CN106796239A - 用于诊断胰腺癌的组合物以及使用其诊断胰腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断胰腺癌的组合物、试剂盒和方法，其包含用于测量某一标记物基因的蛋白或mRNA表达水平的试剂，所述试剂可用于确定胰腺癌的发病或发病的可能性。通过提供用于诊断胰腺癌的标记物，可进行胰腺癌或癌前期病变的发病的可能性的早期诊断和疾病严重性的显著预测，从而用于胰腺癌肿瘤发生的研究。此外，本公开内容的诊断方法允许以无创性方式在样品(例如血液)中方便地检测胰腺癌。

Description

用于诊断胰腺癌的组合物以及使用其诊断胰腺癌的方法
技术领域
本公开内容涉及用于诊断胰腺癌的组合物和试剂盒，其包含用于测量某一标记物基因的蛋白或mRNA表达水平的试剂，所述试剂可用于确定胰腺癌的发病或发病的可能性，以及涉及使用所述组合物或试剂盒诊断胰腺癌的方法。
背景技术
目前，在人类主要疾病中具有代表性的是癌症。关于癌症的研究正在积极进行，特别是在高发癌症(包括肺癌、肝癌、胃癌等)领域，但是对低发癌症(包括食管癌、结直肠癌、胰腺癌等)进行的研究较少。
特别地，胰腺癌在其早期通常不引起可识别的症状，并且该疾病通常由于其症状轻微(例如疼痛、体重减轻等)，直到疾病从胰腺本身扩散至全身才被诊断出。此外，胰腺癌的存活率通常很低，因此定期诊断非常重要。在大多数情况下，胰腺癌的临床症状是缓慢暴露的，并且胰腺癌患者最常出现虚弱、厌食和体重减轻。已发现胰腺癌的五年存活率是1-4％，中位生存期是5个月，其非常致命并且是人类癌症中预后最差的。诊断后，发现80-90％的人不能通过有希望的治愈性切除术治疗。这是通常预后非常差的主要原因之一。主要使用化学疗法治疗胰腺癌。因此，与其他癌症相比，迫切需要胰腺癌的早期诊断方法。
尽管目前已知一些抗癌试剂(包括5-氟尿嘧啶、吉西他滨和特罗凯)可用于治疗胰腺癌，但是它们表现出非常低的疗效和对癌症治疗的仅15％左右的反应率。这些情况表明，迫切需要更有效的胰腺癌的早期诊断和治疗，由此可改善预后。在本文中，用于胰腺癌的前期病变(即胰腺癌的前期)的适合的诊断和治疗对治疗结果非常重要。
根据血液学检验(CA19-9)、使用X-射线造影剂的胃肠道造影术和十二指肠造影术、经皮肤和肝的胆管造影术，或内窥镜逆行胰胆管造影术来确定胰腺癌或其前期病变的诊断。可通过这样的方法检测许多疾病病变，但是目前最优选的是超声波扫描术和计算机断层扫描术。更谨慎的活检方法可产生相对更精确的结果。上述诊断方法由于其通常是精确的而被使用，但是，受试者不愿经受检查，因为这些诊断方法是令人不舒服的或疼痛的。因此，需要方便并快速诊断胰腺癌或其前期病变的方法。
目前，利用影像学诊断技术(包括腹部超声(US)、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等)的广泛医学检查已能够经常在胰腺或胰腺周围发现恶性病变，即使它们倾向于在除胰腺以外的其他器官中检测病变。通过影像学诊断测量显示为囊肿的病变是在临床上重要的，因为它们在病理学特性方面可能会涵盖从良性病变到癌前病变和恶性病变的各种疾病。
尽管在影像学诊断(例如，CT、MRI等)方面有许多进展，但在手术之前准确地区分出具有各种病理学特性(从良性病变到癌前病变和恶性病变)的胰腺的囊肿病变仍然是困难的。因此，确定胰腺中的囊肿病变是否为易于恶化转变的肿瘤病变，以及如果有可能恶化转变，其是否仍处于癌前还是已是恶性肿瘤，这些在临床学上是重要的。
韩国专利第10-0819122号和未经审查的韩国专利申请公开第2012-0082373号公开了使用多种胰腺癌标记物(包括母系蛋白、甲状腺素转运蛋白和分层蛋白)的技术。另外，未经审查的韩国专利申请公开第2009-0003308号描述了通过检测受试者血液样品中REG4的表达水平来诊断胰腺癌。未经审查的韩国专利申请公开第2012-0009781号描述了测量受试者癌症组织中XIST RNA表达水平的分析方法，由此可提供受试者胰腺癌的发病的信息。未经审查的韩国专利申请公开第2007-0119250号公开了新的LBFL313基因家族，其在正常胰腺组织和胰腺癌组织之间以不同模式表达。美国专利申请第2011/0294136A1号公开了使用生物标记物(包括角蛋白8蛋白)的胰腺癌的诊断方法。但是，不同标记物之间的诊断效率和精确度大大不同。因此，迫切需要非常有效的标记物和使用该标记物的诊断方法。
发明内容
技术问题
本公开内容的一个目的是提供胰腺癌的诊断标记物，使用该诊断标记物可在早期方便地诊断出胰腺癌的发病、发病的可能性或风险性。
本公开内容的另一个目的是提供胰腺癌的诊断组合物，使用该诊断组合物可在早期方便地诊断出胰腺癌的发病、发病的可能性或风险性。
本公开内容的又一个目的是提供用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含所述组合物。
本公开内容的再一个目的是提供使用诊断组合物或试剂盒诊断胰腺癌或提供关于胰腺癌的诊断结果的信息的方法。
本公开内容的另一个目的是使用诊断组合物或试剂盒确定受试者中胰腺癌的存在或恶性程度的方法。
本公开内容的另一个目的是提供诊断标记物用于在早期诊断出胰腺癌的发病、发病可能性或风险性的用途。
技术方案
为实现以上目的，本公开内容提供了用于诊断胰腺癌或其前期病变的组合物，其包含用于测量胰腺癌的某种诊断标记物基因的蛋白或mRNA表达水平的试剂；用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含所述组合物；以及确定胰腺癌患者或疑似患有胰腺癌的受试者中胰腺癌的存在或恶性程度的方法。所述组合物或试剂盒还可包含适用于分析的其他成分、溶液或装置。
在本公开内容的一些实施方案中，胰腺癌的诊断是从正常组中选择性地区分出胰腺癌，在各种癌症中选择性地检测出胰腺癌，或在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断出胰腺癌。具体而言，用于诊断胰腺癌的组合物或试剂盒可用于从正常组中检测或区分出胰腺癌患者组，在1期或2期中诊断出胰腺癌(PDAC)——使用常规方法进行检测是困难的，从各种不同的癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌和/或甲状腺癌)或除癌症以外的各种胰腺疾病(例如，胰腺炎和胆囊炎)中选择性地区分出胰腺癌，或者甚至在CA19-9水平小于37U/ml的受试者(而正常受试者CA19-9水平小于36U/ml)或具有胰腺病症(例如，胰腺炎或胆囊炎)的患者中诊断出胰腺癌。
所述标记物基因可为三种以上的标记物基因的结合物。该结合物可包含：
(a)CA19-9(糖类抗原19-9)；
(b)LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，LRG1)；以及
(c)选自TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)、CLU(丛生蛋白前蛋白原)及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)的至少一种。
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含用于诊断胰腺癌的组合物。
根据一些实施方案，本公开内容提供了诊断受试者中的胰腺癌或提供关于胰腺癌的诊断结果的信息的方法，其包括：
从待进行胰腺癌发病诊断的受试者中获得样品；
测量包含以下的胰腺癌标记物的各蛋白或mRNA表达水平，所述标记物包括：(a)CA19-9、(b)LRG1以及(c)至少一种选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的标记物；
将所述胰腺癌标记物的表达水平与相应的正常对照的表达水平分别进行比较；以及
基于比较结果，确定受试者中胰腺癌的发病或发病的可能性。
在确定步骤中，用于确定胰腺癌易于高发的条件如下：在CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9的基因的mRNA表达水平方面，在LRG1的蛋白表达水平或编码LRG1的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者高于正常对照；并且在TTR的蛋白表达水平或编码TTR的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照；在C1R的蛋白表达水平或编码C1R的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者高于正常对照；在CLU的蛋白表达水平或编码CLU的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照；或在KLKB1的蛋白表达水平或编码KLKB1的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照。
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于选择性地诊断高危IPMN的组合物，其包含用于测量包含LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，LRG1)的IPMN标记物的表达水平的试剂。所述IPMN标记物还可包含选自CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR、C1R、CLU及KLKB1的至少一种。例如，所述IPMN标记物可为LRG1与选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少一种的结合物，或LRG1与选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少两种的结合物。
在具体的实施方案中，本公开内容提供了用于选择性诊断高危IPMN的组合物，其包含用于测量IPMN标记物蛋白的表达水平或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂，所述IPMN标记物蛋白包含CLU(丛生蛋白前蛋白原)和选自LRG1(富含亮氨酸α-2-糖蛋白1，LRG1)、CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)的至少一种。例如，所述IPMN标记物是CLU与选自LRG1、CA19-9、TTR、C1R和KLKB1的至少一种的结合物，或LRG1与选自LRG1、CA19-9、TTR、C1R和KLKB1的至少两种的结合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供用于诊断高危IPMN的方法，其包括：
测量受试者样品中的IPMN标记物蛋白的表达水平，或编码所述标记物蛋白的基因的mRNA表达水平，
将所测得的受试者样品和对照样品的各个标记物的表达水平进行比较；以及
基于表达水平的比较结果，确定受试者中高危IPMN的发病风险。
有益效果
如上所述，根据本公开内容的胰腺癌的诊断标记物可用于在早期预测或诊断胰腺癌的发病、发病的可能性及严重性。所述标记物还可用于胰腺癌肿瘤发生的研究。此外，本公开内容的诊断方法允许以无创性(non-invasive)方式在样品(例如血液)中方便地检测胰腺癌。
附图说明
图1是表示对照组和胰腺癌患者组中的CA19-9蛋白的表达水平的图，如通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)所测得的。
图2是表示对照组和胰腺癌患者组中的LRG1蛋白的表达水平的图，如通过MRM试验所测得的。
图3是表示对照组和胰腺癌患者组中的TTR蛋白的表达水平的图，如通过MRM试验所测得的。
图4是表示对照组和胰腺癌患者组中的C1R蛋白的表达水平的图，如通过MRM试验所测得的。
图5是表示对照组和胰腺癌患者组中的CLU蛋白的表达水平的图，如通过MRM试验所测得的。
图6是表示对照组和胰腺癌患者组中的KLKB1蛋白的表达水平的图，如通过MRM试验所测得的。
图7是表示对照组和胰腺癌患者组中的LRG1蛋白的表达水平的图，如通过ELISA所测得的。
图8是表示对照组和胰腺癌患者组中的TTR蛋白的表达水平的图，如通过ELISA所测得的。
图9是表示对照组和胰腺癌患者组中的CLU蛋白的表达水平的图，如通过ELISA所测得的。
图10是表示对照组和胰腺癌患者组中的TTR蛋白的表达水平的图，如通过免疫比浊试验所测得的。
图11示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫试验(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
图12示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
图13示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
图14示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
图15示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。
图16示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。
图17示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。
图18示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。
图19示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。分别通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)、ELISA及免疫比浊测定对CA19-9蛋白、LRG1蛋白及TTR蛋白进行定量分析。
图20示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。分别通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)、ELISA及免疫比浊测定对CA19-9蛋白、LRG1蛋白及TTR蛋白进行定量分析。
图21示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。分别通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)、ELISA及免疫比浊测定对CA19-9蛋白、LRG1蛋白及TTR蛋白进行定量分析。
图22示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和TTR的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。分别通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)、ELISA及免疫比浊测定对CA19-9蛋白、LRG1蛋白及TTR蛋白进行定量分析。
图23示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和C1R的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。
图24示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和C1R的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。
图25示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和C1R的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。
图26示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和C1R的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。
图27示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。
图28示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。
图29示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。
图30示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。
图31示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。
图32示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。
图33示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。
图34示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和CLU的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。
图35示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。
图36示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于诊断早期胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。
图37示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于从其他癌症中区分出胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。
图38示出了将三种标记物CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物与单独的CA19-9及两种标记物CA19-9和TTR的结合物用于在CA19-9水平小于37U/ml的受试者中诊断胰腺癌的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。
图39示出了将LRG1与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1进行MRM定量分析。
图40至44示出了将两种蛋白的结合物(LRG1+CA19-9)、(LRG1+TTR)、(LRG1+CLU)、(LRG1+C1R)或(LRG1+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，对而LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图45至48示出了将三种蛋白的结合物(LRG1+CA19-9+TTR)、(LRG1+CA19-9+CLU)、(LRG1+CA19-9+C1R)或(LRG1+CA19-9+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图49至54示出了将三种蛋白的结合物(LRG1+TTR+CLU)、(LRG1+TTR+C1R)、(LRG1+TTR+KLKB1)、(LRG1+CLU+C1R)、(LRG1+CLU+KLKB1)或(LRG1+C1R+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图55至57示出了将两种蛋白的结合物(CLU+CA19-9)、(CLU+TTR)或(CLU+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图58至63示出了将三种蛋白的结合物(CLU+CA19-9+TTR)、(CLU+CA19-9+C1R)、(CLU+CA19-9+KLKB1)、(CLU+TTR+C1R)、(CLU+TTR+KLKB1)或(CLU+C1R+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图64示出了将LRG1与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1进行MRM定量分析。
图65至69示出了将两种蛋白的结合物(LRG1+CA19-9)、(LRG1+TTR)、(LRG1+CLU)、(LRG1+C1R)或(LRG1+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图70至73示出了将三种蛋白的结合物(CA19-9+LRG1+TTR)、(CA19-9+LRG1+C1R)、(CA19-9+LRG1+CLU)或(CA19-9+LRG1+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图74至79示出了将三种蛋白的结合物(LRG1+TTR+CLU)、(LRG1+TTR+C1R)、(LRG1+TTR+KLKB1)、(LRG1+CLU+C1R)、(LRG1+CLU+KLKB1)或(LRG1+C1R+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图80至83示出了将两种蛋白的结合物(CLU+CA19-9)、(CLU+TTR)、(CLU+C1R)或(CLU+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图84至89示出了将三种蛋白的结合物(CLU+CA19-9+TTR)、(CLU+CA19-9+C1R)、(CLU+CA19-9+KLKB1)、(CLU+TTR+C1R)、(CLU+TTR+KLKB1)或(CLU+C1R+KLKB1)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行MRM定量分析。
图90示出了将LRG1与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1进行ELISA。
图91至93示出了将两种蛋白的结合物(LRG1+CA19-9)、(LRG1+TTR)或(LRG1+CLU)与单独的CA19-9用于诊断出与低危IPMN区分的高危IPMN的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行ELISA。
图94至97示出了将(LRG1+CA19-9+TTR)、(LRG1+CA19-9+CLU)、(LRG1+CA19-9+TTR+CLU)或(LRG1+TTR+CLU)组合标记物与单独的CA19-9用于诊断出将高危IPMN与低危IPMN区分的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行ELISA。
图98至100示出了将(CLU+CA19-9)、(CLU+TTR)或(CLU+CA19-9+TTR)组合标记物与单独的CA19-9用于将高危IPMN与低危IPMN区分的性能(AUC和检测灵敏度)进行比较。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1、TTR、CLU、C1R和KLKB1进行ELISA。
具体实施方式
本文所用的术语“胰腺癌”意指胰腺中的细胞产生的癌症(癌)或恶性肿瘤。有多种类型的胰腺肿瘤，从可通过手术切除而治愈的良性肿瘤到预后非常差的恶性肿瘤。良性肿瘤、恶性肿瘤以及转变成恶性肿瘤的良性肿瘤均包括在胰腺肿瘤的范围内。至于胰腺的恶性肿瘤，这类肿瘤的90％是胰腺导管腺癌(PDAC)。因此，胰腺导管腺癌在狭义上被称为胰腺癌。胰腺癌的其他实例包括神经内分泌肿瘤和腺泡细胞瘤。此外，胰腺肿瘤可为囊性肿瘤的形式，如由浆液性囊性肿瘤、黏液性囊性肿瘤、胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)和固体假***状瘤代表性地表示。
具体地，胰腺癌可以是胰腺导管腺癌或IPMN。胰腺导管腺癌可由于各种原因而产生。例如，胰腺导管腺癌可能衍生自IPMN或可能会与IPMN无关而产生。或者，胰腺导管腺癌可排除IPMN衍生的胰腺导管腺癌。
根据WHO的肿瘤分类，IPMN被定义为上皮细胞在主胰管或其分支胰管内以***状形式生长而成的肿瘤(瘤状物)，其特征在于肿瘤细胞产生粘稠液体并从胰管扩散至囊肿。
IPMN具有包括以下的形貌特性：主胰管的弥漫型扩张、粘液或肿瘤块的非典型充盈缺损、分支胰管的囊性扩张、***孔的扩张，以及粘蛋白通过***孔大量渗出。在组织学上，IPMN的特征是产生粘蛋白的上皮细胞在胰管内的***状增殖，并且表现出从良性肿瘤到恶性肿瘤的广谱的疾病。根据肿瘤的部位和病变的范围，IPMN可分为三种在临床上不同的亚型：主胰管型、分支胰管型及混合型。
确定IPMN预后的因素包括侵袭性、***转移、血管浸润、组织学发现及切除边缘上的组织学发现。尤其，最重要的是侵袭性。IPMN在侵袭性癌症发生之前是一种可治愈的疾病，但在出现侵袭后剩余胰腺或额外胰腺组织中的复发率高达50-90％。由于IPMN甚至在治愈性切除后还有可能在剩余胰腺中复发，因此需要长期跟踪，并采取间歇性适当治疗来增加存活率。
因此，IPMN的恶性评估对于确定随后的预后和治疗方法非常重要。通常，IPMN的恶性程度由手术后的微观组织检查按递升顺序分为低度非典型增生、中度非典型增生、高度非典型增生以及与侵袭性癌相关的IPMN。浸入邻近基质中的侵袭性癌可为导管腺癌或黏液非囊性癌(胶样癌)的形式，它们均是胰腺癌中最常见的形式。
在本公开内容中，提供了方法、组合物以及试剂盒，其用于将IPMN区分为高度非典型增生和侵袭型(例如，恶性亚型或高危IPMN)，以及低度和中度非典型增生(例如，低危IPMN)。根据本公开内容，与胰腺癌相关的的标记物可用于区分高危IPMN与低危IPMN。
此外，本公开内容提供了用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含胰腺癌的诊断组合物。具体地，例如，所述试剂盒可为RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白质芯片试剂盒、快速试剂盒、或MRM(多反应监测)试剂盒。
本文所用的术语“诊断”旨在涵盖确定受试者对某种疾病或病症的易感性、确定受试者是否患有某种疾病或病症、确定患有某种疾病或病症的受试者的预后(例如鉴定癌症的转移前状态或转移状态、确定癌症的阶段或癌症对治疗的响应)或治疗度量(therametrics)(例如，监测受试者的状态以提供关于治疗功效的信息)。具体地，本文所用的诊断意指确定胰腺癌的发病或发病的可能性(风险性)。
本文所用的术语“标记物”、“生物标记物”或“诊断标记物”意指允许区分正常和疾病状态、或能够使治疗结果被预测或客观测量的标记。具体地，在与胰腺癌相关的上下文中，标记物意指在患胰腺癌或有胰腺癌发病风险的受试者中，相比于正常对照(未患胰腺癌的受试者)，其蛋白或基因表达水平显著升高或降低的有机生物分子，例如多肽或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖、二糖、寡糖等)等。
本公开内容提供了用于诊断胰腺癌的组合物，其包含：(1)用于测量CA19-9(糖类抗原19-9)的蛋白或mRNA表达水平的试剂，(2)用于测量LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)的蛋白或mRNA表达水平的试剂，以及(3)用于测量至少一种选自以下的标记物的蛋白或mRNA表达水平的试剂：TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)、CLU(丛生蛋白前蛋白原)以及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)。
利用至少三种不同标记物基因(例如，(a)CA19-9；(b)LRG1；以及(c)选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种)的结合物，本公开内容可有效地诊断受试者的胰腺癌发病或发病的可能性。
本公开内容中可用作胰腺癌诊断标记物的CA19-9蛋白通常在确定消化***癌症预后中用作肿瘤标记物。
作为适用于本公开内容的另一个胰腺癌诊断标记物，LRG1蛋白参与了与子宫内膜癌及肺癌的发病相关的血管生成。LRG1可为NCBI登录号#NP_443204.1。
可用于本公开内容的胰腺癌的其他诊断标记物可为选自以下的至少一种：TTR、C1R、CLU和KLKB1。TTR是一种具有同源四聚体结构(每个亚基由127个氨基酸残基组成)的血清蛋白，并且作为甲状腺激素的脑脊液载体发挥作用。所述蛋白与阿尔茨海默病、乳腺癌、卵巢癌和胃癌的发病有关。CIR——是在补体***的补体中首个发现的补体——部分地负责机体免疫，并与阿尔茨海默病和肾癌的发病有关。CLU用于阻止血液中的蛋白凝聚(coagulation)，并且与阿尔茨海默病和肺癌有关。KLKB参与血液凝聚，并且与高血压和肺癌有关。
在本公开内容具体的一些实施方案中，TTR可为NCBI登录号#NP_000362.1，C1R可为NCBI登录号#NP_001724.3，CLU可为NCBI登录号#NP_001822.3，以及KLKB1可为NCBI登录号#NP_000883.2。
发明人以表1中所示的方式，对比健康对照者的血清样品，分析了患有胰腺导管腺癌(PDAC)、胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)或慢性胆囊炎患者的血清样品，并最终建立了CA19-9、LRG1与TTR、C1R、CLU及KLKB1中至少一种的结合物的功效。
[表1]
在胰腺癌的情况下，本文所用的术语“测量蛋白表达水平”意指检测和鉴定生物样品中胰腺癌的诊断标记物(蛋白)或编码所述标记物的基因的存在和表达水平。
用于测量或比较分析蛋白的方法的实例包括，但不限于，蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹法及ELISA(酶联免疫吸附试验)。
在根据本公开内容用于诊断胰腺癌的组合物中，用于测量CA19-9、LRG1、TTR、C1R、CLU或KLKB1的蛋白表达水平的试剂可包含可特异性结合至蛋白CA19-9、LRG1、TTR、C1R、CLU或KLKB1的抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体。
本文所用的术语“抗体”是指特异性结合抗原以引发抗原-抗体反应的物质。对于本公开内容的目的，术语“抗体”意指特异性结合至CA19-9蛋白、LRG1蛋白、TTR蛋白、C1R蛋白、CLU蛋白或KLKB1蛋白的抗体。落入本公开内容的抗体范围的是多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。这些抗体可使用本领域熟知的技术容易地制得。例如，如本领域中熟知的，可通过将作为抗原的胰腺癌标记物注入动物中并从所述动物获得含有抗体的血清而制备多克隆抗体。多克隆抗体可使用任何动物(例如，山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛、狗等)而制得。单克隆抗体可通过杂交瘤方法(Kohler和Milstein(1976)European Journal ofImmunology 6：511-519)，或噬菌体抗体库技术(Clackson等人，Nature，352：624-628，1991；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：58，1-597，1991)获得。所述抗体可使用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等来进行分离和纯化。此外，适用于本公开内容的抗体可以是由两条全长轻链和两条全长重链组成的完整抗体，或是完整抗体分子的功能片段。术语抗体分子的“功能片段”意指保留抗体结合功能的片段，例如Fab、F(ab′)、F(ab′)2及Fv。
如本文所用的术语“PNA(肽核酸)”是指与DNA或RNA相似的人工合成的聚合物，1991年由Nielsen、Egholm、Berg和Buchardt(丹麦哥本哈根大学)教授首次引入。DNA具有磷酸-核糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。由于这种结构，PNA显著增强DNA或RNA的结合亲合性及稳定性，因此有效地用于分子生物学研究、诊断和反义疗法。对于PNA的详细说明，可参考文献[Nielsen PE，Egholm M，Berg RH，Buchardt O(1991年12月).″Sequence-selective recognition of DNA by stranddisplacement with a thymine-substituted polyamide″.Science 254(5037)：1497-1500]。
本文所用的“适体”是结合至特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。对于适体的详细说明，可参考文献[Bock LC等人，Nature 355(6360)：5646(1992)；Hoppe-Seyler F，Butz K″Peptide aptamers：powerful new tools for molecular medicine″.J Mol Med.78(8)：42630(2000)；Cohen BA，Colas P，Brent R.″An artificial cell-cycle inhibitorisolated from a combinatorial library″.Proc Natl Acad Sci USA.95(24)：142727(1998)]。
在胰腺癌的情况下，本文所用的术语“测量mRNA表达水平”意指检测和鉴定生物样品中编码诊断标记物(蛋白)的基因的mRNA的存在和表达水平。
在本公开内容中，可用于测量mRNA表达水平的分析方法的实例包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定(RPA)、RNA印迹法和DNA芯片，但不限于此。
在根据本公开内容的用于诊断胰腺癌的组合物中，用于测量编码CA19-9、LRG1、TTR、C1R、CLU或KLKB1的基因的mRNA表达水平的试剂包含与编码CA19-9、LRG1、TTR、C1R、CLU或KLKB1的基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。关于CA19-9、LRG1、TTR、C1R、CLU或KLKB1蛋白的信息可从UniProt获得，并且本领域技术人员可基于该信息设计与编码所述蛋白的基因的mRNA特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。
如本文所用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述”引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但并不引起与靶基因序列不一致或不互补的非靶序列的扩增。
本文所用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针均可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA，最优选PNA。具体而言，所述探针是可来自生物或可在活体外合成的生物材料或其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、DNA或RNA。所述DNA可包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸。基因组RNA、mRNA和寡核苷酸也可落入所述RNA的范围内。所述蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。
本文所用的术语“反义寡聚体”是指具有核苷酸碱基序列和亚基-亚基骨架的寡聚体，所述骨架允许反义寡聚体通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交，以在所述靶序列中形成RNA：寡聚体异源双链核酸分子。所述寡聚体可具有与所述靶序列精确或接近的序列互补性。
此外，本公开内容提供了用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含用于诊断胰腺癌的组合物。例如，所述试剂盒可为RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或MRM(多反应监测)试剂盒。
当使用包含CA19-9、LRG1和选自TTR、C1R、CLU及KLKB1中的至少一种的胰腺标记物的结合物时，根据本公开内容用于诊断胰腺癌的组合物或包含该组合物的试剂盒在诊断性能方面远远优于使用两种标记物CA19-9和LRG1的组合物或试剂盒。
用于诊断胰腺癌的试剂盒还可包含至少一种适用于分析的其他元件组成(elemental composition)、溶液或装置。
例如，所述诊断试剂盒还可包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的序列的核酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10至30bp。此外，所述试剂盒还可包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物。另外，所述RT-PCR试剂盒可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水，和无菌水。
此外，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物，及用于构建荧光标记的探针的反应物、试剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA试剂盒可包含特异性针对蛋白的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。另外，所述ELISA试剂盒还可包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)及其底物或能够结合所述抗体的物质。
在一些实施方案中，用于根据本公开内容诊断胰腺癌的组合物或包含本公开内容的组合物的诊断试剂盒可用于区分正常受试者与患有早期(1期或2期)胰腺癌的患者以及患有严重胰腺癌的患者。
因此，本公开内容体提供了用于诊断1期或2期胰腺癌的组合物，其包含(a)用于测量CA19-9的表达水平的试剂，(b)用于测量LRG1的表达水平的试剂，以及(c)用于测量选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种的表达水平的试剂。
另外，本公开内容的用于诊断胰腺癌的组合物或包含本公开内容的组合物的诊断试剂盒可用于选择性地区分胰腺癌患者与患有不同癌症的患者以及正常受试者。因此，本公开内容提供了用于区分胰腺癌与其他癌症的组合物，其包含(a)用于测量CA19-9的表达水平的试剂，(b)用于测量LRG1的表达水平的试剂，以及(c)用于测量选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种的表达水平的试剂。
此外，利用本公开内容的胰腺癌诊断组合物或试剂盒，本公开内容提供了在受试者中诊断胰腺癌或提供关于胰腺癌诊断结果的信息的方法。所述方法包括以下步骤：
从待进行胰腺癌发病诊断的受试者中获得样品；
测量包含以下的胰腺癌标记物的各自蛋白或mRNA表达水平：(a)CA19-9、(b)LRG1以及(c)选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少一种；
将胰腺癌标记物的表达水平分别与相应的正常对照的表达水平进行比较，所述胰腺癌标记物包括：(a)CA19-9、(b)LRG1以及(c)选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少一种；以及
基于比较结果，确定受试者中胰腺癌的发病或发病的可能性。
如在用于诊断胰腺癌或提供关于胰腺癌的诊断信息的方法的上下文中使用的术语“受试者”是指待进行胰腺癌发病检查的受试者，其包括胰腺癌患者、疑似患有胰腺癌的受试者以及未患胰腺癌的正常受试者。例如，将进行PDAC医学检查、无临床胰腺癌确诊史的健康受试者，或尽管切除了肿瘤、由于胰腺癌过往病史而定期检查的受试者，落入所述受试者的范围。在一个实施方案中，所述受试者可为哺乳动物，而在另一个实施方案中可为人类。
在确定受试者中胰腺癌的发病或发病可能性的步骤中，基于比较结果，用于确定胰腺癌高度易发的条件如下：在CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9的基因的mRNA表达水平方面，在LRG1的蛋白表达水平或编码LRG1的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者高于正常对照；并且在TTR的蛋白表达水平或编码TTR的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照；在C1R的蛋白表达水平或编码C1R的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者高于正常对照；在CLU的蛋白表达水平或编码CLU的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照；或在KLKB1的蛋白表达水平或编码KLKB1的基因的mRNA表达水平方面，待进行胰腺癌发病检查的受试者低于正常对照。
如与所述方法结合使用的术语“样品”是指随着胰腺癌的发病，蛋白或基因表达水平不同的生物样品，并且所述样品的实例包括组织、细胞、血清、血浆、唾液、脑脊液和尿液，优选血液、血清或血浆。
由于与正常对照相比，胰腺癌患者的CA19-9蛋白和LRG1蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的mRNA表达水平升高，TTR蛋白、CLU蛋白及KLKB1蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的mRNA表达水平降低，以及C1R蛋白的表达水平或编码该蛋白的基因的mRNA表达水平升高，因此胰腺癌发病的可能性可通过测量胰腺癌标记物的各蛋白表达水平或编码该蛋白的基因的mRNA表达水平来确定，所述胰腺癌标记物包括：(a)CA19-9、(b)LRG1以及(c)至少一种选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的标记物。
例如，当被检测的受试者的CA19-9和LRG1蛋白表达水平或mRNA表达水平比正常对照高，并且TRR蛋白表达水平或mRNA表达水平比正常对照低时，可确定该受试者胰腺癌发病的可能性高。
表述或短语“待进行胰腺癌发病检查的受试者在CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9的基因的mRNA表达水平方面高于正常对照”意指如通过多种方法所测量的，待进行胰腺癌发病检查的受试者的CA19-9蛋白的蛋白表达水平或编码CA19-9蛋白的基因的mRNA表达水平是正常对照的1.0、1.5、2、3、5或10倍。该含义适用于LRG1或C1R的蛋白水平或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平。
表述或短语“待进行胰腺癌发病检查的受试者在TTR的蛋白表达水平或编码CA19-9的基因的mRNA表达水平方面低于正常对照”意指如通过多种方法所测量的，待进行胰腺癌发病检查的受试者的TTR蛋白的蛋白表达水平或编码TTR蛋白的基因的mRNA表达水平是正常对照的0.1、0.2、0.3、0.5或1倍。该含义适用于CLU或KLKB1的蛋白水平或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平。
在一些实施方案中，可根据胰腺癌诊断公式决定“确定胰腺癌高度易发”，如通过以下公式1所示例的。
[公式1]
其中，
x是胰腺癌诊断标记物的表达水平测量值，
αi是SVM中的拉格朗日乘数，
yi是正常组/胰腺癌组的分离系数，
xi是参考测量值，以及
b是校正值。
此函数衍生自SVM(支持向量机)。SVM是被设计以基于拉格朗日最优化理论评估满足给定条件的函数的算法。其中，使用最大间隔分类器进行分类分析的情况被称为SVC(支持向量分类机)。当将CA19-9，LRG1，以及TTR、C1R、CLU和KLKB1中任一个的相对MRM测量值应用于此函数时，函数值为1则诊断为胰腺癌发病的高可能性，而函数值为-1则说明为正常状态。
根据本公开内容的方法，基于通过将CA19-9，LRG1，以及TTR、C1R、CLU和KLKB1中的任一种的蛋白或mRNA表达水平应用于所述胰腺癌诊断公式而得到的结果可容易地确定胰腺癌发病的可能性。
尽管由SVM构建，所述诊断函数可由多种类型的区别分析构成，包括机器学习，例如神经网络、随机森林等。
此外，本公开内容提供了用于诊断胰腺癌的方法，其包括(a)从待进行胰腺癌发病诊断的受试者中获得样品；(b)测量样品中CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9蛋白的基因的mRNA表达水平，及LRG1的蛋白表达水平或编码LRG1蛋白的基因的mRNA表达水平；(c)测量样品中选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种的蛋白表达水平，或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平；以及(d)通过将步骤(b)和(c)的测量值应用于以下公式1来确定胰腺癌发病的可能性：
[公式1]
其中，x是胰腺癌的诊断标记物CA19-9、LRG1，及TTR、C1R、CLU和KLKB1中任一个的表达水平测量值，αi是SVM中的拉格朗日乘数，yi是正常组/胰腺癌组的分离系数，xi是参考测量值，以及b是校正值。
在本公开内容的方法中，可使用特异性结合至相应蛋白的各抗体来测量和比较蛋白表达水平。允许所述抗体与生物样品中的相应蛋白形成抗原-抗体复合物并检测所述复合物。
本文所用的术语“抗原-抗体复合物”意指其中抗原与识别所述抗原的抗体结合的复合物，其被用于确定生物样品中是否存在相应的基因。抗原-抗体复合物的检测可使用本领域熟知的方法实现，例如光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学法、光化学法、化学法等。
出于本公开内容的目的，蛋白表达的测量或比较可使用本领域熟知的方法实现，其实例包括但不限于：蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹法、和ELISA(酶联免疫吸附试验)。
在本公开内容中，LC-MRM可用于测量和比较CA19-9、LRG1、C1R、CLU和KLKB1蛋白的表达水平。
简言之，生物样品中的靶蛋白可通过LC进行分离，所述分离使用LC分析柱，并使用浓度梯度为95∶5至15∶85的含95体积％蒸馏水、5体积％乙腈和0.1体积％甲酸的溶液以及含5体积％蒸馏水、95体积％乙腈和0.1体积％甲酸的溶液。由于某些物质的解析度可随溶液的混合比而变化，因而设定了浓度梯度。所述梯度范围对于同时分离多种蛋白是最佳的。首先，使用溶液A(95体积％蒸馏水、5体积％乙腈和0.1体积％甲酸)使柱平衡10分钟，然后使用溶液B(5体积％蒸馏水、95体积％乙腈、0.1％体积甲酸)以5％至85％的浓度梯度对肽洗脱50分钟，并以85％的浓度对肽洗脱5分钟。
对于质谱分析，MRM(多反应监测)以MS/MS模式进行。SIM(选择性离子监测)利用碰撞到质谱仪的离子源而形成的离子，而MRM利用从已经碎裂的离子中选出特定离子然后使其再次碰撞串联的不同的MS源后而产生的离子。SIM的问题在于如果所选择的定量离子与在血清中检测到的离子相同，则其可能干扰定量分析。另一方面，当离子再次碰撞时，尽管它们与未碰撞的离子具有相同的质量，但它们的分子结构与未碰撞的离子不同，它们表现出不同的特征。因此，使用这类离子去除背景中的噪声峰，以使MRM允许甚至更清楚的基线。此外，合成稳定的同位素标准(SIS)肽并与靶肽对比测量，从而使得以更高的灵敏度同时对所需物质进行精确分析。
使用以上分析方法，可比较正常对照和疑似有胰腺癌发病的受试者之间的蛋白水平，并且评估胰腺癌标记物的蛋白表达水平的显著升高以确定胰腺癌发病的可能性。
可用于测量和比较编码CA19-9、LRG1、C1R、CLU及KLKB1蛋白的各基因的mRNA表达水平的分析方法包括但不限于：RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定、RNA印迹法和DNA芯片。使用所述分析方法，可测量与正常对照相比疑似受试者的胰腺癌标记物的mRNA表达水平，以诊断或预测胰腺癌的发病可能性。
此外，本公开内容提供了提供用于胰腺癌诊断的信息的方法，其包括：(a)从待进行胰腺癌发病诊断的受试者中获得样品；(b)测量样品中CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9蛋白的基因的mRNA表达水平，及LRG1的蛋白表达水平或编码LRG1蛋白的基因的mRNA表达水平；(c)测量样品中选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种的蛋白表达水平，或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平；以及(d)将样品中CA19-9的蛋白表达水平或编码CA19-9蛋白的基因的mRNA表达水平，及LRG1的蛋白表达水平或编码LRG1蛋白的基因的mRNA表达水平与正常对照中的表达水平进行比较；以及(e)将样品中选自TTR、C1R、CLU和KLKB1中的至少一种的蛋白表达水平，或编码所述蛋白的基因的mRNA表达水平与正常对照中的表达水平进行比较。
在根据本公开内容的用于诊断胰腺癌的标记物、组合物、试剂盒以及方法中，胰腺癌可为IPMN，特别为高危IPMN。所述组合物可用于区分高危IPMN与低危IPMN，或用于选择性诊断与正常组、患有除IPMN或胰腺导管腺癌以外的胰腺疾病的患者或患有低危IPMN的对照组区分的高危IPMN。所述高危IPMN可包括高度非典型增生和侵袭型IPMN。此外，所述高危IPMN可包括IPMN衍生的胰腺导管腺癌。
在一些实施方案中，本公开内容提供了选择性诊断高危IPMN的组合物，其包含用于测量IPMN(胰腺导管内***状黏液肿瘤)标记物的表达水平或编码所述标记物的基因的mRNA表达水平的试剂，所述IPMN标记物包括LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)。所述IPMN标记物还可包含至少一种选自CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR、C1R、CLU及KLKB1中的标记物。例如，所述IPMN标记物可为LRG1与选自TTR、C1R、CLU及KLKB1中的一种的结合物，或LRG1与选自TTR、C1R、CLU及KLKB1中的两种的结合物。
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于选择性诊断高危IPMN的组合物，其包含用于测量IPMN标记物蛋白的各表达水平或编码所述IPMN标记物蛋白的基因的各mRNA表达水平的试剂，所述IPMN标记物蛋白包含CLU(丛生蛋白前蛋白原)；以及选自LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，LRG1)、CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)的至少一种。
根据一些实施方案，本公开内容提供了用于诊断高危IPMN的方法，其包括：
测量受试者样品中的IPMN标记物蛋白的各表达水平或编码所述蛋白的基因的各mRNA表达水平，
将所述表达水平测量值与对照标记物的表达水平进行比较，以及
基于所述标记物表达水平的比较结果，确定受试者中高危IPMN的发病可能性。
在进行测量步骤前，所述方法可还包括检查受试者是否患有IPMN。这个检查可通过影像学诊断或活检，或利用遗传标记物来进行。例如，所述影像学诊断包括，但并不限于，腹部超声、计算机断层扫描(CT)、内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)、磁共振胰胆管造影(MRCP)及超声内镜(EUS)。适用于所述检查的生物标记物可为CA19-9，其是公众熟知的胰腺癌诊断标记物。所述活检可为FNA(细针穿刺)活检。
当对照为正常组、患有除IPMN或胰腺导管腺癌以外的胰腺疾病的患者或患有低危IPMN的患者时，使用IPMN标记物可诊断出高危IPMN患者，以与正常状态及各种其他胰腺疾病区分。此外，当对照为低危IPMN患者时，则可选择性地诊断出高危IPMN，以与低危IPMN区分。
当受试者被确定为具有高危IPMN时，则所述方法还可包括进行处理措施，例如手术切除、给药等。
当受试者被确定为具有低危IPMN时，则所述方法还可包括进行处理措施，例如给药、预后监测等。
IMPN标记物、表达水平的测量值以及确定的详细说明如以上所述。
通过以下实施例可获得对本发明的更好的理解，这些实施例只是用于说明而不应被解释为限制本发明。
实施例1：实验样品的制备
为发掘适用于诊断胰腺癌的蛋白结合物，经患者的同意，从5家医院中患有胰腺癌、其他癌症、胰腺炎或胆囊炎的患者组，以及从正常组获得样品，如表2及表3中所示。
对于区分PDAC的试验1，用正常组、胰腺炎组以及胆囊炎组作为对照，同时对胰腺癌(PDAC)患者进行分组。
使用1期或2期胰腺癌(PDAC)患者的样品来进行区分早期PDAC的试验2，同时用正常人及胰腺炎或胆囊炎患者作为对照。
设计试验3用于癌症/胰腺癌选择。在这方面，实验组由胰腺癌样品组成，同时对照包含其他癌症的样品，即54例乳腺癌、45例结直肠癌以及53例甲状腺癌。
在试验4中，在CA19-9不能在临床上起作用的条件下区分出PDAC。对照包括CA19-9水平小于37U/ml的正常组、胰腺炎组及胆囊炎组，同时用CA19-9水平小于37U/ml的胰腺癌(PDAC)组作为实验组。
[表2]
[表3]
-AMC：Asan医疗中心
-NCC：国家癌症中心
-SMC：三星医疗中心
-SNUH：首尔国立大学医院
-YMC：Yonsei医疗中心
*所有试验均使用从训练集中扣除的分类器来进行。
实施例2：通过MRM-MS进行胰腺癌诊断标记物的发掘和性能分析
<2-1>血液样品的预处理
使用消耗柱(depletion column)耗尽40μl的各血液样品中最丰富的7种蛋白，并经3kDa过滤器浓缩残余物。通过BCA对浓缩液进行定量。从所述浓缩液中取出相当于200μg的血浆，用6M尿素使其变性，用20mM DTT和50mM碘乙酸使其还原并烷基化。通过使用胰蛋白酶以50∶1(蛋白∶胰蛋白酶，w/w)的比例在37℃下处理16小时将蛋白分解为肽，使用C18OASIS柱(Waters，美国)使所述肽脱盐并将其冻干。在进行MRM分析之前，将冻干物溶解于溶液A(98％蒸馏水、2％乙腈、0.1％甲酸)中。
<2-2>转换选择
为了进行MRM分析，选择具有某种蛋白(Q1)的荷质比(m/z)特征的肽。此外，在通过电碰撞从所述肽中产生的多种碎片离子中，选择具有某种蛋白的m/z特征的离子(Q3)。将其中组合了某种蛋白的离子特征的Q1与Q3的结合物指定为转换(transition)。将通过Q1和Q3中的特征离子连续经过高分辨率(三级-四极)质谱仪而获得的信号简化为定量信息，用于定量分析。使用美国华盛顿大学医学院(University of Washington School ofMedicine，Seattle，Washington，USA)的MacCoss研究小组研发的软件SKYLine，基于NIST(美国国家标准与技术研究院)的肽串联质谱，对于由ms/ms提供的肽，每种蛋白选择最多达10种肽。肽的长度为至少7个氨基酸至最多达24个氨基酸。
然而，从可由胰蛋白酶作用产生的总的肽中，具有以下氨基酸或基序(motif)的肽由于信号条件差而被排除：
当甲硫氨酸存在于目的肽中时，它在体内易于被ROS(活性氧簇)氧化，从而增加32Da的质量；
当组氨酸存在于目的肽中时，R基团的正电荷可改变所述目的肽的电荷状态；
目的肽中存在的NxS/T基序可能经过N-糖基化，导致质量值的改变；
当目的肽中脯氨酸残基紧随R或K残基之后存在时，错误裂解可发生在R或K位点，所述位点可被胰蛋白酶切割。
对于前体电荷，选择电荷为+2的肽，将+1的电荷用作离子电荷，其具有y离子型。使用Protein Blast P和Skyline来选择不同的转换和肽。最终，使用落入预期保留时间(RT)范围的转换。对于RT预期，进行600SIS肽的MRM分析，并基于使用疏水性范围和RT色谱图的分析结果绘制校准曲线。
<2-3>LC和MRM
对于LC分析，采用Agilent Technologies的1260-毛细管LC，其装配有用于肽分离的毛细管RR 0.5×150 3.5μm柱。样品的注入量为5μl，流速为20μl/min。首先，使用溶液A(95体积％蒸馏水、5体积％乙腈、0.1体积％甲酸)使柱平衡10分钟，然后使用溶液B(5体积％蒸馏水、95体积％乙腈、0.1％体积甲酸)以5％至85％的浓度梯度对肽洗脱50分钟以及以85％的浓度对肽洗脱5分钟。
使用Agilent Technologies的三级四极质谱仪6490-QQQ，以MRM模式监测所选择的蛋白的转换。为补偿批次之间的偏差，同时监测每个样品所掺有的5fmol β-半乳糖苷酶肽(GDFQFNISR[C13N15]，547.3/646.4)。
<2-4>数据的定量分析
对于定量分析，将内标β-半乳糖苷酶肽(GDFQFNISR[C13N15]，547.3/646.4m/z)稀释至0.09、0.27、0.82、2.5、7.4、22.2、66.7和200fmol，并将基质用10μg血浆增补，如用于靶肽分析的条件中。也在不存在内标肽的情况下进行分析以确定内源性信号。将MRM定量在所有9个浓度点重复三次以构建标准曲线。
对于每个个体的MRM结果，使用SKYLine(MacCoss Lab，ver1.4.1)产生相应的MRM转换的提取离子色谱(XIC)，并计算各转换的峰面积并随时间制图。另外，合成并测量稳定同位素标准(SIS)肽。用标准物的XIC峰面积将各转换的XIC峰面积标准化，并基于所述标准化，进行各蛋白的定量分析。
基于MRM分析的结果，胰腺癌患者组中的由表1的方法推断出的四种标记物结合物中的蛋白显示出具有以下表达模式。
如图1和2中可以看出，相比于正常组，胰腺癌患者组中的CA19-9和LRG1的表达水平显著升高，因此选择CA19-9和LRG1作为胰腺癌诊断的标记物。
如图3至6中可以看出，相比于正常组，胰腺癌患者组中的TTR、CLU和KLKB1的表达水平特别地降低，而C1R的表达水平升高。
实施例3：通过ELISA进行诊断胰腺癌的蛋白结合物的发掘和性能分析
通过ELISA，测量胰腺癌组和正常组中的LRG1、TTR和CLU的表达水平。根据制造商的指示，IBL的hLRG1 ELISA用于LRG1，AssayPro的前白蛋白ELISA试剂盒用于TTR，并且R&DSystems的Human Clusterin Quantikine试剂盒用于CLU。
简言之，将ELISA试剂盒及样品置于室温下，然后将样品用稀释缓冲液进行稀释(LRG1：1,000倍；TTR：80,000倍；CLU：2,091倍)。在每个孔中加入50μl的各标准物、对照及样品，然后在室温下孵育2小时并向各孔施加封闭剂。除去溶液后用蒸馏水洗涤孔。反复洗涤四次。随后，将200μl的缀合物加入到各孔中，在室温下孵育2小时，并向各孔施加新鲜的封闭剂。用蒸馏水洗涤孔。这些操作再次重复四次。然后，将200μl底物溶液加入到各孔中，并在室温下孵育30分钟。向各孔中加入50μl终止液后，读取540nm或570nm处的吸收值，以计算浓度。
ELISA分析结果示于图7和图9中。与实施例2中MRM-MS的结果一致，观察到相比于正常组，胰腺癌患者组中的LRG1的蛋白表达水平特别地升高，而TTR和CLU的蛋白表达水平特别地降低。
实施例4：通过免疫比浊试验进行胰腺癌的发掘和性能分析
通过免疫比浊试验，测量胰腺癌组和正常组中TTR的蛋白表达水平。根据制造商的指示，使用Roche Diagnostics的COBAS INTEGRA 800 Prealbumin进行免疫比浊试验。
简言之，在开始试验前，将仪器和样品置于室温下。然后，将50μl的样品加入到各孔中，并用专用的稀释溶液稀释四倍。将200μl经稀释的样品加入到仪器，并由该仪器采集浓度输出值作为结果。
与实施例2和3中的MRM-MS和ELISA的结果一致，免疫比浊试验的结果表明，相比于正常组，胰腺癌患者组中的TTR的蛋白表达水平特别地降低，如图10中所理解的。
实施例5：通过MRM-MS测定CA19-9、LRG1及TTR的标记物结合物的诊断性能的试验
<5-1>CA19-9、LRG1及TTR的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1及TTR的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。使用Roche Diagnostics的COBAS Elecsys CA 19-9仪器通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
当使用胰腺癌诊断函数时，ROC曲线中的AUC和Sn|Sp＝0.9表示CA19-9、LRG1和TTR的结合物对胰腺癌的诊断性能。ROC曲线在2D平面上表示灵敏度和特异性之间的关系。曲线下更大的面积(AUC；0≤AUC≤1)代表更准确的信息。Sn|Sp＝0.9是在0.9的特异性下的灵敏度值，其显示出检测灵敏度。更高的Sn|Sp＝0.9值提供更准确的信息。
AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表4和图11中。
[表4]
标记物结合物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+TTR 0.9312 0.8250
CA19-9+LRG1 0.9305 0.8125
CA19-9+TTR 0.8823 0.7125
LRG1+TTR 0.8027 0.5375
CA19-9 0.8259 0.7250
LRG1 0.7104 0.4375
TTR 0.6573 0.1375
如表4和图11中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9312且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的CA19-9、LRG1和TTR，或其任何两种的结合物，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的胰腺癌诊断性能。
<5-2>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表5和图12中。
[表5]
如表5和图12中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9070且Sn|Sp＝0.9为0.7600，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的胰腺癌诊断性能。
<5-3>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表5和图13中。
如表5和图13中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8994且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<5-4>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区分 PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。在大多数临床病例中，当测量CA19-9为37U/ml或更高时，则确定受试者患有胰腺癌。因此，在CA19-9＜37U/ml的受试者中，CA19-9不能用作胰腺癌的诊断标记物。使用Roche Diagnostics的COBAS Elecsys CA 19-9仪器通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
当使用胰腺癌诊断函数时，ROC曲线中的AUC和Sn|Sp＝0.9表示CA19-9、LRG1和TTR的结合物对胰腺癌的诊断性能。ROC曲线在2D平面上表示灵敏度和特异性之间的关系。曲线下更大的面积(AUC；0≤AUC≤1)代表更准确的信息。Sn|Sp＝0.9是在0.9的特异性下的灵敏度值，其显示出检测灵敏度。更高的Sn|Sp＝0.9值提供更准确的信息。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表5和图14中。
如表5和图14中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8295且Sn|Sp＝0.9为0.5172，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例6：通过ELISA测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物的诊断性能的试验
检查ELISA是否会重现出实施例5中MRM-MS测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分胰腺癌的结果。如通过ELISA所测定的，也证实了CA19-9、LRG1和TTR的结合物对胰腺癌的优异诊断性能。
<6-1>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。
AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表6和图15中。
[表6]
如表6和图15中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9315且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<6-2>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表6和图16中。
如表6和图16中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9144且Sn|Sp＝0.9为0.7800，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的胰腺癌诊断性能。
<6-3>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表6和图17中。
如表6和图17中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8981且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<6-4>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区分 PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。在大多数临床病例中，当测量CA19-9为37U/ml或更高时，则确定受试者患有胰腺癌。因此，在CA19-9＜37U/ml的受试者中，CA19-9不能用作胰腺癌的诊断标记物。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表6和图18中。
如表6和图18中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8287且Sn|Sp＝0.9为0.5172，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例7：CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物的诊断性能的免疫比浊试验
检查免疫比浊试验是否会重现出实施例5中MRM-MS测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分胰腺癌的结果。如通过免疫比浊试验所测量的，也证实了CA19-9、LRG1和TTR的结合物对胰腺癌的诊断性能。
<7-1>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例4的免疫比浊试验，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行分析，通过ELISA对LRG1进行分析，并且通过免疫比浊试验对TTR进行分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表7和图19中。
[表7]
如表7和图19中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9402且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<7-2>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例4的免疫比浊试验，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行分析，通过ELISA对LRG1蛋白进行分析，并且通过免疫比浊试验对TTR进行分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表7和图20中。
如表7和图20中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9146且Sn|Sp＝0.9为0.7600，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<6-3>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例4的免疫比浊试验，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行分析，通过ELISA对LRG1蛋白进行分析，并且通过免疫比浊试验对TTR进行分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表7和图21中。
如表7和图21中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8965且Sn|Sp＝0.9为0.8250，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<7-4>CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区分 PDAC的诊断性能
使用实施例4的免疫比浊试验，测定CA19-9、LRG1和TTR的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。在大多数临床病例中，当测量CA19-9为37U/ml或更高时，则确定受试者患有胰腺癌。因此，在CA19-9＜37U/ml的受试者中，CA19-9不能用作胰腺癌的诊断标记物。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行分析，通过ELISA对LRG1蛋白进行分析，并且通过免疫比浊试验对TTR进行分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表7和图22中。
如表7和图22中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.8439且Sn|Sp＝0.9为0.5172，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例8：通过MRM-MS测定CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物的诊断性能的试验
<8-1>CA19-9、LRG1和PDAC的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。使用Roche Diagnostics的COBAS Elecsys CA 19-9仪器通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表8和图23中。
[表8]
标记物结合物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+C1R 0.9296 0.8375
CA19-9+TTR 0.8823 0.7125
CA19-9 0.8259 0.7250
如表8和图23中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和C1R的结合物的AUC为0.9296且Sn|Sp＝0.9为0.8375，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的CA19-9、LRG1和C1R，或其任意两种的结合物，CA19-9、LRG1和C1R的结合物具有更高的胰腺癌的诊断性能。
<8-2>CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表9和图24中。
[表9]
标记物结合物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+C1R 0.9097 0.7800
CA19-9+LRG1 0.9094 0.7400
CA19-9+C1R 0.8658 0.6600
LRG1+C1R 0.7297 0.3800
CA19-9 0.7924 0.6400
LRG1 0.6362 0.3800
C1R 0.5137 0.1400
如表9和图24中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和C1R的结合物的AUC为0.9097且Sn|Sp＝0.9为0.7800，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和C1R的结合物具有更高的用于早期胰腺癌的诊断性能。
<8-3>CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表10和图25中。
[表10]
如表10和图25中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和C1R的结合物的AUC为0.9088且Sn|Sp＝0.9为0.8375，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和C1R的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<8-4>CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区分 PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和C1R的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和C1R进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表10和图26中。
如表10和图26中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和C1R的结合物的AUC为0.8160且Sn|Sp＝0.9为0.5517，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和C1R的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例9：通过MRM-MS测定CA19-9、LRG1和CLU的诊断性能的试验
<9-1>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表11和图27中。
[表11]
标记物结合物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+CLU 0.9338 0.8500
CA19-9+LRG1 0.9305 0.8125
CA19-9+CLU 0.8662 0.7250
LRG1+CLU 0.8004 0.6125
CA19-9 0.8259 0.7250
LRG1 0.7104 0.4375
CLU 0.6456 0.2250
如表11和图27中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.9338且Sn|Sp＝0.9为0.8500，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的CA19-9、LRG1和CLU，或其任意两种的结合物，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于胰腺癌的诊断性能。
<9-2>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表12和图28中。
[表12]
如表12和图28中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.9027且Sn|Sp＝0.9为0.7800，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于早期胰腺癌的诊断性能。
<9-3>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表12和图29中。
如表12和图29中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.9093且Sn|Sp＝0.9为0.8500，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<9-4>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区分 PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表12和图30中。
如表12和图30中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.8384且Sn|Sp＝0.9为0.5862，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例10：通过ELISA测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物的诊断性能的试验
检查ELISA是否会重现出实施例9中MRM-MS测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分胰腺癌的结果。如通过ELISA所测定的，也证实了CA19-9、LRG1和CLU的结合物用于胰腺癌的优异诊断性能。
<10-1>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表13和图31中。
[表13]
标记物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+CLU 0.9399 0.8000
CA19-9+LRG1 0.9323 0.8000
CA19-9+CLU 0.8980 0.8000
LRG1+CLU 0.8607 0.5750
CA19-9 0.8259 0.7250
LRG1 0.8320 0.5750
CLU 0.7083 0.3000
如表13和图31中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.9399且Sn|Sp＝0.9为0.8000，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的CA19-9、LRG1和CLU，或其任意两种的结合物，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于胰腺癌的诊断性能。
<10-2>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表14和图32中。
[表14]
如表14和图32中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.9193且Sn|Sp＝0.9为0.6400，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于胰腺癌的诊断性能。
<10-3>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表14和图33中。
如表14和图33中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和TTR的结合物的AUC为0.9079且Sn|Sp＝0.9为0.8000，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<10-4>CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中区 分PDAC的诊断性能
使用实施例3的ELISA方法，测定CA19-9、LRG1和CLU的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行ELISA。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表14和图34中。
如表14和图34中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和CLU的结合物的AUC为0.8435且Sn|Sp＝0.9为0.4828，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和TTR的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例11：通过MRM-MS测定CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物的诊断性能的试验
<11-1>CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于区分PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表15和图35中。
[表15]
标记物 AUC Sn|Sp＝0.9
CA19-9+LRG1+KLKB1 0.9382 0.8625
CA19-9+LRG1 0.9305 0.8125
CA19-9+KLKB1 0.8744 0.7250
LRG1+KLKB1 0.8608 0.7000
CA19-9 0.8259 0.7250
LRG1 0.7104 0.4375
KLKB1 0.6076 0.1750
如表15和图35中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物的AUC为0.9382且Sn|Sp＝0.9为0.8625，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的CA19-9、LRG1和KLKB1，或其任意两种的结合物，CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物具有更高的用于胰腺癌的诊断性能。
<11-2>CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于区分早期PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于早期胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析测定(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表16和图36中。
[表16]
如表16和图36中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物的AUC为0.9148且Sn|Sp＝0.9为0.8000，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物具有更高的用于早期胰腺癌的诊断性能。
<11-3>CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于区分癌症/胰腺癌的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和CLU进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表16和图37中。
如表16和图37中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物的AUC为0.8924且Sn|Sp＝0.9为0.8625，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和CLU的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
<11-4>CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的试验组中 区分PDAC的诊断性能
使用实施例2的MRM-MS方法，测定CA19-9、LRG1和KLKB1的标记物结合物用于在CA19-9＜37U/ml的组中区分胰腺癌的诊断性能。通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和KLKB1进行MRM定量分析。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表16和图38中。
如表16和图38中所示，观察到本公开内容的CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物的AUC为0.8349且Sn|Sp＝0.9为0.6207，表明所述结合物作为胰腺癌的诊断标记物表现出优异的性能。特别地，观察到相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，CA19-9、LRG1和KLKB1的结合物具有更高的用于区分癌症与胰腺癌的诊断性能。
实施例12：胰腺癌的诊断——数据统计
<12-1>CA19-9+LRG1+TTR
对于统计分析，使用SVM(支持向量机)。SVM是被设计以基于拉格朗日最优化理论评估满足给定条件的函数的算法。在SVM中，使用最大间隔分类器进行分类分析的情况被称为SVC(支持向量分类)。在此实施例中，采用两个样品组之一。在样品组中，最大差异存在于两个组(正常组和胰腺癌组)之间的SVC来源于机器学习，并且被用于构建以下胰腺癌诊断函数。
其中，
x是胰腺癌诊断标记物的表达水平测量值，
αi是SVM中的拉格朗日乘数，
yi是正常组/胰腺癌组的分离系数，
xi是参考测量值，以及
b是校正值。
此公式的函数值为1时说明胰腺癌发病，函数值为-1时说明是正常状态。使用此函数确定胰腺癌的发病或发病的可能性。
具体而言，从三个正常人得到CA19-9的测量值及TTR和LRG1的MRM值分别如下：(7.4，1.451，3.2359)、(6.3，1.0718，2.136)和(26.1，1.2053，3.1797)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(7.4，1.451，3.2359)＝-1、f(6.3，1.0718，2.136)＝-1和f(26.1，1.2053，3.1797)＝-1，表明这三个人是正常的。
另外，从三个胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及TTR和LRG1的MRM值分别如下：(45318，4.898，1.2514)、(145，2.4608，1.6616)和(889，2.5153，1.5474)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(45318，4.898，1.2514)＝1、f(145，2.4608，1.6616)＝1和f(889，2.5153，1.5474)＝1，表明这三个人患有胰腺癌。
<12-2>CA19-9+LRG1+C1R
基于用于统计分析的SVM(支持向量机)，使用公式1确定胰腺癌的发病或发病的可能性。
从三个正常人得到CA19-9的测量值及LRG1和C1R的MRM值分别如下：(7.4，1.451，1.0748)、(6.3，1.0718，0.4531)和(26.1，1.2053，1.0929)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(7.4，1.451，1.0748)＝-1、f(6.3，1.0718，0.4531)＝-1和f(26.1，1.2053，1.0929)＝-1，表明这三个人是正常的。
另外，从三个胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及LRG1和C1R的MRM值分别如下：(45318，4.893，1.3742)、(145，2.4608，1.483)和(889，2.5153，1.474)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(45318，4.893，1.3742)＝1、f(145，2.4608，1.483)＝1和f(889，2.5153，1.474)＝1，表明这三个人患有胰腺癌。
<12-3>CA19-9+LRG1+CLU
基于用于统计分析的SVM(支持向量机)，使用公式1确定胰腺癌的发病或发病的可能性。从三个正常人得到CA19-9的测量值及LRG1和CLU的MRM值分别如下：(7.4，1.451，3.3803)、(6.3，1.0718，3.1325)和(26.1，1.2053，2.8642)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(7.4，1.451，3.3803)＝-1、f(6.3，1.0718，3.1325)＝-1和f(26.1，1.2053，2.8642)＝-1，表明这三个人是正常的。
另外，从三个胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及LRG1和CLU的MRM值分别如下：(45318，4.893，1.6821)、(145，2.4608，2.545)和(889，2.5153，1.5101)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(45318，4.893，1.6821)＝1、f(145，2.4608，2.545)＝1和f(889，2.5153，1.5101)＝1，表明这三个人患有胰腺癌。
<12-4>CA19-9+LRG1+KLKB1
基于用于统计分析的SVM(支持向量机)，使用公式1确定胰腺癌的发病或发病的可能性。从三个正常人得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(7.4，1.451，1.2801)、(6.3，1.0718，0.961)和(26.1，1.2053，1.5657)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(7.4，1.451，1.2801)＝-1、f(6.3，1.0718，0.961)＝-1和f(26.1，1.2053，1.5657)＝-1，表明这三个人是正常的。
另外，从三个胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(45318，4.893，0.555)、(145，2.4608，0.5347)和(889，2.5153，0.8084)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(45318，4.893，0.555)＝1、f(145，2.4608，0.5347)＝1和f(889，2.5153，0.8084)＝1，表明这三个人患有胰腺癌。
实施例13：早期胰腺癌的诊断——数据统计
基于用于统计分析的SVM(支持向量机)，使用公式1确定早期胰腺癌的发病。从三个正常人得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(7.4，1.451，1.2801)、(6.3，1.0718，0.961)和(26.1，1.2053，1.5657)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(7.4，1.451，1.2801)＝-1、f(6.3，1.0718，0.961)＝-1和f(26.1，1.2053，1.5657)＝-1，表明这三个人是正常的。
另外，从三个早期胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(154.52，4.0994，1.2722)、(190.16，4.5008，0.7645)和(1052.8，3.5696，0.6775)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(154.52，4.0994，1.2722)＝1、f(190.16，4.5008，0.7645)＝1和f(1052.8，3.5696，0.6775)＝1，表明这三个人是早期胰腺癌患者。
实施例14：从其他癌症中区分诊断出胰腺癌——数据统计
基于用于统计分析的SVM(支持向量机)，使用公式1确定早期胰腺癌的发病。从三个胰腺癌以外的癌症患者得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(8，1.3985，0.7085)、(10.68，0.9864，0.776)和(7.32，1.1431，0.9214)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(8，1.3985，0.7085)＝-1、f(10.68，0.9864，0.776)＝-1和f(7.32，1.1431，0.9214)＝-1，由此这三个人可确定为患有胰腺癌以外的癌症。
另外，从三个胰腺癌患者得到CA19-9的测量值及LRG1和KLKB1的MRM值分别如下：(280.72，4.0849，0.9165)、(4000，5.7558，0.7216)和(120.32，6.2917，0.555)。当将这些值应用于所述公式时，计算各函数值为f(154.52，4.0994，1.2722)＝1、f(190.16，4.5008，0.7645)＝1和f(1052.8，3.5696，0.6775)＝1，表明这三个人患有胰腺癌。
实施例15：实验样品的制备
为了有效地检测IPMN的恶性亚型，将首尔国立大学医院中的知情同意的患者分成以下各组，包括正常组、试验组(高危组)等，如以下表17中所示。
[表17]
在试验5中，将高度非典型增生和侵袭型IPMN用作恶性(高危)亚型IPMN试验组，而将正常人、低度非典型增生IPMN患者、中度非典型增生IPMN患者以及有良性肿瘤的胆囊炎患者分到对照组。
用于检测是否可通过MMS测定来相互区分高危组和低危组的试验6，使用恶性(高危)亚型IPMN试验组(由高度非典型增生和侵袭型IPMN组成)和低危组(由低度非典型增生IPMN和中度非典型增生IPMN组成)来进行。
用于检测是否可通过ELISA测定来相互区分高危组和低危组的试验7，使用恶性(高危)亚型IPMN试验组(由高度非典型增生和侵袭型IPMN组成)和低危组(由低度非典型增生IPMN和中度非典型增生IPMN组成)来进行。[表17]
实施例16：通过MRM-MS检测高危IPMN
使用实施例2的MRM-MS，测定以下表32的标记物用于区分高危IPMN的诊断性能。使用Roche Diagnostics的COBAS Elecsys CA19-9仪器通过化学发光酶免疫分析(CLEIA)对CA19-9蛋白进行定量分析，而对LRG1和TTR进行MRM定量分析。
当以与所述胰腺癌诊断函数相同的方式使用胰腺癌诊断函数时，ROC曲线中的AUC和Sn|Sp＝0.9表示CA19-9、LRG1和TTR的结合物对胰腺癌的诊断性能。ROC曲线在2D平面上表示灵敏度和特异性之间的关系。曲线下更大的面积(AUC；0≤AUC≤1)代表更准确的信息。Sn|Sp＝0.9是在0.9的特异性下的灵敏度值，其显示出检测灵敏度。更高的Sn|Sp＝0.9值提供更准确的信息。
AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表18和图39至63中。
[表18]
如表18和图39至63中所示，观察到本公开内容的单独的标记物或其任意两种以上的结合物具有选择性诊断与对照区分的高危IPMN的优异性能。特别地，证实了相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，本公开内容的标记物的结合物对高危IPMN具有更高的诊断性能。
实施例17：通过MRM-MS在高危IPMN和低危IPMN之间进行选择性诊断
为了区分高危IPMN与低危IPMN，以与实施例16的MMS测定基本相同的方式进行以下表33中所示的试验。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表19和图64至89中
[表19]
如表19和图64至89中所示，观察到本公开内容的单独的标记物或其任意两种以上的结合物具有选择性区分高危IPMN与低危IPMN的优异性能。特别地，证实了相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，本公开内容的标记物的结合物对高危IPMN具有更高的诊断性能。
实施例18：通过MRM-MS在高危IPMN和低危IPMN之间进行选择性诊断
检查ELISA是否会重现出实施例17中MRM-MS测定标记物结合物用于区分胰腺癌的结果。如通过ELISA所测定的，也证实了表20的标记物结合物对高危IPMN的优异诊断性能。
为了区分实施例15的试验7的高危IPMN与低危IPMN，以与实施例6的ELISA基本上相同的方式进行以下表20中所示的试验。AUC和Sn|Sp＝0.9的测量值列于表34和图90至100中。
[表20]
如表20和图90至100中所示，观察到本公开内容的单独的标记物或其任意两种以上的结合物具有选择性区分高危IPMN与低危IPMN的优异性能。特别地，证实了相比于单独的市售诊断标记物CA19-9，本公开内容的标记物的结合物对高危IPMN具有更高的诊断性能。

Claims (49)

1.一种用于诊断胰腺癌的组合物，其包括
(a)用于测量CA19-9(糖类抗原19-9)的蛋白表达水平，或编码CA19-9蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂；
(b)用于测量LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)的蛋白表达水平，或编码LRG1蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂；以及
(c)用于测量至少一种标记物的蛋白表达水平，或编码至少一种标记物的各基因的mRNA表达水平的试剂，所述标记物选自TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)、CLU(丛生蛋白前蛋白原)及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)。
2.权利要求1的组合物，其中胰腺癌的诊断是从正常组中选择性地区分出胰腺癌，在各种癌症中选择性地诊断出胰腺癌，或诊断出CA19-9小于37U/ml的胰腺癌。
3.权利要求1的组合物，其中所述胰腺癌为胰腺导管腺癌或高危胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)。
4.权利要求3的组合物，其中所述胰腺导管腺癌处于1期或2期。
5.权利要求3的组合物，其中所述胰腺导管腺癌不是来源于IPMN。
6.权利要求1的组合物，其中所述LRG1蛋白包括NCPI登录号：NP_443204.1的氨基酸序列，所述TTR蛋白包括NCPI登录号：NP_000362.1的氨基酸序列，所述C1R蛋白包括NCPI登录号：NP_001724.3的氨基酸序列，所述CLU蛋白包括NCPI登录号：NP_001822.3的氨基酸序列，并且所述KLKB1蛋白包括NCPI登录号：NP_000883.2的氨基酸序列。
7.权利要求1的组合物，其中所述用于测量蛋白表达水平的试剂包括抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体，所有这些均可特异性结合至所述蛋白。
8.权利要求1的组合物，其中所述用于测量mRNA表达水平的试剂包括引物、探针或反义核苷酸，所有这些均特异性结合至编码所述蛋白的基因的mRNA。
9.一种用于诊断胰腺癌的试剂盒，其包含权利要求1至8中任一项的组合物。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述试剂盒是RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或MRM(多反应监测)试剂盒。
11.一种用于诊断胰腺癌的方法，其包括：
测量受试者样品中的至少三种胰腺癌标记物蛋白的蛋白表达水平，或编码所述标记物蛋白的各基因的mRNA表达水平，
在所述受试者样品与正常组样品之间比较各标记物的测量的表达水平；以及
基于所述表达水平的比较结果，确定所述受试者中胰腺癌的发病风险，
其中至少三种胰腺癌标记物蛋白包括(a)CA19-9(糖类抗原19-9)、(b)LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，LRG)及(c)选自TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)、CLU(丛生蛋白前蛋白原)及KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)的至少一种。
12.权利要求11的方法，其中当满足以下条件时，则确定受试者中胰腺癌的发病：
受试者的(a)CA19-9和(b)LRG1的表达水平均高于正常对照；以及
受试者的(c)TTR、CLU和KLKB1中的至少一种中的任一种的表达水平低于正常对照，或受试者的C1R的表达水平高于正常对照。
13.权利要求11的方法，其中胰腺癌的确定步骤包括将所述标记物的表达水平应用于公式1，并且基于公式1的计算结果，确定胰腺癌的发病的可能性：
<公式1>
f ( x ) = sgn ( &Sigma; i = 1 n &alpha; i y i < x , x i > + b )
x是胰腺癌诊断标记物的表达水平测量值，
αi是SVM中的拉格朗日乘数，
yi是正常组/胰腺癌组的分离系数，
xi是参考测量值，以及
b是校正值。
14.权利要求11的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。
15.权利要求11的方法，其中所述蛋白表达水平的测量使用可分别特异性结合至相应蛋白的抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体。
16.权利要求11的方法，其中mRNA表达水平的测量或比较通过使用选自以下的至少一种来进行：蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹法及ELISA(酶联免疫吸附试验)。
17.权利要求11的方法，其中mRNA表达水平的测量通过使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定、RNA印迹法和DNA芯片来进行。
18.权利要求11的方法，其中所述胰腺癌具有变成胰腺导管腺癌(PDAC)的可能性。
19.权利要求18的方法，其中所述胰腺导管腺癌是IPMN衍生的胰腺导管腺癌。
20.权利要求11的方法，其中胰腺癌的诊断是从正常组中选择性地区分出胰腺癌，在各种癌症中选择性地诊断出胰腺癌，或者诊断出CA19-9小于37U/ml的胰腺癌。
21.权利要求20的方法，其中胰腺癌的诊断是选择性地区分出胰腺癌与至少一种选自胰腺炎和胆囊炎的胰腺疾病。
22.权利要求11的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌或高危胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)。
23.一种用于选择性诊断高危IPMN的组合物，其包括用于测量包括LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1)的胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)标记物的表达水平或编码所述标记物蛋白的基因的mRNA表达水平的试剂。
24.权利要求23的组合物，其中所述组合物用于选择性区分高危IPMN与低危IPMN。
25.权利要求23的组合物，其中所述IPMN标记物还包括选自CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少一种。
26.权利要求25的组合物，其中所述IPMN标记物包括LRG1和选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少一种。
27.权利要求25的组合物，其中所述IPMN标记物包括LRG1和选自TTR、C1R、CLU和KLKB1的至少两种。
28.一种用于选择性地诊断高危IPMN的组合物，其包括用于测量IPMN标记物的蛋白表达水平或编码所述标记物蛋白的各基因的mRNA表达水平的试剂，所述IPMN标记物包括CLU(丛生蛋白前蛋白原)和选自LRG1(富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1，LRG1)、CA19-9(糖类抗原19-9)、TTR(甲状腺素转运蛋白，ATTR，前白蛋白，TBPA)、C1R(补体C1r亚成分前体)和KLKB1(血浆激肽释放酶蛋白)的至少一种。
29.权利要求28的组合物，其中所述IPMN标记物是CLU与选自LRG1、CA19-9、TTR、C1R和KLKB1的至少一种的结合物。
30.权利要求28的组合物，其中所述IPMN标记物是CLU与选自LRG1、CA19-9、TTR、C1R和KLKB1的至少两种的结合物。
31.权利要求26至30中任一项的组合物，其中所述LRG1蛋白包括NCPI登录号：NP_443204.1的氨基酸序列，所述TTR蛋白包括NCPI登录号：NP_000362.1的氨基酸序列，所述C1R蛋白包括NCPI登录号：NP_001724.3的氨基酸序列，所述CLU蛋白包括NCPI登录号：NP_001822.3的氨基酸序列，及所述KLKB1蛋白包括NCPI登录号：NP_000883.2的氨基酸序列。
32.权利要求23或28的组合物，其中所述用于测量表达水平的试剂包括抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体，所有这些均特异性结合至所述蛋白。
33.权利要求23或28的组合物，其中所述用于测量mRNA表达水平的试剂包括引物、探针或反义核苷酸，所有这些均特异性结合至所述基因。
34.一种用于选择性地诊断高危IPMN的试剂盒，其包括权利要求26至30中任一项的组合物。
35.权利要求34的试剂盒，其中所述试剂盒是RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或MRM(多反应监测)试剂盒。
36.一种用于诊断高危IPMN的方法，其包括：
测量受试者样品中的权利要求26至30中任一项的用于选择性诊断IPMN的组合物的胰腺导管内***状黏液肿瘤(IPMN)标记物蛋白的表达水平，或编码所述标记物蛋白的基因的mRNA表达水平，
在所述受试者样品与对照样品之间比较各标记物的测量的表达水平；以及
基于所述表达水平的比较结果，确定受试者中高危IPMN的发病风险。
37.权利要求36的方法，其还包括在进行所述测量步骤之前，检查所述受试者是否患有IPMN。
38.权利要求37的方法，其中所述检查步骤通过影像学诊断或活检，或者利用遗传标记物来进行。
39.权利要求36的方法，其中所述受试者是其中IPMN组织已通过手术切除而移除的患者。
40.权利要求36的方法，其中所述对照是正常组、患有除胰腺导管腺癌以外的胰腺疾病的患者，或患有低危IPMN的受试者。
41.权利要求36的方法，其中所述高危IPMN包含高度非典型增生和侵袭型IPMN。
42.权利要求36的方法，当确定所述受试者患有高危IPMN时，所述方法还包括进行手术切除或给药。
43.权利要求38的方法，当确定所述受试者患有低危IPMN时，所述方法还包括给药或预后监测。
44.权利要求36的方法，其中当满足以下条件时，确定是高危IPMN的发病：受试者的(a)CA19-9和(b)LRG1的表达水平均高于正常对照；并且
受试者的(c)TTR、CLU和KLKB1中的至少一种的任一种的表达水平低于正常对照，或受试者的C1R的表达水平高于正常对照。
45.权利要求36的方法，其中所述高危IPMN包括IPMN衍生的胰腺导管腺癌。
46.权利要求36的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆。
47.权利要求36的方法，其中所述标记物的表达水平的测量使用可分别特异性结合至相应标记物蛋白的抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体。
48.权利要求36的方法，其中所述标记物的表达水平的测量或比较通过使用选自以下的至少一种来进行：蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测定、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白质印迹法和ELISA(酶联免疫吸附试验)。
49.权利要求36的方法，其中mRNA表达水平的测量通过使用以下来进行：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定、RNA印迹法和DNA芯片。
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