CN108982839A - 基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其包括以下步骤：对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。本发明的方法简单易操作，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团(CTM，CirculatingTumorMicroemboli)。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EMT，EpithelialMesenchymalTransition)，故CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、***表型和上皮细胞与***混合表型。CTM和***表型CTC具有更强的转移潜能。早期发现血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。CTC检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。
目前，临床上应用的获得美国FDA和中国药监局批准的唯一的检测循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)的方法是强生公司的仪器(商品名CellSearch)，这是一种使用表皮细胞特异性蛋白作为肿瘤标志物，同时利用免疫磁珠的方法将循环肿瘤细胞富集并最后进行免疫荧光显微观察检测的一种半自动的循环肿瘤细胞计数方法。这种方法存在检测阳性符合率较低的问题。同时由于其***较为昂贵、单个检测样本成本较高、耗时较长，应用较为困难。因此，临床上迫切需要一种特异性灵敏度高、成本低且操作简单的循环肿瘤细胞检测技术。其他正在申请或已授权专利，还有使用先细胞分离再核酸杂交及荧光显微镜检测的，也都严重依赖操作和耗费人工，比较麻烦。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种特异性灵敏度高、成本低且操作简单的循环肿瘤细胞检测方法。
为了实现以上发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其包括以下步骤：
(1)对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；
(2)经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。
优选地，步骤(1)的具体操作如下：
1)用含有枸椽酸钠的ACD管采外周血7.5ml；
2)将血液转入15ml离心管中，加入约5ml HBSS，重悬血细胞后，缓慢加至含7.5ml淋巴细胞分离液的50ml离心管液面上，1500rpm室温离心18min，吸出中间雾状单个核细胞层；
3)离心期间配红细胞裂解液工作液；
4)加入5ml HBSS，1500rpm离心5min；去上清，加入3ml所述红细胞裂解液工作液重悬细胞，室温避光10min，1500rpm离心5min，去上清；
5)加入5ml HBSS重悬细胞，1500rpm离心5min去上清，加入MACS buffer5ml重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
6)加入CD326磁珠(20ul/107个细胞)，4℃遮光孵育30min，用MACS Buffer洗涤细胞，1500rpm离心5min，去上清；
7)取LS磁珠分离管安装于磁板上，用3ml MACS buffer润洗分离柱，用500μl MACSbuffer重悬细胞后加入分离柱，等液体全部流出；
8)用3ml MACS buffer涮洗管壁后加入分离柱；
9)加入5ml MACS buffer然后迅速取出分离柱放于流式管上，将分离柱的液体推入所述流式管中，1500rpm离心5min，去上清；
10)加入1ml HBSS后重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
11)加入三种抗体CK、CD326和CD45，每种10ul，充分混匀，室温避光孵育12min，再加入5ml PBS，1500rpm离心5min去上清，加入500μl PBS上流式细胞仪。
实际应用结果表明，本发明的方法基于免疫磁珠和流式细胞仪，能够有效地检测循环肿瘤细胞，特异性灵敏度高、成本低且操作简单。
附图说明
图1是用本发明的CTC检测方法的流程模式示意图。
图2是流式细胞仪分析第一步的结果。
图3是流式细胞仪分析第二步的结果。
图4是流式细胞仪分析第三步的结果。
图5是流式细胞仪分析三步的数据汇总。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
一、预处理及免疫磁珠处理
如图1所示，是采用本发明的CTC检测方法的流程模式示意图。首先，对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离，并经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。
具体操作如下：
1)用含有枸椽酸钠的ACD管采外周血7.5ml；
2)将血液转入15ml离心管中，加入约5ml HBSS(Hank's平衡盐溶液)，重悬血细胞后，缓慢加至含7.5ml淋巴细胞分离液的50ml离心管液面上，1500rpm室温离心18min，吸出中间雾状单个核细胞层；
3)离心期间配红细胞裂解液(美国BD公司，商品名Pharm Lyse，货号555899)工作液(浓缩液：灭菌纯水体积比为1：9)
4)加入5ml HBSS(Hank's平衡盐溶液)，1500rpm离心5min；去上清，加入3ml上述红细胞裂解液工作液重悬细胞，室温避光10min，1500rpm离心5min，去上清；
5)加入5ml HBSS重悬细胞，1500rpm离心5min去上清(用纸印干余液)，加入MACSbuffer 5ml重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
6)加入CD326磁珠(20ul/107个细胞)(德国美天旎公司的磁珠分离试剂盒，产品编号130-061-101)，4℃遮光孵育30min，用MACS Buffer(107/1-2ml)洗涤细胞，1500rpm离心5min，去上清；
7)取LS磁珠分离管安装于磁板上，用3ml MACS buffer润洗分离柱，用500μl MACSbuffer(≤50×106)重悬细胞后加入分离柱，等液体全部流出；
8)用3ml MACS buffer涮洗管壁后加入分离柱(2次)；
9)加入5ml MACS buffer然后迅速取出分离柱放于流式管上，取推压器将分离管的液体推入流式管中，1500rpm离心5min，去上清；
10)加入1ml HBSS后重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
11)加入三种抗体CK、CD326和CD45，每种10ul，充分混匀，室温避光孵育12min，再加入5ml PBS，1500rpm离心5min去上清，加入500μl PBS上流式细胞仪。
二、流式细胞仪分析
流式细胞仪分析的工作流程参考图2至图5所示。
图2是流式细胞仪分析第一步，将抗体孵育好的细胞上机，每次流式细胞仪共收获20万个细胞进行分析，前向角散射(FSC)示数小于200且成团存在的细胞为带细胞核的完整细胞。在屏幕上圈取完整的细胞(P1所在区域，19.75万个)进行下一步检测，摒弃细胞碎片
图3是流式细胞仪分析第二步，为圈取完整细胞后得到的结果图，从完整细胞中圈取CD45-细胞(CD45-PE示数小于100且成团存在的包含CTC在内，即P2所在区域，机器读数为3.98万个)
图4是流式细胞仪分析第三步，为圈取CD45-细胞后得到的结果图，从CD45-细胞中检测CK和CD326双阳性细胞，即为CTC(图中Q2区域为CK和CD326示数都大于100且成团存在的区域，即为双阳性细胞，机器读数为4个)
图5是流式细胞仪分析三步的数据汇总，是流式细胞仪将上述三步的数据汇总在一个框里。
经50例非肿瘤健康人和500例中晚期肿瘤患者血液标本检测，健康人除极少数检测结果肿瘤细胞数为1外，都是0；肿瘤患者根据病情不同数值从1-40不等。实际检测结果表明，本发明的方法用于检测循环肿瘤细胞简便快速(半天能出结果)，使用机器计数更准确，准确性高。
Claims (2)
1.一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；
(2)经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作如下：
1)用含有枸椽酸钠的ACD管采外周血7.5ml；
2)将血液转入15ml离心管中，加入约5ml HBSS，重悬血细胞后，缓慢加至含7.5ml淋巴细胞分离液的50ml离心管液面上，1500rpm室温离心18min，吸出中间雾状单个核细胞层；
3)离心期间配红细胞裂解液工作液；
4)加入5ml HBSS，1500rpm离心5min；去上清，加入3ml所述红细胞裂解液工作液重悬细胞，室温避光10min，1500rpm离心5min，去上清；
5)加入5ml HBSS重悬细胞，1500rpm离心5min去上清，加入MACS buffer5ml重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
6)加入CD326磁珠(20ul/107个细胞)，4℃遮光孵育30min，用MACS Buffer洗涤细胞，1500rpm离心5min，去上清；
7)取LS磁珠分离管安装于磁板上，用3ml MACS buffer润洗分离柱，用500μl MACSbuffer重悬细胞后加入分离柱，等液体全部流出；
8)用3ml MACS buffer涮洗管壁后加入分离柱；
9)加入5ml MACS buffer然后迅速取出分离柱放于流式管上，将分离柱的液体推入所述流式管中，1500rpm离心5min，去上清；
10)加入1ml HBSS后重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；
11)加入三种抗体CK、CD326和CD45，每种10ul，充分混匀，室温避光孵育12min，再加入5ml PBS，1500rpm离心5min去上清，加入500μl PBS上流式细胞仪。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181211 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |