WO2021045180A1 - 胃がんマーカー、及びこれを用いた検査方法 - Google Patents

胃がんマーカー、及びこれを用いた検査方法 Download PDF

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exosome
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幸嗣 植田
なおみ 大西
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Definitions

  • the present invention relates to a gastric cancer marker contained in an exosome and a test method using the marker.
  • CEA cancer epidermal growth factor
  • Exosomes are lipid bilayer vesicles of 40-100 nm and are stably present in body fluids such as blood and urine.
  • Exosomes are secreted by most cells, and the proteins, miRNAs, mRNAs, etc. contained in them are said to reflect the properties of the cells from which they are derived. Therefore, disease-specific markers are contained in exosomes secreted from diseased cells such as cancer. Therefore, exosome analysis is useful in diagnosing diseases, especially cancer.
  • exosomes secreted from cancer cells not only contain molecules involved in cancer development, but also mediate cancer infiltration, metastasis, immunosuppression, and angiogenesis. That is, the exosome also functions as a communication tool between the secreted cell and the uptake cell.
  • exosomes are contained in body fluids such as blood and urine, they can be prepared and diagnosed in a minimally invasive and non-invasive manner. This is a great advantage for patients because it can be a substitute for tissue biopsy when regular examination is required after surgery or when it is difficult to collect the diseased part.
  • exosomes may be a useful resource for early cancer diagnosis because cancer cells are considered to secrete characteristic exosomes. Therefore, it has been studied to use exosomes in body fluids as biomarkers for diseases such as cancer (Patent Documents 1 and 2).
  • exosomes are separated and analyzed from body fluids containing a large amount of proteins such as serum, contamination with serum proteins and the like becomes a problem. Since the amount of exosomes contained in body fluids is very small and the amount of proteins contained therein is very small, it becomes difficult to detect the proteins contained in exosomes due to contamination with serum proteins. In addition, since exosomes are secreted from almost all cells, it is considered that the amount of exosomes secreted from normal cells, which is overwhelmingly large, is larger than that of diseased cells. Therefore, it has not been actually used as a marker in clinical practice because it is necessary to improve the detection accuracy.
  • An object of the present invention is to provide a novel marker for gastric cancer without a good marker. Another subject is to test for gastric cancer using this marker. Furthermore, the present invention relates to a method of purifying an exosome from a body fluid such as serum easily and with good reproducibility, and searching for a marker using the purified exosome.
  • the present invention relates to markers for detecting gastric cancer, testing methods, and methods for searching for novel markers from exosomes in blood.
  • a method for examining gastric cancer which comprises examining the expression of at least one protein shown in Table 1.
  • the method for examining gastric cancer according to (1), wherein the protein expression detects the amount of protein contained in an exosome in a blood sample.
  • the biomarker according to (10), wherein the exosome is a sample derived from blood.
  • the biomarker according to (11), wherein the sample derived from blood is serum or plasma.
  • the biomarker according to any one of (10) to (12), wherein the exosome is purified by size exclusion chromatography.
  • the biomarker according to any one of (9) to (13), wherein the biomarker is CA1.
  • a method for diagnosing gastric cancer which comprises detecting gastric cancer by collecting blood from a subject, detecting at least one biomarker shown in Table 1, and quantifying the amount of the biomarker.
  • exosomes are purified by size exclusion chromatography.
  • the arrows indicate CA1 in which the expression was most different between gastric cancer patients and healthy subjects.
  • the figure which analyzed the CA1 expression in the gastric cancer cell line The figure which forced expression of CA1 in SNU-1 cell which did not express CA1 and analyzed the resistance to the induction of apoptosis.
  • the figure which cultivated MKN7 which forcibly expressed MKN7 and CA1 under the monolayer or suspension condition, and analyzed the effect on the induction of anoikis.
  • exosome markers CD9, CD63, CD81, and the representative serum protein marker haptoglobin were analyzed by Western blotting. These exosome markers are detected in fractions 4 to 7, whereas haptoglobin is detected in fractions 8 and later. Therefore, the EVSecond column showed that exosomes were separated and purified from serum proteins.
  • the antibodies used are as follows.
  • Anti-CD9 antibody Monoclonal antibody (12A12, Shionogi Pharmaceutical)
  • Anti-CD63 antibody Monoclonal antibody (8A12, Shionogi Pharmaceutical)
  • Anti-CD81 antibody Monoclonal antibody (12C4, Shionogi Pharmaceutical)
  • Anti-haptoglobin antibody polyclonal antibody (A0030, DAKO)
  • Exosomes are dissolved in a denaturing solution (HEPES-NaOH, pH 8.0, 12 mM Sodium deoxycholate, 12 mM Sodium N-lauroylsarcosinate), DTT is added to 20 mM, heated at 100 ° C. for 10 minutes, and then 50 mM. Iodoacetamide was added to the mixture, and alkylation was carried out at room temperature for 45 minutes. The obtained exosome-derived protein was digested with immobilized trypsin (Thermo Scientific) at 37 ° C. overnight with shaking.
  • Mass spectrometry was performed by LTQ-Orbitrap-Verocs mass spectrometry by connecting UltraMate 3000 RLSC nano-flow HPLC (Thermo Scientific) equipped with C18 tip-colum (Nikkyo Technos) of 0.075 x 150 mm.
  • the analysis conditions are as follows.
  • Peptides were separated using a 2-step gradient consisting of an acetonitrile concentration of 0.1% formic acid at 250 ln / min for 95 minutes and 35 to 95% for 15 minutes.
  • the HPLC eluate was ionized at a spray voltage of 2 kV and the spectrum in the 350-1500 m / z range was analyzed in full MS ion scan mode with a resolution of 60,000.
  • the CID MS / MS scan was acquired in the Data dependency acquisition (DDA) mode in which the Dynamic exclusion function was enabled.
  • DDA Data dependency acquisition
  • Protein identification and quantification was performed using Proteome Discoverer 2.2 software (Thermo Scientific).
  • the MS / MS data was analyzed by a SEQ (Thermo Scientific) search engine, and the peptide identification threshold was set to less than 1% False Discovery Rate.
  • SEQ Thermo Scientific
  • the default parameters of the Proteome Discoverer 2.2 software were used, the Minora Featur Detector node was used in the processing workflow, and the Precursor Ions Quantifier node followed by the Featur Mapper node in the consensus workflow.
  • exosomes can be easily purified and analyzed from a small amount of blood sample according to the method shown in this example. Therefore, the marker can be searched by the same method for any disease, not limited to gastric cancer. Even for diseases for which it is difficult to obtain a tissue sample, a biomarker in a blood sample can be searched and used for a test, which can be a useful method for searching for a new marker contained in blood.
  • FIG. 2a A Volcano plot comparing exosome proteins detected in exosomes in the sera of gastric cancer patients and healthy subjects is shown in FIG. 2a (p ⁇ 0.05, Effect size> 2.0, effect size> 50%).
  • 816 exosome proteins 40 proteins were significantly upregulated in exosome samples obtained from gastric cancer patients, and 4 proteins were downregulated (Table 1).
  • Forty-four proteins that showed significant differences between gastric cancer patients and healthy subjects were analyzed by the partial least squares regression method (Fig. 2b). As a result, it was clarified that these proteins can clearly distinguish between the gastric cancer patient group and the healthy subject group.
  • Table 1 shows the proteins that showed a significant difference between gastric cancer patients and healthy subjects.
  • 40 types of proteins were found to be upregulated, and 4 types were found to be downregulated. Therefore, gastric cancer patients can be screened by analyzing any exosome protein.
  • CA1 carbonic anhydrase-1
  • Fig. 2a Table 1
  • the sensitivity and specificity of gastric cancer detection by CA1 were examined using the ROC (Receiver operating characteristic) curve (Fig. 2f).
  • the sensitivity of gastric cancer detection by exosome CA1 was 57.6%, the specificity was 88.0%, and the AUC (area under cureve) was 0.761.
  • the AUC of the existing marker CEA was 0.595, indicating that exosome CA1 is a marker having excellent gastric cancer detection ability as compared with the existing marker CEA.
  • Exosome CA1 was specifically detected in the serum of cancer patients.
  • Exosomes were purified using an EVSecondo column, and analysis was performed for the presence of CA1, the exosome marker CD9, and the serum protein marker haptoglobin in each fraction (Fig. 2g).
  • As the serum sample the sera of 6 cancer patients or the sera of 14 healthy subjects were mixed and used.
  • An anti-CA1 monoclonal antibody (ab108367, Abcam) was used to detect CA1.
  • CA1 was detected in the serum sample of gastric cancer patients, but not in the serum sample of healthy subjects. Further, CA1 was detected in the fraction in which the exosome marker CD9 was detected, that is, the exosome fraction, but not in the fraction in which the serum protein haptoglobin was detected. That is, it was shown that CA1 is a specific marker as a gastric cancer marker contained in exosomes. Since it was detected using an antibody in the purified exosome fraction, it is suggested that it can also be detected by a method conventionally used in clinical practice such as ELISA. Moreover, although serum is used here, it is obvious that plasma can be used.
  • CA1 expression can be specifically detected in gastric cancer tissue, it is more useful as a biomarker. Therefore, it was examined whether CA1 expression could be detected in gastric cancer tissue (Fig. 3).
  • tissue microarray US Biomax
  • 304 samples were tissue-stained with CA1 antibody to examine CA1 expression.
  • the tissue classification of the sample is as follows. Adenocarcinoma: 172 cases, undifferentiated cancer: 5 cases, signet ring cell carcinoma: 80 cases, mucinous adenocarcinoma: 12 cases, malignant stromal tumor: 9 cases, carcinoid: 3 cases, squamous epithelial cancer: 1 case
  • 16 cases of normal gastric tissue were used as controls.
  • the sections were deparaffinized, anti-CA1 antibody (LifeSpan BioSience, Inc.) was used as the primary antibody, and detection was performed using EnVision TM + System (DAKO).
  • the staining intensity was classified into 4 stages from 0 to 3, and the staining intensity was examined in adenocarcinoma, undifferentiated cancer, signet ring cell carcinoma, and normal tissue (Fig. 3b). It was shown that the staining intensity of CA1 was significantly higher in adenocarcinoma, undifferentiated cancer, and signet ring cell carcinoma than in normal mucosa. Staining of CA1 in gastric cancer tissue suggests that CA1 contained in exosomes circulating in the blood is secreted from gastric cancer tissue. In addition, the fact that CA1 expression is observed in gastric cancer tissue also in tissue staining indicates that CA1 can be used as a marker in pathological diagnosis.
  • CA1 expression of human gastric cancer cell lines was analyzed by Western blotting using a cell lysate (total cell lysate, TCL) (FIG. 4a, TCL).
  • the histological types of gastric cancer cell lines used were differentiated adenocarcinoma (MKN7, AGS), poorly differentiated adenocarcinoma (MKN45), metastatic gastric cancer (SNU-1, SNU-16), and scirrhous gastric cancer (OCUM-1).
  • MKN7, AGS differentiated adenocarcinoma
  • MKN45 poorly differentiated adenocarcinoma
  • SNU-1, SNU-16 metastatic gastric cancer
  • OCUM-1 scirrhous gastric cancer
  • exosomes were obtained from the culture supernatant of the gastric cancer cell line by ultracentrifugation, and CA1 expression was analyzed by Western blotting (Fig. 4a, Exosomes). It was found that the exosomes obtained from cell lines that endogenously express CA1 contained CA1. This result indicates that exosomes containing CA1 are secreted from cells expressing CA1. CD9, CD63, and CD81 are exosome markers.
  • Exosomes were isolated from SNU-1 cells in which 3'-FLAG-tagged CA1 was forcibly expressed, added to the culture medium of MKN7, and induced apoptosis by staurosporine in the same manner as described above. The effect of the addition was analyzed (Fig. 4c). As a result, it was clarified that the proportion of cells in which apoptosis was induced was significantly reduced in the cells to which exosomes were added. Therefore, it was clarified that apoptosis resistance is also acquired by exosomes containing CA1.
  • Anoikis refers to apoptosis that results from scaffold dependence that cannot adhere to the extracellular matrix or is caused by improper adhesion. In tumors, anoikis resistance is considered to be a property deeply involved in cancer cell infiltration and metastasis.
  • Annexin V, 7AAD was obtained by culturing MKN7 cells or MKN7 cells in which CA1 was forcibly expressed by 3'-FLAG-tagged CA1 under the conditions of monolayer culture or suspension culture, and the proportion of cells in which anoikis was induced was determined. Staining and analysis were performed (Fig. 4d). CA1 expression significantly reduced the proportion of cells in which anoikis was induced in suspension culture.
  • exosomes containing CA1 were added to the culture supernatant of MKN7 cells, and the cells were similarly cultured in a monolayer culture or under suspension culture conditions, and the proportion of cells in which anoikiss was induced was analyzed ( FIG. 4e). It was shown that the addition of exosomes containing CA1 to the culture medium significantly reduced the proportion of cells in which anoikis was induced in suspension culture. From the above results, it was shown that CA1 is also involved in resistance to anoikis.
  • the novel gastric cancer marker CA1 can detect gastric cancer with good sensitivity and specificity. It is also a marker that is deeply related to apoptosis and anoikis resistance related to metastasis. Since the test can be performed using a blood sample, it is a particularly useful marker as a marker for testing recurrence, metastasis, etc. of gastric cancer.
  • CA1 was analyzed in detail including its function, and any of the proteins shown in Table 1 whose expression was significantly different between gastric cancer patients and healthy subjects was used to treat gastric cancer. It is possible to detect. In particular, 40 proteins whose expression has been enhanced in gastric cancer patients can be good markers for detecting gastric cancer. Further, if a plurality of markers shown in Table 1 are used for detection, gastric cancer can be detected more accurately. As shown in this example, it is possible to detect gastric cancer with high sensitivity by a minimally invasive method using blood.

Abstract

胃がん患者、健常者の血清中からサイズ排除クロマトグラフィーを用いてエクソソームを精製し、質量分析によって新規マーカーを得た。胃がん患者で発現増強が認められた４０種、発現減少が認められた４種のタンパク質は、胃がんを検出するための良いマーカーとなり得る。特に、ＣＡ１についてその機能も含めて詳細に解析を行ったところ、感度良く胃がんを検出できることが示された。

Description

胃がんマーカー、及びこれを用いた検査方法
　本発明は、エクソソームに含まれる胃がんマーカー、及びこれを用いた検査方法に関する。
　本邦では、高齢化が進んだこともあり、生涯でがんに罹患する確率は二人に一人と言われている。中でも胃がんの罹患者数は依然と高く、部位別予測がん罹患数は男性では８７，８００人と胃が一番多く、女性では４０，９００人と***、大腸に次いで３番目に罹患数が多い（公益財団法人　がん研究振興財団、がんの統計’１８）。
　検診による胃がんの早期発見、治療が進んだことにより、本邦での胃がんによる死亡者数は年々減少する傾向にあるものの、罹患者数が多いことから、再発、転移など、経過を観察する必要のある患者数は多数に登っている。再発など、すでに原発がんで摘出を行っている場合には、再度疾患部位を採取し、検査することは通常行われない。また、早期に転移を検出するためには、血液などの体液中に存在するバイオマーカーを定期的に検査することが有効であると考えられている。
　現在バイオマーカーとして使用されているのは、血清中に含まれるＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、がん胎児性抗原）である。ＣＥＡは代表的な腫瘍マーカーであり、種々のがんで発現増強が認められ、胃がんに特異的なマーカーではない。また、個人差が大きく、腫瘍が認められたすべての患者で、発現増強が認められるわけではない。
　細胞外小胞、とりわけエクソソームは近年精力的に研究され、機能の解明が進んでいる。エクソソームは、４０－１００ｎｍの脂質二重膜小胞であり、血液、尿などの体液中に安定に存在する。エクソソームは、ほとんどの細胞から分泌され、内包されているタンパク質、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどは、由来する細胞の性質を反映すると言われている。そのため、がんなどの疾患細胞から分泌されたエクソソームには疾患特異的なマーカーが含有されている。したがって、エクソソーム解析は、疾患、特にがんの診断には有用である。
　がん細胞から分泌されたエクソソームは、がん発症に関与する分子が内包されているだけではなく、がんの浸潤、転移、免疫抑制、血管新生などを介在することが知られている。すなわち、エクソソームは、分泌した細胞と取り込んだ細胞との間のコミュニケーションツールとしても機能している。
　また、上述のように、エクソソームは血液、尿などの体液に含まれていることから、低侵襲的、非侵襲的に調製し、診断を行うことができる。これは、手術後、定期的に検査が必要な場合、あるいは疾患部位の採取が困難な場合など、組織生検の代替になり得ることから患者にとって大きいメリットとなる。また、早期がんであっても、がん細胞は特徴的なエクソソームを分泌していると考えられることから、エクソソームは早期がん診断のための有用なリソースとなる可能性がある。そのため、体液中のエクソソームをがんなどの疾患のバイオマーカーとして利用することが検討されている（特許文献１、２）。
特表２０１６－５２０８０３号公報 特表２０１７－５２６９１６号公報
　しかし、血清などタンパク質が多量に含まれている体液からエクソソームを分離し解析する際に、血清タンパク質などの混入が問題となる。体液中に含まれているエクソソームは微量であり、さらに内包されているタンパク質量は非常に少ないことから、血清タンパク質の混入により、エクソソームに内包されているタンパク質の検出が困難となる。また、ほぼ全ての細胞からエクソソームが分泌されていることから、疾患細胞に比べて圧倒的に多い正常細胞から分泌されるエクソソームの方が量が多いと考えられる。そのため、検出精度を高める必要があるなど、実際に臨床現場でマーカーとして使用されるにはいたっていない。
　本発明は、良いマーカーのない胃がんの新規マーカーを提供することを課題とする。また、このマーカーを用いて、胃がんを検査することを課題とする。さらに、血清等の体液から簡便に、かつ再現性良くエクソソームを精製し、精製したエクソソームを用いて、マーカーを探索する方法に関する。
　本発明は、胃がんを検出するためのマーカー、検査方法、及び血液中のエクソソームから新規マーカーを探索する方法に関する。
（１）表１に記載の少なくとも１つのタンパク質の発現を検査することを特徴とする胃がんの検査方法。
（２）前記タンパク質発現は、血液試料中のエクソソームに内包されるタンパク質量を検出するものである（１）記載の胃がんの検査方法。
（３）前記血液試料が血清、又は血漿であることを特徴とする（２）記載の胃がんの検査方法。
（４）前記タンパク質の検出は、質量分析によって行う（１）～（３）いずれか１つ記載の胃がんの検査方法。
（５）前記タンパク質の検出は、抗体を用いて行う（１）～（３）いずれか１つ記載の胃がんの検査方法。
（６）前記タンパク質の検出は組織染色によって行う（１）記載の胃がんの検査方法。
（７）前記タンパク質がｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ-１（ＣＡ１）である（１）～（６）いずれか１つ記載の胃がんの検査方法。
（８）疾患マーカーの探索方法であって、特定の疾患に罹患している患者と、健常者の血液試料からサイズ排除クロマトグラフィーによってそれぞれエクソソームを単離し、質量分析によって前記患者と前記健常者において発現に差が認められるタンパク質を同定し、新規疾患マーカーを探索する方法。
（９）表１に記載の胃がんを検出するためのバイオマーカー。
（１０）エクソソームに含まれることを特徴とする（９）記載のバイオマーカー。
（１１）前記エクソソームが、血液に由来する試料であることを特徴とする（１０）記載のバイオマーカー。
（１２）前記血液に由来する試料が血清、又は血漿であることを特徴とする（１１）記載のバイオマーカー。
（１３）前記エクソソームはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されるものであることを特徴とする（１０）～（１２）いずれか１つ記載のバイオマーカー。
（１４）前記バイオマーカーが、ＣＡ１である（９）～（１３）いずれか１つ記載のバイオマーカー。
（１５）前記バイオマーカーが、アポトーシス、又はアノイキス抵抗性に関与することを示す（１４）記載のバイオマーカー。
（１６）対象から血液を採取し、表１記載のバイオマーカーを少なくとも１つ検出し、バイオマーカーの量を定量することによって、胃がんを検出することを特徴とする胃がんの診断方法。
（１７）前記バイオマーカーがＣＡ１であることを特徴とする（１６）記載の胃がんの診断方法。
（１８）前記バイオマーカーの検出が、質量分析、又は抗体による免疫学的な検出方法であることを特徴とする（１６）、又は（１７）記載の胃がんの診断方法。
サイズ排除クロマトグラフィーによりエクソソームが精製されていることを示す。ＥＬＩＳＡによる解析結果を示す図。 サイズ排除クロマトグラフィーによりエクソソームが精製されていることを示す。ウェスタンブロッティングによる解析結果を示す図。 胃がん患者、健常者で差が見られたエクソソームタンパク質のｖｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔを示す図。胃がん患者、健常者間で最も発現に差が認められたＣＡ１を矢印で示している。 胃がん患者、健常者間で発現量に差が認められた４４種のタンパク質を部分的最小二乗回帰法により分析した図。 健常者、及び患者のエクソソームの絶対的定量を示す図。 血清エクソソーム中のＣＡ１量を健常者と胃がん患者で比較した図。 健常者、ステージごとの胃がん患者のＣＡ１量の定量結果を示す図。 ＣＡ１の感度、及び特異度を示すＲＯＣ曲線を示す図。 胃がん患者、健常者のエクソソームをサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、各分画中のＣＡ１をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。 組織におけるＣＡ１発現を解析した図。 抗ＣＡ１抗体による染色強度をスコア化し、正常粘膜組織、腺がん、未分化がん、印環細胞がんでの染色強度を示す図。 胃がん細胞株でのＣＡ１発現を解析した図。 ＣＡ１を発現していないＳＮＵ－１細胞にＣＡ１を強制的に発現させ、アポトーシス誘導に対する抵抗性を解析した図。 ＣＡ１の発現量が少ないＭＫＮ７細胞の培養液にＣＡ１を内包するエクソソームを添加し、アポトーシス誘導に対する抵抗性を解析した図。 単層、あるいは懸濁条件でＭＫＮ７、ＣＡ１を強制的に発現させたＭＫＮ７を培養し、アノイキス誘導に対する効果を解析した図。 単層、あるいは懸濁条件で、ＭＫＮ７、ＣＡ１を内包するエクソソームを培養液に添加してＭＫＮ７を培養し、アノイキス誘導に対する効果を解析した図。
　［新規マーカーの探索］
　新規マーカーの探索方法について説明する。４８名の胃がん患者、１０名の健常者から常法にしたがって静脈血を採取し、４℃、３，０００ｇで５分間遠心を行い血清を得た。血清は使用時まで－８０℃で保存した。各１００μｌの血清をサイズ排除クロマトグラフィー、ＥＶＳｅｃｏｎｄカラム（ジーエルサイエンス株式会社）を用いて精製した。
　サイズ排除クロマトグラフィーから溶出される分画１００μｌずつを採取し、各分画のエクソソームと、血清タンパク質量を定量した（図１ａ）。エクソソームは、ＣＤ９／ＣＤ９サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出し、血清タンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク定量により行った。その結果、分画４～７は、総タンパク量が低いのにもかかわらず、エクソソームが濃縮されていることが示された。
　さらに、エクソソームマーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及び代表的な血清タンパク質のマーカーであるハプトグロビンをウェスタンブロッティングによって解析した。分画４～７にこれらのエクソソームマーカーが検出されるのに対し、ハプトグロビンは分画８以降で検出される。したがって、ＥＶＳｅｃｏｎｄカラムによって、エクソソームは血清タンパク質と分離精製されたことが示された。なお、用いた抗体は下記のとおりである。抗ＣＤ９抗体：モノクローナル抗体（１２Ａ１２、シオノギ製薬）、抗ＣＤ６３抗体：モノクローナル抗体（８Ａ１２、シオノギ製薬）、抗ＣＤ８１抗体：モノクローナル抗体（１２Ｃ４、シオノギ製薬）、抗ハプトグロビン抗体：ポリクローナル抗体（Ａ００３０、ＤＡＫＯ）
　精製したエクソソームを用いて、質量分析により新規マーカーの探索を行った。エクソソームは変性溶液（ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ８．０、１２ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１２ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｎ-ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）に溶解し、２０ｍＭになるようにＤＴＴを添加し、１００℃で１０分間加熱した後、５０ｍＭになるようにヨードアセトアミドを添加し、室温で４５分間アルキル化を行った。得られたエクソソーム由来のタンパク質は、固相化したトリプシン(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｎｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、３７℃で一晩、振盪しながら消化した。酢酸エチルで、Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅとＳｏｄｉｕｍ　Ｎ-ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅを除去後、得られたペプチドをＯａｓｉｓ　ＨＬＢ　μ-ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐｌａｔｅ（Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩し質量分析を行った。
　質量分析は０．０７５×１５０ｍｍのＣ１８　ｔｉｐ－ｃｏｌｕｍｎ（Ｎｉｋｋｙｏ　Ｔｅｃｈｎｏｓ）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００　ＲＬＳＣ　ｎａｎｏ－ｆｌｏｗ　ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接続したＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ-Ｖｅｒｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって行った。分析条件は以下のとおりである。
　２５０ｎｌ／ｍｉｎで０．１％ギ酸入りアセトニトリル濃度２～３５％　９５分間、３５～９５％　１５分間からなる２ステップグラジェントを使用してペプチドの分離を行った。ＨＰＬＣ溶出液を２ｋＶのスプレー電圧でイオン化し、３５０～１５００ｍ／ｚ範囲のスペクトルをフルＭＳイオンスキャンモードにより分解能６０，０００で解析した。ＣＩＤ　ＭＳ／ＭＳスキャンは、Ｄｙｎａｍｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ機能を有効にしたＤａｔａ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　（ＤＤＡ）モードで取得した。
　タンパク質の同定および定量は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．２ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｎｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。ＭＳ／ＭＳデータをＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｎｅｎｔｉｆｉｃ）検索エンジンで解析し、ペプチド同定閾値としてＦａｌｓｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｒａｔｅ　１％未満と設定した。タンパク質の定量およびデータの標準化には、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　２．２ソフトウェアのデフォルトパラメータを用い、プロセシングワークフローではＭｉｎｏｒａ　Ｆｅａｔｕｒｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒノード、コンセンサス・ワークフローではＰｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｉｏｎｓ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒノードの後にＦｅａｔｕｒｅ　Ｍａｐｐｅｒノードを使用した。
　また、ここでは、胃がんの新規マーカーの探索例を示しているが、本実施例で示した方法によれば、少量の血液試料からエクソソームを簡便に精製し、解析することができる。したがって、胃がんに限らず、どのような疾患であっても、同様の方法でマーカーの探索を行うことができる。組織サンプルを得ることが困難である疾患であっても、血液サンプル中のバイオマーカーを探索し、検査に用いることができるため、血液中に含まれる新規マーカーを探索する有用な方法となり得る。
　胃がん患者４８名、健常者１０名に由来する血清エクソソームに対する質量分析の結果１２８１タンパク質が同定され、そのうち８１６のタンパク質をエクソソーム内タンパク質として抽出した。胃がん患者と健常者の血清中のエクソソームから検出されたエクソソームタンパク質を比較したＶｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔを図２ａに示す（ｐ＜０．０５、Ｅｆｆｅｃｔ　ｓｉｚｅ＞２．０、有効値＞５０％）。８１６のエクソソームタンパク質のうち、４０のタンパク質が胃がん患者から得られたエクソソーム試料で有意に発現増強が認められ、４つのタンパク質に発現減少が認められた（表１）。胃がん患者、健常者間で有意な差が認められた４４のタンパク質を部分的最小二乗回帰法により分析した（図２ｂ）。その結果、これらのタンパク質は胃がん患者群と健常者群を明瞭に区別できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に胃がん患者と健常者で有意な差が認められたタンパク質を示す。胃がん患者において発現増強が認められたタンパク質は４０種、発現減少が認められたタンパク質は４種であった。したがって、いずれのエクソソームタンパク質を解析することによっても、胃がん患者をスクリーニングすることができる。
　これら４４のタンパク質のうち、炭酸脱水素酵素１（ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ-１、以下、ＣＡ１と記載する。）は、胃がん患者群、健常者群から得られたエクソソームで最も差が認められたバイオマーカーである（図２ａ、表１）。エクソソームに含まれるＣＡ１量は、ｐ＝６．３４×１０－７、ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ＝１０．６８と有意に胃がん患者、健常者間で差が認められた（図２ｄ）。そこで、胃がんを検出するマーカー、ＣＡ１の有用性の検討を行った。
［新規胃がんバイオマーカー、ＣＡ１の有用性］
　ＣＡ１の定量的な解析を行うために、多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＭＲＭ）によって解析を行った。健常者２５名、胃がんステージ分類Ｉ～ＩＶ（ステージＩ：６７名、ＩＩ：１８名、ＩＩＩ：１３名、ＩＶ：２７名）の患者の血清エクソソーム中に含まれるＣＡ１量の絶対的定量を行った（図２ｃ、ｅ）。エクソソームＣＡ１レベルは、早期胃がんであるステージＩであっても健常者群と比較して有意に高い値を示しており、さらに病期が進行するにしたがって、高い値を示している。したがって、血液試料中のエクソソームのＣＡ１を定量することによって、胃がんを検査することができる。
　次に、ＣＡ１による胃がん検出の感度、特異度をＲＯＣ（Ｒｅｃｉｅｖｅｒ　ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線によって検討した（図２ｆ）。エクソソームＣＡ１による胃がん検出の感度は５７．６％、特異度は８８．０％、ＡＵＣ（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｃｕｒｅｖｅ）は０．７６１であった。既存のマーカーであるＣＥＡのＡＵＣは０．５９５であり、エクソソームＣＡ１は、既存のマーカーであるＣＥＡと比較して胃がん検出能力に優れたマーカーであることが示された。
　エクソソームＣＡ１が、がん患者血清中で特異的に検出可能であることを確認するために、ウェスタンブロッティングにより解析を行った。エクソソームはＥＶＳｅｃｏｎｄカラムを用いて精製し、各分画にＣＡ１、エクソソームマーカーであるＣＤ９、血清タンパク質マーカーであるハプトグロビンが存在するか解析を行った（図２ｇ）。なお、血清試料は、６名のがん患者の血清、あるいは１４名の健常者血清を混合して用いた。なお、ＣＡ１の検出には、抗ＣＡ１モノクローナル抗体（ａｂ１０８３６７、Ａｂｃａｍ）を用いた。
　ウェスタンブロッティングによる解析では、ＣＡ１は胃がん患者血清試料では検出されたが、健常者血清試料では検出されなかった。また、ＣＡ１は、エクソソームマーカーであるＣＤ９が検出される画分、すなわちエクソソーム画分で検出されるが、血清タンパク質であるハプトグロビンが検出される画分では検出されなかった。すなわち、ＣＡ１はエクソソームに含まれる胃がんマーカーとして特異的なマーカーであることが示された。精製したエクソソーム分画中で抗体を用いて検出されたことから、ＥＬＩＳＡなど臨床で従来から用いられている方法でも検出できることが示唆される。また、ここでは血清を用いているが血漿を用いることができることは自明である。
　［胃がん組織におけるＣＡ１の検出］
　胃がん組織においてＣＡ１発現を特異的に検出することができれば、バイオマーカーとしてさらに有用である。そこで、胃がん組織において、ＣＡ１発現が検出できるか検討を行った（図３）。
　胃がん組織マイクロアレイ（ＵＳ　Ｂｉｏｍａｘ）を用いて、３０４の試料についてＣＡ１抗体により組織染色を行い、ＣＡ１発現を検討した。試料の組織分類は以下のとおりである。
腺がん：１７２症例、未分化がん：５症例、印環細胞がん：８０症例、粘液性腺がん：１２症例、悪性間質腫瘍：９症例、カルチノイド：３症例、扁平上皮がん：１症例
また、正常胃組織１６例をコントロールとして用いた。切片は脱パラフィンを行い、一次抗体として抗ＣＡ１抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）を用い、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ+　Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を用いて検出を行った。
　染色を行うことのできなかった症例を除き、２８１症例で染色を行うことができた。１７２症例の胃腺がんのうち、１３０症例（７５．６％）、５症例の未分化がんのうち５症例（１００．０％）、８５症例の印環細胞がんのうち７２症例（８４．７％）でＣＡ１の発現が認められた。これに対し、正常粘膜ではＣＡ１の発現は全く検出が認められないか、低レベルの検出が認められるに過ぎなかった（図３ａ）。
　さらに、組織染色において染色強度を０～３までの４段階に分類し、腺がん、未分化がん、印環細胞がん、及び正常組織で染色強度の検討を行った（図３ｂ）。正常粘膜と比べ、腺がん、未分化がん、印環細胞がんでは、いずれも有意にＣＡ１の染色強度が高いことが示された。胃がん組織においてＣＡ１が染色されることは、血液中を循環しているエクソソームに内包されているＣＡ１は胃がん組織から分泌されていることを示唆している。また、組織染色においても胃がん組織でＣＡ１発現が認められることは、病理診断においてもＣＡ１をマーカーとして使用できることを示している。
［細胞株を用いた検討］
　ＣＡ１の発現をヒト胃がん細胞株を用いて検討した。ヒト胃がん細胞株のＣＡ１発現を細胞溶解液（ｔｏｔａｌ　ｃｅｌl　ｌｙｓａｔｅ、ＴＣＬ）を用いてウェスタンブロッティングにより解析した（図４ａ、ＴＣＬ）。用いた胃がん細胞株の組織型は、分化腺がん（ＭＫＮ７、ＡＧＳ）、低分化腺がん（ＭＫＮ４５）、転移性胃がん（ＳＮＵ－１、ＳＮＵ－１６）、スキルス胃がん（ＯＣＵＭ－１）の６株である。ＳＮＵ－１６、ＯＣＵＭ－１、ＡＧＳでは２９ｋＤａの位置にＣＡ１が検出された。さらに、ＭＫＮ７、ＭＫＮ４５では低レベルのＣＡ１発現が観察されたが、ＳＮＵ－１では発現が観察されなかった。
　さらに、胃がん細胞株の培養上清から超遠心法によってエクソソームを得て、ウェスタンブロッティングによりＣＡ１発現の解析を行った（図４ａ、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）。ＣＡ１を内在的に発現している細胞株から得られたエクソソームには、ＣＡ１が含まれていることが認められた。この結果は、ＣＡ１を発現している細胞から、ＣＡ１を内包するエクソソームが分泌されていることを示している。なお、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１はエクソソームマーカーである。
　［ＣＡ１の機能解析］
　ＣＡ１を発現していなかったＳＮＵ－１細胞に、３’末端にＦＬＡＧタグを融合したＣＡ１、３’－ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ　ＣＡ１を発現させた細胞を用い解析を行った。キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリン（ＳＴＳ）を１．０μＭで上記細胞に添加し、アポトーシスを誘導した（図４ｂ）。アポトーシスは、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、７ＡＡＤキット（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって染色を行い、フローサイトメトリー、ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって解析した。
　ＣＡ１を発現していないＳＮＵ－１細胞では、１９．３％がスタウロスポリン処理開始後、３時間以内にアポトーシスが誘導されている。しかしながら、ＣＡ１を強制発現させた細胞では、アポトーシスが誘導される細胞が６．１％と有意に減少している。ＣＡ１を発現することによって、アポトーシスに対する抵抗性が獲得されることが示された。
　３’－ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ　ＣＡ１を強制発現させたＳＮＵ－１細胞から、エクソソームを単離し、ＭＫＮ７の培養液に添加し、上記と同様にしてスタウロスポリンによりアポトーシスを誘導し、ＣＡ１を含むエクソソームの添加による効果を解析した（図４ｃ）。その結果、エクソソームを添加した細胞では、アポトーシスが誘導される細胞の割合が大きく減少していることが明らかとなった。したがって、ＣＡ１を内包したエクソソームによっても、アポトーシス抵抗性を獲得することが明らかとなった。
　次に、ＣＡ１のアノイキスに対する効果を解析した。アノイキスは、アポトーシスの中でも、細胞外マトリクスに接着することができず、あるいは不適切な接着により生じる足場依存に由来するアポトーシスを指す。腫瘍においては、アノイキス抵抗性は、がん細胞の浸潤、転移に深く関わる性質であると考えられている。
　ＭＫＮ７細胞、又は３’－ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ　ＣＡ１によりＣＡ１を強制発現させたＭＫＮ７細胞を単層培養、あるいは懸濁培養の条件で培養を行い、アノイキスが誘導される細胞の割合を、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、７ＡＡＤ染色を行い解析した（図４ｄ）。ＣＡ１発現により懸濁培養では有意にアノイキスが誘導される細胞の割合が減少した。
　次に、ＭＫＮ７細胞の培養上清に、ＣＡ１を内包するエクソソームを添加し、同様に単層培養で、あるいは懸濁培養の条件で培養を行い、アノイキスが誘導される細胞の割合を解析した（図４ｅ）。ＣＡ１を含むエクソソームを培養液に添加することにより、懸濁培養ではアノイキスが誘導される細胞の割合が有意に減少することが示された。以上の結果から、ＣＡ１はアノイキスに対する抵抗性にも関与することが示された。
　以上示したように、新規胃がんマーカーＣＡ１は、胃がんを感度、特異度よく検出することができる。また、転移に関わるアポトーシス、アノイキス抵抗性とも深く関わりのあるマーカーである。血液試料を用いて検査を行うことができることから、特に、胃がんの再発、転移などを検査するマーカーとして有用なマーカーとなる。
　ここでは、ＣＡ１について、その機能も含めて詳細に解析を行ったが、表１に示した胃がん患者、健常者間で発現に有意な差が認められたタンパク質は、いずれを用いても胃がんを検出することが可能である。特に、胃がん患者で発現増強が認められた４０種のタンパク質は、胃がんを検出する良いマーカーとなり得る。また、表１に示したマーカーを複数用いて検出すれば、より精度良く胃がんの検出を行うことができる。本実施例で示したように、血液を用いる低侵襲な方法で感度良く胃がんの検出を行うことが可能となる。

Claims (15)

  1. 　表１に記載の少なくとも１つのタンパク質の発現を検査することを特徴とする胃がんの検査方法。
  2. 　前記タンパク質発現は、
    　血液試料中のエクソソームに内包されるタンパク質量を検出するものである請求項１記載の胃がんの検査方法。
  3. 　前記血液試料が血清、又は血漿であることを特徴とする請求項２記載の胃がんの検査方法。
  4. 　前記タンパク質の検出は、
    　質量分析によって行う請求項１～３いずれか１項記載の胃がんの検査方法。
  5. 　前記タンパク質の検出は、
    　抗体を用いて行う請求項１～３いずれか１項記載の胃がんの検査方法。
  6. 　前記タンパク質の検出は組織染色によって行う請求項１記載の胃がんの検査方法。
  7. 　前記タンパク質がｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ-１（ＣＡ１）である請求項１～６いずれか１項記載の胃がんの検査方法。
  8. 　疾患マーカーの探索方法であって、
    　特定の疾患に罹患している患者と、健常者の血液試料からサイズ排除クロマトグラフィーによってそれぞれエクソソームを単離し、
    　質量分析によって前記患者と前記健常者において発現に差が認められるタンパク質を同定し、
    　新規疾患マーカーを探索する方法。
  9. 　表１に記載の胃がんを検出するためのバイオマーカー。
  10. 　エクソソームに含まれることを特徴とする請求項９記載のバイオマーカー。
  11. 　前記エクソソームが、血液に由来する試料であることを特徴とする請求項１０記載のバイオマーカー。
  12. 　前記血液に由来する試料が血清、又は血漿であることを特徴とする請求項１１記載のバイオマーカー。
  13. 　前記エクソソームはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製されるものであることを特徴とする請求項１０～１２いずれか１項記載のバイオマーカー。
  14. 　前記バイオマーカーが、ＣＡ１である請求項９～１３いずれか１項記載のバイオマーカー。
  15. 　前記バイオマーカーが、
    　アポトーシス、又はアノイキス抵抗性に関与することを示す請求項１４記載のバイオマーカー。
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