CN102094075A - 外周血肝癌细胞检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种外周血肝癌细胞检测试剂盒。该试剂盒主要由淋巴细胞分层液、阳性磁珠、阴性磁珠、逆转录预混液、巢式PCR预混液和两组引物组成，采用免疫磁珠富集法和巢式PCR的方法检测外周血肝癌细胞。免疫磁珠可以富集血细胞中的肝癌细胞，提高检测灵敏度；巢式PCR通过外引物和内引物，提高检测的特异性。本发明克服了传统的检测灵敏度底的缺点，能够更好地监测肝癌细胞的血液转移，为临床治疗肝癌和预防肝癌转移提供了很大的帮助。
Description
技术领域
本发明涉及一种的检测试剂盒，具体的说，涉及一种针对外周血肝癌细胞的检测试剂盒。
背景技术
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。
肝癌平均患病年龄44岁。肝病恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年。肝癌早期可无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹有肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等。
肝癌的主要治疗方法有：手术、中医药、肝动脉栓塞、肝动脉插管化疗、全身化疗、放疗及免疫治疗等。如病人属早期，肝功能代偿较好，可手术切除，肝肿瘤较小，切除效果越好，但术后很容易随血液转移。
血液转移的肝癌转移中最为常见的和多发的一种转移的方式，癌细胞往往先侵犯门静脉，进而进入体循环，发生肝外转移，以肾上腺、骨、脑、肺等器官较为常见。为了预防或者及早了解这种转移的发生，在血液中检测肝癌细胞的显得有为重要。
目前最为常用的肝癌细胞的诊断标志物是甲胎蛋白又称APF。APF是胚胎时期血液里含有的一种特殊蛋白质，只有在胎儿的肝细胞中才能合成，尤其在怀孕16-20周时，胎儿的这种蛋白质含量最高，100毫升血中可达到300-400毫克，以后逐渐减少，待出生以后一周完全消失。由于它只存在于胎儿的血液中，所以全名叫做甲种胎儿蛋白。
正常人的肝细胞是不产生甲胎蛋白的，可是当得了肝癌时，由于肝细胞癌变幼稚化无休止地生长，恢复合成甲胎蛋白的能力，有时在100毫升血中竟达到1000毫克的高度，这就是检测甲胎蛋白可用于诊断肝癌的道理。
因而外周血检测肝癌细胞的技术发展全部是针对甲胎蛋白展开的。早期通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)直接检测血液中的APF mRNA，这种方法有很高的特异性，可用于微量APFmRNA检测，但是具有一定的是假阴性，特别是当肝癌细胞的量很少的时候。现在主要的方法是免疫磁珠富集和巢式RT-PCR的方法结合的方法。前者能够提高检测的灵敏度，由于通过磁珠富集肝癌细胞，提高肝癌细胞的浓度；后者是在普通RT-PCR的基础上，进行改进，提高特异性。这个方法能够对于临床诊断提供更大的支持和更精确的结果。
发明内容
本发明提供一种外周血肝癌细胞检测试剂盒。该试剂盒通过磁珠富集外周血肿的肝癌肿瘤细胞，然后应用巢式PCR扩增APF基因，完成检测。
本试剂盒使用原理：从肝癌患者身上获取外周血，用淋巴细胞分离液分离单核细胞，然后通过阴性和阳性磁珠富集肝癌细胞，针对APF mRNA设计扩增引物，最后将扩增结果在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，既可得到结果。
本发明技术方案如下：一种外周血肝癌细胞检测试剂盒，包括淋巴细胞分层液、阳性磁珠、阴性磁珠、逆转录预混液、巢式PCR预混液和两组引物组成。
所述阴性磁珠为抗人分化群CD45免疫磁珠；
所述阳性磁珠为抗人Ber-EP4免疫磁珠；
所述针对APF mRNA的巢式的两组扩增引物，序列如下：
第一步：上游引物A1：5-TCA GTG AGG ACA AAC TAT TGG-3；
下游引物A2：5-CTC TTC AGC AAA GCA GAC TTC-3；
第二步：上游引物M1：5-GCT GACATTATTATC GGA CAC-3；
下游引物M2：5-AGC CTCAAG TTG TTC CTC TGT-3。
具体实施例：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：分离单核细胞
(1)抗凝血的预离心
取待检者的抗凝全血，以2000r/min离心20min，弃上层血浆，获得下层沉淀细胞。
(2)配制淋巴细胞分层液
1、分别称取NaCl80.0g、Na2HPO4·2H2O 0.6g、KCl4.0g、KH2PO40.6g、NaHCO3 3.5g，加三蒸水溶解至1000ml。
2、原液配好后应分装于250ml玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。
3、取D-Hanks原液100ml，加三蒸水896ml，再加0.5％的酚红溶液4ml，混合均匀即成。并调节pH到7.2-7.6。
(3)离心和分离
1、将第一步得到的沉淀细胞加入淋巴细胞分层液，制成细胞悬浮液。
2、将细胞悬浮液加入到LTS1077淋巴细胞分层液中，缓慢。
3、用水平离心机以2000r/min离心20-30min。
(4)吸取单核细胞
在上层橙红色液体和中层透明液体交界处可见一较为清晰的环状乳白色细胞层，用毛细吸管轻轻吸取。
实施例2：磁珠富集肝癌细胞
(1)将用淋巴细胞分离液获取单核细胞，并以PBS等体积稀释。
(2)阴性富集。用阴性免疫磁珠选择：8×106抗CD45单核包被的免疫磁珠(购自珠宁波新芝生物科技股份有限公司)与单核细胞稀释液混匀，4℃孵育30min，除去淋巴细胞，上清液备用。
(3)阳性富集。用阳性免疫磁珠选择：8×106 Ber-EP4单抗包被的免疫磁珠(购自由挪威Dynal公司)与上一步得到的上清液混匀，4℃孵育30min，富集肿瘤细胞。
实施例3：提取肿瘤细胞RNA
(1)取分离所得的肿瘤细胞，加入1ml Trizol，室温充分匀浆，静置5分钟。
(2)加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟。
(3)4℃，12000g×15分钟，取上清。
(4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。
(5)4℃，12000g×10分钟，弃上清。
(6)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5分钟，弃上清。
(7)晾干，加入适量的DEPC水溶解(65℃促溶15min)。
(8)定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。
实施例4：逆转录反应
(1)逆转录预混液配方：以6.5μl为例，M-MLV Buffer 5×，4μl；dNTP 10mM，1μl；RNasin 40U/μl，0.5μl；M-MLV 200U/μl，1μl；
(2)RNA 11.5μl加上Oligo(dT)15 0.05μg/μl 2μl混匀，离心，70℃水浴5min，立即冰水浴，稍离心。
(3)取逆转录预混液6.5μl和上一步产物混匀，离心，42℃水浴60min，再95℃水浴10min(破坏MLV)，4℃保存。
实施例5：巢式PCR检测
(1)第一步：PCR反应
1、巢式PCR预混液配方：以14.4μl为例，Taq Buffer 10×，2μl；MgCl2 25mM，1.2μl；dNTP10mM，0.2μl；DEPC水，10.7μl；Taq酶2.5U/μl，0.3μl
2、按照20ul体系、取14.4ulPCR预混液、上游引物10pmol/μl，0.3μl、下游引物10pmol/μl，0.3μl和模板(逆转录产物)，5μl；混匀，97℃水浴5分钟，然后在立即冰水浴。
3、95℃ 5分 预变性；
94℃ 30秒 变性；
60℃ 40秒 退火；
72℃ 30秒 延伸；
72℃ 7分 终末延伸；
15个循环，4℃保温。体系对应的引物对为：
上游引物A1：5-TCA GTG AGG ACA AAC TAT TGG-3；
下游引物A2：5-CTC TTC AGC AAA GCA GAC TTC-3。
(2)第二步PCR
1、按照20μl体系、取巢式PCR预混液14.4μl、上游引物10pmol/μl，0.3μl；下游引物10pmol/μl，0.3μl和模板(第一步巢氏PCR产物)，5μl，混匀。
2、95℃ 5分 预变性；
94℃ 30秒 变性；
60℃ 40秒 退火；
72℃ 30秒 延伸；
72℃ 7分 终末延伸；
20个循环，4℃保温。体系对应的引物对为：
上游引物M2：5-GCT GAC ATT ATT ATC GGA CAC-3；
下游引物M2：5-AGC CTC AAG TTG TTC CTC TGT-3。
(3)检测
将巢式PCR结果在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，扩增片段大小为282bp，在Marker的相应位置出现条带，即为有肝癌肿瘤细胞。
序列表
<110>上海裕隆临床检验中心有限公司
<120>外周血肝癌细胞检测试剂盒
<160>4
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作外周血肝癌细胞检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物A1。
<400>1
tcagtgagga caaactattg g 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作外周血肝癌细胞检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物A2。
<400>2
ctcttcagca aagcagactt c 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作外周血肝癌细胞检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物M1。
<400>3
gctgacatta ttatcggaca c 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作外周血肝癌细胞检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物M2。
<400>4
agcctcaagt tgttcctctg t 21
Claims (3)
1.一种外周血肝癌细胞检测试剂盒，其特征在于：包括淋巴细胞分层液、阳性磁珠、阴性磁珠、逆转录预混液、巢式PCR预混液和两组引物组成。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性磁珠为抗人分化群CD45免疫磁珠；所述阳性磁珠为抗人Ber-EP4免疫磁珠。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的两组引物，用于巢式PCR扩增，序列如下：
第一步：上游引物A1：5-TCA GTG AGG ACA AAC TAT TGG-3；
下游引物A2：5-CTC TTC AGC AAA GCA GAC TTC-3；
第二步：上游引物M1：5-GCT GAC ATT ATT ATC GGA CAC-3；
下游引物M2：5-AGC CTC AAG TTG TTC CTC TGT-3。
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|---|---|---|---|---|
| CN102242204A (zh) * | 2011-06-24 | 2011-11-16 | 武汉格蓝丽富科技有限公司 | 一种单细胞分子生物学鉴定法 |
| CN107389420A (zh) * | 2017-08-04 | 2017-11-24 | 武汉格蓝丽富科技有限公司 | 一种细胞富集分离方法 |
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2009
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Application publication date: 20110615 |