CN105899953A - 膀胱癌生物标志物 - Google Patents

Abstract

公开了膀胱癌蛋白质生物标志物、用所述膀胱癌蛋白质生物标志物确定患者是否患或表现复发膀胱癌或早期膀胱癌或晚期膀胱癌的方法、一种检测***和其试剂盒。所述膀胱癌生物标志物包括冠蛋白‑1A、载脂蛋白A‑IV、精囊凝固蛋白‑2、γ‑突触核蛋白和DJ‑1，及其变体的至少一种。

Description

膀胱癌生物标志物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年11月5日提交的新加坡临时申请第201308203-7号的优先权权益，其内容全文通过引用纳入本文用于各种用途。

技术领域

本发明涉及生物化学特别是生物标志物。特别地，本申请涉及与膀胱癌相关的生物标志物和使用所述生物标志物确定患者患或者表现复发膀胱癌、或早期膀胱癌、或晚期膀胱癌的可能性的方法。

背景技术

膀胱癌症(或膀胱癌)在发达国家盛行，尤其在男性中盛行。膀胱癌也是排第五的最常见癌症并且导致可观的发病率和死亡率。一旦其达到2期(T2)，膀胱癌是众所周知最具侵袭性的肿瘤之一。早期膀胱癌(Ta、T1阶段)患者的早期检测和监测是关键性的，因为众所周知这些肿瘤复发频率高并且最终进展至T2期。

膀胱癌早期检测有赖于有创程序以确认诊断。例如，膀胱镜检查和细胞学检查仍是用于检测和随访膀胱癌的金标准。然而，这些方法不能检测某些病变诸如原位的小癌症，并且这些方法通常在患者表现其他临床体征时采用。

由于患者和医疗***都非常需要无创尿液检查，因而已经进行了开发膀胱癌生物标志物的许多尝试以替代或补充有创诊断诸如膀胱镜检查。

除了许多推荐的蛋白质生物标志物外，基于DNA甲基化图谱分析、点突变和微小RNA确定了新颖生物标志物用于检测膀胱癌。可商购的基于尿的诊断性蛋白质标志物也已经开发。然后，到目前为止，本领域中已知的单一生物标志物测定中没有任何一个能够充分解决膀胱癌的早期检测问题。例如，测量核基质蛋白22(NMP22)和***抗原(BTA)的测试目前可商购并且已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于膀胱癌诊断。然而，依赖于单一标志物测定的这些测试已知缺乏特异性。

既然本领域中已知的单一生物标志物测定中没有任何一个能够充分解决膀胱癌的早期检测问题，那么就需要提供一种能够解决膀胱癌早期检测问题的可替代测定。例如，已经开发了十种生物标志物或八种生物标志物的两种多重蛋白质标签，并且它们在本领域中已知。然而，这些目前可获得的诊断性标志物测定中没有任何一个提供了足够的灵敏度和特异性，因而无法在临床上常规使用。

综上所述，需要提供一种可替代的膀胱癌蛋白质生物标志物。也需要提供一种用于在患者中无创性检测膀胱癌的可替代检测***。还需要提供一种用于确定患者是否患或者表现复发膀胱癌或早期膀胱癌或晚期膀胱癌的可替代方法。

发明内容

在一方面，提供了膀胱癌蛋白质生物标志物，其中所述标志物是选自由冠蛋白-1A(Coronin-1A)、载脂蛋白A-IV(Apolipoprotein A-IV)、精囊凝固蛋白-2(Semenogelin-2)、γ-突触核蛋白(Gamma-synuclein)和DJ-1组成的群组中的至少一种。

在另一方面，提供了一种检测***，其包括a)接收部分，以接收来自疑似患膀胱癌的患者的流体样品，并且其中所述流体样品被怀疑包含一种或多种根据本公开的生物标志物；和b)检测部分，其包括能够检测一种或多种根据本公开的生物标志物的一种物质或多种物质。

在另一方面，提供了一种用于确定患者是否患或者表现复发膀胱癌或早期膀胱癌或晚期膀胱癌的方法，其中所述方法包括检测一种或多种根据本公开的生物标志物的存在。

在另一方面，提供一种试剂盒，其包括根据本公开的检测***和实施根据本公开的方法所需要的物质。

附图说明

参考详细描述并结合非限定性实施例和附图考虑，将更好地理解本发明，在附图中：

图1显示实时定量PCR分析结果，其证实与健康受试者(即正常个体)相比，(A)补体H(BTA-TRAK测定)、(B)冠蛋白-1A、(C)载脂蛋白A、(D)精囊凝固蛋白-2、(E)γ-突触核蛋白和(F)DJ-1在Ta/T1和T2/T3膀胱癌患者样品中的mRNA表达。该图表示了来自每组的五个受试者特定标志物表达的分析数据。还检查了补体H的mRNA表达(BTA-TRAK测定)作为比较基础。所有的数值均是统计学显著的，P值≤0.05。

图2显示了免疫印迹(Western Blot)分析，该分析比较根据本公开的五种生物标志物在从(A)正常受试者、Ta/T1(未浸润肌层)和T2/T3(浸润肌层)膀胱癌患者的合并尿样；(B)三个正常受试者和十一个Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌患者的尿样；或者(C)三个正常受试者和七个T2/T3(浸润肌层)膀胱癌患者的尿样中获得的样品中的表达。所述生物标志物的蛋白表达与用于补体因子H的BTA-TRAK测定相比较。图2显示本公开的生物标志物至少与商购用于补体因子H的BTA-TRAK测定相当。

图3显示通过利用本公开的生物标志物的斑点印迹(dot blot)对膀胱癌进行快速检测的结果。从正常受试者、Ta/T1(未浸润肌层)和T2/T3(浸润肌层)膀胱癌患者获得尿样。斑点印迹测定结果为：正常受试者显示可检测水平(阴性；低或无)；Ta/T1显示标志物的可检测水平(+)；并且T2/T3显示高水平的目标标志物(++)。因此，表明本公开的生物标志物在检测和区分正常受试者和患有Ta/T1(未浸润肌层)和T2/T3(浸润肌层)膀胱癌的患者方面是可与补体因子H相比的。

图4是膀胱标本组织学染色集合，显示在高级别膀胱癌中恶性尿路上皮细胞增生紊乱(x20)，苏木精和曙红(H&E)染色(a)、冠蛋白-1A(b)、精囊凝固蛋白-2(c)、γ-突触核蛋白(d)、DJ-1(e)和载脂蛋白A4(f)。细胞核用DAPI复染并且其在这图中显示为淡阴影。

图5是五种生物标志物各种组合的诊断图示。绘制ROC曲线图以比较从A.5-生物标志物组合(冠蛋白-1A、载脂蛋白A1、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1)；B.4-生物标志物组合(冠蛋白-1A、载脂蛋白A1、精囊凝固蛋白-2和γ-突触核蛋白)；C.3-生物标志物组合(冠蛋白-1A、载脂蛋白A1和精囊凝固蛋白-2)；D.BTA-TRAK测试收集到的数据。基于ROC曲线下面积(AUROC)，对于每个生物标志物和生物标志物的组合确定约登指数临界值，该值最大化灵敏度和特异性之和。图5清楚地显示，本公开的生物标志物的不同组合与BTA-TRAK测试相比在灵敏度和特异性测试中表现更佳。因此，表明本公开的生物标志物为膀胱癌患者提供了更灵敏和更特异的测试。

图6显示了在Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌受试者、T2/T3(浸润肌层)膀胱癌受试者和健康受试者的尿样中通过免疫印迹分析本公开的五种生物标志物(冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白，和DJ-1)与补体因子H对照相比的表达结果的盒须图。健康受试者血浆中的生物标志物水平也以相对于白蛋白的相对强度(log2)形式显示。结果是健康受试者(n＝30)、血浆(n＝4)、Ta/T1(n＝66)和T2/T3(n＝28)尿样的结果。盒子表示较小四分位数、中位数和较大四分位数；须显示最小值和最大值。使用曼-惠特尼检验计算显著性。与正常比较的p值：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。与血浆比较的p值：#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。因此，图6显示了，与健康受试者尿样或者血浆相比，Ta/T1和T2/T3尿样中本公开的所有五种生物标志物的水平显著较高。因此，确认了本公开的生物标志物对膀胱癌具有特异性并且特异地用于检测从患有膀胱癌的患者中获得的尿样。

图7a显示了受试者工作特征(ROC)曲线，其阐明使用本公开的生物标志物的ELISA在患有Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌的患者和健康受试者，以及患有T2/T3(浸润肌层)膀胱癌的患者和健康受试者中的总诊断精度。这一模型评估基于从ELISA分析获得的数据将非肌层浸润性(NMI；Ta/T1)膀胱癌和肌层浸润性(MI；T2/T3)膀胱癌二者与健康受试者相区分的生物标志物效率。图7a显示，本公开的生物标志物为Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌和T2/T3(浸润肌层)膀胱癌都提供了高度灵敏和特异的生物标志物，其可用于尿样的ELISA分析。

图7b显示了受试者工作特征(ROC)曲线，其阐明使用本公开的生物标志物的免疫印迹测定在患有Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌的患者和健康受试者，以及患有T2/T3(浸润肌层)膀胱癌的患者和健康受试者中的总诊断精度。这一模型评估基于从尿样的免疫印迹数据分析获得的数据将非肌层浸润性(NMI；Ta/T1)膀胱癌和肌层浸润性(MI；T2/T3)膀胱癌二者与正常受试者相区分的生物标志物效率。图7b显示，本公开的生物标志物为Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌和T2/T3(浸润肌层)膀胱癌都提供了高度灵敏和特异的生物标志物，其可用于尿样的免疫印迹分析。

图8显示了在正常健康受试者(n＝2)、患有Ta/T1(未浸润肌层；NMI；n＝5)膀胱癌的患者和患有T2/T3(浸润肌层；NMI；n＝5)膀胱癌的患者中使用RT-PCR对于本公开的五种生物标志物(以及补体因子H对照)进行mRNA表达分析的盒须图。根据β-肌动蛋白内对照归一化生物标志物Ct值。与正常比较的p值：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图8显示，与健康受试者中获得的尿样相比，从患有Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌的患者和患有T2/T3(浸润肌层)膀胱癌的患者获得的尿样中，表达的倍数变化显著较高。因此，表明本公开的生物标志物能够用于在受试者中无创性检测膀胱癌。

图9显示在从来自30名健康受试者、72名非肌层浸润性膀胱癌(Ta/T1)患者和55名肌层浸润性膀胱癌(T2/T3)患者的尿样获得的样品中，通过免疫印迹分析比较本公开的五种生物标志物(以及补体因子H对照)的表达。对来自健康受试者、非肌层浸润性(NMI；Ta/T1)膀胱癌患者和肌层浸润性(MI；T2/T3)膀胱癌患者的每份净排尿样的100μg蛋白质进行免疫印迹。所述五种生物标志物的表达与补体因子H相比较。对于每个样品还进行人血清白蛋白的免疫印迹检测，以确定每种生物标志物的表达与血尿之间是否存在相关性。图9显示，本公开的五种生物标志物中至少有三种一致性地被发现存在于膀胱癌患者中。因此，表明本公开的生物标志物能够可靠地用于在受试者中无创性地检测膀胱癌。

图10显示图8中免疫印迹结果的log2条带强度的盒须图，该图根据来自健康受试者(n＝30)、Ta/T1膀胱癌(n＝72)和T2/T3(n＝55)膀胱癌的所有尿样的五种生物标志物和补体因子H而绘制。盒子表示较小四分位数、中位数和较大四分位数；须显示最小值和最大值。使用曼-惠特尼检验计算显著性。与正常比较的p值：***p<0.001。

图11是显示健康、非肌层浸润性(Ta/T1)膀胱癌和肌层浸润性(T2/T3)膀胱癌样品中所选择生物标志物量化结果的代表性质谱图。图11显示来自三重标记尿样分析的潜在标志物的相对丰度对荷质比(m/z)的变化。源自正常尿液、Ta/T1和T2/T3患者样品的各个蛋白质的肽分别用箭头和标记每个峰的文字指示。通过多重肽稳定同位素标记(即，还原性二甲基标记和质谱法)鉴定候选生物标志物。

图12显示从84位非膀胱癌患者和患如表6所示的各种慢性病的患者获得的尿样中，通过免疫印迹分析比较本公开的五种生物标志物(以及补体因子H对照和人血清白蛋白，对于每个样品确定人血清白蛋白以证实生物标志物表达和血尿之间是否存在相关性)的表达。图12使用来自从患各种类型慢性病的患者(n＝120)获得的每份净排尿样的100μg蛋白质验证了本公开的生物标志物的特异性。图12显示，本公开的生物标志物一致性地不存在于从非膀胱癌患者获得的样品中。因此，表明本公开的生物标志物对于膀胱癌具有特异性。

图13显示从患其他类型的癌症的非膀胱癌患者获得的尿样中，通过免疫印迹分析比较本公开的五种生物标志物(以及补体因子H对照和人血清白蛋白，对于每个样品确定人血清白蛋白以证实生物标志物表达和血尿之间是否存在相关性)的表达。图13使用来自从患各种类型癌症的患者(n＝88)获得的每份净排尿样的100μg蛋白质验证了本公开的生物标志物的特异性。图13显示，本公开的生物标志物一致性地不存在于从患其他类型癌症的非膀胱癌患者获得的样品中。因此，表明本公开的生物标志物对于膀胱癌具有特异性。

图14是对于从患有膀胱癌的患者获得的组织学样品的免疫组织化学染色结果，其显示，本公开的五种生物标志物在膀胱癌组织中同等富集。因此，显示本公开的五种生物标志物能够被用于检测膀胱癌并且对于膀胱癌具有特异性。

表格说明

表1列出了本公开实验部分实施例1中的正常/非癌症受试者和癌症受试者研究组的人口统计学和临床病理学特征。

表2A列出了本公开实验部分实施例1中的免疫印迹和斑点印迹分析所使用的抗体。

表2B列出了本公开实验部分实施例1中的免疫组织化学分析所使用的抗体。

表3列出了在本公开实验部分实施例1的每个患者组中检测到的尿标志物数目。

表4列出了与补体H相比，使用本公开的生物标志物进行免疫印迹分析的检测结果。

表5列出了本公开的单独生物标志物和三种不同组合的性能值。

表6列出了本公开实验部分实施例2中研究的患者的临床信息。

表7列出了本公开实验部分实施例2中使用的用于定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)的引物序列。

表8列出了本公开实验部分实施例2中描述的免疫印迹、免疫染色和ELISA测定所使用的抗体和ELISA试剂盒。

表9A列出了本公开实验部分实施例2中用于诊断Ta/T1膀胱癌的组合模型的精度研究结果。

表9B列出了本公开实验部分实施例2中用于诊断T2/T3膀胱癌的组合模型的精度研究结果。

表10列出了本公开的生物标志物在血浆中的浓度(从数据库获得的数据)。

表11列出了本公开实验部分实施例2的血浆和白细胞中生物标志物水平的皮尔森相关性分析(Pearson correlation analysis)结果。

表12A列出如本公开实验部分实施例2所示的在尿样数据分析中使用ELISA和免疫印迹两种方法研究生物标志物在Ta/T1诊断中的精度和阈值的结果。

表12B列出如本公开实验部分实施例2所示的在尿样数据分析中使用ELISA和免疫印迹两种方法研究生物标志物在T2/T3诊断中的精度和阈值的结果。

具体实施方式

膀胱癌是世界上最常见的五种恶性肿瘤之一。80％以上的膀胱癌是未浸润肌层的(Ta/T1)，其具有＞90％的5年成活率。但是，患有这些病变的患者中大约70％在初始诊断两年内发生肿瘤复发。如果任其不予治疗，初始的非肌层浸润性肿瘤(Ta/T1)能够发展为肌层浸润性肿瘤(T2/T3)，其具有显著降低的5年成活率。这一临床观察推动了用于膀胱癌或膀胱癌复发的早期检测的精确诊断方法的开发。

传统的，膀胱镜检查和尿细胞学检查是针对患者中膀胱癌的标准诊断测试。然而，膀胱镜检查是一种有创程序，其导致患者不适，需要局部或者全身麻醉，相对昂贵并且由于出血降低了能见度而缺乏灵敏度。此外，膀胱镜检查不能检测某些病变，诸如原位的小癌症。尿细胞学检查也具有不足，诸如检测需要经过培训的细胞病理学专家、灵敏度低并且成本高。膀胱镜检查和尿液细胞学检查还都只能在患者具有其他临床症状时才能实施，这些临床症状表明患者可能处在更晚期。如上文所述，如果任其不予治疗，膀胱癌能够逐渐发展至会显著降低患者存活率的更晚期。因此，需要提供一种用于无创性地检测膀胱癌的可替代方法。

已经进行许多努力以检测可靠的膀胱癌的肿瘤标志物。基于商购测定和FDA批准的诊断方法包括***抗原(BTA-STAT)和核基质蛋白22(NMP-22)。但是，这些生物测定已知其灵敏度有限。而且，这些已知的测定不能处理通常在个体(受试者)之间呈现的膀胱癌的复杂性。

鉴于上述问题，本公开的发明人着手提供膀胱癌的可替代生物标志物。因此，提供了一种膀胱癌蛋白质生物标志物。本文所用术语“膀胱癌(bladder cancer)”或“膀胱癌(bladder carcinoma)”可以互换使用，指代在膀胱(储藏尿的器官)组织中形成的癌症。本文所用术语“膀胱癌”可以包括移行细胞癌(起始于正常构成膀胱内衬的细胞的癌症)、鳞状细胞癌(起始于薄的扁平细胞的癌症)和腺癌(起始于制造和释放粘液和其他流体的细胞的癌症)。在一个实例中，该术语指代尿路上皮细胞癌症(也被称为“移行细胞癌”、“移行膀胱癌”或“移行膀胱癌症”)，其是工业国家中百分之九十膀胱癌发生的原因。膀胱癌相伴的症状和意义是本领域中所熟知的，比如血尿、尿痛、尿频或者有尿意但尿不出。在一个实例中，“膀胱癌”指代其中内衬膀胱的细胞失去调节其生长的能力导致形成肿瘤的细胞团块的疾病。在一个实例中，该术语涵盖膀胱的大量类型的恶性生长。众所周知，膀胱癌具有广泛的侵袭性和危险性。因此，在一个实例中，本文所用的膀胱癌症或膀胱癌指代膀胱癌的不同分期，其可以被分为两个主要时期：早期或非肌层浸润性膀胱癌(Ta/T1)和晚期或肌层浸润性膀胱癌(T2/T3)。早期或非肌层浸润性膀胱癌包括不同的分期诸如：Tis被定义为原位癌(“扁平肿瘤”)；当癌被发现为非浸润性乳突状时是Ta；当癌被发现具有浸润的上皮下***时是T1。晚期或肌层浸润性膀胱癌包括三种不同的分期，其中当癌被发现具有被浸润的肌层时是T2；当癌被发现具有被浸润的膀胱周组织(即在膀胱附近)时是T3；并且当癌被发现具有被浸润的邻近器官比如在盆壁或腹壁之后的***、子宫或***时是T4。T2可以被进一步细分为两个亚期，其中当癌被发现具有被浸润的浅表肌层(内部的一半)时是T2a，并且当癌被发现具有被浸润的深层肌层(外部的一半)时是T2b。T3也可以被进一步细分为两个亚期，其中当癌在显微镜下被发现具有被浸润的膀胱周组织时是T3a，并且当癌肉眼可见被发现具有被浸润的膀胱周组织(膀胱外的团块)时是T3b。

本文所用术语“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本公开中，术语“生物标志物”指代与膀胱癌相关联的多肽、此多肽的片段或变体。所述多肽的变体可以包括由于存在保守氨基酸置换而其氨基酸序列不同的多肽。例如，这样的变体具有的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，或至少99％在整个序列区域与特异性多肽的氨基酸序列是相同的。变体可以是等位基因变体、剪切变体或任意其他物种特异性同源蛋白、旁系同源蛋白或直系同源蛋白。在一个实例中，可以通过本领域中已知的算法确定同一性百分比。上述百分比(％)形式的序列同一性数值优选使用本领域中已知的程序例如Blasts和类似程序来确定。

本文中所用术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并且广义上指代具有两个或多个氨基酸亚基、氨基酸类似物或者拟肽的化合物。所述亚基可以由肽键相连。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸并且氨基酸最大数目不限，其可以包含蛋白质或者肽的序列。本文所用术语“氨基酸”指代天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体二者、氨基酸类似物和拟肽。

在一个实例中，本公开的膀胱癌蛋白质生物标志物可以包括选自由冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1组成的群组的至少任意一种生物标志物。这五种蛋白质中的每一种都具有如下述进一步讨论的重要生物学功能。

冠蛋白-1A指代在造血***中高度表达，并且调节胸腺细胞中F-肌动蛋白含量的蛋白质。基因表达研究已经显示其在淋巴瘤中和在其他血液恶性肿瘤中表达改变。冠蛋白-1A已经被鉴定为临床孤立综合症和多发性硬化症的新颖抗体靶标。

载脂蛋白A-4也被称为apoA-IV、apoAIV、或者apoA4，其指代主要合成于肠中并分泌到血浆的蛋白质。载脂蛋白A-4在胆固醇逆转运途径中对于脂质吸收、转运、和代谢起到主要作用，并且可以作为餐后饱腹感信号传导因子和抗氧化剂而起作用。这一生物标志物也显示与各种癌症类型包括胃癌、胰腺癌和卵巢癌相关。

第三种生物标志物γ-突触核蛋白指代突触核蛋白家族的一员，该蛋白质家族也包括α和β亚型。γ突触核蛋白已经在晚期乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌，和膀胱癌中被发现，并且在体外模型和动物模型中都显示促进癌症侵袭和转移。

第四种生物标志物精囊凝固蛋白-2指代参与人类***凝结物的液化和活动***A的逐渐释放的一种分泌蛋白质。在小细胞肺癌细胞系中检测到精囊凝固蛋白-2。

最后，DJ-1指代PARK7(帕金森病7)的蛋白产物，并且其正调控雄激素受体依赖性转录。已经在乳腺、肺、血液、***、子宫颈、甲状腺和胰腺恶性肿瘤中报道了DJ-1的过表达和与肿瘤进展的相关性。

如下述实验部分所述，本公开的膀胱癌蛋白质生物标志物可以单独使用，或者相互组合使用。因此，在一个实例中，该膀胱癌蛋白质生物标志物可以包括包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1的生物标志物中的任意一种、两种、三种、四种或者所有五种。蛋白质生物标志物的各种组合实例在下述实验部分(例如在表9A、9B和4中)例示。在一个实例中，所述生物标志物可以包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1。在另一个实例中，所述生物标志物可以包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、γ-突触核蛋白(例如，图5和表5)。在另一个实例中，所述生物标志物可以包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV和DJ-1(例如，在表9A中)。在另一个实例中，所述生物标志物可以包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2，和DJ-1(例如，在表9A中)。如实验部分所述，本公开的生物标志物能够相互组合并且仍能高度灵敏和高特异地确定膀胱癌症患者。本公开的生物标志物能够组合是有利的，因为其将确保检测众所周知在个体(受试者)间具有显著遗传异质性和复杂体细胞突变的膀胱癌。

此外，本公开的发明人发现本文所述的生物标志物指示膀胱癌的不同分期。在一个实例中，本公开的生物标志物可以指示早期(Ta/T1)膀胱癌。例如，表9A和表12A显示，与FDA批准的膀胱癌生物标志物补体H相比，本公开的生物标志物(单独使用或者相互组合使用时)提供更佳的灵敏度、特异性和总精度。在另一个实例中，所述生物标志物可以指示晚期(T2/T3)膀胱癌。表9B和表12B显示，与FDA批准的补体H相比，本公开的生物标志物(单独使用或者组合使用时)提供更佳的灵敏度、特异性和总精度。在另一个实例中，所述生物标志物可以指示早期(Ta/T1)膀胱癌和晚期(T2/T3)膀胱癌。在一个实例中，可以指示晚期膀胱癌(T2/T3)的生物标志物可以包括选自由冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1组成的群组的生物标志物中的至少一种。也就是说，可以指示晚期(T2/T3)膀胱癌的生物标志物可以是包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1的生物标志物中的一种、两种、三种、四种或者所有五种。在另一个实例中，可以指示早期(Ta/T1)膀胱癌的生物标志物可以包括选自由冠蛋白-1A、DJ-1、γ-突触核蛋白、载脂蛋白A4和精囊凝固蛋白-2组成的群组中的至少一种的生物标志物。也就是说，可以指示早期(Ta/T1)膀胱癌的生物标志物可以包括一种、两种、三种、四种或者所有五种的包括冠蛋白-1A、DJ-1、γ-突触核蛋白和载脂蛋白A4的生物标志物。在一个实例中，选择所有五种生物标志物并且能够将其有利地用于在患者中检测膀胱癌，因为其能够解决膀胱癌在个体之间普遍异质的问题，虽然异质性来源于种族和国家。例如，本公开的实施例2一致地阐明了本公开的生物标志物相比于补体H对照具有在受试者中检测膀胱癌的优越性，所述补体H对照已知由美国食品和药品监督管理局(FDA)批准(参见图6、图8、表9A、表9B、表12A和表12B)。此外，由图6所示，本公开的生物标志物可以用于膀胱癌的早期检测。

如本公开的实验部分所述，本公开的发明人发现本公开的生物标志物可以在本文所述的各种样品类型中检测到。例如，在组织切片(例如图14、图4中所示的组织学切片)和尿样(例如，实验部分的全文、图6、图8、图9、图11、图1、图2和图3)中清楚地检测到所述生物标志物。因此，在本公开的一个实例中，本公开的生物标志物可以在样品中检测到。例如，所述样品可以是来自所有合适的器官诸如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃、膀胱和类似器官的活检材料的组织切片。在另一个实例中，所述样品可以包括源自体液或包括体液的流体样品诸如全血、血清、血浆、泪液、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖液、乳汁、奶、初乳、胎盘液、羊水、汗、滑液、腹水、脑脊液、胆汁、胃液、房水、玻璃体液、胃肠液、渗出液、漏出液、胸膜液、心包液、***、上呼吸道液、腹腔液、自免疫反应部位获得的流体、自合并收集部位获得的流体，支气管灌洗液、有核细胞样品、与粘膜表面、毛发或者皮肤相关的流体，和尿。在一个实例中，所述流体样品是尿或者净排尿。检测尿中的本公开的生物标志物是需要的，因为其允许无创地检测患者中的膀胱癌。实验部分的实施例2也表明，所述生物标志物也能够用于在还患血尿的患者中预测或检测膀胱癌的存在，不损害检测的特异性或精度。

在另一方面，设想本文描述的生物标志物可以能够诊断或检测或预测患者或受试者患有膀胱癌的可能性。因此，本文所描述的生物标志物可以纳入诊断工具、检测***、诊断方法、预测或确定患者患有膀胱癌的可能性的方法。

在另一方面，提供了一种检测***。本公开的所述检测***可以包括a)接收部分，以接收来自疑似患膀胱癌的患者的样品，并且其中所述样品被怀疑包含一种或多种本公开的生物标志物；和b)检测部分，其包括能够检测一种或多种本公开的生物标志物的一种或多种物质。在一个实例中，所述样品可以是流体样品，例如尿或净排尿样品。

为了辅助检测本公开的生物标志物，本公开的检测***可以包括能够结合或特异性结合一种、两种、三种、四种或者所有五种本公开的生物标志物的物质。在一个实例中，所述物质可以是生物特异性捕获剂诸如抗体(或者其抗原结合片段)、相互作用融合蛋白、适体或者亲和体(其是基于三螺旋束蛋白质结构域的非免疫球蛋白来源的亲和蛋白质)，其识别所述生物标志物和/或其变体。在一个实例中，所述物质可以与固相结合，其中所述生物标志物可以通过质谱检测或者通过将生物标志物从所述生物特异性捕获剂洗脱并且借助传统MALDI或借助SELDI检测所洗脱的生物标志物。在另一个实例中，所述检测***可以是生物芯片、测试条或者微量滴定板。

在一个实例中，所述抗体可以包括本领域中已知特异性识别冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白II、γ-突触核蛋白或者DJ-1的抗体。可以用于实施本发明的抗体的实例包括列于下述的表8和2A中的抗体。在一个实例中，所述抗体或其抗原结合片段可以包括抗冠蛋白-1A抗体诸如NB110-58867(其识别在大肠杆菌(E.coli.)[UniProt#P31146]中表达并从其中纯化的重组全长人冠蛋白-1A，由美国的Novus Biologicals制备)；抗载脂蛋白A4抗体诸如AB59036(其识别对应于人APOA4内部氨基酸序列359-371的合成肽：C-KEKESQDKTLSLP(SEQ ID NO:13)，来源为美国Abcam)；抗精囊凝固蛋白II抗体诸如AB108085(其识别对应于人精囊凝固蛋白II(NP_002999)内部氨基酸42-91(GQKGQHYFGQKDQQHTKSKGSFSIQHTYHVDINDHDWTRKSQQYDLNALH；SEQ ID NO:14)内的区域的合成肽，来源为美国Abcam)；抗γ-突触核蛋白抗体诸如AB55424(其识别源自人γ-突触核蛋白的合成肽，来源为美国Abcam)；抗DJ-1抗体诸如SC-27006(其针对定位在人来源的DJ-1的C-末端的肽产生，由美国的Santa Cruz制备)和NB100-483(其识别针对人Park7蛋白C-末端部分(100-189残基之间)[UniProtQ99497]制备的合成肽，来源为美国Novus Biologicals)，以及类似物。

在另一个实例中，所述检测***可以被构造成单独或相互组合地检测一种、两种、三种、四种或全部五种本文所描述的生物标志物。

在一个实例中，所述检测***可以被用于预测患者中膀胱癌的风险或者诊断患者中的膀胱癌。本文所用术语“预测风险”指代评估膀胱癌在受试者中发生的可能性。

在另一个方面，提供了一种用于确定患者是否患或表现复发膀胱癌或早期膀胱癌或晚期膀胱癌的方法。所述方法包括检测一种或多种本公开的生物标志物的存在。

本文所用术语“患者”或“受试者”或“个体”可以交互使用，其涉及动物，例如哺乳动物，包括奶牛、马、非人灵长类、狗、猫和人类。本公开的患者可能被怀疑患膀胱癌或者可能之前患膀胱癌。例如，本发明的方法可以应用于疑似患膀胱癌的受试者。在另一个实例中，本申请的方法可以应用于疑似复发膀胱癌的受试者。本文所用术语“复发”指代在已经被认为不具有膀胱癌的患者中重新发生或重新检测到膀胱癌。

在一个实例中，当所述生物标志物用于本公开的方法中时，其可以自样品诸如流体样品中被检测到。在一个实例中，所述流体样品可以是尿或净排尿。有利的是，本文所描述生物标志物的特异性和灵敏性使得本公开的检测***或本公开的方法仅需要小体积的尿，诸如大约1μl至大约30ml。在一个实例中，所述尿样可以为大约1μl、大约5μl、大约10μl、大约15μl、大约20μl、大约25μl、大约30μl、大约35μl、大约40μl、大约45μl、大约50μl、大约100μl、大约150μl、大约200μl、大约250μl、大约300μl、大约350μl、大约400μl、大约450μl、大约500μl、大约550μl、大约600μl、大约650μl、大约700μl、大约750μl、大约800μl、大约850μl、大约900μl、大约950μl、大约1ml、大约2ml、大约3ml、大约4ml、大约5ml、大约6ml、大约7ml、大约8ml、大约9ml、大约10ml、大约11ml、大约12ml、、大约13ml、大约14ml、约15ml、大约16ml、大约17ml、大约18ml、大约19ml、大约20ml、大约21ml、大约22ml、大约23ml、大约24ml、大约25ml、大约26ml、大约27ml、大约28ml、大约29ml至大约30ml，或者其间的任意数值。本文所用术语"大约"在尿样量的上下文中通常表示所述数值的+/-5％，更通常为所述数值的+/-4％，更通常为所述数值的+/-3％，更通常为所述数值的+/-2％，甚至更通常为所述数值的+/-1％，并且甚至更通常为所述数值的+/-0.5％。

可以使用本领域中已知的方法检测样品诸如净排尿中的所述生物标志物。应理解本领域技术人员将了解本领域中哪些已知的测定将适于检测本公开的生物标志物。例如，检测本公开的生物标志物涉及观察所述生物标志物存在或不存在。检测可以直接进行或间接进行。直接检测涉及基于信号检测所述多肽，所述信号由多肽本身获得并且其强度直接与样品中存在的多肽分子数目相关。这样的信号有时被称为强度信号，可以通过例如测量所述多肽的特定物理性质或化学性质的强度值而获得。间接测量包括测量从第二组分(即，不是多肽本身的组分)或者生物学读出***获得的信号，例如可测量的细胞应答、配体、标签，或者酶反应产物。例如，可以使用分子生物学方法实施检测。所述分子生物学方法可以包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(诸如实时或定量PCR)、免疫印迹、斑点印迹、质谱、免疫学方法(诸如使用抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA))，以及类似方法。例如，在本公开的实验部分中，使用了免疫印迹、斑点印迹、实时(RT)PCR和ELISA(参见实施例1和2)。

在一个实例中，关于一种或多种生物标志物是否存在于从患者获得的样品中的指示可以基于与使用对照组的结果相比较而获得。例如，本公开的方法可以包括对照组，其可以包括不患膀胱癌的患者。如图12和图13所示，本公开的生物标志物对于膀胱癌是特异的，因此所述对照组可以是不患膀胱癌的任意患者，包括健康(即不患有任意已知的慢性疾病)的患者、患有已知慢性疾病但非癌症相关疾病的患者，或者患有不是膀胱癌的癌症的患者。

在一个方面，提供一种试剂盒，其包括如本文所描述的检测***和实施本文所描述方法所需要的物质。

还公开了一种组合物，其可以包含本公开的生物标志物。在一个实例中，所述组合物可以用于本文所描述的检测***、确定方法或者试剂盒。

在一个实例中，本公开的生物标志物、方法、检测***或组合物可以在可能经历或可能没有经历膀胱癌治疗或者已经接受膀胱癌治疗的患者中预测膀胱癌的后果中有用。本公开的生物标志物、方法、检测***或组合物也可以在可能经历或可能没有经历膀胱癌治疗或者已经接受膀胱癌治疗的患者中检测或者预测复发中有用。在一个实例中，所述患者可以患有浅表性膀胱癌(即早期，诸如未浸润肌层，Ta/T1)，其经尿道切除治疗或者经卡介苗(BCG)治疗。

此处说明性描述的本发明可以在本文没有具体公开的任一要素或者多种要素、一种限制或者多种限制不存在的情况下适当实施。因此，例如，应该广义地和无限制地理解术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等。另外，本文所用的术语和表述己被用作描述性术语并且不是限制性术语，并且这样的术语和表述的使用不意图于排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，而是承认在所要求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征被具体公开，但是本领域技术人员可以对本文公开的其中以实施方案体现的发明进行修改和变化，并且认为这样的修改和变化在本发明范围内。

本文中，本发明已以宽泛的和概括性的方式被描述。落入该概括性公开内容中的每一较窄的种类和亚类也形成本发明的一部分。这包括对本发明的带有从该类中除去任何主题的附加条件或负面限制的概括性描述，不论删除的资料是否在本文中被具体地叙述。

其它的实施方案包括在下面的权利要求和非限定性实施例中。另外，当本发明的特征或者方面针对马库什组(Markush groups)进行描述时，本领域技术人员会意识到，本发明因此也针对该马库什组成员中的任何单独成员或亚组进行描述

实验部分

实施例1

实施例1描述对于本公开的生物标志物的初步研究和初步数据。

材料(临床样本)

根据伦理审查委员会的批准和知情同意书(IRB#205-001,2012-527-B)，在研究的实施中收集净排尿样和相关临床信息。从健康个体和膀胱癌患者收集～20mL净排尿存于小便收集和保存管中(NorgenBiotek公司，Cat#18118,美国)。将净排尿样收集为三个独立的组。第一组(群组1)由无尿路上皮细胞癌、肉眼血尿、活动性***或者尿石症的既往史的30个个体组成。这些样本用作对照。第二组(群组2)由患有早期尿路上皮细胞癌(Ta或T1)的36个个体组成，并且第三组(群组3)为患有晚期尿路上皮细胞癌(T2或T3)的22个个体。在实验室操作之前为每一份尿样等分试样指定一个唯一的标识编号。根据制造商(Millipore,卡朗图厄尔山,爱尔兰)的描述使用3kDa离心过滤器富集尿蛋白质。简言之，将14mL尿样在4℃以8000g离心30分钟。将含有肉眼可见的血的样本舍弃。将这些样本保存在-80℃直至进一步处理。

表1正常/非癌症和癌症研究群组的人口统计学和临床病理学特征。

方法

质谱分析

基于高分辨率质谱(MS)的定量蛋白质组学方法已经成功用于定量比较两种或两种或更多种不同状态下的蛋白质组。最常用于比较和精确定量蛋白质水平的方法依赖于使用差异同位素标记。代谢标记法诸如SILAC仅应用于基于细胞培养物的研究。蛋白质或肽水平(收集后阶段)的化学标记适合于包括生物流体在内的任意类型的蛋白质样品。这些方法中，稳定同位素还原二甲基(R-diMe)标记是一种非常简单、快速且便宜的多重定量蛋白质组学方法，其使用高分辨率MS设备诸如LTQ-Orbitrap能够在单一的实验中定量数千蛋白质。可以直接使用开源的广为认可的MaxQuant程序来分析R-diMe数据。MaxQuant实现蛋白质鉴定、相对比例、比例归一化以修正混合误差，以及其他的相关统计信息诸如比例显著性。

将浓缩的尿液悬浮在8M尿素，100mM碳酸氢铵(ABC,SigmaAldrich)中。通过添加1M DTT以形成5mM DTT终浓度，将蛋白质样品在室温还原30分钟，接着使用10mM碘乙酰胺(IAA)在暗处处理30分钟进行烷基化。将还原的样品调整至6M尿素并与Lys-C(Promega)(1:100)在37℃孵育过夜。将混合物稀释至1M尿素后，用胰蛋白酶(猪来源的，经修饰测序等级；Promega)(1:50)在37℃消化所述样品4小时。根据Hsu等的描述(Anal.Chem.2003.75,6843-6852)进行一些修改后实施二甲基标记。用100μl的1％三氟乙酸(TFA)将消化产物(肽混合物)酸化，然后在C18-SD固相萃取(SPE)柱(3M Empore^TM)上进行二甲基标记。首先用甲醇，接着用0.1％TFA/70％CAN和0.1％TFA平衡柱子。将肽加样到三个不同的柱子上，接着令“轻”试剂(45mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，甲醛(CH₂O)(37％(体积/体积))、“中等”试剂(45mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，甲醛(CH₂O)(20％,98％D,Isotec)，0.3M氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)(Fluka))和“重”试剂(45mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，甲醛(CH₂O)(20％,99％13C,98％D,Isotec),0.3M氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)(96％D,Sigma-Aldrich))穿过柱子。对于正向标记实验，“轻”、“中等”和“重”试剂分别穿过含有正常(对照)、Ta/T1和T2/T3样品的柱子。对于逆向实验，“轻”、“中等”和“重”试剂分别穿过含有T2/T3、正常(对照)和Ta/T1样品的柱子。用0.1％TFA清洗后，将经标记的肽用0.1％TFA/70％ACN洗脱并混合，然后用高速真空浓缩仪浓缩。通过质谱分析对少量单独的标记肽进行标记掺入检查。剩下的相应地混合。在Agilent 3100OFFGEL分级分离仪(Agilent，G3100AA)上实施IEF。简言之，将13cm ImmobilineDryStrip pH 3-10(Scimed)用固定在托盘中的12-孔框架进行再水化之后，将肽混合物等量加样于12个样品孔中。用密封条覆盖12-孔框架，并且将电极固定在湿电极垫上的托盘上，然后将托盘连到分级分离仪上。将作为覆盖液的甘油添加到左电极和右电极，然后进行总计50kVh的梯度电泳。使用C18stage-tip将收集的级分如下脱盐。将3张固相萃取片、C18膜片(3M Empore)装入200μL的移液管吸头中。先用甲醇接着用80％/ACN 0.1％甲酸(FA)和0.1％FA离心调节stage tip。在调节过程中，确定stage tip的流量。然后将样品加样到stage tip并以所确定的流量离心。然后用0.1％FA清洗stage tip，接着用80％ACN/0.1％FA洗脱肽。将洗脱的肽在高速真空浓缩仪中浓缩15分钟，并且用0.1％FA加满至总体积20μl，然后将其引入到质谱仪中。将真空干燥的肽样在0.1％甲酸中复水并且用与LTQ Orbitrap XL(Thermo FisherScientific)耦联的nanoHPLC(Proxeon,Thermo Scientific)分析。肽被截留在C18前置柱上并且在分析柱上被分离，用2％乙腈/0.1％甲酸作为溶剂A和80％乙腈/0.1％甲酸作为溶剂B。以250nL/min的流量使用120分钟从5％至50％溶液B范围的梯度，接着5分钟从50％至100％溶液B范围的梯度。以r＝60,000的分辨率在m/z 400获得普查(survey)全扫描MS谱图(m/z 300-1400)，AGC靶标为1e6，并且最大注射时间为500ms。将在每个普查扫描中具有＞2000次计数的离子强度和≥2的电荷状态的10个强度最大的肽离子依次分离至1e4的目标值，并且在线性离子阱中使用35％的归一化碰撞能量通过碰撞诱导解离片段化。应用动态排除功能，使用最大排除清单为500，具有一个重复计数，重复，和30s排除持续时间。根据uniprot DROME fasta(18787条序列)使用MaxQuant1.2.0.18版检索数据。根据胰蛋白酶酶切位点特异性实施数据库检索，允许最大两个漏切和两个标记氨基酸，以及对于母离子初始质量容差为7ppm且碎片离子为0.5Da。将半胱氨酸酰胺甲基化作为固定修饰进行检索，并且N-乙酰化和氧化甲硫氨酸作为可变修饰进行检索。将二甲基Lys4、二甲基Nter4、二甲基Lys8、二甲基Nter8分别选择作为轻标记和重标记。对于蛋白质和肽都将最大错误发现率设置为0.01。当蛋白质得到至少一个具有最小六个氨基酸长度的唯一肽支持时则认为其被鉴定。

RNA分离和表征

使用ZR尿RNA分离试剂盒(Cat#ZYR.R1039,加利福尼亚州,美国)从尿的脱落细胞分离总RNA。通过注射筒将30ml净排尿推入ZRC GF^TM过滤器[试剂盒中提供]以在过滤器中分离尿脱落细胞。然后根据制造商的说明将RNA纯化。用ND-1000分光光度计测量RNA的浓度和A260/A280比值。进一步定量RNA的纯度并储存在80或者用于实时PCR。

实时PCR分析

使用III第一链合成***(Invitrogen，Cat#18080-051,加利福尼亚州，美国)逆转录总RNA(500ng)。使用含有预混合ROX的EXPRESSGreenER^TM qPCR Supermix(Invitrogen,Cat#11794-01K，加利福尼亚州，美国)进行RT-PCR预扩增反应。对于每个反应/孔，将10μL qPCR supermix与8μL各自经稀释的cDNA样品和2μL引物组合形成20μl终浓度。引物序列与实施例2中的表6中所列相同，其如下：冠蛋白-1A_F 5′CTTCAGCCGCATGAGTGAG 3′(SEQ ID NO:3)和冠蛋白-1A_R 5’AGGTAGACGATGTTGGTGTCA 3′(SEQ ID NO:4)；载脂蛋白A4_F 5′CCCAGCAACTCAATGCCCT 3′(SEQ ID NO:5)和载脂蛋白A4_R 5′CCTTCAGTTTCTCCGAGTCCT 3′(SEQ ID NO:6)；精囊凝固蛋白-2_F 5′CCAACATGGACCCAAAGACAT 3′(SEQ ID NO:7)和精囊凝固蛋白-2_R 5′TGTACGTGAAGACGGGTATGA 3′(SEQ ID NO:8)；γ-突触核蛋白_F 5′CAAGAAGGGCTTCTCCATCGCCAAGG 3′(SEQ ID NO:9)和γ-突触核蛋白_R 5′CCTCTTTCTCTTTGGATGCCACACCC 3′(SEQID NO:10)；DJ-1_F 5′TGCGTTCACTTTCAGCCT 3′(SEQ ID NO:11)和DJ-1_R 5′TGTGACTTCCATACTTCCGC3′(SEQ ID NO:12)。热循环条件如下：快速实时PCR反应包括95℃初始模板变性以及95℃变性和60℃退火/延伸的40个循环。反应在7900HT快速实时PCR***(Applied Biosystems)上进行。反应在7900HT快速实时PCR***(Applied Bio systems)上进行。

免疫印迹分析

使用蛋白质测定试剂盒(Pierce^TM BCA蛋白质测定试剂盒，Cat#23225，罗克福德，伊利诺斯州，美国)估计尿蛋白质。将来自单独样品的尿蛋白(100μg)在SDS凝胶上分离并电泳转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Bio-Rad Laboratories,Cat#162-0177，加利福尼亚州，美国)上。用于TBST(含有0.1％吐温-20的Tris-缓冲盐水)中的5％BSA(牛血清白蛋白)在室温封闭膜1小时。列于表2A中的下述第一抗体用于免疫印迹分析。通过首先与第一抗体孵育然后与辣根过氧化物酶-缀合的第二抗体孵育而用探测膜，并且使用增强的化学发光检测(Immobilon免疫印迹化学发光HRP底物，EMD Millipore，美国)显色。

表2A.用于免疫印迹和斑点印迹分析的抗体

斑点印迹测定

硝酸纤维膜(BioTrace,Pall Gleman Laboratory,美国)用于本测定。用铅笔画网格以标示进行印迹的区域。将来自单独患者的经处理净排尿蛋白(200μg)点在硝酸纤维膜上的网格的中心。通过缓慢地将样品点在膜上而使得吸收溶液的区域最小化。然后将膜放置一小时干燥。通过在室温将膜浸泡在于TBS-T中的5％BSA中1小时而封闭膜上的非特异性位点。然后与溶解于在TBS-T中的5％BSA的第一抗体(1:100至1:10000的稀释范围)在室温孵育1小时，接着用TBS-T以10分钟间隔清洗三次。与HRP缀合的第二抗体的孵育在室温进行1小时，接着用TBS-T以10分钟间隔清洗三次。将膜与ECL(Immobilon免疫印迹化学发光HRP底物，EMD Millipore，美国)孵育并且对化学发光成像Gbox曝光。

ELISA定量

(Pierce 96孔板-Corner Notch,Cat#15041，美国)(于TBS中的SuperBlock封闭缓冲液，Cat#37535，Thermo Fisher Scientific Inc.，美国)(1-Step^TM Ultra TMB-ELISA,Cat#34028,Thermo Fisher Scientific Inc.，美国)。使用各种ELISA试剂盒(USCN生命科学有限公司，武汉，湖北)根据制造商的说明确定每种生物标志物和补体因子H的尿蛋白浓度(一式三份)。试剂盒列于表8中。通过在ELISA板的每个孔中加样相等浓度的总蛋白而将尿中生物标志物的量归一化。

组织病理学和免疫染色

将每个膀胱活检样品的一部分在10％NBF中固定48小时，转移至70％乙醇中，然后石蜡包埋。以5-μm间隔将样品切片连续10层，并用苏木精和曙红染色用于组织病理学检查。

使用甲醛固定的石蜡切片实施免疫组织化学分析。使用Bond^TM表位修复溶液2(用于pH9)在100℃下实施热诱导表位修复40分钟。使用Leica Bond^TM自动染色仪实施免疫组织化学染色，Leica Bond^TM自动染色仪在染色规程中使用他们具有专利权的Bond^TM检测改良试剂盒(Leica,目录号：DS9800)。所有免疫荧光反应根据表2B中所列的抗体稀释度实施。作为检测试剂盒的一部分，第二抗体构成于tris-缓冲盐水/0.9％ProClin^TM 950中的含有10％(v/v)动物血清的抗兔聚-HRP IgG。该溶液不经稀释使用。

表2B.IHC中使用的抗体

抗体名称	使用稀释度	IHC条件
			冠蛋白-1A	1:500	兔
抗-APOA4	1:250	兔
			抗-精囊凝固蛋白II	1:250	兔
抗-γ-突触核蛋白_	1:500	兔
			DJ-1	1:500	兔

尿蛋白质的质谱分析：稳定同位素还原二甲基标记

基于高分辨率质谱(MS)的定量蛋白质组学方法已经成功用于定量比较两种或更多种不同状态下的蛋白质组。最常用于比较和精确定量蛋白质水平的方法依赖于使用代谢的或化学的差异同位素标记。代谢标记方法诸如SILAC仅能够直接应用于基于细胞培养物的研究。蛋白质或肽水平的化学标记适合于包括生物流体在内的任意类型的蛋白质样品。这些方法中，稳定同位素还原二甲基(R-diMe)标记是一种非常简单、快速且便宜的多重定量蛋白质组学方法，其使用高分辨率MS设备诸如LTQ-Orbitrap可以在单一的实验中定量数千蛋白质。可以直接使用开源的广为认可的MaxQuant程序来分析R-diMe数据。对于来自正常(对照)、Ta/T1和T2/T3患者的浓缩尿样实施三重标记的R-diMe分析。使用标准程序用Lys-C接着用胰蛋白酶消化样品。为了减少样品复杂度，在Agilent3100OFFGEL分级分离仪上使用等电聚焦电泳将所获得肽混合物(来自差异性标记的尿样)分级分离。每一级分进行nanoHPLC(Proxeon,ThermoScientific)-LTQ Orbitrap质谱分析。根据uniprot DROME fasta(18787条序列)使用MaxQuant 1.2.0.18版处理原始数据。二甲基Lys4、二甲基Nter4、二甲基Lys8、二甲基Nter8分别选择作为轻、中等和重标记。对于蛋白质和肽都将最大错误发现率设置为0.01。当蛋白质得到至少一个具有最小六个氨基酸长度的唯一肽支持时则认为其被鉴定。

使用各种免疫化学技术进一步分析所鉴定蛋白质列表。从发现阶段开始，挑选了17个候选蛋白质用以检查它们在来自早期和晚期膀胱癌患者的单个尿样中的丰度。在免疫印迹、RT-PCR和斑点印迹中评估每个生物标志物的相对能力和相对影响。通过本研究，选择了五种候选生物标志物，单独地和组合两者均用于膀胱癌检测。此外，使用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)监测尿样中各个生物标志物的水平。使用纯化标准品针对每个所评估蛋白质制定校正曲线。确定五种生物标志物用于BCa检测的诊断值。应用逻辑回归过程，膀胱癌状态作为反应变量且所述生物标志物作为预测变量。一旦产生预测模型，即使用Graphpad产生受试者工作特征(ROC)曲线，提供灵敏度值对假阳性率的曲线。通过使用Graphpad计算ROC曲线下面积(AUC)而评估我们所选择的生物标志物的不同组合的相对能力。较高的AUC指示较强的预测物。基于最大约登指数选择每个生物标志物的阈值。使用所选择的用于诊断的阈值依次计算灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)和总精度。

结果

对在发现膀胱癌生物标志物中的尿蛋白质组比较分析的评估

对于通过如方法部分所述将来自四个志愿者的等体积尿样合并而制备的尿样进行第一次qMS分析。为了最小化实验误差，包括了生物学重复试验(不同的合并混合物)和技术重复试验(对于相同样品进行不同标记以及不同MS分析试验)。最后，组合所有数据集以获得尿样中存在的蛋白质的平均倍数变化。与正常尿样相比具有两倍或者更多倍数变化的任意蛋白质被认为是分泌过多的蛋白质(表3)。

表3在每个患者组中检测到的尿标志物的数目

膀胱癌分期	所检测到的尿标志物的数目
		仅Ta/T1(未浸润肌层)	87
仅T2/T3(浸润肌层)	56
		Ta/T1和T2/T3二者	45

从这一蛋白质列表中选择17个潜在候选蛋白基于其功能、亚细胞定位和疾病相关性进行初步验证。应用不同的生物化学技术以验证所选择的这些标志物：RT-PCR用于定量所鉴定命中(hit)的mRNA表达，并且免疫印迹用于检查所选择生物标志物的表达水平。基于mRNA表达分析的结果，五种候选生物标志物显示，与正常个体相比它们在非肌层浸润性以及肌层浸润性BC患者中的mRNA表达水平升高。冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1的RNA表达倍数变化显示一定范围的表达。最重要的是，与正常个体相比，所有的生物标志物都显示高水平的倍数变化。将这些数据与FDA批准的BTA-TRAK测定因子补体H进一步比较(图1)。基因水平的数据与我们的MS数据相比较。上述潜在标志物的代表性MS图谱也清楚地显示，在患者样品中它们以较高水平存在(图11)。

然后在下述样品中通过免疫印迹分析冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1：合并尿样(图2A)和来自单独的非肌层浸润性BC患者的24份尿样(图2B、图3)和肌层浸润性BC患者样品的24份尿样(图2C)。归一化后，显示表达水平升高的所述五种候选蛋白质的相对蛋白质水平列示于表4中。由免疫印迹分析获得的数据与由RT-PCR获得的数据相匹配。

表4.免疫印迹分析

还开发了一种简单的无创性快速斑点印迹测定，用于在患有膀胱癌的患者尿样中检测所发现的五种标志物。如果所述标志物被检测到并形成一个环(即阳性测试)，那么这一技术允许半定量读取所获得的有色点。如果没有检测到标志物(即阴性测试)，则产生无色点或者不形成环，列示于图3中。在所有测定中，由本公开的生物标志物生成的所有数据均与FDA批准的BTA-TRAK测定因子补体H相比较。

为了进一步评估本公开的生物标志物的诊断表现，在从高等级膀胱癌患者中获得的活检样品中检查它们的表达。对所有五种生物标志物实施免疫组织化学检测。结果清楚地确认了所有五种生物标志物在呈现于图4中的组织切片中表现阳性染色。

设计了基于高级MS的同位素二甲基标记方法，用于鉴定一组新颖生物标志物。这一方法是一种非常简单、快速且便宜的多重定量蛋白质组学方法，其基于能够定量比较生物流体的蛋白质组的有效化学标记。在本研究中，将尿样与借助高分辨率MS设备诸如LTQ-Orbitrap的多重定量蛋白质组学方法结合使用，以分析膀胱癌患者和正常个体之间的差异。本公开中实施的质谱研究获得了在早期Ta/T1膀胱癌、晚期T2/T3膀胱癌以及Ta/T1和T2/T3膀胱癌二者中水平升高的一系列蛋白质(未显示)。

在基于重要性和相关性的淘汰步骤之后，选择了17种标志物并且在mRN表达和免疫印迹研究后进一步缩小至五种潜在标志物。通过斑点印迹和ELISA技术进一步验证这五种生物标志物，确认它们能够用作无创性标志物。对本研究所收集的数据进行统计学分析以生成所述生物标志物的特异性和灵敏度。本公开的生物标志物组(冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白、DJ-1/PARK 7)在88个受试者的群组中实现了最精确的基于多分析物的BC检测测定。纳入额外的生物标志物有可能影响特异性和灵敏度。测试所有可能的组合，发现所述五种生物标志物组中的三种(冠蛋白-1A、ApoA4和γ-突触核蛋白)组合产生100％的总精度并且保持高灵敏度(100％)和特异性(100％)(图5)。因此，实施例1表明，三种生物标志物组合可以提供对于非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的可靠诊断(表5)。为了验证这一发现，在下述实施例2中使用较大样品量开展了进一步研究。

表5.单独和三种不同组合的性能数值。

实施例2

实施例2是实施例1的延续和升级研究，其中开展了基本上相同的实验(基于较大样本量)以验证本公开的生物标志物的可靠性

材料和方法

尿样

根据伦理审查委员会的批准和知情同意书收集净排尿样品和相关临床信息(表6)。对于初始筛选步骤，将来自健康受试者和膀胱癌患者的20mL净排尿收集在保存管中并存储在-80℃(Norgen Biotek公司，加拿大)。构建三个独立的组：对照组，对应于无尿路上皮细胞癌、肉眼血尿、活动性***或者尿石症的既往史的健康受试者；第二组，由Ta和T1膀胱癌患者形成，特征在于患有非肌层浸润性膀胱癌；和第三组，包括T2和T3膀胱癌患者，特征在于患有肌层浸润性膀胱癌。在实验室操作之前为每一份尿样等分试样指定一个唯一的标识编号。将根据肉眼检查或者基于尿液试纸条测试(Combur9,Roche Diagnostics，巴塞尔，瑞士)确定具有显著血液污染的尿样剔除。将样品保存在-80℃直至进一步处理。

表6-患者详细情况(n＝365)

缩写:n/a,不适用；BCa,膀胱癌。

对于验证筛选，从受到慢性疾病、膀胱癌或者其他癌症类型影响的患者中收集额外的5mL净排尿。

尿样的定量质谱分析

使用3kDa离心过滤器根据制造商(Millipore,卡朗图厄尔山,爱尔兰)的说明浓缩尿蛋白质。将来自各群组(即健康、Ta/T1和T2/T3膀胱癌分期)的四份样品合并并且在4℃以8000×g离心30-60分钟。将丙酮沉淀的样品在120μl处于100mM碳酸氢铵中的8M尿素中复水。通过在每个样品中添加1M二硫苏糖醇至终浓度为5mM而将样品还原，然后在室温孵育30分钟。通过添加0.5M碘乙酰胺至终浓度为10mM而实施烷基化，并且将样品在暗处孵育30分钟。然后使用100mM碳酸氢铵将所有样品从初始8M尿素稀释至6M尿素，并且接着与Lys-C(酶比蛋白质的比率为1：100)在37℃孵育过夜。通过添加50mM碳酸氢铵将消化混合物调整至终浓度为1M尿素，接着与胰蛋白酶在37℃孵育4小时(酶比蛋白质的比率为1：50)。

根据Swa,H.L.,A.A.Shaik,等(2014)."Mass spectrometry-basedquantitative proteomics and integrative network analysis accentuatesmodulating roles of Annexin-1in mammary tumorigenesis."Proteomics的描述，对胰蛋白酶消化的肽混合物进行柱上稳定同位素二甲基标记。使用三重标记方法。将差异标记的尿样混合并使用等电点聚焦电泳在Agilent3100OFFGEL分级分离仪上分级分离(12个级分)。使用单独包装的C18stage tip清洁所述样品，并且如前文所述对其进行质谱分析(Swa,Shaik等，2014)。根据2013年7月的uniprot人fasta数据库(88354条目)使用MaxQuant 1.3.0.5版处理原始数据。对于蛋白质和肽最大错误发现率都设置为0.01。当蛋白质得到至少一个具有最小七个氨基酸长度的唯一肽支持则认为其被鉴定。

实时定量聚合酶链式反应

使用ZR尿RNA分离试剂盒(Zymo Research,欧文,加利福尼亚州)从5ml尿样中的脱落细胞中分离总RNA。使用III第一链合成***(Invitrogen,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)将总RNA(500ng)逆转录。使用含有预混合ROX(Invitrogen)的EXPRESSGreenER^TMqPCR Supermix实施RT-PCR预扩增反应。引物序列列于表7中。

表7-用于定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)的引物序列。

免疫印记分析

将尿样离心去除细胞后对其实施免疫印迹。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce,罗克福德,伊利诺斯州)估计蛋白质浓度。将来自单独样品的蛋白质(100μg)在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上分离并且电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad Laboratories,Hercules，加利福尼亚州)上。用处于含有0.1％吐温-20的Tris-缓冲盐水(TBST)中的5％牛血清白蛋白(BSA)在室温封闭膜1小时，接着用表8中所列的第一抗体作为探针检测膜。

表8-用于免疫印迹、免疫染色和ELISA测定的抗体和ELISA试剂盒

ELISA蛋白质定量

使用各种ELISA试剂盒(表8)(USCN生命科学有限公司，武汉，湖北)确定用于各个生物标志物(冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1)以及FDA批准的补体因子H的尿蛋白浓度。根据制造商的说明实施所述测定。所有测试一式三份地进行。通过在ELISA板的每个孔中加样相等浓度的总蛋白而将尿中生物标志物的量归一化。在自动化微量滴定板读数仪M1000PRO(Tecan,瑞士)上在450nm读数。

组织病理学

将膀胱癌活检样品在10％中性缓冲***(NBF)中固定48小时，转移至70％乙醇中，然后石蜡包埋。将4-μm组织切片用苏木精和曙红染色用于组织病理学检查。使用Bond^TM表位修复溶液2(用于pH9)在100℃下实施热诱导表位修复40分钟。使用Leica Bond^TM自动染色仪完成免疫组织化学染色，Leica Bond^TM自动染色仪使用他们具有专利权的Bond^TM检测改良试剂盒(Leica,Solms,德国)。所有免疫荧光标记使用表8中所列的抗体稀释度实施。

统计学分析

使用GraphPad5.0软件分析所有数据。对于RT-PCR数据，使用双边曼-惠特尼U检验获得健康受试者、Ta/T1和T2/T3患者之间生物标志物表达的显著性差异或者倍数变化。使用图像处理程序ImageJ(美国国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州)定量免疫印迹的数据强度。开展皮尔森相关性检验分析生物标志物与血浆的任何相关性。使用来自R2012a统计学工具箱8.0版(MathWorks,纳蒂克,马萨诸塞州)的Lasso回归模型开发了组合五种生物标志物的诊断模型。使用ELISA试剂盒中提供的纯化蛋白质绘制校正曲线。使用Graphpad(GraphPad软件,La Jolla,加利福尼亚州)构建受试者工作特征(ROC)曲线和AUC。较高的AUC(＞0.5)指示是比随机选择更强烈的预测指标。基于约登指数选择每个生物标志物的阈值，J＝灵敏度+特异性-1。使用所选择的用于诊断的阈值计算灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)，和总精度。p<0.05(双边)的p-值被认为是显著的。

结果

使用定量MS鉴定用于膀胱癌检测的候选生物标志物

为了鉴定用于诊断非肌层浸润性膀胱癌(Ta/T1)和肌层浸润性膀胱癌(T2/T3)的潜在生物标志物，借助来自四个志愿者的等体积合并尿样实施MS分析。为了最小化实验误差，包括了生物学重复试验(不同的合并混合物)和技术重复试验(对于相同样品进行不同标记以及不同MS分析试验)。最后，组合整个数据集以获得与健康尿样相比，膀胱癌尿样中存在的蛋白质的平均倍数变化。与来自健康受试者的样品相比，具有至少两个比值计数的两倍或者更高的倍数变化(至少在一个分期中)的蛋白质被认为是分泌过多的蛋白质。通过大量的在线数据库文献检索对所述分泌过多的蛋白质进行详细检查，并且基于他们的新颖性、先前发表的与癌症相关性和亚细胞定位将其列入候选名单。

净排尿脱落细胞中生物标志物的mRNA倍数变化

在由RT-PCR进行的初始验证实验中考虑列入候选名单的潜在生物标志物，采用对于下述三个组每组10个样品：对照组(健康受试者)、Ta/T1膀胱癌(未浸润肌层)组；和T2/T3膀胱癌(浸润肌层)组。基于mRNA表达分析结果，与其在健康受试者中的表达相比，五种候选生物标志物——冠蛋白-1A、载脂蛋白A4、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1——在非肌层浸润性(Ta/T1)膀胱癌患者和肌层浸润性(T2/T3)膀胱癌患者中具有显著较高的表达倍数变化。补体因子H也在膀胱癌患者尿中呈现较高的mRNA表达(图8)。

健康、非浸润性和浸润性BCa分期尿样的免疫印迹分析

分析了来自30个健康受试者、72个非肌层浸润性膀胱癌(Ta/T1)患者和55个肌层浸润性膀胱癌(T2/T3)患者的尿样。所有的非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌尿样均呈现所述五种生物标志物中的至少三种表达水平升高(图9)。使用条带强度值建立的ROC曲线显示，五种生物标志物组合使用时，健康受试者相对于非肌层浸润性膀胱癌(Ta/T1)和健康受试者相对于肌层浸润性膀胱癌(T2/T3)的AUC分别为0.98和1.0(图7b和表9A和表9B)。

表9A-组合模型用于诊断Ta/T1(未浸润肌层)膀胱癌的精度

缩写:AUC,曲线下区域；PPV,阳性预测值；NPV,阴性预测值。

表9B-组合模型用于诊断T2/T3(浸润肌层)膀胱癌的精度

缩写:AUC,曲线下区域；PPV,阳性预测值；NPV,阴性预测值。

免疫印迹分析数据(图9)显示与RT-PCR的数据(图8)完全一致，指示与正常受试者的尿样相比，五种生物标志物在膀胱癌患者尿样中显著富集。五种潜在标志物的代表性MS谱图也很好地符合了RT-PCR和免疫印迹数据(图11)。

尿的生物标志物和血尿

血尿发生在许多患有尿路疾病的患者中，因而血尿能够影响使用本公开所选择的生物标志物对膀胱癌的诊断，因为这些蛋白质也可以见于血液中，虽然含量较低。表10基于数据库检索提供了四种所述生物标志物在血浆中的丰度。

表10-从数据库获得的生物标志物血浆浓度

蛋白质	Uniprot名称	登录号	MS测定浓度
				冠蛋白-1A	COR1A_HUMAN	P31146	41ng/ml
载脂蛋白A4	APOA4_HUMAN	P06727	30-50μg/ml
				精囊凝固蛋白-2	SEMG1_HUMAN	P04279	6ng/ml
γ-突触核蛋白	SYUG_HUMAN	O76070	--
				DJ-1	PARK7_HUMAN	Q99497	23ng/ml
补体H	CFAH_HUMAN	P08603	30-120μg/ml

所有数据引自http://www.plasmaproteomedatabase.org/

文献检索也表明所述生物标志物的浓度变化非常巨大。因此，在本研究中，使用免疫印迹以确定这五种生物标志物在来自于四份血液样品的血浆中和白细胞中的表达。所有生物标志物均在血浆中表达，但是在白细胞提取物中只看到冠蛋白-1A的表达。为了计算这些生物标志物与血浆的相关性，在各个样品中根据人血清白蛋白(HSA)值定量和归一化所述生物标志物在血液和尿样中的免疫印迹强度。将数据绘图为盒须图分析时，与健康受试者尿样或血浆相比，所有的五种生物标志物在Ta/T1和T2/T3尿样中具有显著较高的相对表达水平(图6)。而且，使用皮尔森相关性检验，仅冠蛋白-1A显示与人血清白蛋白水平具有少量相关性(表11)。因此，得出结论，本公开的尿生物标志物的表达不是由于样品中的血尿而导致的。

表11-血浆和白细胞与生物标志物的皮尔森相关分析：对于来自健康受试者、Ta/T1膀胱癌(未浸润肌层，NMI)患者和T2/T3膀胱癌(浸润肌层，MI)患者的尿样和血浆样品中的生物标志物的皮尔森相关系数(r)。

接下来，本公开试图将冠蛋白-1A的表达与白细胞计数联系起来，以假设人血清白蛋白仅来源于血液而不是来自有缺陷的肾脏过滤。本研究发现冠蛋白-1A在尿中的实际条带强度比理论上来源于白细胞的条带强度增加至少289倍(见下文)。这一分析因而允许排除白细胞对于冠蛋白-1A含量的***著贡献。

血尿中的白细胞(WBC)与冠蛋白-1A生物标志物表达的相关性分析

血液中白蛋白浓度(文献中报道)＝40μg/μl；

BCa患者尿样中的白蛋白浓度范围(从我们实验分析中推断)＝0.012-2.56μg/μl(使用该范围上限进行进一步计算)；

BCa患者尿样中的平均白蛋白浓度＝1.18μg/μl；

因此，尿中血液体积大约＝(1/40)*1.18＝0.0295μl[假定：血液是白蛋白的唯一来源]；

WBC数目/μl血液(文献中报道)＝大约5000个；

因此，尿中的0.0295μl血液包含＝(5000*0.0295)＝147.5个WBC；

单个细胞的重量(文献中报道)＝3.5*10^-3μg；

蛋白质的量/细胞(文献中报道)＝0.0007μg[蛋白质重量是细胞重量的20％]；

从白细胞层获得的大约40μg裂解WBC将来源于＝(1/0.0007)*40＝57142.86个WBC[大约57,000个WBC]；

57,000个WBC裂解物的冠蛋白-1A印迹强度为＝34403[获自在进行本研究的实验室中进行的WB实验]；

因此，如果147.5个WBC在尿中裂解将产生＝(34,403/57000)*147.5＝89.025的强度；

从BCa尿样印迹中获得的实际冠蛋白-1A强度＝25,788.58(平均值)；

实际印迹强度与理论来源的印迹强度相比的倍数变化＝(25,788.58/89.025)＝289.68。

因此，本研究确认血清白蛋白和冠蛋白-1A表达之间不具有相关性，并且目前通过统计学计算和试验获得的这一生物标志物的表达差异证明BCa患者尿中的冠蛋白-1A不是主要由裂解的白细胞而是主要由***贡献的。

来自非膀胱癌患者和患各种慢性疾病的患者的尿样中生物标志物的丰度

为了进一步评估本公开的生物标志物在膀胱癌中的特异性，对来自非膀胱癌患者的84份尿样和来自患各种慢性疾病的患者的120份尿样实施免疫印迹分析(表6)。绝大部分样品对于这五种生物标志物是完全阴性的；尽管在有些实例中零星地观察到一种生物标志物的表达(图12a、图12b和图13)。

用以分析五种生物标志物的组合的诊断模型

本研究开发了一种使用Lasso回归的诊断模型，用以评估所有五种尿生物标志物的不同组合的临床效用(表12A和12B)。

表12A-在使用ELISA和免疫印迹尿样数据分析二者诊断Ta/T1中生物标志物的精度和阈值。

缩写:AUC,曲线下区域；PPV,阳性预测值；NPV,阴性预测值。

表12B-在使用ELISA和免疫印迹尿样数据分析二者诊断T2/T3中生物标志物的精度和阈值。

缩写:AUC,曲线下区域；PPV,阳性预测值；NPV,阴性预测值。

使用ELISA和免疫印迹数据单独和以各种组合计算所述五种生物标志物中的每一种的诊断性能。表12A和12B中列示了每个生物标志物的灵敏度和特异性，以及阈值。与实施例1中的结果相比，这一升级研究(实施例2)使用来自ELISA的表达数据发现，表9A的组合所有五种生物标志物的诊断模型在区分Ta/T1膀胱癌患者与健康受试者方面是最准确的，达到0.92的AUC和85.3％的总精度(灵敏度79.2％；特异性100％)。类似地，对于在升级研究(实施例2)中诊断T2/T3膀胱癌患者，该诊断模型达到0.94的AUC和90.6％的总精度(灵敏度86.4％；特异性100％；在表9B中)。相比之下，补体因子H对于Ta/T1膀胱癌诊断显示0.72的AUC和73.3％的总精度(灵敏度80％；特异性60％)；并且对于T2/T3膀胱癌诊断显示0.51的AUC和64.3％的总精度(灵敏度77.8％；特异性40％)(表9A和9B)。

同样地，这一升级研究(实施例2)使用免疫印迹数据发现，组合所有五种生物标志物的诊断模型是最准确的，对于Ta/T1膀胱癌诊断达到0.98的AUC和94.8％的总精度(灵敏度93.9％；特异性96.7％)。因此，组合所有五种生物标志物的诊断模型是高度灵敏和高度特异的，超过FDA批准的补体因子H达27-30％并且胜过常规细胞学检测或者目前已报道用于Ta/T1膀胱癌诊断的任意已有生物标志物。

基于高级MS的同位素二甲基标记技术允许本公开的发明人高精度地鉴定用于膀胱癌诊断的一组新颖生物标志物。在本研究中，使用这一尖端技术分析尿样，以相对于健康受试者的尿蛋白质组而相对地定量膀胱癌患者的尿蛋白质组。在广泛的筛选和文献调查之后从MS数据中选择了五种生物标志物。接着通过RT-PCR、免疫印迹和ELISA测定验证这五种推定的生物标志物。与健康受试者相比，这五种生物标志物的尿浓度在患有膀胱癌的患者中升高。

使用来自ELISA和免疫印迹的数据，有力验证了这五种推定的生物标志物用于检测膀胱癌的诊断性能，并且在一个实施例中发现，有必要组合所有五种生物标志物以获得精确诊断。没有一个健康受试者中具有可检测浓度的这五种生物标志物。在本研究中，本公开的五种生物标志物也与目前使用的生物标志物，包括FDA批准的生物标志物补体因子H相比较。补体因子H对于良性肾脏疾病和***以及其他癌症类型诸如***癌或者肾癌显示60％的特异性。与补体因子H不同，本公开的尿生物标志物能够将患有膀胱癌的患者与患有良性病症诸如膀胱炎、良性***增生或者可能与血尿相关的尿石症的那些患者区分开。本文描述的实验研究仅在受到慢性疾病或者本研究中测试的某些癌症类型影响的患者尿中不常见地检测到了本公开的一些标志物。

已经显示FDA批准的生物标志物NMP22会受到尿中的血尿的影响。因此，本研究也考虑了血液污染对于这些生物标志物可能发生的作用。人血清白蛋白在尿中的水平变化非常巨大，而且其在健康受试者中也能被检测到。很明显，来自患有慢性疾病诸如糖尿病的患者的尿比来自在本公开中所观察的许多膀胱癌患者的尿具有高得多的水平的人血清白蛋白。因此，人血清白蛋白并不总能反映血液污染。此外，血浆或白细胞污染对于这些生物标志物的作用不能解释低速离心尿后所检测到的这些生物标志物的水平的原因。

在实施例2中，所有五种生物标志物在免疫组织化学染色的膀胱癌组织中显示同样地富集表达(图14)，并且统计学分析阐明了使用所有五种生物标志物的诊断模型用于膀胱癌检测的意义。

Claims (21)

1.一种膀胱癌蛋白质生物标志物，其中所述生物标志物是选自由冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1，及其变体组成的组的至少一种。

2.根据权利要求1所述的膀胱癌生物标志物，其中所述生物标志物指示早期(Ta/T1)和/或晚期(T2/T3)膀胱癌。

3.根据前述权利要求中任一项权利要求所述的膀胱癌生物标志物，其中所述生物标志物将在样品中被检测。

4.根据权利要求3所述的膀胱癌生物标志物，其中所述样品是流体样品。

5.根据权利要求4所述的膀胱癌生物标志物，其中所述流体样品是尿或者净排尿。

6.根据前述权利要求中任一项权利要求所述的膀胱癌生物标志物，其中所述生物标志物包括冠蛋白-1A、载脂蛋白A-IV、精囊凝固蛋白-2、γ-突触核蛋白和DJ-1。

7.一种检测***，其包括a)接收部分，以接收来自疑似患膀胱癌的患者的样品，并且其中所述样品被怀疑包含一种或多种根据权利要求1至6中任一项权利要求所述的生物标志物和b)检测部分，其包括能够检测一种或多种根据权利要求1至6中任一项权利要求所述的生物标志物的一种或多种物质。

8.根据权利要求7所述的检测***，其中所述检测部分包括能够与一种或多种根据权利要求1至6中任一项权利要求所述的生物标志物结合或特异性结合的物质。

9.根据权利要求8所述的检测***，其中所述物质是选自由抗体或其抗原结合片段、相互作用融合蛋白、适体和亲和体组成的组的生物特异性捕获剂。

10.根据权利要求7至9中任一项权利要求所述的检测***，其中所述***是生物芯片或测试条或微量滴定板。

11.根据权利要求7至10中任一项权利要求所述的检测***，其中所述样品是流体样品。

12.一种用于确定患者是否患或表现复发膀胱癌或早期膀胱癌或晚期膀胱癌的方法，其中所述方法包括检测一种或多种根据权利要求1至6中任一项权利要求所述的生物标志物的存在。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物标志物从样品中被检测。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品是流体样品。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述流体样品是尿或者净排尿。

16.根据权利要求12至15中任一项权利要求所述的方法，其中所述检测是使用分子生物学方法实施的。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分子生物学方法选自由聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹、斑点印迹、质谱和免疫学方法组成的组。

18.根据权利要求12至17中任一项权利要求所述的方法，其中关于所述一种或多种生物标志物是否被包含在从所述患者获得的样品中的指示是基于结果与对照组的比较而做出的。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述对照组包括不患膀胱癌的患者。

20.根据权利要求12至19中任一项权利要求所述的方法，其中所述方法使用根据权利要求7至11中任一项权利要求所述的检测***。

21.一种试剂盒，其包括根据权利要求7至11中任一项权利要求所述的检测***和实施根据权利要求12至20中任一项权利要求所述的方法所需的物质。