CN107271672B - 外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了外泌体中p‑ERK在诊断结直肠癌中的应用。本发明的研究结果表明，正常非癌细胞的培养液中的外泌体中不含p‑ERK，结直肠癌细胞的培养液中的外泌体中含有较多p‑ERK，因此可将外泌体中p‑ERK作为诊断结直肠癌的分子标志物。本发明的研究成果为临床提供了一种具有广泛应用前景的结直肠癌无创诊断方法。

Description

外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及癌症的诊断，具体涉及外泌体p-ERK在诊断结直肠癌中的应用。
背景技术
肿瘤组织活检常作为肿瘤诊断的金标准，但是组织活检技术有一定的局限性。主要表现为：肿瘤具有异质性；某些患者不适合做组织活检；组织活检的滞后性对患者的治疗不利。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。液体活检技术的出现，解决了上述问题，也缩短了癌症的诊断时间。作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过检测血液或者尿液等体液中的某些生物活性分子，从而对癌症等疾病做出诊断。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害；由于其具有敏感性高、检测快捷等特点，而有利于肿瘤的早期发现。液体活检主要包括三种检测方法：游离DNA的检测、循环肿瘤细胞的检测、细胞外泌体的检测。
外泌体是细胞内的多囊泡体与细胞质膜融合后主动分泌到细胞外的大小均一，直径为30-100nm的脂质双分子层结构囊泡。外泌体可由不同类型细胞(其中包括肿瘤细胞)脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等体液中可检测到。外泌体中含有许多生物活性物质，如蛋白质、mRNA，microRNA，DNA片段等，这些生物活性物质可在细胞间相互传递，进而调节细胞的生理功能。肿瘤细胞来源的外泌体可以通过多种途径调控肿瘤环境，进而促进肿瘤的进展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于结直肠癌早期诊断的分子标志物。本发明研究发现，结直肠癌细胞培养液中外泌体内含有p-ERK，而正常的非癌细胞的细胞培养液中的外泌体中不含有p-ERK。根据以上研究成果，申请人发现了一种可用于结直肠癌无创诊断的方法，通过检测体液优选血液中外泌体p-ERK的有无或者表达量即可用于诊断结直肠癌。
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测外泌体中p-ERK的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用。
进一步，所述检测外泌体中p-ERK的试剂包括任何可用于检测外泌体中p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。
所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹测定法。
进一步，检测外泌体中p-ERK的试剂包括p-ERK的抗体。所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或免疫血清。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了外泌体中p-ERK作为标志物在开发和/或设计结直肠癌诊断产品中的应用。
根据本发明的再一个方面，本发明还提供了一种结直肠癌的诊断产品。所述诊断产品包括检测外泌体中p-ERK的试剂。
进一步，所述检测外泌体中p-ERK的试剂包括任何可用于检测外泌体中p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。
所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹测定法。
进一步，检测外泌体中p-ERK的试剂包括p-ERK的抗体。所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或免疫血清。
进一步，所述试剂还可包括分离外泌体所用的试剂、裂解外泌体所用的试剂。
所述分离外泌体所用的试剂包括任何能够分离外泌体的方法中使用的试剂。
分离外泌体的方法包括但不限于超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、表面蛋白标记亲和分离方法、免疫磁珠液相色谱法、超滤、试剂盒法。
进一步，本发明的诊断产品可以是用于诊断的所有类型的产品，包括试剂、试剂盒、芯片、试纸。
本发明用于诊断结直肠癌的外泌体来自体液，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。优选地，本发明的用于诊断结直肠癌的外泌体来自血液。
本发明的诊断产品进行结直肠癌诊断的步骤包括：
(1)从体液中分离外泌体；
(2)检测外泌体中p-ERK表达水平；
(3)根据p-ERK表达信息帮助结直肠癌诊断。
上述步骤中，所述体液包括血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。优选地，体液是血液。
根据外泌体的大小、密度和表面标志物等物理化学性质，目前分离体液和细胞培养液中外泌体的方法有经典的超速离心法、沉淀法、分子排阻层析、表面蛋白标记亲和分离方法、免疫磁珠液相色谱法、超滤、试剂盒法。
本发明的优点和有益效果如下：
(1)血液中外泌体中蛋白是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发有助于结直肠癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明开发了一种无创的用于诊断结直肠癌的方法，该方法操作方便、大大减轻了患者的痛苦。
附图说明
图1显示利用Western blot检测外泌体中p-ERK含量的电泳图；
图2显示利用电镜观察外泌体的形态图；
图3显示利用Western blot检测外泌体特征性标志物的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1细胞培养液中外泌体的分离与鉴定
1、细胞培养
HT-29细胞及HUVECs细胞均于含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的条件下培养，细胞呈单层贴壁生长，常规换液、传代，选择对数生长期的细胞进行实验。
2、细胞培养液中外泌体的分离
采用ExoQuick-TCExosome Precipitation Solution试剂盒，收集HT-29细胞培养液及HUVECs细胞培养液各10ml，3000×g，离心15min(4℃)，去除细胞和细胞碎片，上清转移到无菌容器中，加入2ml ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution，颠倒和晃动试管使溶液混匀，4℃冷藏过夜(至少孵育12h)，试管在孵育过程中不要旋转，次日，将ExoQuick-TCExosome Precipitation Solution/细胞培养液混合物以1500×g，离心30min(室温或4℃均可)，离心后，在试管底部的米色或白色沉淀即为外泌体，再次除上清，将试管1500×g，离心5min(4℃)，旋转吸取残留的ExoQuick-TC溶液，将液体抽吸干净，注意不要接触制备好的外泌体沉淀，使用60μl DEPC水重新悬浮外泌体沉淀，10μl/EP管分装，放于-80℃冰箱冷藏，待用。
3、外泌体形态的观察
外泌体分离之后，固定于0.01M的磷酸盐(内含4％的多聚甲醛，pH为7.4)的缓冲液中，4℃过夜。次日，PBS冲洗之后固定于1％OsO4 30分钟。蒸馏水冲洗之后，将外泌体沉淀物在浓度梯度的酒精中脱水，使用含有1％醋酸双氧铀进行染色30分钟，嵌入至Taab 812中。在60℃下聚合作用过夜之后，切片，超薄切片使用电子显微镜进行观察。
结果：分离出细胞培养液中的外泌体，电镜下外泌体的形态如图2所示，呈囊泡结构。
4、外泌体表面特征性标志物检测
应用Western Blot法检测外泌体表面特征性标志物CD9。
(1)裂解外泌体
在制备好的新鲜外泌体沉淀中加入200μl RIPA buffer，涡旋15s，置于室温下5min(待完全溶解)，加入2*Laemmli buffer，95℃加热5分钟，在加到凝胶上样之前，在冰上冷却5分钟。RIPA buffer和Laemmli buffer的配方如表1所示。
表1溶液配方
按照常规方法收取对数生长期的HT-29及HUVECs细胞，采用上述方法裂解，获得细胞蛋白。
2、BCA法测定外泌体蛋白浓度
①吸取10μl标样和外泌体蛋白或细胞蛋白分别加入到96孔板的各孔中；
②每孔加入200μl的BCA工作液，摇晃混匀30s，盖住各样品孔；
③标准检测：在37℃孵育30min或室温放置2～16h；
④冷却至室温，酶标仪562nm波长检测吸光度(OD)；
⑤根据吸光度值绘制标准曲线并计算外泌体蛋白或细胞蛋白的浓度。
3、分别取20μg外泌体蛋白和细胞蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用2％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，加入一抗(4℃摇床过夜)、TBST洗膜、二抗孵育45分钟、TBST洗膜，用Western blot低背景化学发光仪器进行曝光显影。
4、结果
结果如图3所示，在分离的外泌体蛋白中检测到了外泌体的特征性标志物CD9的表达，表明外泌体分离提取成功。
实施例2外泌体中p-ERK的差异表达
步骤：取20μg步骤1中定量后的外泌体蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用2％的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，加入一抗(4℃摇床过夜)、TBST洗膜、二抗孵育45分钟、TBST洗膜，用Western blot低背景化学发光仪器进行曝光显影。
结果：分别取HT-29细胞、HUVECs细胞的外泌体蛋白20μg进行的Western blot结果如图1所示，HUVECs细胞外泌体中不含有p-ERK，而HT-29细胞外泌体中含有较多p-ERK。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测结直肠癌细胞来源的外泌体中p-ERK的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂包括分离外泌体所用的试剂，和/或裂解外泌体所用的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法中使用的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测p-ERK存在与否或检测p-ERK表达量的方法选自以下组：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹测定法。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂包括p-ERK的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体或免疫血清。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断产品包括试剂盒、芯片、试纸。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，外泌体来自体液，所述体液选自以下组：血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述外泌体来自血液。
9.结直肠癌细胞来源的外泌体中p-ERK作为标志物在开发和/或设计结直肠癌诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，外泌体来自体液，所述体液选自以下组：血液、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液。
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