CN107056898A

CN107056898A - 鲤疱疹病毒3型1301株orf136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

Info

Publication number: CN107056898A
Application number: CN201710076686.6A
Authority: CN
Inventors: 王庆; 郑树城; 李莹莹; 曾伟伟; 王英英; 刘春�; 任燕; 石存斌; 黄琦雯
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-02-13
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明公开了一种鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、多克隆抗体及其应用。本发明提供的鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白，其全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码该蛋白的全长核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明选取ORF136部分基因序列构建pET32a‑ORF136重组原核表达载体，经IPTG诱导表达后得到重组表达蛋白，经免疫兔子获得多克隆抗体，将所得多克隆抗体用纯化的CyHV‑3病毒和感染CyHV‑3的KS细胞进行western blot分析，并进一步采用间接免疫荧光实验验证抗体的检测应用。ORF136基因重组表达蛋白多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV‑3血清学诊断方法的建立提供了重要材料。

Description

鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及由鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、由ORF136重组表达蛋白制备的多克隆抗体及其应用，进一步涉及多克隆抗体的制备方法。

背景技术

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3，CyHV-3)，又称为锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus，KHV)，是引起鲤鱼、锦鲤及其变种高度传染性锦鲤疱疹病毒病(Koiherpesvirus disease,KHVD)的病原。该病自从1997年在欧洲发现以来，多个国家和地区都报道了由该疾病引起的鲤鱼或锦鲤暴发性死亡现象，给鲤鱼及锦鲤养殖产业带来了严重的经济损失。CyHV-3属于疱疹病毒目，异疱疹病毒科，鲤疱疹病毒属，是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长295kbp，两端为22kbp的正向重复序列，共编码164个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，包括8个重复ORF，是已知基因组最大的疱疹病毒。

目前，运用质谱学的方法已鉴定到46种病毒结构蛋白。其中，Michel等运用液相串联色谱技术在KHV-FL株中鉴定到13种囊膜蛋白、3种核衣壳蛋白、2种皮层蛋白和22种未知蛋白共40种结构蛋白。随后，Yi等通过对亚洲型KHV-GZ10和欧洲型KHV-GZ11进行质谱鉴定，将鉴定的结构蛋白增加至46种。虽然通过蛋白质质谱鉴定对CyHV-3病毒蛋白有了一定的认识，但大部分蛋白的精确定位和功能研究仍处于空白，只有少数蛋白进行了较深入的鉴定，其中，ORF81编码蛋白是研究较多的结构蛋白之一。另外，Fuchs等还对部分囊膜蛋白ORF25、ORF65、ORF99、ORF136、ORF149和主要衣壳蛋白ORF92进行了初步鉴定。

本发明选择的ORF136在亚洲型和欧洲型分离株中存在核苷酸序列差异，其完整开放阅读框长度分别为474bp和462bp，该基因可作为CyHV-3分子分型的有效工具。虽然蛋白质谱分析显示ORF136编码蛋白为结构蛋白，但未见具体的验证，其深入的功能定位还不清楚，更多相关研究仍有待开展。

虽然目前已有很多CyHV-3的检测诊断方法，但在实际广泛应用中主要还是基于分子的检测技术，血清学诊断并没有得到广泛的应用。尤其是对于潜伏感染的宿主来说，基于分子的检测并不能判断宿主体内是否存在病毒，而血清学诊断技术能弥补这个缺陷。基于免疫学的抗原检测方法的建立，需要有能特异性识别CyHV-3的抗体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种锂疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白及其制备的多克隆抗体，进一步提供所述多克隆抗体用于检测ORF136基因病毒的应用，以及多克隆抗体的制备方法。

为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白，其全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明在于提供一种编码鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白的核苷酸，其全长核苷酸碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

一方面，本发明提供一种多克隆抗体，其是以氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白为抗原在免疫动物中制备所得。

进一步地，本发明所述如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的一部分；其具体制备过程为将鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因进行PCR扩增后，得到重组克隆载体pMD18-T-ORF136；将重组克隆载体pMD18-T-ORF136、原核表达载体pET-32a(+)分别进行双酶切后进行连接，构建重组原核表达载体pET-32a-ORF136；将pET-32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta经IPTG诱导表达后得到如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白。

进一步地，本发明所述的多克隆抗体制备过程如下：将如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白对兔子进行皮下多点注射免疫，免疫后进行采血；将血液静置后，离心，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体。

另一方面，本发明在于提供一种本发明所述的多克隆抗体用于制备检测鲤疱疹病毒3型的免疫工具的应用。本发明所述的免疫工具包括但不限于，试剂、试剂盒、芯片或试纸。

更进一步地，本发明所述的多克隆抗体在检测、预防或治疗鲤疱疹病毒3型感染引起的相关疾病中的应用。

另一方面，本发明在于提供一种检测鲤疱疹病毒3型的试剂盒，含有本发明所述的鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白的抗体。

另一方面，本发明提供一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，具体制备步骤如下：

1)扩增：以鲤疱疹病毒3型1301株DNA为模板，设计特异性引物对ORF136基因编码蛋白第91～471位核苷酸区域进行PCR扩增，得到重组克隆载体pMD18-T-ORF136；

2)构建：将重组克隆载体pMD18-T-ORF136、原核表达载体pET-32a(+)分别进行双酶切后连接，构建重组原核表达载体pET-32a-ORF136；

3)表达：将pET-32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta经IPTG诱导表达后得到如SEQID NO:5所示的重组表达蛋白；

4)制备：将如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白在免疫动物中免疫后进行采血；对血液进行处理后得到多克隆抗体。

进一步地，本发明所述的一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，所述步骤2)中酶切的体系为：10×buffer 2ul，EcoR I和Xho I各1ul，质粒1ug，补ddH₂O水至20ul；37℃水浴酶切2h。

进一步地，本发明所述的一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，所述步骤2)中连接的体系为：T4Ligase 1.5uL，10×T4Ligase buffer 1.5uL，pET-32a(+)3uL，酶切后的片段9uL；16℃连接过夜。

进一步地，本发明所述的一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，所述步骤3)中pET32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta中，筛选阳性克隆，接种于含有氨苄的LB培养基中，培养至OD600为0.4，加入IPTG进行表达诱导后，离心收集菌体，将菌体进行清洗、破碎、离心后收集包涵体蛋白，包涵体蛋白纯化后得到重组表达蛋白。

进一步地，本发明所述的一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，所述步骤3)中菌体破碎采用冰上超声波破碎。

进一步地，本发明所述的一种制备本发明所述的多克隆抗体的方法，所述步骤4)中重组表达蛋白在免疫动物中进行皮下多点注射免疫，免疫后进行采血；将血液静置后，离心，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体。

进一步地，本发明所述特异性引物为

F:CCGGAATTCGGCACAACAACCATGAACTCTACC(SEQ ID NO:3)(含EcoR I酶切位点，见下划线部分)

R:CCGCTCGAGTTAGATTTTTCTAAAGTGCACGACGTC(SEQ ID NO:4)(含Xho I酶切位点，见下划线部分)。

本发明通过生物信息学软件，筛选KHV ORF136基因编码蛋白第31～157位氨基酸区域为较完整的潜在B细胞抗原表位，构建pET-32a-ORF136重组原核表达载体；通过IPTG诱导表达后纯化重组蛋白，经免疫兔子获得多克隆抗体，并用纯化的CyHV-3病毒和感染CyHV-3的KS细胞进行免疫印迹分析(Western blot)，并进一步采用间接免疫荧光实验验证抗体的检测应用。ORF136基因重组表达蛋白多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要材料。

本发明抗体的制备方法具有较高的回收率和较好的保持蛋白的生物活性，适合大规模纯化和制备。本发明中多克隆抗体的纯度高，易于产业化。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供一种鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白，并将该蛋白产生多克隆抗体。该重组蛋白能用于鲤疱疹病毒3型的检测应用。本发明提供一种能特异性识别CyHV-3的多克隆抗体，并提供制备的ORF136基因重组表达蛋白多克隆抗体的方法，所述多克隆抗体能特异性识别纯化的病毒和感染CyHV-3的细胞，在后续CyHV-3血清学诊断方法的建立中具有一定的应用价值，可用于临床、实验室检测和流行病学研究。本发明提供的制备方法简单，易操作。

附图说明

图1为CyHV-3ORF136基因(第91～471位核苷酸)PCR扩增产物电泳图；图1中M为DLmarker 2000；1为以KHV DNA为模板的PCR扩增产物；

图2为重组质粒pET32a-ORF136双酶切鉴定结果；图2中M为DL marker 10000；1为重组质粒pET32a-ORF136双酶切产物；2为空载体pET32a(+)双酶切产物；

图3为SDS-PAGE分析重组质粒pET32a-ORF136表达产物；图3中M为低分子质量蛋白质marker；1为pET32a-ORF136诱导表达上清；2～4为pET32a-ORF136诱导表达包涵体2倍、5倍和10倍稀释；

图4为western blot分析ORF136编码蛋白抗血清特性；图4中M低分子质量蛋白质marker；1为纯化的CyHV-3 1301株；2为感染CyHV-3的KS细胞；3为未感染CyHV-3的KS细胞上清；4为未感染的KS细胞；

图5为利用多克隆抗体检测病毒感染的细胞；图5中A为接种CyHV-3 1301株的KS细胞；B为未接种病毒的正常KS细胞对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

步骤一、KHV 1301株ORF136基因的扩增

根据GenBank中CyHV-3ORF136基因序列，用生物信息学软件ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)和DNAstar子模块Protean预测ORF136基因潜在B细胞抗原表位。

用Primer Premier 5.0设计特异性引物(特异性引物为：

F:CCGGAATTCGGCACAACAACCATGAACTCTACC(SEQ ID NO:3)(含EcoR I酶切位点，见下划线部分)，

R:CCGCTCGAGTTAGATTTTTCTAAAGTGCACGACGTC(SEQ ID NO:4)(含Xho I酶切位点，见下划线部分)，

并由生工生物公司合成。

病毒基因组提取按血液/细胞/组织DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)中的说明书进行。

PCR反应体系：12.5ul rTaq Mix、引物各1ul(10umol/L)和1ul DNA模板，补灭菌水至25ul。

反应程序如下：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，7min。

以F/R为引物，针对ORF136基因潜在B细胞抗原表位区域(即ORF136基因编码蛋白第91～471位核苷酸区域，即第31～157位氨基酸区域)，以鲤疱疹病毒3型1301株为模板进行PCR扩增，1.5％的琼脂糖电泳分析显示获得一条与预期大小相符的条带，片段大小为381bp(具体如图1所示)。

步骤二、重组原核表达载体pET32a-ORF136的构建

对步骤一扩增的重组克隆载体pMD18-T-ORF136、原核表达载体pET-32a(+)分别进行双酶切(酶为EcoR I和Xho I酶)，并将重组克隆载体***片段和双酶切后的原核表达载体进行连接，得到重组原核表达载体。实验条件如下：

酶切体系为：10×buffer 2ul，EcoR I和Xho I各1ul，质粒1ug，补dd H₂O水至20ul。37℃水浴酶切2h。酶切后，电泳鉴定酶切效果，并对重组克隆中载体***片段0RF136和双酶切后的原核表达载体pET-32a(+)进行割胶回收。

连接体系：T4Ligase 1.5uL，10×T4Ligase buffer 1.5uL，pET-32a(+)3uL，酶切后的片段9uL。16℃连接，过夜。

将连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR。

将构建的重组原核表达载体pET32a-ORF136进行双酶切鉴定，获得与预期大小相符的两条条带，表明重组原核表达载体构建成功(具体如图2所示)。

步骤三、蛋白表达

将步骤二鉴定正确的重组原核表达载体pET32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，筛选阳性克隆，接种于含有氨苄的LB培养基中，在37℃下摇床培养至OD600为0.4，加入终浓度为0.8mM的IPTG进行表达诱导，4h后10000rpm/min离心5min收集菌体，进行少量表达鉴定。

将收集的菌体用PBS清洗2次后，重悬，在冰上超声波破碎，10000rpm/min离心5min，分别收集上清和包涵体沉淀，运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。

SDS-PAGE分析，结果显示获得与目的大小相符的蛋白条带，大小约为35kDa(载体约为20kDa，ORF136第31～157位氨基酸预测蛋白分子量约为14kDa)，且目的蛋白主要分布在包涵体中(图3)。

参照Ni-凝胶纯化试剂盒的方法对包涵体蛋白进行纯化，得到纯化的重组表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

步骤四、多克隆抗体制备与纯化

将步骤三纯化的重组表达蛋白对兔子进行皮下多点注射免疫(首次免疫采用弗氏完全佐剂，后三次免疫采用弗氏不完全佐剂，佐剂和重组表达蛋白体积比为1:1)，免疫66天后，进行颈动脉采血。将血液于37℃静置1h后，3000rpm/min离心10min，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体，于-20℃下保存。

实施例2

SDS-PAGE与免疫印迹分析(Western blot)

聚丙烯酰胺凝胶由12％的分离胶和4％的浓缩胶组成，将纯化的CyHV-3 1301株病毒、RIPA裂解液裂解后感染CyHV-3的KS细胞和未感染CyHV-3的KS细胞分别与5×蛋白上样缓冲液按比例混合后在沸水中加热5min，冷却后点样进行电泳分析(200V，35min)。将SDS-PAGE分离后的凝胶用湿转的方法转移至硝酸纤维素膜，5％的脱脂奶粉室温封闭1h，然后用封闭剂1:1000稀释的实施例1步骤四得到的多克隆抗体室温下孵育1h，接着用0.05％的PBST清洗3次，每次10min；最后用封闭剂1:10000稀释的HRP标记羊抗兔IgG室温孵育1h，用0.05％的PBST清洗3次后进行DAB显色。

Western blot分析结果显示，在15～25kDa之间出现一条特异条带(如图4所示)，ORF136编码蛋白预测分子量约为17kDa，与预期大小一致，说明本发明制备的多克隆抗体能特异性识别CyHV-3。

实施例3

间接免疫荧光试验检测感染细胞

将锦鲤吻端细胞(KS细胞)传代至96孔细胞培养板中，待细胞长至单层铺满80％左右后，感染CyHV-3 1301株病毒；感染病毒5d后，将细胞培养板中的培养基吸尽，用0.01mol/L的PBS洗涤3次，加入80％的丙酮溶液室温孵育30min，吸去丙酮，室温干燥1h；每孔加100μl1：1000稀释的兔抗ORF136蛋白多克隆抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入1:50稀释的羊抗兔IgG-FITC标记的荧光二抗100μl，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，最后加入细胞核染料碘化丙啶(PI)作用5min，荧光倒置显微镜(Nikon，Eclipse Ti-S)下观察结果。阴性对照为未感染病毒的正常KS细胞。

间接免疫荧光实验的结果显示，制备的多克隆抗体能使感染CyHV-3 1301毒株的KS细胞能产生特异性的荧光(见图5A)，而在未感染病毒的正常KS细胞中观察不到荧光信号(图5B)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白、抗体及其应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 474

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

atgaaggcct ctaaactgct gctggttaca tgggtggctt tcgcggccgg ccagaacgcc 60

accaccctgg ctccgctcgc cgccactaac ggcacaacaa ccatgaactc tacctggtcc 120

tctaccgctt cagtcatgaa ctctactacc tggtcctcta ctatgaactc tacctggtcc 180

accaccaccg cggcgagcgg cgactcttgg tggcgcccag aagaggtgct gtctaggtgt 240

agggaccagg ccggactgaa ctggctgggg tgcgctcagg gtatggtggt ggtgatggtc 300

atcttcgcta tcatctttgc catcatcgtg atcgtcgtgg tgtgggtgct gatgcacgtc 360

gtgatcgccc gtcgcgaccc agccggcgcg gcagggccag gagccatgtc tgcatcctac 420

aacaggggct acgtcgagga tgaagacgac gtcgtgcact ttagaaaaat ctaa 474

<210> 2

<211> 157

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Met Lys Ala Ser Lys Leu Leu Leu Val Thr Trp Val Ala Phe Ala Ala

1 5 10 15

Gly Gln Asn Ala Thr Thr Leu Ala Pro Leu Ala Ala Thr Asn Gly Thr

20 25 30

Thr Thr Met Asn Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ser Val Met Asn Ser

35 40 45

Thr Thr Trp Ser Ser Thr Met Asn Ser Thr Trp Ser Thr Thr Thr Ala

50 55 60

Ala Ser Gly Asp Ser Trp Trp Arg Pro Glu Glu Val Leu Ser Arg Cys

65 70 75 80

Arg Asp Gln Ala Gly Leu Asn Trp Leu Gly Cys Ala Gln Gly Met Val

85 90 95

Val Val Met Val Ile Phe Ala Ile Ile Phe Ala Ile Ile Val Ile Val

100 105 110

Val Val Trp Val Leu Met His Val Val Ile Ala Arg Arg Asp Pro Ala

115 120 125

Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ala Met Ser Ala Ser Tyr Asn Arg Gly Tyr

130 135 140

Val Glu Asp Glu Asp Asp Val Val His Phe Arg Lys Ile

145 150 155

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

ccggaattcg gcacaacaac catgaactct acc 33

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

ccgctcgagt tagatttttc taaagtgcac gacgtc 36

<210> 5

<211> 127

<212> PRT

<213> 未知

<400> 5

Gly Thr Thr Thr Met Asn Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ser Val Met

1 5 10 15

Asn Ser Thr Thr Trp Ser Ser Thr Met Asn Ser Thr Trp Ser Thr Thr

20 25 30

Thr Ala Ala Ser Gly Asp Ser Trp Trp Arg Pro Glu Glu Val Leu Ser

35 40 45

Arg Cys Arg Asp Gln Ala Gly Leu Asn Trp Leu Gly Cys Ala Gln Gly

50 55 60

Met Val Val Val Met Val Ile Phe Ala Ile Ile Phe Ala Ile Ile Val

65 70 75 80

Ile Val Val Val Trp Val Leu Met His Val Val Ile Ala Arg Arg Asp

85 90 95

Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ala Met Ser Ala Ser Tyr Asn Arg

100 105 110

Gly Tyr Val Glu Asp Glu Asp Asp Val Val His Phe Arg Lys Ile

115 120 125

Claims

1.一种鲤疱疹病毒3型1301株ORF136基因重组表达蛋白，其特征在于，其全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述的重组表达蛋白的核苷酸，其特征在于，其全长核苷酸碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种多克隆抗体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的重组表达蛋白为抗原在免疫动物中制备所得。

4.权利要求3所述的抗体制备用于检测锂疱疹病毒3型的免疫工具的应用。

5.权利要求3所述的抗体在检测、预防或治疗鲤疱疹病毒3型感染引起的相关疾病中的应用。

6.一种制备权利要求3所述的多克隆抗体的方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

1)扩增：以鲤疱疹病毒3型1301株DNA为模板，设计特异性引物对ORF136基因编码蛋白第31～157位氨基酸区域进行PCR扩增，得到重组克隆载体pMD18-T-ORF136；

3)表达：将pET-32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta经IPTG诱导表达后得到如SEQ IDNO:5所示的重组表达蛋白；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，

所述步骤2)中酶切的体系为：10×buffer 2ul，EcoR I和Xho I各1ul，质粒1ug，补ddH₂O水至20ul；37℃水浴酶切2h；

所述步骤2)中连接的体系为：T4Ligase 1.5uL，10×T4Ligase buffer 1.5uL，pET-32a(+)3uL，酶切后的片段9uL；16℃连接过夜。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中pET32a-ORF136转化至大肠杆菌Rosetta中，筛选阳性克隆，接种于含有氨苄的LB培养基中，培养至OD600为0.4，加入IPTG进行表达诱导后，离心收集菌体，将菌体进行清洗、破碎、离心后收集包涵体蛋白，包涵体蛋白纯化后得到重组表达蛋白。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中重组表达蛋白在免疫动物中进行皮下多点注射免疫，免疫后进行采血；将血液静置后，离心，收集血清，用亲和纯化的方式对抗血清进行纯化，得到多克隆抗体。