CN111621506B - 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0145基因编码的蛋白，所述牛支原体Mbov_0145基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，本发明还公开了其抗体，以及所述蛋白和抗体在制备牛支原体检测试剂盒中的应用，属于动物传染病防治技术领域。该蛋白能与牛支原体毒力株M.bovis HB0801自然感染和人工感染牛阳性血清发生特异性反应，可以鉴别疫苗免疫后发生野毒感染的动物。可望作为牛支原体感染的诊断试剂、疫苗和药物研发的分子靶标，在牛支原体防控中发挥重要作用。

Description

牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及到一种牛支原体分泌蛋白MbovP0145、其抗体，以及所述蛋白和抗体在制备牛支原体检测试剂盒中的应用。

背景技术

牛支原体是致牛呼吸道疾病综合征的重要病原，常在运输应激后爆发，引起牛肺炎、乳腺炎，并继发关节炎、流产和***等病症，是当今危害世界养牛业的重要常发传染病之一。随着牛业国内国际贸易的迅速发展，牛支原体病已呈全球范围传播的趋势。我国于2008年首次报道肉牛爆发牛支原体肺炎，发病率为80％以上，病死率10％以上，可高达40％。此后全国多个省市和地区的肉牛和奶牛不断爆发牛支原体肺炎，目前已成广泛流行状态，严重危害我国肉牛和奶牛业的发展。由于支原体无细胞壁，对青霉素类药物先天性耐药，再加上其它抗生素耐药性的增加，给临床治疗带来严重的影响。并且尚无疫苗用于牛支原体病的有效预防。因此，早诊断早治疗是当前唯一可靠的控制方法。

当前用于诊断牛支原体病的金标准是病原分离，此方法耗时耗力且需要配置专业实验室以及专业人员，不适用于临床批量、快速和早期检测。此外培养物的PCR检测方法依然存在假阳性过高、易污染等问题。综合起来，ELISA方法仍然是一种敏感性高、特异性强且可在短时间内检测大量样品的诊断技术。建立优秀的ELISA抗原或抗体诊断方法的关键是筛选有效的牛支原体诊断靶标。同时，免疫原性良好的靶标分子也是新型疫苗研发的侯选靶标。

分泌蛋白一般是病原菌的毒素、黏附素和决定毒力的酶，参与细菌黏附、侵袭、增殖以及抑制宿主防御机制等过程，是细菌之间、细菌与宿主间交流的重要分子，也是近年来寻找诊断、疫苗和药物靶标的重要结构。本发明发现牛支原体一个分泌脂蛋白MbovP0145，由Mbov_0145基因编码。在大肠杆菌表达的重组蛋白rMbovP0145能够与牛支原体毒力株M.bovis HB0801自然感染和人工感染牛的血清发生特异性反应，但不与其弱毒力菌株M.bovis HB0801-150感染牛的血清发生免疫反应。因此，该蛋白是一种抗原性蛋白，且可能与毒力相关，可望成为牛支原体新型血清学诊断试剂、疫苗和药物的潜在靶标，对牛支原体病的防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个牛支原体免疫原性分泌蛋白MbovP0145，该蛋白由Mbov_0145基因编码，可望用于诊断、疫苗和药物的潜在靶标，在牛支原体防控领域中具有很好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

申请人于2008年6月从病牛的病变肺组织中分离得到一株牛支原体HB0801，命名为牛支原体HB0801，Mycoplasma bovis HB0801，该毒株为牛支原体强毒分离株。

从牛支原体HB0801的分泌蛋白组中，发现了一个未知功能的分泌蛋白MbovP0145，该蛋白由Mbov_0145基因编码，核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:1，长度为1446bp。为了证明Mbov_0145基因及其蛋白的功能，本发明以牛支原体HB0801基因组Mbov_0145基因为模板，根据大肠杆菌对密码子偏爱性进行密码子修饰，将牛支原体中色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，修饰后的Mbov_0145基因核苷酸是序列表SEQ ID NO:2的1-1446位碱基所示的序列，其长度为1446bp，送商业化公司人工合成。牛支原体Mbov_0145基因编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，共编码481个氨基酸残基。

将修饰后的牛支原体Mbov_0145基因与pET-30a质粒经过限制性内切酶xhoI和BamHI消化后连接重组，从而将Mbov_0145基因克隆到pET-30a中获得重组质粒pET-30a-Mbov_0145，转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0145基因编码的重组蛋白rMbovP0145。

经检测，本发明纯化的rMbovP0145蛋白具有分泌特性，能诱导小鼠产生抗体，能与牛支原体毒力株M.bovis HB0801自然感染和人工感染牛的血清发生特异性反应，表明其具有良好的免疫原性；以此蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法，区分牛支原体阳性和阴性样品的阈值为0.211，该阈值大小可以鉴别疫苗免疫后发生野毒感染的动物。基于该蛋白的免疫原性、分泌特性和强弱菌株感染牛血清间的差异反应推断，该蛋白可望作为牛支原体诊断试剂、疫苗和药物的候选靶标，在牛支原体防控手段开发中发挥重要作用。

本发明具有以下优点：

本发明的抗原蛋白MbovP0145是发明人从牛支原体分泌蛋白组中筛选出来的新型免疫原性蛋白，目前其基因Mbov_0145及其蛋白的功能未知，其分泌蛋白特性、抗原性以及在强弱毒力株中差异表达是发明人首次鉴定的。

利用抗原蛋白MbovP0145所建立的牛支原体抗体检测试剂盒还具有高敏感性和特异性等优点，能够在感染后的很短时间内检测到抗体。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是本发明纯化的牛支原体rMbov_0145蛋白胶图。附图标记说明：泳道M：分子量参考蛋白质；1:纯化的牛支原体rMbovP0145重组蛋白。

图2：是本发明rMbovP0145蛋白多抗效价测定。

图3：是本发明牛支原体MbovP0145蛋白在牛支原体培养物上清中分泌鉴定。附图标记说明：泳道1：牛支原体HB0801株分泌蛋白；泳道2：牛支原体HB0801株全菌蛋白；泳道3：牛支原体HB0801-150株分泌蛋白；泳道4：牛支原体HB0801-150株全菌蛋白。

图4：是本发明rMbovP0145蛋白抗原性检测。A图为rMbovP0145与牛支原体抗体阳性牛血清的反应；B图为rMbovP0145与牛支原体抗体阴性牛血清的反应。

图5：为免疫后攻毒血清样品的rMbovP0145-iELISA动力学曲线。

具体实施方式

实施例1：牛支原体Mbov_0145基因的克隆及表达

1.1牛支原体Mbov_0145基因的克隆

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在牛支原体中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体基因进行突变，使密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。

申请人于2008年6月从病牛的病肺组织中分离得到牛支原体地方分离株，将其命名牛支原体HB0801(Mycoplasma bovis HB0801)，该毒株已在CN 102220263A的专利文献中公开。

根据大肠杆菌对密码子偏爱性，对牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为CP002058)中Mbov_0145基因进行密码子修饰，在该序列的558，606，756，831，906，1059，1098，1134，1209，1284，1359位发生了11个密码子的同义突变，将牛支原体中色氨酸密码子UGA突变成大肠杆菌中的色氨酸密码子UGG，最后通过人工合成，得到全基因序列SEQ IDNO:2。

回收Mbov_0145基因的扩增产物，用BamH I和Xho I酶切，同时将pET-30a质粒(购自默克中国有限公司)用BamH I和Xho I进行双酶切。将酶切后的Mbov_0145基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4 DNAligase)连接，得到重组质粒pET-30-Mbov_0145。用该重组质粒pET-30-Mbov_0145转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21，将该大肠杆菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3小时。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30uL的PBS和30uL上样缓冲液(1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水)重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定带有His标签的重组蛋白rMbovP0145大部分表达于上清中，分子量约为55kDa。

1.2牛支原体MbovP0145蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS洗一次后在8000r/min离心10min，再重复用500mL的PBS洗一次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。

rMbovP0145蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体，编号为1；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体，编号为2；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白，收集前几滴，编号为3；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为4；

(8)将编号为1到4的管中各加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置10％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。

SDS-PAGE结果显示，纯化后蛋白大小约为55kDa，如图1所示。该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，共编码481个氨基酸残基。

实施例2：牛支原体蛋白MbovP0145分泌特性的鉴定

2.1牛支原体重组蛋白rMbovP0145小鼠多克隆抗体的制备及效价检测

利用上述制备的rMbovP0145蛋白免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下：

(1)初次免疫，牛支原体rMbovP0145抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(2)二周后，第二次免疫，牛支原体rMbovP0145抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(3)四周后，第三次免疫，牛支原体rMbovP0145抗原剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。

(4)7天后，剪尾尖采血，分离血清，用间接ELISA测其效价，即用牛支原体rMbovP0145蛋白包板，加入小鼠血清稀释品于37℃孵育，洗板后加入HRP标记的羊抗鼠二抗(购自Southern Biotech公司)于37℃孵育，洗板后加入TMB底物显色，选取效价高的血清作为多克隆抗体使用。

结果显示，rMbovP0145的抗体效价约为2¹⁴×100，如图2所示。

2.2牛支原体分泌蛋白的制备及MbovP0145分泌特性鉴定

在PPLO培养基(PPLO 10.5g，酵母粉2.5g，丙酮酸钠0.5g，超纯水定容至440mL，121℃灭菌20min后，加入马血清50mL，灭菌10×MEM 5mL，无菌8万单位/mL青霉素溶液5mL，无菌1％酚红溶液500μL)中分别培养牛支原体HB0801株、牛支原体(疫苗株)MbovHB0801-150.2(已在CN 102220263A的专利文献中公开)18h后，以15400g，4℃条件下离心20min，收集菌体沉淀，用50mL预冷的PBS洗涤沉淀3次，然后分别加入100mL无菌PBS 37℃孵育2h，再次于15400g，4℃条件下离心20min，收集上清即为牛支原体分泌蛋白。将两组分泌蛋白样品分别加入50mL超滤管(分子截留量为5kDa)，在15400g，4℃条件下离心，直至体积浓缩至80μL。在浓缩的样品中加入5×SDS loading buffer，沸水浴10min。12000g离心30min，取上清待用。

按照上述病原培养条件，将牛支原体HB0801株、牛支原体(疫苗株)MbovHB0801-150.2培养36h，在10000g 4℃条件下离心获得全菌沉淀，经液压破碎(压力1000pa，破碎时间20分钟)，获得各菌株的全菌蛋白。

配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，经过湿转印到硝酸纤维素膜上(60V,120min)，5％脱脂奶在4℃封闭过夜，TBST洗膜三次，用制备的多克隆抗体(1：500稀释)作为一抗在室温下孵育3hm，TBST洗膜三次，与1：3000倍稀释的HRP-羊抗鼠IgG孵育1小时，TBST洗膜三次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermo scientific)在化学发光仪显色观测，观察结果。

结果显示，在培养物HB0801株分泌蛋白中可以检测到大小约55kDa的MbovP0145，而在HB0801-150株分泌蛋白中未检测到明显条带，二者呈现明显差异；同时MbovP0145在牛支原体HB0801株全菌蛋白表达较HB0801-150株全菌蛋白高，进一步说明该蛋白为强、弱菌株差异表达(图3)。

实施例3：牛支原体蛋白MbovP0145抗原性的鉴定

采用western blot方法进行rMbovP0145蛋白抗原性鉴定，主要步骤为：将纯化的重组蛋白rMbovP0145进行SDS-PAGE电泳，将胶上蛋白转移至PVDF膜上，经洗涤、封闭后，将其分别与牛支原体牛阳性血清和牛阴性血清为一抗进行孵育，以HRP标记的羊抗牛IgG为二抗，进行western blot验证。

结果显示，MbovP0145可以与牛支原体阳性血清发生反应，在相应蛋白大小为55kDa处有条带(图4A)，与MbovP0145预期分子量一致，而与牛支原体阴性血清无明显反应(图4B)。

实施例4：牛支原体蛋白MbovP0145蛋白在诊断牛支原体野毒株感染中的应用

4.1MbovP0145抗体检测间接ELISA的建立

(1)动物血清样本收集：牛支原体野毒株自然感染牛血清和人工感染HB0801株的牛血清为阳性血清，共计100份；来源于临床免疫实验的空白组为阴性血清，共计78份。

(2)抗原包被：用包被液(Na₂CO₃ 1.59g,NaHCO₃ 2.93g,加ddH₂O至1000mL)稀释纯化后rMbovP0145蛋白，按每孔100ng的比例加入稀释rMbovP0145蛋白后的包被液100μL每孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜。弃去包被液，每孔加300μL PBST洗涤3次，每次2分钟。

(3)封闭：每孔加入100μL 5％脱脂牛奶(5g脱脂牛奶加PBST至100mL)，置于37℃温箱中封闭1h，甩干封闭液，加入300μL PBST洗涤3次，每次2分钟。

(4)加样：用PBST按1:100(V/V)的比例稀释待检血清和对照血清，每孔加入100μL稀释后的样本，37℃孵育1h。甩干空中溶液，加入300μL PBST洗涤3次，每次2分钟。

(5)加酶标二抗：用PBST以1:5000(V/V)的比例稀释酶标二抗(购自Southernbiotech公司)，向96孔酶标板每孔加入100μL稀释后的HRP标记的羊抗牛IgG(H+L)酶标二抗，置于37℃孵育1h，甩干孔中溶液，加入300μL PBST洗涤3次，每次2分钟。

(6)加底物显色：向96孔酶标板每孔加入100μLTMB底物显色液(购自美国Seracare生物公司)，避光显色10分钟；每孔加50μL 0.2M浓硫酸终止反应(取21.7mL浓H₂SO₄加入178.3mL ddH₂O配制而成)，用酶标仪在450nm波长下测定OD₄₅₀值。

(7)结果判定。计算S/P值＝(样品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD)，使用在线工具http://epitools.ausvet.com.au/content.php？page＝ROC_curves软件确定阈值为0.211，此时诊断敏感性为97％(95％CI:91.5-99.0％)，诊断特异性为98.7％(95％CI:93.1-99.8％)，ROC曲线下面积AUC为0.99(95％CI:97.5-100％)。该方法的检测敏感性和特异性都高于现有的大多数同类试剂盒。

4.2rMbovP0145-间接ELISA方法测定血清动力学曲线

试验动物为9头经过筛选的牛支原体抗体阴性的奶犊牛，分别收集牛支原体弱毒疫苗HB150免疫后7、14、21、28、35d后的血清，以及疫苗免疫35d后再用HB0801野毒株攻毒后的7、14、21、28、35d后的血清样本，利用上述实施例4.1的方法进行检测，根据检测值判定结果。结果如图5显示，该抗原对于疫苗免疫后血清测定为阴性，攻毒后7d即可检测到阳性。表明该蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法，还可以鉴别疫苗免疫后发生野毒感染的动物。MbovP0145蛋白在强、弱毒力株的差异表达，可望作为区分疫苗免疫和自然感染的靶标分子。另外，现有的大多数牛支原体抗体试剂盒需在感染14天以上才能检测到阳性，而本发明在感染7天时就能检测到抗体，说明该试剂盒还具有很高的敏感性。

4.3rMbovP0145-iELISA特异性试验

使用rMbovP0145-iELISA方法对临床上易造成诊断干扰的牛常见病原体的阳性血清样品进行了检测，包括沙门氏菌阳性血清、大肠杆菌阳性血清、布鲁氏菌阳性血清、多杀性巴氏杆菌阳性血清、副结核阳性血清、牛传染性鼻气管炎阳性血清、***阳性血清和轮状病毒阳性血清，结果表明，除牛支原体阳性血清以外，其余样品均为阴性，确定rMbovP0145与其他病原体的阳性血清无交叉反应性，rMbovP0145-iELISA方法具有良好的特异性。结果见表1。

表1 rMbovP0145-iELISA交叉反应

综上所述，Mbov_0145基因编码的蛋白MbovP0145为牛支原体的分泌蛋白，可与牛支原体自然感染血清和人工攻菌牛阳性血清发生特异性反应，可以鉴别疫苗免疫后发生野毒感染的动物。可作为诊断靶标在临床试剂研发中具有应用价值；同时，基于其因此，Mbov_0145基因和其编码的MbovP0145蛋白将在抗牛支原体感染疫苗和药物致病和防控中具有重要的潜在应用前景。

相关术语

牛支原体，英文名：Mycoplasma bovis,缩写：M.bovis；

牛支原体湖北分离株HB0801，英文名：Mycoplasma bovis HB0801，缩写：M.bovisHB0801；

牛支原体湖北分离株HB0801的弱毒力株150.2，英文名：Mycoplasma bovisHB0801-150，缩写：M.bovis HB0801-150；

牛支原体0145蛋白表述为：MbovP0145；

牛支原体0145大肠杆菌重组蛋白表述为：rMbovP0145；

牛支原体0145蛋白的编码基因表述为Mbov_0145。

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 1

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<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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atgaatgcaa tgttttggga tgcaaaagca tttaatcagg atctgagcaa ttggaaaacc 1140

gataatgtta ccctgatgca taatatgttt tatggtgcaa ttatttttaa tagcgatatt 1200

agccgttgga aaaccagcaa agttaccaat atgagccaga tgttttgggg tgcaaaagca 1260

tttaatcaga atattagcga ttgggatgtt aaaaatgtta ccgatgttag cagcatgttt 1320

gcatatgcaa gcagctttaa acaggatctg gataaatgga cctttaataa aattgttaat 1380

agcagccatt ttcgtaatgg tgcaccgatt tttaaactgc cgaattttcg tcaggttagc 1440

aaataa 1446

<210> 3

<211> 481

<212> PRT

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 3

Met Leu Phe Ala Ser Ser Leu Pro Leu Ile Ala Ala Ser Cys Lys Asn

1 5 10 15

Asn Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Glu Pro Glu Met Asp Ala Pro Ile

20 25 30

Ala Pro Pro Thr Asp Pro Glu Lys Asp Asn Pro Gly Lys Thr Glu Pro

35 40 45

Met His Ser Asp Lys Pro Lys Val Phe Lys Thr Asp Ile Ser Gly Leu

50 55 60

Lys Leu Lys Phe Ser Pro Thr Asn Asn Thr Asn Lys Asn Asp Val Leu

65 70 75 80

Glu Leu Leu Lys Lys Gln Pro Lys Leu Glu Asn Leu Thr Glu Gly Asp

85 90 95

Phe Asp Phe Lys Leu Glu Arg Lys Ser Leu Leu Asn Arg Glu Gly Leu

100 105 110

Ile Val Ile Ala Ala Asn Pro Glu Ser Gln Leu Val Ser Gly Met Leu

115 120 125

Asn Ile Thr Ile Asn Lys Leu Asp Lys Leu Ile Pro Arg Glu His Lys

130 135 140

Tyr Asn Asn Asp Lys Thr Lys Val Leu Glu Ile Gly Tyr Asp Glu Lys

145 150 155 160

Gly Arg Ile Lys Lys Phe Val Glu Asn Val Lys Glu Val Pro Ala Asn

165 170 175

Leu Pro Glu Glu Ile Ile Ser Leu Asp Trp Ala Phe Ala Arg Asn Leu

180 185 190

Asn Glu Lys Ile Val Asn Leu Glu Lys Trp Asp Thr Ser Asn Ile Glu

195 200 205

Ser Met Ser Lys Thr Phe Leu Gln Ala Lys Lys Phe Asn Thr Asp Ile

210 215 220

Ser Ser Trp Lys Thr Asn Arg Val Lys Asp Met Ser Asn Met Phe Thr

225 230 235 240

Ser Ala Glu Ala Phe Ser Gln Asn Leu Asp Lys Trp Asp Thr Ser Asn

245 250 255

Val Thr Thr Met Tyr Arg Met Phe Glu Glu Ala Lys Thr Phe Asn Gly

260 265 270

Asn Ile Ser Ser Trp Lys Thr Glu Asn Val Thr Asn Met Glu His Met

275 280 285

Phe Glu Lys Ala Ala Ala Phe Asn Gln Asp Leu Ser Ser Trp Asn Val

290 295 300

Glu Asn Val Ser Lys Met Lys Asn Met Phe Ser Gly Ala Lys Glu Phe

305 310 315 320

Asn Lys Pro Leu Phe Lys Leu Ile Asn Pro Lys Val Ser Asp Met Ser

325 330 335

Tyr Met Phe Phe Gly Ala Glu Lys Phe Asn Asp Ser Ser Val Ser Gln

340 345 350

Trp Asn Thr Thr Ser Val Thr Lys Met Asn Ala Met Phe Trp Asp Ala

355 360 365

Lys Ala Phe Asn Gln Asp Leu Ser Asn Trp Lys Thr Asp Asn Val Thr

370 375 380

Leu Met His Asn Met Phe Tyr Gly Ala Ile Ile Phe Asn Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ser Arg Trp Lys Thr Ser Lys Val Thr Asn Met Ser Gln Met Phe Trp

405 410 415

Gly Ala Lys Ala Phe Asn Gln Asn Ile Ser Asp Trp Asp Val Lys Asn

420 425 430

Val Thr Asp Val Ser Ser Met Phe Ala Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gln

435 440 445

Asp Leu Asp Lys Trp Thr Phe Asn Lys Ile Val Asn Ser Ser His Phe

450 455 460

Arg Asn Gly Ala Pro Ile Phe Lys Leu Pro Asn Phe Arg Gln Val Ser

465 470 475 480

Lys

Claims (1)

1.牛支原体Mbov_0145基因编码的蛋白在制备牛支原体检测试剂盒中的应用，所述牛支原体Mbov_0145基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于：该试剂盒用于鉴别弱毒株MbovHB0801-150.2疫苗免疫后发生野毒株牛支原体HB0801感染的动物。

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