室700可以设在分离纯化室100内，并位于两个所述微柱阵列400之间具有的通道500内。所述捕获通道500连通于所述第一出口120与所述靶标细胞收集室600。抗原抗体捕获室700的制作材料可以选自纳米材料、硅、玻璃材料或生物兼容高分子材料等，优选为纳米材料。所述抗原-抗体捕获装置内表面修饰的针对正常血细胞特异性抗原的抗体可以选自：CD45、CD38、CD36、CD19、CD16、CD2中的两个或两个以上。上述的抗原抗体捕获室700涉及的抗原抗体捕获方法包含但不仅限于：化学气相沉积法、刻蚀法等。此循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10记为循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B。

参见图3所示，所述抗原抗体捕获室700具有捕获通道500，所述抗原抗体捕获室700设置在所述分离纯化室100与所述靶标细胞收集室600之间，且所述捕获通道500连通于所述第一出口120与所述靶标细胞收集室600。此循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片记为循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片C。所述抗原抗体捕获室700用于捕获混合在靶标细胞中的血细胞。抗原抗体捕获室700的制作材料可以选自纳米材料、硅、玻璃材料或生物兼容高分子材料等，优选为纳米材料。所述抗原-抗体捕获装置内表面修饰的针对正常血细胞特异性抗原的抗体可以选自：CD45、CD38、CD36、CD19、CD16、CD2中的两个或两个以上。上述的抗原抗体捕获室700涉及的抗原抗体捕获方法包含但不仅限于：化学气相沉积法、刻蚀法等。

本实施例中的分离纯化室100、分流柱200、两个微柱阵列400、第二出口130、第一出口120、抗原抗体捕获室700以及靶标细胞收集室600构成的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10，以所述入口及所述第一出口120构成的轴线为对称轴呈轴对称。

本发明的另一目的还在于提供一种循环肿瘤细胞自动分离纯化方法。

一种循环肿瘤细胞自动分离纯化方法，包括如下步骤：

将样品由分离纯化室100的入口进样，样品流速为4mL/h-10mL/h；优选的是，所述样品流速为6mLl/h。进入所述分离纯化室100内的所述样品经过分流柱200分流至两侧的两个微柱阵列400内。

所述样品通过所述微柱阵列400的所述微柱300之间的间隔以及两个所述微柱阵列400之间具有的通道500进行分离，半径小于微柱临界半径的非靶标细胞与微柱阵列碰撞后不发生侧向位移，按原来的流向通过所述微柱300之间的间隔经所述分离纯化室100的第二出口130流出。半径大于微柱临界半径的细胞的靶标细胞与微柱阵列碰撞后发生侧向位移，逐步汇集进入两个所述微柱阵列400之间具有的通道500内，并经过所述分离纯化室100的第一出口120流入抗原抗体捕获室700内，所述抗原抗体捕获室700用于捕获混合在靶标细胞中的血细胞。靶标细胞进入靶标细胞收集室600内。

实施例2

采用实施例1中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A对临床样品进行检测

本实施例采用实施例1中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A对20例肿瘤患者外周血样品(编号1-20)进行检测。

1、试剂配方：

(1)封闭液的配制：最低必需培养基(MEM)中含有15％聚蔗糖，0.2％的Pluronic和5％牛血清白蛋白(BSA)。

(2)Hank's平衡盐溶液：

2、具体检测步骤：

(1)封闭：所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10的分离纯化室由PDMS的底片和上盖玻璃片构成，为了防止细胞与PDMS和分离纯化室100的玻璃表面进行非特异性吸附，在使用该分离纯化室100前，需要对分离纯化室进行封闭处理。将上述配制的封闭液及样品入口110注入分离纯化室100内，使整个分离纯化室100的通道500充满封闭液，并孵育15min。

(2)洗涤：使用Hank's平衡盐溶液对孵育完成的分离纯化室100进行洗涤。

(3)进样：将5mL待测样品从样品入口110注入分离纯化室100中，当待测样品完全进入分离纯化室100后，可将缓冲液从样品入口110注入分离纯化室100中，保证待检测样品全部流出分离纯化室100。

(4)细胞收集与鉴定：收集靶标细胞收集室600内的细胞，采用益善生物技术股份有限公司的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法(CN2014102285119)对收集到的循环肿瘤细胞进行进一步的鉴定。具体检测结果如下表所示：

表1样品检测结果

由检测结果可知，本发明循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A能实现样品中各种类型循环肿瘤细胞(循环肿瘤细胞)(包括上皮型、上皮-间质型和间质型)的全自动化捕获，同时有效去除样品中的正常血细胞。说明本发明循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A能高效快速地将样品中的循环肿瘤细胞进行捕获分离，并且捕获到的循环肿瘤细胞具有很高的纯度，非常适用于下游分子和蛋白相关方面的研究。

实施例3

利用实施例1中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A对细胞株进行检测

一、样品制备

为了证明本发明的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A具有很好的捕获率，能有效将样品中的肿瘤细胞检出，同时去除样品中的正常血细胞，本实施例以肿瘤细胞数量已知的样品为例进行检测。本实施例选用上皮型细胞株MCF-10A、间质型肿瘤细胞株U118、上皮-间质混合型肺癌细胞株PC-9和阴性对照CCRF-HSB-2淋巴母细胞进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。用细胞计数器取一定数量的上述细胞，加入5mL正常人外周血中，制备如下表所示细胞浓度梯度的样品：

表2样品细胞浓度

二、样品检测

利用实施例1中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10和实施例2中的检测方法，对样品21-40进行检测，按鉴定试剂盒中阳性循环肿瘤细胞判断标准，对富集得到的表达循环肿瘤细胞相关标志物的细胞进行分析和统计，具体结果如下表3所示。

表3样品检测结果

为了评估本发明的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10分离纯化的纯度，同时对靶标细胞收集室600中残留的正常血细胞进行分析和统计，具体结果见表4：

表4样品检测结果

从上述检测结果可以看出，本发明提供的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10，可以全自动的完成循环肿瘤细胞的收集，减少循环肿瘤细胞在检测中的过多人为干预，提高检测效率。本实施例循环肿瘤细胞的回收率高(97％-100％)，纯化效果好，说明本发明提供的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10具有全自动化、回收率高、纯化效果好和检测结果稳定等优点。

实施例4

不同循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10(A、B、C)对检测结果的影响

一、循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10(A、B、C)选择

本实施例利用实施例1中的3种类型的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10(A、B、C)对样品进行检测，具体实验设计见表5：

表5循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10设计

二、样品检测

本实施例选用乳腺癌细胞株MCF-7进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取100个MCF-7细胞，加入15例健康志愿者外周血中(即每5mL外周血液样品中含有100个MCF-7细胞)，编号41-55。利用上述设计制备的芯片和实施例2所述检测方法，对样品进行检测，具体结果如表6：

表6芯片组成对检测结果的影响

从上面的检测结果可以看出，不同循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10(A、B、C)均能实现循环肿瘤细胞的分离纯化，捕获效率基本一致。其中，结合了确定性侧向位移和抗原-抗体特异性结合阴性分选原理的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B和循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片C(即实验组2和实验组3)捕获到的循环肿瘤细胞纯度显著高于实验组1中的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A，几乎不含非靶标细胞。说明本发明设计的抗原抗体捕获室700能有效去除样品中体积较大的正常血细胞，大大提高分离纯化的纯度，减少假阳性结果，并且抗原抗体捕获室700在中循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片10位置对检测结果没有影响。

实施例5

不同样品流速对检测结果的影响。

一、样品流速设计

本实施例以循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B为例，研究样品流速对微流控芯片分离纯化效果的影响，为此，本实施例设计了5个实验组，具体见表7：

表7样品流速的设计

实验组	样品流速
		实验组4	4mL/h
实验组5	5mL/h
		实验组6	6mL/h
实验组7	7mL/h
		实验组8	10mL/h

二、样品检测

本实施例选用乳腺癌细胞株MCF-7进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取100个MCF-7细胞，加入20例健康志愿者外周血中(即每5mL外周血液样品中含有100个MCF-7细胞)，编号56-75。采用上述样品流速和实施例2所述检测方法，对样品进行检测，具体结果如表8：

表8样品检测结果

从上述5个实验组的检测结果可以看出，本发明循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B在样品流速为4mL/h-10mL/h时均能实现样品中循环肿瘤细胞的分离纯化，其中当样品流速在4mL/h、5mL/h和6mL/h时，样品中循环肿瘤细胞的富集率和分离纯化纯度都能达到最优效果。当样品流速大于6mL/h时，在高流速的情况下，细胞直径与相邻微柱300之间的间隔相近的循环肿瘤细胞发生形变，容易从非靶标细胞收集口(第二出口130)流出，从而造成较低的循环肿瘤细胞富集率，同时残留的血细胞数目显著增多。因此，本发明提供的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片在进行样品检测时最佳的流速为6mL/h。样品流速对循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片A和循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片C的分离纯化效果检测实验与循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片B一致，具体数据省略。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，包括分离纯化室、分流柱、微柱以及抗原抗体捕获室，所述分离纯化室具有样品入口、用于供靶标细胞流出的第一出口以及分布在所述第一出口两侧以用于供非靶标细胞流出的第二出口；

所述分离纯化室内具有两个微柱阵列，每个所述微柱阵列由多个微柱行组成，每个所述微柱行上具有多个所述微柱，所述微柱的径向截面为圆角正三角形，圆角正三角形的直边长为20-40μm，圆角半径与直边的比为0.05-0.2，每个所述微柱行上相邻的两个所述微柱之间具有间隙且该间隙形成用于供非靶标细胞通过的非靶标细胞通道，两个所述微柱阵列之间具有间隙且该间隙形成靶细胞通道，所述靶标细胞通道的宽度大于所述非靶标细胞通道的宽度；所述微柱行与所述靶标细胞通道夹有锐角，且该锐角朝向于所述样品入口；

所述分流柱设置在所述分离纯化室内且靠近于所述样品入口处，所述分流柱用于将所述样品分流至两侧的所述微柱阵列内；

所述抗原抗体捕获室具有捕获通道，所述抗原抗体捕获室设置在所述分离纯化室与所述靶标细胞收集室之间，且所述捕获通道连通于所述第一出口与所述靶标细胞收集室，所述抗原抗体捕获室用于捕获混合在靶标细胞中的血细胞。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，还包括靶标细胞收集室，所述靶标细胞收集室连通于所述第一出口以用于收集流出的靶标细胞。

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，所述分流柱具有两个导流面，两个所述导流面由所述样品入口处分别延伸至两个所述微柱阵列处。

4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，每个所述微柱阵列上的多个所述微柱行均平行。

5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，所述非靶标细胞通道临界半径为6-20μm。

6.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，所述非靶标细胞通道的临界半径为10μm。

7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，每个所述微柱阵列上，相邻的所述微柱行之间的间距为60-70μm。

8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片，其特征在于，每个所述微柱阵列上，相邻的所述微柱行之间的间距为65μm。

9.一种使用权利要求1-8任意一项所述的循环肿瘤细胞自动分离纯化微流控芯片的循环肿瘤细胞自动分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

将样品由分离纯化室的入口进样，进入所述分离纯化室内的所述样品经过分流柱分流至两侧的两个微柱阵列内；

所述样品通过所述微柱阵列的所述微柱之间的间隔以及两个所述微柱阵列之间具有的通道进行分离，半径小于微柱临界半径的非靶标细胞与微柱阵列碰撞后不发生侧向位移，按原来的流向通过所述微柱之间的间隔经所述分离纯化室的第二出口流出；半径大于微柱临界半径的细胞的靶标细胞与微柱阵列碰撞后发生侧向位移，逐步汇集进入两个所述微柱阵列之间具有的通道内，并经所述分离纯化室的第一出口流出，进入靶标细胞收集室。