CN109750054B

CN109750054B - 一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用

Info

Publication number: CN109750054B
Application number: CN201910129071.4A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 朱习芳; 董亚旗; 李茜茜; 陈颖钰; 胡长敏; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2039-02-21
Also published as: CN109750054A

Abstract

本发明属于动物传染病防制技术领域，具体涉及牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用。Mbov_0276根据牛支原体HB0801基因组序列人工合成获得。针对大肠杆菌对密码子的偏爱性，对Mbov_0276基因进行了修饰：将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中编码色氨酸的密码子UGG，得到大肠杆菌重组蛋白rMbovGdpP。Mbov_0276基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。突变株T6.290出现生长缺陷表型，在PPLO培养基上呈小菌落形态，对EBL细胞黏附减少，对盐离子的敏感性升高。该突变株可望在牛支原体致病机理和制备免疫防制药物中应用。

Description

一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用，该蛋白可以降解环二核苷酸，超小片段核酸，ATP和ADP，编码该蛋白的基因为Mbov_0276，其突变菌株T6.290。相较于野生菌株，突变菌株表现显著的细胞共增减下生长缺陷，小菌落形态表型，黏附能力降低，对盐离子包括钾离子和钠离子的耐受能力显著降低。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是牛的一种重要病原体，引起牛肺炎、乳腺炎、关节炎等多种症状。1961年首次在美国乳腺炎患牛的乳液中发现，1976年首次报道该病原导致牛肺炎。目前，牛支原体病在世界范围内广泛流行，已成为危害养牛业的主要传染病和常发病，给全球养牛业带来了严重的经济损失。我国于1983年首次报道从***炎患牛的乳汁中分离到牛支原体(黎济申，1983)。2008年，在湖北省从外地引进的肉牛中爆发呼吸道疾病，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室通过病原分离鉴定，率先在全国确定该病为“传染性牛支原体肺炎”，此后牛支原体肺炎呈全国性流行，该病临床治疗效果差，死亡率高，平均死亡率为10％，最高可达到60％(石磊等，2008)。由于缺少特异高效的防治措施，该病给我国养牛业造成了巨大的经济损失。但目前对牛支原体的毒力机制仍知之甚少，尚未发现经典的细菌毒素和毒力因子(Qi et al.,2012)。阐明其毒力机制和致病机理是研究特效防治措施的前提条件。

c-di-AMP是2008年最新发现的一种存在于细菌内的小分子第二信使(Romling U,2008)，该信号分子对许多细胞过程具有调控作用，如孢子形成、脂肪酸合成、DNA损伤反应、钾离子运输、抗生素耐药性以及细菌毒力等(Tazin Fahmi et al,.2017)。c-di-AMP内环境稳态对细菌正常生理活动至关重要，含量升高或降低均会对细菌产生重大影响。细菌内环二核苷酸的浓度是由降解酶和合成酶决定的。目前DHH/DHHA1结构域的磷酸二酯酶活性已经在一些细菌中进行了研究，证实它们是c-di-AMP特异性降解酶，在环二核苷酸的降解过程中发挥重要作用(Huynh TN and Woodward JJ,2016)。缺失该基因会导致细菌出现一系列功能异常，包括如细菌的耐药性，细菌生长和生物被膜的形成，同时会显著降低病原菌对宿主的感染性及毒力等。目前环二核苷酸作为第二信使的研究在支原体属中刚刚起步，因此，牛支原体的环二核苷酸磷酸二酯酶相关功能的研究将对阐明支原体属成员的相关生理活动和致病机制研究具有重要参考价值。本发明涉及一株与牛胚胎肺细胞共培养时存活能力缺陷的突变体，其突变基因为Mbov_0276，编码蛋白为环二核苷酸磷酸二酯酶(MbovGdpP)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种牛支原体MbovGdpP蛋白及其突变菌株，该蛋白可以降解环二核苷酸，超小片段核酸，ATP和ADP，编码该蛋白的突变菌株T6.290相较于野生菌株表现显著的生长缺陷及小菌落形态表型；该突变菌株的黏附能力，对盐离子包括钾离子和钠离子的耐受能力较野生菌株显著降低。

为了实现本发明的目的，申请人所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室从牛支原体基因缺失突变体库中筛选出一株与牛胚胎肺细胞(EBL)共培养下生长缺陷菌株。经分析，申请人将该突变基因命名为Mbov_0276。Mbov_0276基因编码的蛋白具有3个跨膜区和一个DHH-DHHA1结构域，预测其具有环二核苷酸磷酸二酯酶(cyclicdinucleotide phosphodiesterase)超小片段核酸酶的活性。进一步验证确定其重组蛋白具有环二核苷酸磷酸二酯酶活性，可以降解c-di-AMP和c-di-GMP等环二核苷酸。同时本发明发现，该蛋白还具有超小片段核酸酶的功能，能降解pApA和pGpG等超小片段核酸。此外，本发明发现该蛋白还具有ATP酶及ADP酶活性，可以降解ATP，GTP，ADP，GDP。环二核苷酸作为第二信使的研究，在支原体中刚刚起步，该信号分子在细胞内环境中的稳定受二核苷酸环化酶和环二核苷酸磷酸二酯酶的调控，因此MbovGdpP对细菌生理活动和致病因子具有重要的调控作用，是研发新药和疫苗的重要潜在靶点，其突变株表现出生长缺陷、细胞黏附能力下降、钾离子和钠离子的耐受能力降低等特征，这些结果不但证实该基因作为毒力相关因子，而且表明突变株可在牛支原体免疫防控中具有潜在的应用价值。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovisHB0801，于2010年2月1日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040。进一步地，本发明的前期工作包括构建了牛支原体HB0801的随机突变体库。

本发明首先利用细胞模型从突变体库中筛选生长缺陷的突变株T6.290，申请人将该菌株命名为牛支原体T6.290，Mycoplasma bovis T6.290，于2018年8月31日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018582。对该突变株进行突变基因鉴定，确定为Mbov_0276株。进一步对该片段进行合成，合成过程中，根据大肠杆菌对密码子偏爱性进行了基因修饰，即，将牛支原体色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，共进行了4个密码子的突变，以保证其在大肠杆菌中表达。

经过人工合成后的牛支原体基因Mbov_0276的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1的1-1527位碱基所示的序列，其长度为1527bp；其中在该序列的387位，648位，1116位和1182位点处发生等位基因突变。

牛支原体MbovGdpP蛋白基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示，共编码509个氨基酸残基。

将本发明的牛支原体Mbov_0276基因的核苷酸序列，通过构建质粒载体pET-28b-Mbov_0276转化大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌pET-28b-Mbov_0276，Escherichia coli pET-28b-Mbov_0276，于2018年8月31日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018580。在IPTG诱导下，该菌株表达Mbov_0276基因编码的重组蛋白rMbovGdpP。

经过验证，本发明纯化的重组蛋白rMbovGdpP具有磷酸二酯酶，超小片段核酸酶，ATP酶和ADP酶活性。

对本发明的牛支原体突变菌株对宿主细胞的黏附能力以及对盐离子的耐受能力进行了检测，所述的检测包括下列步骤：

在体外检测牛支原体与EBL细胞的相互作用比较突变菌株与野生菌株对宿主细胞的黏附能力。方法是将牛支原体HB0801和牛支原体T6.290菌株分别培养至对数末期，以感染比为1000分别感染EBL细胞，作用1h后，洗掉未结合的牛支原体，将细胞裂解，释放出与EBL细胞结合的牛支原体并计数，检测结果显示，牛支原体T6.290突变菌株黏附宿主细胞的能力较野生菌株显著下降。

分别接种等量的HB0801和T6.290至含不同浓度盐离子的培养基中培养48h，对不同条件下生长的牛支原体进行计数，检测结果显示，T6.290对盐离子的耐受能力较野生菌株下降。

本发明具有以下优点：

1、本发明的牛支原体T6.290菌株是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得与细胞共培养条件下筛选得到的生长缺陷突变菌株。

2、本发明的牛支原体Mbov_0276基因是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中筛选获得的生长相关基因，并根据大肠杆菌密码子偏爱性进行了人工修饰。

3、本发明的牛支原体MbovGdpP重组蛋白已被发明人证实具有环二核苷酸磷酸二酯酶，超小片段核酸酶，ATP酶和ADP酶活性。

4、本发明T6.290菌株已被发明人证实对宿主细胞的黏附能力和对盐离子的耐受能力下降。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是本发明牛支原体与细胞共培养条件下的生长缺陷菌株定量检测分析图。附图标记说明：方框所示为生长缺陷突变菌株T6.290。

图2：是本发明实施例中的空质粒(起始质粒)pET-28b的质粒图谱。pET-28b质粒为商业化质粒，购自Novagen公司。

图3：是本发明制备的重组质粒pET-28b-Mbov_0276的图谱。附图标记说明：该重组质粒pET-28b-Mbov_0276是由pET-28b质粒和突变后的Mbov_0276基因经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图4：是本发明纯化的牛支原体rMbovGdpP蛋白胶图。附图标记说明：泳道M：蛋白质marker；泳道1：纯化的牛支原体rMbovGdpP重组蛋白。

图5：是本发明rMbovGdpP酶活性检测图。附图标记说明：图5中的A图：磷酸二酯酶活性检测和超小片段核酸酶活性检测，图5中的B：ATP酶活性检测和ADP酶活性检测。

图6：是本发明牛支原体与EBL细胞共培养生长曲线分析图。

图7：是本发明牛支原体在PPLO培养基中生长曲线分析图。

图8：是本发明牛支原体菌落形态图。附图标记说明：图8中的A图：野生株HB0801菌落形态；图8中的B图：突变株T6.290菌落形态。

图9：是本发明牛支原体对宿主黏附能力检测图。

图10：是本发明牛支原体对盐离子的耐受能力检测图。图10中的A图：牛支原体对KCl的耐受能力检测图；图10中的B图：牛支原体对NaCl的耐受能力检测图。

具体实施方式

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明涉及的牛支原体蛋白基因MbovGdpP的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是牛支原体蛋白基因MbovGdpP的编码的蛋白质序列。

实施例1：牛支原体生长缺陷突变体的筛选的鉴定

1.牛支原体生长缺陷突变体高通量筛选。

将牛支原体突变体库转移至24个96孔板，利用发明人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室构建的细胞共培养生长缺陷实验细胞感染模型和96针复制器，对牛支原体突变体库进行高通量筛选。将EBL细胞按照4×10⁴cell/cm²铺至96孔细胞培养板，利用96针复制器将突变体库接种至细胞中，在37℃，5％CO₂培养箱中共培养72h，经一次冻融(-80℃/+37℃)循环裂解细胞，利用96针复制器将各株突变体涂布PPLO固体平皿，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3-7天。共筛选出16株生长缺陷型突变菌株。

2. 16株牛支原体生长缺陷突变体定量检测的分析。

将EBL细胞按照4×10⁴cell/cm²铺至24孔细胞培养板，利用感染比为0.5将初筛的16株突变体接种至EBL细胞中，设置牛支原体野生株HB0801为阳性对照。将牛支原体突变体与EBL细胞在37℃二氧化碳培养箱中共培养72h。经一次冻融(-80℃/+37℃)循环裂解细胞，利用菌落计数法定量测定16株突变体菌落数。结果显示包含牛支原体突变体的T6.290菌株在内的6株突变菌株具有显著的生长缺陷表型(图1)。

3.突变菌株突变基因的鉴定。

利用细菌基因组提取试剂盒(宝生物工程大连有限公司)，提取筛选出的6株突变体全基因组，对Tn4001转座子与牛支原体基因组(基因组在GenBank上的登录号为CP002058)连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，其中T6.290突变株缺失基因为Mbov_0276，该基因编码的蛋白MbovGdpP，与申请人所在实验室前期研究的CDNPase均含有DHH-DHHA1结构域。与CDNPase不同之处在于，MbovGdpP的N端还含有3个跨膜区。转座子***位点为基因组318376位点后，在该基因的1547位点后。申请人将该菌株命名为牛支原体T6.290，Mycoplasma bovis T6.290，,于2018年8月31日送中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018582。

实施例2：牛支原体MbovGdpP蛋白的表达

1.牛支原体Mbov_0276基因的合成

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到牛支原体地方分离株，将其命名牛支原体HB0801,Mycoplasma bovis HB0801，于2010年2月1日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010040。本发明利用基因合成的方法对Mbov_0276基因的截短表达序列进行了合成，该序列长度为1527bp(见序列表SEQIDNO：1中1-1527位碱基所示的序列，其编码区也是1-1527位碱基对应的序列)。

上述Mbov_0276基因的截短表达序列由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

将合成的Mbov_0276基因片段，用NcoI和XhoI酶切，同时将pET-28b质粒(图2，购自默克中国有限公司)用NcoⅠ和XhoI进行双酶切。将酶切后的Mbov_0276基因和pET-28b质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒pET-28b-Mbov_0276(图3)。用该重组质粒pET-28b-Mbov_0276转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液(PBS)(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液【1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mMDDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水】重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-28b-Mbov_0276转化到大肠杆菌DH5α中得到重组大肠杆菌，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-28b-Mbov_0276；Escherichia coli pET-28b-Mbov_0276，于2018年8月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018580。

2.牛支原体rMbovGdpP重组蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rMbovGdpP蛋白大部分表达于上清中。

rMbovGdpP蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1至4的管中各加入50μL上样缓冲液，煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80V，分离胶电泳条件为直流电压为120V)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白(图5)

实施例3：牛支原体重组蛋白rMbovGdpP酶活性检测

1.牛支原体rMbovGdpP重组蛋白磷酸二酯酶活性的检测

(1)反应体系配制：加入如下反应溶液至1.5mL EP管中：Tris-HCl(pH 7.0)100mM，Mncl₂ 10mM，底物环二核苷酸(环二腺苷酸c-di-AMP和环二鸟苷酸c-di-GMP)50μM，rMbovGdpP重组蛋白5μM。反应总体系为100μL，将配制的反应体系混匀，于37℃进行反应。

(2)磷酸二酯酶活性测定：采用HPLC分离检测方法对样品进行检测，具体设置如下：利用10％甲醇与0.2％的乙酸铵作为流动相，流速1mL/min，柱温箱控制在25℃，自动进样器进样量为10μL，将反应产物进行分离，紫外检测器波长设置为254nm，对反应产物进行检测。同时对标准品c-di-AMP、c-di-GMP、AMP、GMP进行检测，作为标准品的对照。

(3)结果判断：利用相同物质的在色谱柱中的保留时间对测定结果进行判定，将反应产物出峰时间与标准品进行比较，确定反应产物类型。结果显示，重组蛋白rMbovGdpP可以将环二核苷酸c-di-AMP降解为AMP，将c-di-GMP降解为GMP(见图5中的A图)。

2.牛支原体rMbovGdpP重组蛋白超小片段核酸酶活性的检测

(1)反应体系配制：加入如下反应溶液至1.5mL EP管中：Tris-HCl(pH 7.0)100mM，Mncl₂ 10mM，底物超小片段核酸(pApA/pGpG)50μM，rMbovGdpP重组蛋白5μM。反应总体系为100μL，将配制的反应体系混匀，于37℃进行反应。

(2)超小片段核酸酶活性测定：采用HPLC分离检测方法对样品进行检测，具体设置如下：利用10％甲醇与0.2％的乙酸铵作为流动相，流速1mL/min，柱温箱控制在25℃，自动进样器进样量为10μL，将反应产物进行分离，紫外检测器波长设置为254nm，对反应产物进行检测。同时对标准品pApA、pGpG、AMP、GMP进行检测，作为标准品对照。

(3)结果判断：利用相同物质的在色谱柱中的保留时间对测定结果进行判定，将反应产物出峰时间与标准品进行比较，确定反应产物类型。结果显示，重组蛋白rMbovGdpP可以将超小片段核酸pApA/pGpG降解为AMP/GMP(见图5中的A图)。

3.牛支原体rMbovGdpP重组蛋白ATP酶和ADP酶活性的检测

(1)反应体系配制：加入如下反应溶液至1.5mL EP管中，Tris-HCL(pH 7.0)100mM，Mncl₂ 10mM，底物ATP/GTP/ADP/GDP 200μM，rMbovGdpP重组蛋白5μM，反应总体系为100μL将配制的反应体系混匀，于37℃进行反应。

(2)超小片段核酸酶活性测定：采用HPLC分离检测方法对样品进行检测，具体设置如下：利用5％甲醇与0.2％的乙酸铵作为流动相，流速1mL/min，柱温箱控制在25℃，自动进样器进样量为10μL，将反应产物进行分离，紫外检测器波长设置为254nm，对反应产物进行检测。同时对标准品ATP，ADP，AMP和GTP，GDP，GMP进行检测，作为标准品对照。

(3)结果判断：利用相同物质的在色谱柱中的保留时间对测定结果进行判定，将反应产物出峰时间与标准品进行比较，确定反应产物类型。结果显示，重组蛋白rMbovGdpP可以将ATP降解为ADP/AMP，可以将GTP降解为GDP/GMP，可以将ADP降解成AMP，可以将GDP降解成GMP(见图5中的B图)。

实施例4：牛支原体生长曲线的检测

1.牛支原体在EBL细胞中生长曲线的检测

(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体(野生型)HB0801和牛支原体(突变体)T6.290分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基(PPLO粉末10.5g，丙酮酸钠粉末0.5g，酵母2.5g，加入440mL ddH₂O定容并于121℃高温蒸汽灭菌18min，加入10％的马血清50mL，10×MEM 5mL，40万单位/mL青霉素溶液1mL，酚红生长指示剂500μL)，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU计数。即，将培养好的菌液进行10倍倍比稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，37℃，5％CO₂培养箱中静置培养3-7d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数为CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。

(2)EBL细胞培养和计数：将EBL细胞培养于MEM完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的MEM培养基)中，于37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞长至80％满的单细胞层时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min，后立即加入MEM完全培养基终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适当体积的MEM完全培养基吹打制成细胞悬液，并用血球计数板对细胞悬液进行计数。计数方法简述如下：取重悬均匀的细胞悬液适量沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，使盖片下充满悬液，在高倍镜下对血球计数板四周及中间的5个小格中的细胞进行计数，细胞数/mL＝(5个小格的细胞数/20)×稀释倍数×10⁶。

(3)牛支原体与EBL细胞共培养及生长曲线的检测：取计数好的细胞细胞悬液按2×10⁴cells/cm²接种于24孔细胞培养板，即每孔4×10⁴cells。取适量计数好的牛支原体于8000g离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，将洗涤后的牛支原体用适量MEM完全培养基重悬，使细菌数为2×10⁴CFU/mL。取100μL处理好的菌液于含有EBL细胞的培养板中，并添加MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL。将支原体，细胞混合物于37℃，5％CO₂培养箱中培养分别24h，48h，72h。经一次冻融(-80℃/+37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数，结果显示突变菌株的生长速度显著低于野生菌株(图6)。

2.牛支原体在PPLO中生长曲线的检测

取野生型牛支原体HB0801和突变体牛支原体T6.290以1:1000的比例接种PPLO液体培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养36h，到达对数期后，进行CFU计数。将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成10⁵CFU/mL，按感染比为1：10比例接种至PPLO培养基中，37℃，5％CO₂培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数，将各时间点的菌落数对时间作图获得生长曲线，比较突变株和野生株的生长曲线，结果显示突变株相较于野生株在PPLO培养基中生长延迟，野生株生长24h后到达平台期，突变菌株生长36h后到达平台期(图7)。

由于支原体缺乏细胞壁，且其生物合成和代谢能力有限，其生存需依赖于宿主提供的营养物质。在宿主体内的增殖是病原体传播和建立致病性所必需的，MbovGdpP基因的缺失导致牛支原体在宿主细胞条件下表现生长缺陷，可能使其对宿主的致病性产生影响。

实施例5：牛支原体共培养生长缺陷突变体的形态学观察

将培养至对数末期的牛支原体HB0801和T6.290菌株分别稀释适当倍数，涂布于PPLO固体培养基上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3-7d后，在体视显微镜下观察支原体菌落形态，结果显示T6.290突变菌株菌落较野生株HB0801减小(图8)。

实施例6：牛支原体对宿主细胞黏附能力的检测

(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体HB0801和T6.290分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU计数。

(2)EBL细胞的培养：将EBL细胞培养于MEM完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的MEM培养基，Hyclone)中，于37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞长至80％满的单细胞层时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min，后立即加入MEM完全培养基终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适当体积的MEM完全培养基吹打制成细胞悬液，并对细胞悬液进行计数。将计数好的EBL细胞以1×10⁵cell/孔加入至24孔细胞培养板，并于37℃，5％CO₂条件下培养过夜使EBL细胞贴壁。

(3)牛支原体对EBL细胞的黏附：取适量计数好的牛支原体用PBS洗涤3次，并用MEM完全培养基将菌体重悬，按照MOI＝1:1000的感染比加入EBL细胞中，同时设置牛支原体野生株HB0801为阳性对照。37℃，5％CO₂培养箱中中反应1h，用内开的PBS洗涤未黏附的牛支原体3-4次，然后用预冷的内开ddH₂O处理细胞使细胞上黏附的菌均匀分布，然后CFU计数，计数结果显示，T6.290黏附宿主细胞的能力较野生菌株显著降低，降低倍数约为10倍(图9)。

支原体黏附于粘膜上皮细胞是其感染的第一步，不仅有利于其突破宿主细胞的屏障结构，持续增殖，向深层组织侵袭，而且可以激发宿主免疫反应引起疾病发生。因此黏附也被认为是支原体感染的主要毒力因素。C-di-AMP的内环境稳态对病原菌的黏附和毒力具有重要作用，MbovGdpP基因是c-di-AMP特异性酶，参与细胞内c-di-AMP的调节，因此，该基因的缺失会导致细胞内c-di-AMP的积累，同时也导致支原体对宿主黏附能力降低，可能致使支原体对宿主的毒力降低。

实施例7：牛支原体对盐离子耐受能力的检测

将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成10⁵CFU/mL，按1：10比例接种至含有不同浓度钠离子或钾离子(盐离子浓度从0mM到250mM)的PPLO培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中连续静置培养48h，计数观察牛支原体的生长情况，检测结果显示，T6.290菌株对盐离子的敏感性较野生菌株更高(图10)。

MbovGdpP基因的缺失导致牛支原体对盐离子的耐受能力降低，渗透压对细菌细胞的结构，化学和生理有深远的影响，渗透胁迫的适应和耐受机制是细菌在自然环境中存活和生长的关键。所以该基因的缺失可能导致支原体在自然环境中的生存能力降低。

综上所述，Mbov_0276基因编码的蛋白MbovGdpP为具有磷酸二酯酶，超小片段核酸酶，ATP酶和ADP酶的多功能蛋白；与野生株比较，MbovGdpP基因突变株表现出与宿主细胞共培养生长缺陷；在培养基中菌落变小，对数生长期生长变慢；对宿主细胞的黏附能力降低，对盐离子的敏感性升高等特征，这些特征导致该突变株将在防制牛支原体致病和制备药物中具有潜在应用前景。

名词术语说明：

牛支原体MbovGdpP重组蛋白以MbovGdpP表示。

牛支原体MbovGdpP蛋白基因以Mbov_0276表示。

牛支原体MbovGdpP基因突变株以牛支原体T6.290表示。

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用

<141> 2019-02-17

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1527)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1527)

<400> 1

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35 40 45

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85 90 95

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260 265 270

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420 425 430

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Gln Ala Ile Val Ser Glu Lys Asn Glu Gly Tyr Thr Asn

500 505

<210> 2

<211> 509

<212> PRT