CN107176977A - 牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用。根据大肠杆菌的密码子偏爱性，对M.bovis HB0801的Mbov_730基因进行克隆，将Mbov_730基因修饰，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，进而在大肠杆菌中表达重组的牛支原体MbovP730蛋白。本发明的MbovP730蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示,该蛋白可作为抗原蛋白在制备鉴别诊断牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫鉴别试剂盒中的应用。

Description

牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种牛支原体MbovP730蛋白及其应用。经过纯化后的蛋白可以作为抗原蛋白在制备鉴别诊断野毒株Mycoplasma bovis HB0801感染和疫苗株Mbov HB0801-150.2免疫试剂盒中的应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是导致我国肉牛呼吸综合征、运输应激综合征和奶牛乳腺炎的主要病原体，临床症状主要表现为肺炎，乳腺炎、关节炎，还可表现为中耳炎、结膜炎和生殖道炎症等多种症状。牛支原体于1961年首次在美国发现，从患***炎奶牛的牛奶中分离得到。1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。此后发现，牛支原体肺炎和乳腺炎在全世界广泛流行(Caswell等，2010；White等，2010)。据估计，欧洲每年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元,其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国牛场牛支原体感染率可达70％，每年因牛支原体肺炎和乳腺疾病所造成损失也达1.40亿美元。

随着我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已成为重要的肉牛养殖模式。长距离运输是“异地运输”的重要环节，运输应激可诱发多种重要疫病，牛支原体肺炎就是其中一种。该病2008年在湖北省首次报道(石磊等，2008)，从外地引进肉牛，在引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。发病率为50％～100％。临床治疗周期长，效果差，病死率平均10％，可高达60％，主要病理变化为肺实变、化脓或干酪样坏死，给我国养牛业带来了巨大损失。继2008年首次报道后，不同研究者均证实该病在全国广泛流行(辛九庆等，2008；胡长敏等，2009)。

牛支原体无细胞壁，对常用β内酰胺类抗生素不敏感，对其它药物如四环素、大环内脂类和氟喹酪酮类等敏感药物也很容易产生耐药性(Mustafa等,2013)。由于抗生素的不敏感，疫苗被认为是预防牛支原体病的有效措施。申请者先前将牛支原体野毒株(Mycoplasma bovisHB0801)在体外连续传代150代获得疫苗株Mbov HB0801-150.2，经过牛体验证该疫苗株免疫后对牛支原体野毒株攻击具有良好的抵抗力(Zhang等，2014)。

对M.bovis HB0801(GenBank登录号：CP002058)和Mbov HB0801-150.2的全基因组序列解析(Qi等,2012)发现，Mbov HB0801-150.2较M.bovis HB0801缺失了长为14kb的DNA片段，这为Mbov HB0801-150.2免疫和M.bovis HB0801感染的区分提供了良好的分子标识。对缺失DNA片段中的基因进行克隆表达，利用感染血清和疫苗免疫血清进行平行检测，筛选发现一个能区分牛支原体野毒株感染和疫苗免疫的鉴别诊断标识分子MbovP730。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其第一个目的是提供一个可以鉴别诊断牛支原体野毒株(M.bovis HB0801)感染和牛支原体疫苗株(Mbov HB0801-150.2)免疫的分子标识牛支原体MbovP730蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一种牛支原体MbovP730蛋白的抗体检测方法，组装用于区分牛支原体野毒株感染和牛支原体疫苗株ELISA试剂盒中的应用。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体Mycoplasma bovis HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2010040；同时将该分离株的基因组的核苷酸序列在GenBank上登录，登录号为：CP002058。

以该株牛支原本基因组登录号为CP002058)中的Mbov_730基因序列为参照设计引物，从该菌基因组DNA中克隆该基因，根据大肠杆菌的密码子偏爱性，对Mbov_730基因进行了修饰，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，进而在大肠杆菌中表达，得到了重组的牛支原体MbovP730蛋白(rMbovP730)。

进一步，本发明还公开了牛支原体MbovP730蛋白的纯化方法。

生物验证表明，本发明的rMbovP730蛋白可以作为鉴别诊断牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫试剂盒中的应用。

具体地，本发明的牛支原体MbovP730蛋白在区分牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫中的应用步骤包括：

利用间接ELISA方法鉴别牛支原体野毒株感染，以rMbovP730蛋白作为抗原包被酶标板于4℃过夜，经PBST洗涤后加入5％脱脂乳后在37℃封闭1h，再用PBST洗涤后加入检测样本于37℃孵育1h，样本稀释比例为1：1600。PBST洗涤后加入羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标二抗(1：5000，V/V)37℃孵育45min。最后用PBST洗涤后加入TMB底物显色液显色。

本发明具有以下优点：

疫苗株Mbov HB0801-150.2免疫后，机体也会产生高水平血清抗体，但是现在国内还没有鉴别牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫的诊断试剂盒。MbovP730蛋白是疫苗株MbovHB0801-150.2的缺失蛋白，又发现其具有良好的免疫原性，因此，使用rMbovP730蛋白构建的间接ELISA可以准确区分牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫，ROC曲线分析表明以该蛋白建立的检测方法特异性和敏感性都可以达到90％。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是扩增Mbov_730基因片段的引物730a1序列。

序列表SEQ ID NO:2是扩增Mbov_730基因片段的引物/730a2序列。

序列表SEQ ID NO:3是扩增Mbov_730基因片段的引物730b1序列。

序列表SEQ ID NO:4是扩增Mbov_730基因片段的引物730b2序列。

序列表SEQ ID NO:5是扩增Mbov_730基因片段的引物730c1序列。

序列表SEQ ID NO:6是扩增Mbov_730基因片段的引物730c2序列。

序列表SEQ ID NO:7是扩增Mbov_730基因片段的引物730d1序列。

序列表SEQ ID NO:8是扩增Mbov_730基因片段的引物730d2序列。

序列表SEQ ID NO:9是扩增Mbov_730基因片段的引物730e1序列。

序列表SEQ ID NO:10是扩增Mbov_730基因片段的引物730e2序列。

序列表SEQ ID NO:11是扩增Mbov_730基因片段的引物730f1序列。

序列表SEQ ID NO:12是扩增Mbov_730基因片段的引物730f2序列。

序列表SEQ ID NO:13是保藏号为CCTCC NO：M2010040的牛支原体MbovP730蛋白的核苷酸序列，序列长度为867bp。在该序列的471位，531位，615位，663位和738位发生等位基因突变。

序列表SEQ ID NO:14是保藏号为CCTCC NO：M2010040的牛支原体MbovP730蛋白的蛋白质序列，编码288个氨基酸。

图1：是本发明的起始质粒(空载体)pET-30a的图谱。pET-30a为一种商业质粒(购自Novagen公司)。

图2：是本发明制备的重组质粒pET-30-Mbov_730的图谱。附图标记说明：重组质粒pET-30-Mbov_730是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_730基因全长经过限制性内切酶消化后连接后重组而成。

图3：是本发明实施例的牛支原体MbovP730蛋白纯化的SDS-PAGE胶图。附图标记说明：泳道：M蛋白marker；1为诱导前的含重组质粒pET-30-Mbov_730的BL21表达菌；2为诱导后的含重组质粒pET-30-Mbov_730的BL21表达菌；3为含有重组质粒pET-30-Mbov_730的BL21表达菌破碎后上清上Ni柱后的穿流液；4为纯化后的牛支原体MbovP730重组蛋白。

图4：是Western blot检测牛支原体MbovP730蛋白特异性图。附图标记说明：泳道：M蛋白marker；1为牛支原体HB0801株全菌蛋白；2为牛支原体Mbovis-150株全菌蛋白；3为无乳支原体PG2株全菌蛋白；4为巴氏杆菌全菌蛋白；5为溶血曼氏杆菌全菌蛋白；6为牛结核分枝杆菌全菌蛋白；7为牛传染性鼻气管炎病毒总蛋白。

图5：包被牛支原体HB0801株全菌蛋白筛选牛支原体自然感染血清结果。附图标记说明：F1为牛支原体HB0801株自然感染血清；F150为Mbov HB0801-150.2疫苗株免疫后血清；阴性：牛支原体阴性血清

图6：包被rMbovP 730通过间接ELISA鉴别牛支原体自然感染与疫苗免疫。附图标记说明：牛支原体自然感染和疫苗株免疫检测及阈值的确定，阈值为0.673时，敏感性为95.45％，特异性为90.91％。

具体实施方式

实施例1：牛支原体Mbov_730蛋白的克隆表达

1.1牛支原体Mbov_730基因克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体Mbov_730基因时，需要对支原体Mbov_730基因进行突变，即，使牛支原体密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

申请人将突变后得到大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30-Mbov-730，Escherichia coli，pET-30-Mbov-730，于2015年12月18日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2015762。

本实施例利用PCR引物对相应基因进行突变。用于突变的起始菌株是牛支原体HB0801，该菌株是申请人2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到，申请人将其命名牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801,于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2010040。该牛支原体的基因组已在GenBank登录，登录号为：CP002058。

以登录号为为CP002058的Mbov_730基因为模板，利用如下设计的6个引物对(编号分别为：730a1/730a2，730b 1/730b2，730c1/730c2，730d1/730d2，730e1/730e2，730f1/730f2)分别扩增出突变后的Mbov_730基因的6个片段，然后，以突变后的6个片段为模板，使利用730a1/730f2扩增出突变后的Mbov_730基因的全序列，序列长度为867bp(见序列表SEQID NO:13)。

具体引物序列如下：

(1)730a1/730a2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为863600-863101，PCR扩增产物长度为509bp。

正向引物730a1:5’ GAATTCATGCCTAATGATGGTTCA 3’(下划线部分为EcoR I酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；即序列表SEQ ID NO：1所示的序列)。

反向引物730a2：5’ACAATTTTTTTGCCATTTTTTATACTGATCCAGTTTTTA 3’(下划线部分为突变位点，由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：2所示的序列)。)

(2)730b1/730b2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为863140-863045，PCR扩增产物长度为96bp。

正向引物730b1：5’ATAAAAACTGGATCAGTATAAAAAATGGCAAAAAAATTGT3’(下划线部分为突变位点，由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：3所示的序列)。

反向引物730b2：5’GAAGAACAGTGAGCTTAATTCCTGTCCAATC 3’(下划线部分为突变位点，由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：4所示的序列)。

(3)730c1/730c2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为863081-862913，PCR扩增产物长度为169bp。

正向引物730c1：5’CACAAAGATTGGACAGGAATTAAGCTCACT 3’(下划线部分为突变位点，由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：5所示的序列)。

反向引物730c2：5’CAGCATACTTAATATTTGATGTATCCCATTCATTAAGGTT 3’(下划线部分为突变位点，由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：6所示的序列)。

(4)730d1/730d2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为862952-862846，PCR扩增产物长度为107bp。

正向引物730d1：5’AACCTTAATGAATGGGATACATCAAATATTAAGTATGCTG 3’(下划线部分为突变位点，由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：7所示的序列)。

反向引物730d2：5’ACGCTACCTCTAATTTTCCAATTTTTTAAAGACTGATCTA3’(下划线部分为突变位点，由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：8所示的序列)。

(5)730e1/730e2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为862875-862771，PCR扩增产物长度为105bp。

正向引物730e1：5’TTTAAAAAATTGGAAAATTAGAGGTAGCGTTAATACCAAG 3’(下划线部分为突变位点，由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

反向引物730e2：5’GTTTTCCAAGCGGTAGCCATATCCTT 3’(下划线部分为突变位点，由T突变为C；即序列表SEQ ID NO：10所示的序列)。

(6)730f1/730f2扩增片段在Mbov_730基因中的位置为862797-862734，PCR扩增产物长度为73bp。

正向引物730f1：5’AAAGGATATGGCTACCGCTTGGAAAAC 3’(下划线部分为突变位点，由A突变为G；即序列表SEQ ID NO：11所示的序列)。

反向引物730f2：5’ AAGCTTTTATGCTTTTTTATAGTTATATAGCATATTT 3’(下划线部分为Hind III酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；即序列表SEQ ID NO：1所示的序列)。

以上6个片段的反应体系如下：

模板DNA 2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。

回收上述六个片段的PCR扩增产物，以此为模板，使用引物730a1至730f2扩增突变后的Mbov_730基因，其PCR反应体系如下：每个片段2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu bufferwith MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

回收Mbov_730基因扩增产物，用EcoR I和Hind III酶切，同时将pET-30a质粒(购自默克中国有限公司)用EcoR I和Hind III进行双酶切。将酶切后的Mbov_730基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4 DNA ligase)连接，得到重组质粒pET-30-Mbov_730(见图2)。用该重组质粒pET-30-Mbov_730转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行处理。样品处理方法为12000r/min离1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司，1MTris-HCl，pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

1.2牛支原体rMbovP730蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取一点沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rMbovP730蛋白大部分表达于上清中。

rMbovP730蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

实施例2：牛支原体rMbovP730蛋白特异性检测

2.1多克隆抗体的制备

利用上述制备的rMbovP730蛋白免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下：

(1)初次免疫,牛支原体rNOX抗原100μg/只鼠,加弗氏完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(2)二周后，第二次免疫,牛支原体rMbovP730抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。

(3)四周后，第三次免疫,牛支原体rMbovP730抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。

(4)7天后，剪尾尖采血，分离血清，用间接法ELISA测其效价，即用牛支原体rNOX抗原包板，加入小鼠血清稀释品于37℃孵育，洗板后加入HRP标记的羊抗鼠二抗(购自Southern Biotech公司)于37℃孵育，洗板后加入TMB底物显色。选取效价高的血清做多克隆抗体使用。

2.2MbovP730蛋白特异性检测

在PPLO培养基(PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后，加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL,无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)中分别培养牛支原体HB0801株(CCTCC保藏编号CCTCC NO：M2010040)、牛支原体(疫苗株)Mbov HB0801-150.2，(该牛支原体Mbov HB0801-150.2，Mycoplasma bovis Mbov HB0801-150.2于2011年3月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏；保藏编号CCTCC NO:M2011102)、无乳支原体标准株PG2(购自美国典型培养物保藏中心，编号ATCC NO:35890)。在LB液体培养基中培养巴氏杆菌(Pm-AL)株和溶血曼氏杆菌Mh-L株(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒份室临床分离保存株，文献见谢倩茹等，2015)，在7H9(4.7g 7H9粉末溶解于900mL蒸馏水中(含甘油2mL或者0.5g吐温-80)，121℃，10min高压蒸汽灭菌。在培养基温度降至45℃时，无菌条件下加入100mL OADC增菌液(BD公司))中培养牛结核分枝杆菌1458株(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒份室临床分离鉴定，文献见Chen et al.,2009)，在牛肾细胞中培养牛传染性鼻气管炎病毒BHV-1株(文献见Zhang et al.,2011)。除结核分枝杆菌全菌蛋白是通过加入2×SDS加热(95℃，30min)获得外，其余全菌蛋白都通过超声破碎(功率200W，破碎时间20分钟)获得。取HB0801株全菌蛋白、Mbovis-150株全菌蛋白、无乳支原体全菌蛋白、巴氏杆菌全菌蛋白、溶血曼氏杆菌全菌蛋白、牛结核分枝杆菌全菌蛋白、牛传染性鼻气管炎病毒总蛋白进行SDS-PAGE电泳，经过湿转印到硝酸纤维素膜上(50V，120min)，5％脱脂奶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用制备的多克隆抗体(1：500稀释)做为一抗在室温下作用1小时，用TBST洗膜三次，与1：10000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜三次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermoscientific)显色。结果显示多克隆抗体可以识别36KD左右的目标蛋白(MbovP730)，在牛支原体HB0801株和无乳支原体PG2株中可以检测到这一特定大小的目的蛋白。

实施例3：牛支原体MbovP730蛋白在区分牛支原体野毒株自然感染和牛支原体疫苗株免疫中的应用

3.1以M.bovis HB0801全菌蛋白为包被抗原通过间接ELISA方法检测血清

(1)动物血清样本收集：牛支原体野毒株自然感染血清来源于临床试验的牛支原体疑似感染牛，牛支原体疫苗株Mbov HB0801-150.2(即牛支原体Mbov HB0801-150.2)(由M.bovisHB0801体外接种PPLO液体培养基，3天为一代，体外连续传代150代所得)免疫血清来源于临床试验，阴性血清来源于临床免疫实验的空白组。

(2)全菌蛋白制备：M.bovis HB0801在PPLO培养基上(配制方法：取PPLO粉10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，用超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后，加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL,无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)培养2天，取100ml培养液于10000rpm下离心10分钟，用PBS洗涤2次后，加入1ml的PBS重悬沉淀。使用超声破碎仪破碎(功率200W，破碎时间20分钟)，取破碎后的蛋白冻存于-20℃。

(3)包被：用包被液(Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加ddH₂O至1000ml)稀释浓缩后的M.bovis HB0801HB0801全菌蛋白，96孔酶标板按每孔1250ng的量加入稀释后的M.bovisHB0801全菌蛋白液100μl，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔加300μl PBST缓冲液(配制方法，PBS缓冲液配制:NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaH₂PO₄ 0.2g，加ddH₂O至1000ml。PBST缓冲液配制:加入0.05％的Tween-20到PBS中即为PBST缓冲液)洗涤3次，每次2分钟。

(4)封闭：向96孔酶标板每孔加入100μl 5％的脱脂牛奶(5g脱脂牛奶加PBST至100ml)，置于37℃温箱中封闭1h，甩干封闭液，加入300μl的PBST洗3次，每次2分钟。

(5)加样：用PBST(按500μl吐温-20加入1000ml PBS制成)以1:100(V/V)比例稀释待检测的血清，向96孔酶标板每孔加100μl稀释后的血清，37℃下培养1h；甩干孔中溶液，加入300μl的PBST洗3次，每次2分钟。

(6)加羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标二抗)：用PBST(按500μl吐温-20加入1000ml PBS制成)以1:5000(V/V)的比例稀释酶标二抗(购自Southernbiotech公司)，向96孔酶标板每孔加入100μl稀释后的羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标二抗，置于37℃孵育60分钟；甩干孔中溶液，加入300μl PBST洗5次，每次2分钟。

(7)加底物显色：向96孔酶标板每孔加入TMB底物显色液A液和TMB底物显色液B液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)各50μl，避光显色10min；每孔加50μl终止液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)终止反应；用酶标仪在630nm波长下测定OD₆₃₀值。

(8)以17份阴性血清OD值为样本计算出平均值(M)和标准差(SD)，待检测血清OD值大于M+2SD时被认为是阳性。将筛选出的阳性血清、免疫后血清、空白组血清使用GraphPad软件进行差异分析。

3.2以本发明的rMbovP730蛋白为抗原的间接ELISA鉴别牛支原体疫苗免疫与野毒株自然感染

以3.1筛选到的阳性血清为牛支原体野毒株自然感染的血清和以牛支原体疫苗株MbovHB0801-150.2免疫后的血清为一抗，通过上述2.1的步骤所述方法检测血清样本，血清样本检测值见表1。根据检测值使用GraphPad软件确定阈值。

表1牛支原体野毒株自然感染和疫苗株免疫后血清鉴别诊断值

实施例3：牛支原体rMbovP730蛋白区分牛支原体野毒株自然感染和牛支原体疫苗株免疫ELISA试剂盒的组装

本实施例的ELISA试剂盒主要核心试剂包括rMbovP730蛋白(作抗原用)包被板2块(为96孔酶标板，50ng/孔)，牛支原体ELISA阴性(即牛支原体疫苗株Mbov HB0801-150.2免疫后血清)，牛支原体阳性对照(M.bovis HB0801自然感染血清)各1管(0.5ml/管)，样品稀释液1瓶(40ml/瓶)，羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标记二抗1管(200μl/管)，20倍浓缩洗涤液1瓶(30ml/瓶)，TMB底物显色液A液，TMB底物显色液B液各1瓶(10ml/瓶)，终止液1瓶(10ml/瓶)；其余试剂按以下步骤配制：

(1)20倍浓缩洗涤液：NaCl 160g、KCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 58g、KH₂PO₄ 4g，Tween-2010ml定容至1000ml纯化水中。

(2)羊抗牛(IgG Fc-HRP)酶标二抗：购自Southernbiotech，用保护剂(含1％BSA的PBST溶液(M/V)稀释至1:500倍中间浓度。

(3)封闭液：含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液。

(4)样品稀释液：含0.05％的Tween-20的磷酸盐缓冲液。

(5)底物液：TMB底物显色液A液配制：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加纯化水至1000ml，调至pH值5.0～5.4；TMB底物显色液B液配制：TMB20mg，无水乙醇10ml，加纯化水至1000ml。

(6)终止液：0.25％氢氟酸。

名词术语说明：

在本说明书中：

牛支原体野毒株，以Mycoplasma bovis HB0801表示，简写为M.bovis HB0801；

牛支原体疫苗株，以Mbov HB0801-150.2表示。

主要参考文献

1.谢倩茹，姜鹏，彭清洁等.牛溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌A型、B型的比较鉴定研究.中国奶牛，2015，14:0048‐0053.

2.Chen Y,Chao Y,Deng Q,et al.Potential challenges to the Stop TB Plan for humans in China；cattle maintain M.bovis and M.tuberculosis.Tuberculosis,2009,89:95‐100.

3.Zhang M,Fu S,Deng M,et al.Attenuation of bovine herpesvirus type 1 by deletion of its glycoprotein G andtk genes and protection against virulent viral challenge.Vaccine,2011,29(48):8943‐50。

Claims (4)

1.一种鉴别诊断牛支原体野毒株感染和疫苗株的牛支原体特异性蛋白MbovP730，其特征在于，编码该蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:13所示。

2.一种鉴别诊断牛支原体野毒株感染和疫苗株的牛支原体特异性蛋白MbovP730，其特征在于，所述蛋白的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:14所示。

3.一种含有表达权利要求1所述的牛支原体MbovP730蛋白的pET-30-Mbov_730重组质粒的大肠杆菌，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015762。

4.权利要求1所述的牛支原体MbovP730蛋白在制备鉴别诊断牛支原体野毒株感染和疫苗株试剂盒中的应用，其特征在于，作为抗原蛋白使用，该抗原蛋白包含有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。