CN116478953A - 鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用，涉及生物技术领域，本发明的重组蛋白包括鲍曼不动杆菌DlaT蛋白，所述鲍曼不动杆菌DlaT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明通过构建原核***重组表达载体、重组工程菌，实现了DlaT重组蛋白的高表达量，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。其制备时质量可控，纯化工艺简单快捷。同时该重组蛋白在抵抗鲍曼不动杆菌致死性感染中有较高的免疫保护性，有利于鲍曼不动杆菌疫苗的研发。

Description

鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种非发酵的革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界、医院环境、人体皮肤及呼吸道，已经成为医院感染最常见的病原菌。由于抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌的耐药形式日益严峻，该菌已经成为医院获得感染的主要病原菌之一。这种感染主要表现为呼吸机相关的肺部炎症、败血症、脑膜炎以及烧伤相关的皮肤和软组织感染。而多重耐药不动杆菌的出现对这种感染造成了更大的危险，全球80%的医院获得和呼吸机相关性肺炎病例中存在着多重耐药鲍曼不动杆菌。研发新的疫苗有助于应对鲍曼不动杆菌的威胁以及多重鲍曼不动杆菌的出现。在鲍曼不动杆菌疫苗研究进展中，迄今未知，尚无鲍曼不动杆菌候选疫苗进入临床阶段，当前所研究的疫苗的安全性和稳定性还有所欠缺，因此开发一种安全稳定的疫苗是目前急需解决的问题。
重组蛋白亚单位疫苗具有组分明确，产品纯度可控、易于控制细菌内毒素含量及杂质含量等优点，目前的研究表明其作为潜在疫苗能够在动物实验中发挥保护作用。因此，亟需开发一种抗鲍曼不动杆菌感染的重组蛋白，以适用于鲍曼不动杆菌重组蛋白亚单位疫苗的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶（dihydrolipoamideacyltransferase，DlaT）重组蛋白、制备方法及应用，本发明的鲍曼不动杆菌重组蛋白能够用于制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗。本发明的DlaT重组蛋白生产工艺简便、时间成本低、生长成本低，质量可控，纯度高，具有良好的免疫原性。
二氢硫辛酰胺转乙酰酶（DlaT）作为细菌丙酮酸脱氢酶复合体中的主要组成成分之一，在细菌的糖代谢中具有重要作用，阻断其功能可能影响细菌的生存，繁殖，以及细菌的毒力和致病性。将鲍曼不动杆菌DlaT作为重组蛋白亚单位疫苗进行高效稳定的表达和纯化不但为研制安全高效的预防感染或治疗性疫苗奠定了基础，同时也开拓了对鲍曼不动杆菌疫苗研究的新思路。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白，包括鲍曼不动杆菌DlaT蛋白，所述鲍曼不动杆菌DlaT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据一种优选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了编码所述的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白的多核苷酸。
本发明还提供了所述的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌编码DlaT 蛋白的核苷酸序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌全基因组为模板，根据所设计的PCR引物对编码DlaT 蛋白的目的基因片段进行PCR扩增，其中，正向引物：5`-CGCGGATCCATGGCAACCGAAATTAAAGCA-3`；反向引物：5'-TTATGCGGCCGCCTTAAAGATCAAGAATGAGTTTAGC-3`；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达***中进行诱导表达含有GST标签的DlaT融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得DlaT重组蛋白。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码所述的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白的多核苷酸，所述表达载体为pGEX-6P-2质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，包括所述表达载体。
根据一种优选实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
本发明还提供了所述的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白在制备治疗或预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
根据一种优选实施方式，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
本发明还提供了所述的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
基于上述技术方案，本发明的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白、制备方法及应用至少具有如下有益效果：
1、本发明的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白生产工艺简便，时间成本低，生长成本低，质量可控，所得蛋白可溶性好，最大限度保持了原有的空间构象，纯度高，具有很好的免疫原性。
2、利用本发明的鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白制备的重组亚单位疫苗无毒副作用，能够产生高效价的抗体，具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。且鲍曼不动杆菌DlaT重组蛋白亚单位疫苗成分明确，安全可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是DlaT基因片段的PCR扩增结果图。
图2为重组表达质粒pGEX-6p-2-DlaT的酶切鉴定结果图。
图3为重组表达质粒pGEX-6p-2-DlaT测序与目的蛋白的DNA序列比对结果图。
图4表示在16℃下诱导蛋白表达结果图。
图5为重组工程菌在16℃下诱导表达后，上清中获得含GST标签的融合蛋白，即GST-DlaT及其纯化结果图。
图6为重组工程菌在16℃下诱导表达后，对GST-DlaT融合蛋白酶切后获得DlaT重组蛋白使用离子交换柱精纯后的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
1.菌株
鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978由美国ACTT提供。
2.试剂
质粒pGEX-6p-2（购于GE公司）、大肠杆菌菌株BL21（DE3）（购于擎科公司）；
2×High Fidelity PCR Master Mix、DNA Marker、DNA Ligation Mix购买于北京擎科生物公司；限制性内切酶BamH I和Not I购于美国NEB公司；蛋白Marker为伯乐公司产品。
质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为上海生物公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌DlaT蛋白的克隆。
1.首先在NCBI蛋白数据库中检索鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶DlaT蛋白序列（编号：AIY36145.1），得到其氨基酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，同时检索获得DlaT编码的DNA序列，DNA序列如SEQ ID NO.2所示.
2.采用PCR方法以鲍曼不动杆菌全基因组为模板扩增DlaT蛋白的基因片段，扩增步骤如下：
1）根据鲍曼不动杆菌DlaT基因序列设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO.4和SEQID NO.5，（下划线示酶切位点碱基序列）
正向引物（SEQ ID NO.4）：
5`- CGCGGATCCATGGCAACCGAAATTAAAGCA- 3`
BamH I
反向引物（SEQ ID NO.5）：
5'-TTATGCGGCCGCCTTAAAGATCAAGAATGAGTTTAGC-3`
Not I
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示DlaT蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO.2作为目的基因片段进行PCR扩增。但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ ID NO.2所示DNA序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列氨基端缺失多个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段。
2）从-80℃冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌涂布于TSA固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，放置于恒温摇床中，37℃，220rpm下培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提鲍曼不动杆菌全基因组DNA。
3）以鲍曼不动杆菌全基因组DNA为模板，PCR扩增DlaT蛋白基因片段；
其中，PCR体系：
组分 体积
鲍曼不动杆菌全基因组DNA模板（200 ng/μl） 3μl
正向引物（1μM） 2μl
反向引物（1μM） 3μl
2×High Fidelity PCR Master Mix 25μl
灭菌双蒸水 17μl
总体积 50μl
PCR扩增反应条件：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min12s，30个循环，72℃完全延伸5min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker：DL5000）；泳道1：DlaT基因片段（1197bp）的PCR扩增产物。
4）使用凝胶回收试剂盒回收DlaT PCR产物。
3. PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1）BamH I和Not I分别酶切pGEX-6P-2质粒和DlaT PCR产物，37℃酶切3h。
其中，酶切反应体系：
组分 体积
BamH I 3μl
Not I 3μl
Buffer 15μl
质粒或PCR产物 10μl
H2O 19μl
总体积 50μl
2）使用凝胶回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。
3）连接和转化。
根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2～10，设计以下连接反应体系。
其中，连接反应体系：
组分 体积
DNA Ligation Mix 5μl
目的基因酶切回收产物 4.5μl
PGEX-6P-2酶切回收产物 0.5μl
总体积 10μl
混匀，37℃连接30min。
4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入500 ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。
各管以4000 rpm室温离心5min，弃去400 ul上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养12h。
5）pGEX-6p-2/DlaT重组表达质粒的筛选、鉴定。
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取连接产物转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
其中，双酶切反应体系：
BamH I 0.5μl
Not I 0.5μl
Buffer 5μl
质粒 5μl
H2O 9μl
总体积 20μl
37℃酶切1h；
④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker：TSJ102-1 kb DNA Ladder）；泳道1：重组表达质粒pGEX-6p-2/DlaT经酶切后的鉴定结果，均表示酶切后分离的片段4000bp和1197bp，可见泳道1中酶切产生的片段与目的基因DNA片段大小相同，说明pGEX-6p-2/DlaT重组表达质粒构建成功。
⑤pGEX-6p-2/DlaT重组表达质粒送往上海生工生物公司测序，经比对测序正确如图3所示，即重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。
实施例2：鲍曼不动杆菌DlaT蛋白在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定。
1. 目的蛋白诱导表达。
1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-DlaT/BL21（DE3）菌液100μL加入10mL Amp 抗性的TB培养基中，100rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18mL Amp 抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2～3h，转速250rpm，二次活化至OD600为0.8～1.2时，加入IPTG使其终浓度为200μM（加入前，取2ml菌液，12000rpm/min，离心10min收集菌体作为诱导前），再置于摇床诱导表达16℃过夜诱导表达。
2）将诱导表达后的菌液取出，以1000rpm离心2min，弃去上清，加入1mL PBS缓冲液混匀，超声裂解10min，超声5s，暂停5s，防治蛋白过热，用2ml EP管收集超声后的液体，使用高速离心机，4℃ 14000rpm离心15min，收集上清，剩下的沉淀用1mlPBS缓冲液重悬，诱导前的菌体操作同样如此。对收集诱导后的上清液和沉淀，分别取40ul，加入5x SDS 上样缓冲液 10ul,在金属浴中，100℃条件下，变形5min，变性完成后，取10ul变性后样品，对诱导前蛋白，诱导后蛋白以及诱导后蛋白上清和蛋白沉淀进行SDS-PAGE检测（图4）。从图4结果可见：泳道M：蛋白分子量标准（Marker）；泳道“-”：重组工程菌在诱导表达前，全菌的蛋白条带；泳道“+”：重组工程菌在16℃下诱导表达后，全菌中表达的含GST标签的融合蛋白，即GST-DlaT；泳道“S”：重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清中获得的GST-DlaT融合蛋白。经诱导后，“+”泳道中目的蛋白明显表达，凝胶图片经ImageJ软件分析目的蛋白的灰度值占整个泳道蛋白的灰度值，计算其蛋白含量约占为总蛋白的30%，提示重组蛋白表达量高。且蛋白表达大部分可以在细菌裂解上清中检测到（泳道S），说明蛋白以可溶形式表达，可溶形式蛋白表达有利于保持蛋白的构象，功能以及后续的纯化以及疫苗大规模生产的工艺扩大。结果显示重组蛋白GST-DlaT可有效表达，且在细菌上清中，以可溶形式表达，箭头所示为重组蛋白GST-DlaT，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。同时本发明所获得的pGEX-6P-2-BL21(DE3)重组工程菌具有易于培养，纯化周期短，安全可控，方便操作的优点。
实施例3：DlaT重组蛋白抗原的制备。
1．放大培养获取融合蛋白GST-DlaT。
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2- DlaT/BL21（DE3）菌种接种于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于100ml 氨苄抗性LB培养基（氨苄浓度为100ug/ml），37℃，200rpm培养过夜；将活化的100ml菌液加入到2L含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为0.8时，加入1ml IPTG（终浓度为500uM）置于16℃摇床中诱导12h后，6000rpm离心20min收集菌体,再加80ml PBS重悬菌体后，用高压均质仪器（800bar，流速25）循环破碎5个循环，破碎后使用落地式高速离心机12000rpm，离心30min，收集上清与4ml谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B结合；获得大量的含有GST标签的二氢硫辛酰胺转乙酰酶融合蛋白。
2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取DlaT重组蛋白。
向余下约4ml已结合目的蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μLPreScission protease（PP酶），4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后，分别用2ml PBS洗涤2次，取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在呈相***下观察结果，酶切后获得DlaT蛋白分子量在43kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，泳道M：蛋白分子量标准（Marker），泳道1表示重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清获取的目的蛋白，泳道2表示酶切后第一次洗涤后的融合蛋白、目的蛋白和GST蛋白，泳道3表示酶切后，第二次洗涤凝胶珠获取的的目的蛋白，泳道4表示酶切后，结合在凝胶珠上蛋白。
3.置换缓冲液，将目的蛋白保存于PBS（pH=8.0）缓冲液中。
4.使用离子交换柱对DlaT重组蛋白进行进一步纯化，获取高纯度的DlaT重组蛋白。
取出离子交换柱，并连接安装，用去离子水冲洗交换柱5个柱体积，用过滤后PBS（pH=8.0）溶液对柱进行充分平衡；对保存于PBS（pH=8.0）缓冲液中样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；用含有10mM NaCl和20mM NaCl先后对交换柱的杂蛋白进行冲洗，以出去杂蛋白；使用线性的方法对目的蛋白进行洗脱，并收集流出液进行电泳检测，如图6所示，泳道M：蛋白分子量标准（Marker）；泳道1表示使用离子交换柱后精纯的DlaT重组蛋白，用Image J软件扫描蛋白胶中目的蛋白DlaT条带灰度值占整个泳道的蛋白总灰度值的比例，计算得到其蛋白纯度达到97.8%。
5.按照BCA法蛋白测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，最终测定浓度为2.2mg/mL。
实施例4：小鼠鲍曼不动杆菌感染模型的构建。
将鲍曼不动杆菌用三线法接种于TSA固体培养基平板，37℃恒温孵育16小时；在平板上挑取单菌落，接种于10ml TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养。5小时后收集菌体，用无菌PBS稀释15倍后测其OD600的值，并以1.5×109CFU/ml/OD600进行计算，将菌液稀释至1×108CFU/ml、2×108CFU/ml、3×108CFU/ml，4×108CFU/ml三种不同浓度，再将各组菌液经静脉注射入C57Bl/6雌性小鼠尾静脉（100μL/只）。6-8周龄、体重为18-20g的小鼠最佳。设置每组5只小鼠，连续观察7天并统计各组小鼠的死亡率。最终得到鲍曼不动杆菌感染剂量为3×107CFU/只小鼠，后续小鼠模型构建均选用此剂量（表１）。
表1：鲍曼不动杆菌致死剂量的确定
感染剂量（CFU/mouse） 小鼠（只） 七天内死亡数（只） 死亡率
1 x 107 5 0 0
2 x 107 5 2 40%
3 x 107 5 5 100%
4 x 107 5 5 100%
实施例5：DlaT重组蛋白亚单位疫苗的制备。
将重组DlaT蛋白与不同的佐剂进行吸附做预实验并检测吸附效果，发现氢氧化铝佐剂吸附效率最好，后续主要氢氧化铝作为佐剂成分，进行吸附制备亚单位疫苗。经摸索后的方法如下：量取氢氧化铝佐剂用pH6.0的组氨酸稀释液调整浓度到5 mg/ml，充分混匀，得溶液A；用pH6.0的组氨酸稀释液将DlaT重组蛋白稀释至200 μg/mL，得溶液B；取等体积的溶液A和溶液B于4℃条件下旋转混悬吸附1小时后获得疫苗。 同样条件将重组抗原溶液用疫苗稀释液替代制备不含抗原的佐剂对照制剂。
实施例6：重组蛋白DlaT免疫动物。
1. 免疫动物。
1）首次免疫，用胰岛素针头，于小鼠大腿内侧行肌肉注射，每只C57Bl/6小鼠注射量为200μL，左右大腿各100μl，并设置佐剂对照组。
2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿外侧；
3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿内侧；
2．第三次免疫后第7天，采集C57Bl/6小鼠的静脉血，凝固后离心分离血清，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。
实施例7：ELISA检测EF-Ts重组蛋白特异性抗体。
1. ELISA试剂盒的制备。
1）配置试剂：包被液：0.05 M碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.6g/L，Na2CO3 2.9g/L，pH9.6）；洗涤液为PBST（PBS+0.05%吐温-20，pH7.4）；封闭液为含PBS（pH7.4）+3% BSA；血清及抗体稀释液为PBS（pH7.4）+1% BSA +0.05%吐温-20，终止液为2M H2SO4。
2）包被抗原：用包被液将纯化后的DlaT重组蛋白稀释为4μg/ml；将稀释好的重组蛋白加入酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜后用洗涤液洗涤4遍；
3）封闭：抗原包被后的酶标板加封闭液，100μL/孔，37℃孵育2小时，洗涤4遍即获得检测抗体用ELISA试剂板；
4) 配以HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体以及抗体稀释液，TMB显色液及终止液即为DlaT抗体检测试剂盒。
2. DlaT重组蛋白特异性抗体的检测。
1）将DlaT蛋白免疫后的血清及对照组血清分别进行倍比稀释，稀释梯度设置为1:1000、1:5000、1:25000、1: 125000；
2）取ELISA检测试剂盒中封闭好的酶标板，依次加入不同稀释浓度的血清，100μL/孔，同时设置PBS空白孔置于37℃孵育箱2h，洗涤3遍，控干；
3）将HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体储存液以1:10000稀释，制成抗体工作液；
4）加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤5遍，控干；
5）加入底物显色液TMB，100μL/孔，室温避光反应5-10 min；
6）加入终止液50μL/孔，置于酶标仪上以450 nm波长处测定OD450值；
7）结果判断：OD样品∕OD阴性值≧2.1为阳性。
表2：ELISA检测重组蛋白免疫后抗体（OD450）
稀释倍数 佐剂对照组 DlaT免疫组
125000 0.045 0.471
25000 0.037 1.282
5000 0.034 2.489
1000 0.034 3.579
结果：DlaT蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法建立成功，可以用于DlaT蛋白特异性抗体的检测。用此试剂盒检测DlaT蛋白抗体效价，结果显示（表2）DlaT蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体在稀释125000后OD450仍高达0.471，抗体效价高于1：125000，说明本发明制备的DlaT重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生高效价的特异性抗体，具有很好的免疫原性。
实施例8：通过免疫小鼠确定DlaT重组蛋白免疫动物的攻毒保护。
同实施例6的免疫方案，第三次免疫后第14天采用致死剂量，经尾静脉注射鲍曼不动杆菌活菌进行攻毒，每只小鼠注射菌量为3×107CFU，注射体积为100μl，观察7天，统计各组小鼠的存活率。结果示于下表3。
表3：动物免疫保护结果
组别 小鼠（只） 免疫组分 死亡数 死亡率（%） 保护率（%）
DlaT蛋白免疫组 10 DlaT+ Al(OH)3佐剂 4 40 55.55
佐剂对照组 10 Al(OH)3佐剂 9 90 0
表3显示为动物免疫试验结果，佐剂对照组的死亡率为90% ，Dlat疫苗免疫组死亡率40%，根据公式计算免疫保护率：[免疫保护率=（对照组发病率-接种组发病率）/对照组发病率×100%]，Dlat蛋白免疫组的保护率为55.55%。
通过本发明所制备的DlaT重组蛋白，具有纯度高（如图6所示，通过ImageJ软件计算后得到蛋白纯度为97.8%），对鲍曼不动杆菌感染保护效果好，在小鼠实验中，DlaT重组蛋白辅以Al(OH)3佐剂组的免疫保护率为55.55%，且无毒副作用的优点。因此，本发明的二氢硫辛酰胺酰基转移酶DlaT重组蛋白具有良好的免疫原性，能够激发机体产生特异抗体，能够对鲍曼不动杆菌感染起到良好的免疫保护效果。
本发明所制备的重组蛋白能够与其他相关试剂，例如检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白，其特征在于，包括鲍曼不动杆菌DlaT蛋白，所述鲍曼不动杆菌DlaT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白的多核苷酸。
3.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌DlaT蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌全基因组为模板，根据所设计的PCR引物对编码DlaT蛋白的目的基因片段进行PCR扩增，其中，正向引物：5`-CGCGGATCCATGGCAACCGAAATTAAAGCA-3`；反向引物：5'-TTATGCGGCCGCCTTAAAGATCAAGAATGAGTTTAGC-3`；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达***中进行诱导表达含有GST标签的DlaT融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得DlaT重组蛋白。
4.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白在制备预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
6.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌二氢硫辛酰胺转乙酰酶重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
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