CN109085359A - 血清蛋白标志物组合在结直肠癌筛查和诊治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学、临床检测技术领域,涉及蛋白组合物,其包含选自CA19‑9、CEA、HGF、IP‑10、MIP‑1β和SDF‑1α中任意的两种、三种、四种、五种或六种。本发明还涉及与蛋白组合物中的蛋白特异性结合的配体组合物,以及所述蛋白组合物或配体组合物在制备结直肠癌筛查、辅助诊断、治疗监测和预后判断试剂盒中的应用。本发明可用于结直肠癌的筛查、辅助诊断、治疗监测和预后判断,尤其是早期结直肠癌的筛查和辅助诊断,其敏感性优于单一蛋白标志物以及临床常用血清标志物CA19‑9和CEA的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和临床检测技术领域,具体地,涉及包含选自CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白的标志物组合,以及所述标志物组合在制备结直肠筛查、辅助诊断、治疗监测和预后判断血清标志物试剂盒中的应用。
背景技术
结直肠癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一,对人类健康和生命构成极大威胁。在我国,根据国家癌症中心的最新数据,中国2012年新发结直肠癌33.13万,发病率为24.47/106;死亡病例为15.93万,死亡率为11.77/106,其发病率和死亡率分别位居第四位和第五位。大多数患者在确诊时已属于中晚期,晚期结直肠癌患者术后的5年生存率约为12.5%,而早期患者的5年生存率可达90.3%,因此早诊早治可有效降低结直肠癌患者的死亡率。当前,结直肠癌的治疗方式仍以手术为主,同时辅助放化疗。结直肠癌手术效果明显,但仍有较多患者没有手术的机会,是死亡率上升最快的消化道肿瘤。大多数结直肠癌起源于腺瘤性癌前病变,经典的结直肠癌分子模型指出,多数结直肠癌的发生发展存在正常结直肠粘膜增生、腺瘤形成、腺瘤癌变、侵入性癌的演变过程。
随着医学研究的不断深入,肿瘤标志物逐步成为临床上可辅助肿瘤诊断的重要参考指标。肿瘤标志物在肿瘤的普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效以及高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。肿瘤标志物具有简便、灵敏、特异、无创、可动态观察等优点,对肿瘤患者相关基因及蛋白进行检测,是目前临床上较常用的早期辅助诊断方法。因此,研发出可用于结直肠癌筛查和早期辅助诊断的生物标志物,提高检出水平和早期诊断率,使结直肠癌患者得到及时合理的处理,可显著降低死亡率,并延长患者术后五年生存率,具有非常重要的临床意义。
粪便潜血实验(FOBT)目前是一种简单且经济的筛查手段,但其敏感度较低,不适合于不出血的肿瘤患者,且普查的依从性和普查效率仍较低,造成大量的结直肠癌早期患者漏诊等现象。目前诊断结直肠癌的金标准为纤维肠镜下对病变组织进行活检和病理组织学检查,但单纯依靠局部活检病理组织对肿瘤癌变程度难以提出准确的判断,也易造成腺瘤早期癌变的漏诊,且由于其侵入性和价格的原因,难以人群筛查中普遍使用。
目前临床上常见的结直肠癌血清标志物包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA19-9)等,但这些肿瘤标志物检测其敏感性和特异性均很有限。鉴于此,本领域迫切需要研发出可用于结直肠癌筛查、辅助诊断、治疗监测和预后判断的血清标志物或标志物组合,以提高结直肠癌的诊断率和检出率,改善结直肠癌的整体预后水平。另一方面,本领域也迫切需要研发出可用于结直肠癌早期辅助诊断的标志物或标志物组合,以期可以有效地检测早期结直肠癌,提高早诊早治效果。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动,得到了一种蛋白组合物。本发明人惊奇地发现,该蛋白组合物能够用于结肠癌和/或直肠癌的筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断,并且具有良好的敏感性和/或特异性。由此提供了下述发明:
本发明的一个方面涉及一种蛋白组合物,其包含选自CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白中的任意至少两种、三种、至少四种或至少五种。在本发明的一些实施方案中,所述蛋白组合物包含其中的任意五种或六种。
在本发明的一个或多个实施方案中,所述的蛋白组合物,其包含CA19-9和CEA;可选地,所述蛋白组合物还包含选自HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种、三种或四种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和HGF,以及选自IP-10、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种或三种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和IP-10,以及选自HGF、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种或三种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和MIP-1β,以及选自IP-10、HGF和SDF-1α中任意的一种、两种或三种。
在本发明的一些实施方案中,所述蛋白组合物包含如下蛋白或者由如下蛋白组成:
(1)CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白;
(2)CA19-9、CEA、HGF、IP-10和SDF-1α蛋白;
(3)CA19-9、CEA、HGF、MIP-1β和SDF-1α蛋白;
(4)CA19-9、CEA、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白;
(5)CA19-9、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白;
(6)CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白或者
(7)CA19-9、CEA、HGF、IP-10和MIP-1β蛋白。
在本发明中,所述蛋白组合物为可作为标志性蛋白的组合物,用于结直肠癌的检测,具体包括结直肠癌的筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断。所述蛋白组合物也可称为蛋白组合、标志物组合物或标志物组合。当成为标志物组合物或标志物组合时,各蛋白视为标志物。各蛋白或各标志物可以混合在一起,也可以不混合,例如独立包装。所述蛋白组合物也可简称为组合物;在本发明的一些实施方式中,所述组合物为一种用于结直肠癌的筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断的组合物。
本发明的另一方面涉及一种配体组合物,其为与本发明的蛋白组合物中所述的蛋白特异性结合的配体的组合物,用于检测所述的蛋白组合物。所述配体组合物能够用于结直肠癌的检测,具体包括结直肠癌的筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断。所述配体组合物也可称为配体组合。
在本发明中,所述配体是与本发明的蛋白组合物中的蛋白特异性结合的分子。本发明的配体可以是核酸、多肽(包括抗体)或化合物。在本发明的一些实施方案中,所述配体为抗体例如单克隆抗体。抗体可以是人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体或其抗原结合片段或者多克隆抗体。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒,其包含本发明的配体组合物。
本发明的另一方面涉及本发明的蛋白组合物或配体组合物在制备结直肠癌筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断试剂盒中的用途。
在本发明中,所述试剂盒用于血清样本的筛查、辅助诊断、治疗监测和/或预后判断。在本发明的实施方案中,所述血清样品为结直肠癌患者和/或正常人血清样本。
一种筛查结直肠癌、诊断例如辅助诊断结直肠癌、结直肠癌治疗监测或结直肠癌预后判断的方法,包括检测本发明的蛋白组合物的步骤。如果至少两种蛋白的检测结果为阳性,判断为结直肠癌样本。
在本发明中,所述判断方法为,当本发明的配体组合物中的至少两种配体与待测样品反应呈现阳性时,即判断为结直肠癌样本。在本发明的一些实施方式中,根据蛋白(标志物)浓度作为阳性和阴性的评判标准,定义为Cut-off值;蛋白浓度大于Cut-off值的样品记为阳性,小于Cut-off值的样品记为阴性。在本发明的一些实施方式中,六个蛋白(标志物)浓度的Cut-off值分别为:3.51ng/ml(CA19-9)、1.95ng/ml(CEA)、376.76pg/ml(HGF)、33.79pg/ml(IP-10)、53.88pg/ml(MIP-1β)、273.04pg/ml(SDF-1α)。
检测蛋白标志物的方法涉及通过与蛋白质特异性抗体的相互作用进行检测。例如可以如本文所述使用针对蛋白标志物的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂(其中包含该蛋白的抗体)。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体,或者可以使用购买的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体,或优选是单克隆抗体。
可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样品与抗体一起孵育,并通过熟知技术ELISA检测结合抗体。
可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样品与抗体一起孵育,并通过熟知技术ELISA检测结合抗体。
在本发明的实施方案中,制备样本方法、ELISA方法和阳性判断标准如下:
(1)制备样本:
所有入组患者及正常对照均空腹抽取5ml外周静脉血,加入非抗凝采血管中,采集后室温静置30分钟,进行血清分离。之后室温离心,将血清移入新的离心管中,编号,并置于-80℃冰箱保存待测。在最终检测前避免反复冻融。
(2)ELISA:各蛋白的具体检测方法如下:
(a)CA19-9:在使用前将所有的试剂和所需的板条在室温中放置30min。溶解标准品和质控品,配制洗涤液,将实验所需数目的板条固定在板架上。将50μl标准品、质控品和血清样品加入相应的检测孔中,彻底混合。每孔加入50μl的缓冲液,室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗4次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl的酶联物(此为CA19-9的抗体,其上偶联了可以分解底物的酶),室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗4次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl底物液,在室温下避光放置30分钟。每孔加入100μl终止液终止反应。在加终止液后10分钟内,室温下,使用酶标仪于450nm处读取吸光率。
(b)NSE:在使用前将所有的试剂和所需的板条在室温中放置30min。溶解标准品和质控品,配制洗涤液,将实验所需数目的板条固定在板架上。将50μl标准品、质控品和血清样品加入相应的检测孔中,彻底混合。每孔加入100μl稀释后的酶联物(此为NSE的抗体,其上偶联了可以分解底物的酶),在室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗3次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl底物液,在室温下避光放置30分钟。每孔加入100μl终止液终止反应。在加终止液后5分钟内,室温下,使用酶标仪于450nm处读取吸光率。
(c)HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α:标准品复溶及收集(向抗原标准品小管中每管加入样品50μl特异性缓冲液1×Mniversal Assay Buffer复溶标准品。将抗原标准品小管置于冰上10分钟以确保完全复溶。将每个小管的全部内容物收集至一个小管中,并添加1×Mniversal Assay Buffer至250μl)。制备4倍稀释标准品(离心管标注1~8备用,向1号管中加入200μl复溶抗原标准品,向2~8号管中加入150μl 1×Mniversal Assay Buffer。从1号管中取50μl加入2号管中,混匀,重复上此步骤直至7号管中有标准品,8号管为空白孔)。每孔加入50μl磁珠液。清洗磁珠(将96孔板固定在手持式磁珠清洗机上,并确保96孔板卡好,静置2min,以使磁珠积聚于每孔板底。倒置,以弃掉96孔板中的液体并拍净残留液。每孔加入150μl 1×Wash Buffer并静置2min,以使磁珠积聚于每孔板底。倒置,以弃掉96孔板中的液体并拍净残留液。将96孔板从手持式磁珠清洗机上取下)。加样并孵育(每孔加入25μl 1×Mniversal Assay Buffer,随后每孔加入25μl准备好的标准品或者样品。贴上封板膜并盖上黑色微孔板盖,500r/min室温孵育120分钟)。清洗96孔板。加入检测抗体并孵育(每孔加入25μl 1×Detection Antibody Mixture。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育30分钟。清洗96孔板。加入SAPE并孵育(每孔加入50μl SAPE。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育30分钟)。清洗96孔板。在Luminex仪器上读取数据(每孔加入120μl Reading Buffer。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育5分钟。移去封板膜,于Luminex仪器读取96孔板数据)。
(3)阳性判断标准:根据蛋白浓度作为阳性和阴性的评判标准,定义为Cut-off值。蛋白浓度大于Cut-off值的样品记为阳性,小于Cut-off值的样品记为阴性。上述六个蛋白浓度的Cut-off值分别为:3.51ng/ml(CA19-9)、1.95ng/ml(CEA)、376.76pg/ml(HGF)、33.79pg/ml(IP-10)、53.88pg/ml(MIP-1β)、273.04pg/ml(SDF-1α)。
本发明中,术语“结直肠癌”,如果没有特别说明,是指结肠癌或直肠癌,也可指结肠癌和直肠癌。在下面的实施例中,仅指结肠癌或直肠癌。
在本发明中:
CA19-9是糖抗原的一种,在结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌等肿瘤中的阳性率较高。
CEA为癌胚抗原,是结直肠癌组织产生的一种糖蛋白,作为抗原可引起患者的免疫反应。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物,是结直肠癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤的辅助诊断、疗效判断、病情发展、监测和预后评估的标志物。
HGF为干细胞生长因子,能够调节细胞的生长、分化、运动、促进肝细胞生长。HGF/c-Met信号通路的激活可诱发肿瘤的侵袭及转移。
IP-10为趋化因子的一种,可由IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α等诱导产生。IP-10高表达的食管癌、骨肉瘤患者预后相对较差,其还可促进胃癌细胞的侵袭迁移。
MIP-1β为巨噬细胞炎症因子,对多种免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞及树突状细胞等均具有显著趋化作用。在结直肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤中表达升高,促进肿瘤的侵袭和转移。
SDF-1α为基质细胞衍生因子-1,属于趋化因子家族,其活化与肿瘤的侵袭、转移和化疗敏感性相关。
在本发明中,当提及上述任一个蛋白的氨基酸序列时,其包括该蛋白的全长,还包括其融合蛋白。然而,本领域技术人员理解,在所述蛋白的氨基酸序列中,可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换,缺失和/或添加),而不影响其生物学功能。在本发明的一个实施方案中,该蛋白为人蛋白。
上述蛋白具有本领域技术人员所知悉的含义,其具体氨基酸序列可以采用本领域技术人员知悉的手段获得,例如参考NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)中的ID号:CEA(1048),HGF(3082),IP-10(3627),MIP-1β(6351),SDF-1α(6387)。
本发明中,术语“敏感性”是指由金标准(临床常规的组织病理学诊断方法)确诊患病的病例组内所检测出阳性病例数的比率(%),即本实验诊断的真阳性率。敏感性=真阳性病例数/病例组总病例数。
本发明中,术语“特异性”是指由金标准(临床常规的组织病理学诊断方法)确诊为无病的对照组内所检测出阴性人数的比率(%),即本诊断实验的真阴性率。特异性=真阴性人数/对照组总人数。
本发明中,所述结直肠癌优选为早期结直肠癌即I期和/或II期的结直肠癌。
根据UICC(国际抗癌联盟)发布的第八版的恶性肿瘤的TNM分期。结直肠癌的分期通常由三个基本分期要素组成,即T分期、N分期、M分期。由这三个要素,共同决定最后的分期。这是目前通用的分期方法。T分期:T指肿瘤原发灶的情况,随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加,依次用T1~T4来表示。N分期:N指区域***受累情况。***未受累时,用N0表示。随着***受累程度和范围的增加,依次用N1~N2表示。M分期:M指远处转移(通常是血道转移),没有远处转移者用M0表示,有远处转移者用M1表示。
本发明中,术语“I期结直肠癌”包括T1N0M0和T2N0M0期。
本发明中,术语“II期结直肠癌”包括T3N0M0、T4aN0M0和T4bN0M0。
发明的有益效果
本发明取得了如下技术效果中的一种或多种:
(1)本发明提供了一种可有效检测结直肠癌血清蛋白组合物,该组合具有以下特征:(a)在结直肠癌患者血清中的水平相对较高;(b)在正常人血清中的水平相对较低。
(2)本发明利用抗体联合检测样品中的CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α蛋白,可以有效检测结直肠癌,其敏感高于使用任意一个单一蛋白标志物以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的检测结果。
(3)本发明的方法能够显著提高早期结直肠癌的检出率,有利于结直肠癌患者早发现、早治疗,提高结直肠癌患者的生存率。
附图说明
图1A-图1F:结直肠癌患者及正常人血清标志物ELISA检测。
从图1A-图1F可以看出,CA19-9(图1A)、CEA(图1B)、HGF(图1C)、IP-10(图1D)、MIP-1β(图1E)和SDF-1α(图1F)六个蛋白在结直肠癌患者血清样本中的水平高于正常人血清样本。
图2A-图2F:结肠癌患者及正常人血清标志物ELISA检测。
从图2A-图2F可以看出,CA19-9(图2A)、CEA(图2B)、HGF(图2C)、IP-10(图2D)、MIP-1β(图2E)和SDF-1α(图2F)六个蛋白在结肠癌患者血清样本中的水平高于正常人血清样本。
图3A-图3F:直肠癌患者及正常人血清标志物ELISA检测。
从图3A-图3F可以看出,CA19-9(图3A)、CEA(图3B)、HGF(图3C)、IP-10(图3D)、MIP-1β(图3E)和SDF-1α(图3F)六个蛋白在直肠癌患者血清样本中的水平高于正常人血清样本。
图4A-图4F:结直肠癌患者手术前后血清标志物ELISA检测。从图4A-图4F可以看出,CA19-9(图4A-图4B)、CEA(图4C-图4D)、IP-10(图4E-图4F)蛋白在结直肠癌患者手术后血清样本中的水平明显降低。其中:
图4A为结直肠癌患者术前术后CA199血清水平均值的差异;图4B为同一患者术前术后CA199血清水平的变化,每条直线的左端和右端分别为病人术前和术后CA199的血清水平。
图4C为结直肠癌患者术前术后CEA血清水平均值的差异;图4D为同一患者术前术后CEA血清水平的变化,每条直线的左端和右端分别为病人术前和术后CEA的血清水平。
图4E为结直肠癌患者术前术后IP-10血清水平均值的差异;图4F为同一患者术前术后IP-10血清水平的变化,每条直线的左端和右端分别为病人术前和术后IP-10的血清水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
下面的实施例中,检测CA19-9和CEA使用的ELISA试剂购自DRG(德国)公司,货号分别为EIA5069和EIA1868;检测HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α使用的多因子联合检测试剂订制于eBioscience(美国)公司,货号为EPX070-19451-801(此为本研究专门订制产品,因此该公司的现有产品中无此产品)。
下面的实施例中,制备样本方法、免疫组织化学方法和评分标准如下:
(1)ELISA:各蛋白的具体检测方法如下:
(a)CA19-9和NSE:在使用前将所有的试剂和所需的板条在室温中放置30分钟。溶解标准品和质控品,配制洗涤液,将实验所需数目的板条固定在板架上。将50μl标准品、质控品和血清样品加入相应的检测孔中,彻底混合。每孔加入50μl的缓冲液,室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗4次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl的酶联物(此为CA19-9的抗体,其上偶联了可以分解底物的酶),室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗4次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl底物液,在室温下避光放置30分钟。每孔加入100μl终止液终止反应。在加终止液后10分钟内,室温下,使用酶标仪于450nm处读取吸光率。
(b)NSE:在使用前将所有的试剂和所需的板条在室温中放置30分钟。溶解标准品和质控品,配制洗涤液,将实验所需数目的板条固定在板架上。将50μl标准品、质控品和血清样品加入相应的检测孔中,彻底混合。每孔加入100μl稀释后的酶联物(此为NSE的抗体,其上偶联了可以分解底物的酶),在室温下震荡孵育60分钟。快速弃去检测孔中的内含物,每孔加入400μl洗涤液清洗3次,在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。每孔加入100μl底物液,在室温下避光放置30分钟。每孔加入100μl终止液终止反应。在加终止液后5分钟内,室温下,使用酶标仪于450nm处读取吸光率。
(c)HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α:标准品复溶及收集(向抗原标准品小管中每管加入样品50μl特异性缓冲液1×Mniversal Assay Buffer复溶标准品。将抗原标准品小管置于冰上10分钟以确保完全复溶。将每个小管的全部内容物收集至一个小管中,并添加1×Mniversal Assay Buffer至250μl)。制备4倍稀释标准品(离心管标注1~8备用,向1号管中加入200μl复溶抗原标准品,向2~8号管中加入150μl 1×Mniversal Assay Buffer。从1号管中取50μl加入2号管中,混匀,重复上此步骤直至7号管中有标准品,8号管为空白孔)。每孔加入50μl磁珠液。清洗磁珠(将96孔板固定在手持式磁珠清洗机上,并确保96孔板卡好,静置2min,以使磁珠积聚于每孔板底。倒置,以弃掉96孔板中的液体并拍净残留液。每孔加入150μl 1×Wash Buffer并静置2分钟,以使磁珠积聚于每孔板底。倒置,以弃掉96孔板中的液体并拍净残留液。将96孔板从手持式磁珠清洗机上取下)。加样并孵育(每孔加入25μl1×Mniversal Assay Buffer,随后每孔加入25μl准备好的标准品或者样品。贴上封板膜并盖上黑色微孔板盖,500r/min室温孵育120分钟)。清洗96孔板。加入检测抗体并孵育(每孔加入25μl 1×Detection Antibody Mixture。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育30分钟。清洗96孔板。加入SAPE并孵育(每孔加入50μl SAPE。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育30分钟)。清洗96孔板。在Luminex仪器上读取数据(每孔加入120μl Reading Buffer。用新的封板膜密封96孔板,盖上黑色微孔板盖,500r/min室温震荡孵育5分钟。移去封板膜,于Luminex仪器读取96孔板数据)。
(2)阳性判断标准:根据蛋白浓度作为阳性和阴性的评判标准,定义为Cut-off值。蛋白浓度大于Cut-off值的样品记为阳性,小于Cut-off值的样品记为阴性。上述六个蛋白浓度的Cut-off值分别为:3.51ng/ml(CA19-9)、1.95ng/ml(CEA)、376.76pg/ml(HGF)、33.79pg/ml(IP-10)、53.88pg/ml(MIP-1β)、273.04pg/ml(SDF-1α)。
实施例1:蛋白组合在结直肠癌患者血清样本中的敏感性和特异性
针对173例经组织病理学诊断确认为结直肠癌的患者(结肠癌患者或直肠癌患者,不特别区分早期或晚期)和115例正常人血清样本,使用ELISA方法检测CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白的水平,并进行分析。
实验结果如表1、表2以及图1A-图1F所示。
表1:结直肠癌中单一蛋白的敏感性和特异性
全部样品均为有效样本。
表2:结直肠癌中蛋白组合的敏感性和特异性
注:6选2阳性指6个抗体中有2个抗体阳性;5选2阳性指5个抗体中有2个抗体阳性;2选2阳性指2个抗体均为阳性;全部样品均为有效样本。
结果表明,CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白在结直肠癌血清中的水平高于正常人血清(图1A-图1F);选用五个或六个蛋白抗体联合检测结直肠癌,当其中两个抗体阳性即判断所测病例为阳性时,其敏感性可达67.05%(特异性达62%以上),高于任意一个单一蛋白以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的组合的检测结果。
实施例2:蛋白抗体组合在结肠癌血清样本检测中的敏感性
针对24例经组织病理学诊断确认为结肠癌的患者,使用ELISA方法检测CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白的水平,并进行分析。
实验结果如表3和表4以及图2A-图2F所示。
表3:结肠癌中单一蛋白的敏感性
蛋白名称 | 阳性病例数 | 敏感性 |
CA19-9 | 8 | 33.33% |
CEA | 11 | 45.83% |
HGF | 7 | 29.17% |
IP-10 | 8 | 33.33% |
MIP-1β | 6 | 25.00% |
SDF-1α | 6 | 25.00% |
注:全部样品均为有效样本。
表4:结肠癌中蛋白组合的敏感性
注:6选2阳性指6个抗体中有2个抗体阳性;5选2阳性指5个抗体中有2个抗体阳性;2选2阳性指2个抗体均为阳性;全部样品均为有效样本。
结果表明,CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白在结肠癌血清中的水平高于正常人血清(图2A-图2F);选用五个或六个蛋白抗体联合检测结肠癌,当其中两个抗体阳性即判断所测病例为阳性时,其敏感性可达66.67%(特异性同实施例1,达62%以上),高于任意一个单一蛋白以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的组合检测结果。
实施例3:蛋白抗体组合在直肠癌血清样本检测中的敏感性
针对89例经组织病理学诊断确认为直肠癌的患者,使用ELISA方法检测CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白的水平,并进行分析。
实验结果如表5和表6以及图3A-图3F所示。
表5:直肠癌中单一蛋白的敏感性
蛋白名称 | 阳性病例数 | 敏感性 |
CA19-9 | 30 | 33.71% |
CEA | 55 | 61.80% |
HGF | 33 | 37.08% |
IP-10 | 31 | 34.83% |
MIP-1β | 33 | 37.08% |
SDF-1α | 32 | 35.96% |
全部样品均为有效样本。
表6:直肠癌中蛋白组合的敏感性
注:6选2阳性指6个抗体中有2个抗体阳性;5选2阳性指5个抗体中有2个抗体阳性;2选2阳性指2个抗体均为阳性;全部样品均为有效样本。
结果表明,CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白在直肠癌血清中的水平高于正常人血清(图3A-图3F);选用五个或六个蛋白抗体联合检测直肠癌,当其中两个抗体阳性即判断所测病例为阳性时,其敏感性可达73.03%(特异性同实施例1,达62%以上),高于任意一个单一蛋白以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的组合检测结果。
实施例4:蛋白抗体组合在早期结直肠癌血清样本检测中的敏感性
针对42例早期(I期、II期)结直肠癌,使用ELISA方法检测CYFRA21-1、NSE、IL-2、IFN-γ、MIP-1β和VEGF-A六个蛋白的水平,并进行分析。
实验结果如表7和表8所示。
表7:早期结直肠癌中单一蛋白的敏感性
蛋白名称 | 阳性病例数 | 敏感性 |
CA19-9 | 17 | 40.48% |
CEA | 25 | 59.52% |
HGF | 11 | 26.19% |
IP-10 | 17 | 40.48% |
MIP-1β | 15 | 35.71% |
SDF-1α | 17 | 40.48% |
全部样品均为有效样本。
表8:早期结直肠癌中蛋白组合的敏感性
注:6选2阳性指6个抗体中有2个抗体阳性;5选2阳性指5个抗体中有2个抗体阳性;2选2阳性指2个抗体均为阳性;全部样品均为有效样本。
结果表明,选用五个或六个蛋白抗体联合检测早期结直肠癌,当其中两个抗体阳性即判断所测病例为阳性时,其敏感性可达69.05%(特异性同实施例1,达62%以上),高于任意一个单一蛋白以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的组合检测结果。
实施例5:蛋白组合在结直肠癌患者手术前后血清样本中的变化
针对18例结直肠癌患者手术前和手术后的血清样本,使用ELISA方法检测CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白的水平。
结果如表8以及图4A-图4F所示。
表8:结直肠癌患者手术前后单一蛋白血清水平降低情况
蛋白名称 | 术后水平降低的病例数 | 水平降低的病例比例 |
CA19-9 | 8 | 44.44% |
CEA | 14 | 77.78% |
HGF | 3 | 16.67% |
IP-10 | 11 | 61.11% |
MIP-1β | 1 | 5.56% |
SDF-1α | 4 | 22.22% |
注:全部样品均为有效样本。
结果显示,CA19-9、CEA、IP-10等蛋白的血清水平在手术后下降较为明显。结果表明,CA19-9、CEA、IP-10等蛋白的血清水平在手术后下降较为明显蛋白进行组合分析,结果显示6选2和5选2蛋白组合检测出结直肠癌病例手术后血清水平降低的比例为83.33%,详见表9。
表9:结直肠癌患者手术前后蛋白组合血清水平降低情况
注:5选2阳性指5个抗体中有2个蛋白水平降低;6选2阳性指6个抗体中有2个蛋白水平降低;2选2阳性指2个抗体均为阳性;全部样品均为有效样本。
以上结果表明,CA19-9、CEA、HGF、IP-10和MIP-1β五个蛋白组合、以及CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α六个蛋白组合检测结直肠癌术后血清水平降低的敏感性高于任意一个单一蛋白以及临床常用血清标志物CA19-9和CEA的组合检测结果,表明上述蛋白组合能够有效地用于结直肠癌治疗监测。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.蛋白组合物,其包含选自CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α中任意的两种、三种、四种、五种或六种。
2.根据权利要求1所述的蛋白组合物,其包含CA19-9和CEA,以及选自HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种、三种或四种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和HGF,以及选自IP-10、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种或三种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和IP-10,以及选自HGF、MIP-1β和SDF-1α中任意的一种、两种或三种;
优选地,所述蛋白组合物包含CA19-9、CEA和MIP-1β,以及选自IP-10、HGF和SDF-1α中任意的一种、两种或三种。
3.权利要求1的蛋白组合物,其包含或者为如下的(1)-(7)项中的任意一项:
(1)CA19-9、CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α;
(2)CA19-9、CEA、HGF、IP-10和SDF-1α;
(3)CA19-9、CEA、HGF、MIP-1β和SDF-1α;
(4)CA19-9、CEA、IP-10、MIP-1β和SDF-1α;
(5)CA19-9、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α;
(6)CEA、HGF、IP-10、MIP-1β和SDF-1α;或者
(7)CA19-9、CEA、HGF、IP-10和MIP-1β。
4.配体组合物,其为与权利要求1至3中任一权利要求的蛋白组合物中的各个蛋白特异性结合的配体的组合物;其中所述配体优选为抗体例如单克隆抗体;优选地,所述抗体连接有可检测的标记物,例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
5.试剂盒,其包含权利要求4的配体组合物。
6.权利要求1至3中任一权利要求的蛋白组合物或权利要求4的配体组合物在制备结直肠癌的筛查、诊断例如辅助诊断、治疗监测或预后例如预后判断的药物或者试剂盒中的用途;优选地,所述药物或试剂盒用于血清样品的检测。
7.根据权利要求6所述的用途,其中,所述试剂盒的判断方法为,当权利要求4的配体组合物中至少两种配体与待测样品反应呈现阳性时,即判断为结直肠癌样品。
8.一种药物组合物,其包含能够检测权利要求1至3中任一权利要求的蛋白组合物中的各个蛋白的试剂;可选地,所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料;优选地,所述试剂为抗体;优选地,为单克隆抗体;优选地,所述抗体还连接有可检测的标记,例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
9.一种试剂盒,其包含能够检测权利要求1至3中任一权利要求的蛋白组合物中的各个蛋白的试剂,所述试剂是各自独立包装的;优选地,所述试剂为抗体;优选地,为单克隆抗体;优选地,所述抗体还连接有可检测的标记,例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
10.权利要求8所述的药物组合物或者权利要求9所述的试剂盒在制备结直肠癌的筛查、诊断例如辅助诊断、治疗监测或预后例如预后判断的药物中的用途;优选地,所述药物用于血清样品的检测。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110456042A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-15 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 血清学生物标志物在制备试剂盒和/或芯片中的应用、试剂盒或芯片及其制备方法 |
CN116449018A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-07-18 | 浙江大学 | 一种用于肠腺瘤腺癌诊断的血浆蛋白标记物及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102549169A (zh) * | 2009-07-24 | 2012-07-04 | 吉第克生物技术有限公司 | 子宫内膜癌的标记物 |
US20150104470A1 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Neil H. Riordan | Immune modulation by peri-lymphatic or intra-lymphatic cell therapy |
US20160317615A1 (en) * | 2015-05-01 | 2016-11-03 | Jose Javier Lopez GONZALEZ | T cell modulator |
WO2016210144A1 (en) * | 2015-06-23 | 2016-12-29 | Bogin Vlad | Therapeutic immune modulation using noble gas compositions |
US20170020930A1 (en) * | 2015-07-21 | 2017-01-26 | Therapeutic Solutions International, Inc. | Prevention of pregnancy complications by probiotic administration |
-
2018
- 2018-06-13 CN CN201810606510.1A patent/CN109085359A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102549169A (zh) * | 2009-07-24 | 2012-07-04 | 吉第克生物技术有限公司 | 子宫内膜癌的标记物 |
US20150104470A1 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Neil H. Riordan | Immune modulation by peri-lymphatic or intra-lymphatic cell therapy |
US20160317615A1 (en) * | 2015-05-01 | 2016-11-03 | Jose Javier Lopez GONZALEZ | T cell modulator |
WO2016210144A1 (en) * | 2015-06-23 | 2016-12-29 | Bogin Vlad | Therapeutic immune modulation using noble gas compositions |
US20170020930A1 (en) * | 2015-07-21 | 2017-01-26 | Therapeutic Solutions International, Inc. | Prevention of pregnancy complications by probiotic administration |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
N YOSHITAKE,ET AL.: "Expression of SDF-1a and nuclear CXCR4 predicts lymph node metastasis in colorectal cancer", 《BRITISH JOURNAL OF CANCER》 * |
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会医政医管局 等: "结直肠癌诊疗规范(2015 年版)", 《中国实用外科杂志》 * |
宋蕾 等: "趋化因子IP10在结直肠癌组织中的表达及临床意义", 《宁夏医学杂志》 * |
王全玉 等: "肝细胞生长因子及其受体c-Met在结直肠癌中的表达及其意义", 《肿瘤研究与临床》 * |
程欣: "体外肿瘤细胞引起的树突状细胞表型和移动性的变化", 《国外医学免疫学分册》 * |
黄子杰: "《预防医学》", 30 September 2001 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110456042A (zh) * | 2019-08-09 | 2019-11-15 | 臻悦生物科技江苏有限公司 | 血清学生物标志物在制备试剂盒和/或芯片中的应用、试剂盒或芯片及其制备方法 |
CN116449018A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-07-18 | 浙江大学 | 一种用于肠腺瘤腺癌诊断的血浆蛋白标记物及应用 |
CN116449018B (zh) * | 2023-02-14 | 2023-09-05 | 浙江大学 | 一种用于肠腺瘤腺癌诊断的血浆蛋白标记物及应用 |
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