CN105586265A - 冬虫夏草菌丝体的固体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌丝体的固体发酵方法，包括菌种培养和固体发酵培养，采用中国被毛孢(Hirsutella？sinensis)为菌种，接种到固体培养基中发酵生产。根据本发明的固体发酵方法制备的产品的有效成分与野生冬虫夏草一致或接近，且成本低、过程控制简单、无污染，安全有效。

Description

冬虫夏草菌丝体的固体发酵方法

技术领域

本发明属于真菌生物发酵领域，涉及一种冬虫夏草菌丝体的固体发酵方法。

背景技术

冬虫夏草Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.是我国传统名贵中药，与人参、鹿茸齐名，三者合称为“中药三宝”。冬虫夏草含有虫草素、虫草多糖、腺苷、虫草酸等多种有效物质，有补肾益肺、止血化痰、已唠嗽、抗癌、提高免疫力、抗疲劳等功能。因野生冬虫夏草产量逐年降低，近年来市场价格不断攀升，被称为“软黄金”。

为解决市场供不应求现状，人工培育冬虫夏草成为各科研机构及各大保健品厂主研的方向。现市场上产品主要以液体发酵采收冬虫夏草无性菌为主。但液体发酵虽然生产周期短，但投入大，存在胞外有效成分损失严重、废液排放量大等问题。固体发酵技术可有效解决上述问题。

现有固体发酵技术对菌种种类把控不严。2005年，中国菌物协会通过充分地讨论和严格的论证，最终统一认定中国被毛孢(Hirsutellasinensis)为冬虫夏草唯一正确的无性型。(冬虫夏草头孢Cephalosporiumdongchongxiacae、蝙蝠蛾被毛孢Hirsutellahepiali、中华束丝孢Synnematiumsinensis皆为中国被毛孢Hirsutellasinensis不合格发表名称，是中国被毛孢的同物异名)。而有些文献或专利在实验工作前或结束后，未对来源于野生冬虫夏草提取的菌种进行鉴定，虽以冬虫夏草之名发表却未必是使用中国被毛孢菌发酵而成，因为从野生冬虫夏草可提取分类出超过90多种菌，超过10种菌与冬虫夏草菌类似。例如申请号为CN201410180618.0和申请号CN200510014467.2两个专利申请，都有冬虫夏草字样，但根据其发酵温度，前者一级菌丝培育温度为18℃～37℃，发酵温度为18℃～22℃(且原冬虫夏草被在60℃热水中浸泡24小时)。后者菌种培养温度为24℃～27℃，发酵温度为22℃～26℃，二者所用的菌种是中国被毛孢的可能性极小，因为中国被毛孢菌在12℃～18℃最适生长，达到21℃便停止生长，达到25℃便开始有死亡现象。

现有固体发酵技术发酵周期较长，例如申请号CN201410174424X的专利申请，发酵周期需要50～70天，且配料中含有牡蛎壳等不适合作为食品或保健品添加剂的配料。

发明内容

本发明的目的是针对野生冬虫夏草价格昂贵、液体发酵生产冬虫夏草菌丝体粉成本较高等问题，提供一种简单、有效、成本低的适合工业化生产的制备方法。

为了解决上述问题，本发明提供了一种冬虫夏草菌丝体的固体发酵制备方法。

具体步骤如下：

一、菌种培养

(1)菌种：菌种为购自中科院微生物研究所的中国被毛孢(Hirsutellasinensis)。

(2)液体一级菌种培养：

将菌种切成5mm²左右小片，向盛有150ml一级菌种液体培养基的1L锥形瓶中添加2～3片，在转速为150～180r/m的全温震荡培养基中培养，培养温度为16～18℃，培养6～10d，即可得到冬虫夏草一级菌种；

一级菌种液体培养基构成为：土豆粉1.5～3％w/v；葡萄糖1.5～2.5％w/v；MgSO₄·7H₂O0.02～0.05％w/v，KH₂PO₄0.05g～0.10％w/v，蛋白胨0.3～0.5％w/v，酵母膏0.4g～0.6％w/v，其余为纯净水，pH值自然；

(3)液体二级菌种培养：

将30L菌种发酵罐空消和实消后，把培养好的一级菌种投入到菌种发酵罐中，接种量5％～10％，菌种发酵罐中二级菌种液体培养基的量为21～24L，通气量为0.15～0.35L/min，在16～18℃下培养6～10d，即可得到液体二级菌种；

二级菌种液体培养基构成为：土豆粉1.5～3％w/v；葡萄糖1.5～2.5％w/v；MgSO₄·7H₂O0.02～0.05％w/v；KH₂PO₄0.05％～0.10％w/v；蛋白胨0.3～0.5％w/v；酵母膏0.4g～0.6％w/v；CaCO₃粉末0.05g～0.10％w/v；其余为纯净水，pH值自然；

二、固体发酵培养：

(1)固体培养基前处理：

固体培养基以小麦或燕麦为主，将其放进含有葡萄糖和蔗糖溶液的加热锅内蒸煮至涨裂开花；葡糖糖和蔗糖比例为1:1，糖浓度为1.5％～2.5％w/v；沥干水后添加低聚半乳糖1％～3％w/w、蚕蛹粉2％～5％w/w、玉米粉2％～5％w/w，搅拌均匀；

(2)灭菌：将上述固体培养基装入发酵罐中，121℃～126℃灭菌30min，冷却后取出待接种；

(3)接种：将上述所得的二级菌种用接种枪接种到灭菌处理后的固体培养基中，接种量为固体培养基干重的10％～15％v/w；

(4)发酵培养和采收：将发酵室温度控制在16～18℃，暗光下经30～40d培养，培养基整体呈黑褐色，即可取出；

(5)低温低压干燥粉碎：将取出的培养物用低温低压干燥法在60～70℃、60～90Pa的条件下干燥，时间8～12h，干燥后粉碎。

其中，在灭菌步骤中，发酵罐为特制广口瓶罐头罐，分罐体和盖子两部分，盖子中间留有2cm长直径12mm的管状通气道，用棉塞塞住，利于透过空气；发酵罐的内直径不宜超过12cm，固体培养基厚度不宜超过5cm。

在接种步骤中，将所述二级菌种用接种枪透过玻璃罐盖子上的棉塞接种到固体培养基中。

在发酵培养和采收步骤中，固体发酵期间从第15天开始，每隔24h将环境温度调节到8℃～12℃2小时，防止菌种高速增殖过程产热超过20℃，影响菌丝生长，从而拖延发酵周期。

整个固体发酵在暗光下进行。

本发明的固体发酵生产周期仅30～40天，随着时间的延长，有效成分如虫草多糖等被菌类作为营养消耗，反而降低。

本发明最大的特点：1)发酵周期短，30天～40天，且不能超过50天，超过越多有效成分如虫草多糖等流失越严重。2)有效成分如腺苷、虫草素、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶等达到或接近野生冬虫夏草水平。

具体实施方式

实施例1

一、菌种培养

1.菌种：菌种为购自中科院微生物研究所的中国被毛孢(Hirsutellasinensis)。

2.液体一级菌种培养：

一级菌种培养基：土豆粉15g；葡萄糖15g；MgSO₄·7H₂O0.2g；KH₂PO₄0.5g；蛋白胨3g；酵母膏4g；纯净水定容1000ml。分装在8个1L的锥形瓶中。灭菌：121℃，30分钟。

将菌种切成5mm²左右小片，向盛有上述一级菌种液体培养基的1L锥形瓶中添加2片，在转速为150r/m的全温震荡培养箱中培养，培养温度为16℃，培养10d。

3.液体二级菌种培养：

二级菌种培养基：土豆粉315g；葡萄糖315g；MgSO₄·7H₂O4.2g；KH₂PO₄10.5g；蛋白胨63g；酵母膏84g；CaCO₃粉末10.5g；其余为纯净水，共21L。

将培养好的一级菌种1.5L投入到菌种发酵罐中，通气量为0.15L/min，在16℃下培养10d，得到液体二级菌种，在无菌条件下将菌种分装在1L的锥形瓶中。

二、固体发酵培养：

1.固体发酵配方及前处理：

配方：小麦20Kg，葡萄糖300g，蔗糖300g，蚕蛹粉400g，玉米粉400g，低聚半乳糖200g，水40Kg。

将葡萄糖和蔗糖添加到水中煮开，加入20Kg小麦，煮至开花，捞出沥干，添加蚕蛹粉、玉米粉、低聚半乳糖拌匀。

2.灭菌：将上述固体发酵培养基装入发酵玻璃罐中，每罐150g，随后放入高压灭菌锅内121℃灭菌30min，冷却后待接种。

3.接种：将上述二级菌种用接种枪透过玻璃罐盖子上的棉塞接种到固体培养基中，接种量为每瓶7.5ml。

4.发酵培养和采收：将发酵室温度控制在16℃，从第15天开始，每24h将环境温度调节到8℃～12℃2小时。暗光下经40d培养，培养基中裸麦内胚乳等营养物质完全被菌丝转化，整体呈黑褐色，即可取出。

5.低温低压干燥粉碎：将取出的培养物用低温低压干燥法在60℃、60Pa的条件下干燥8h。干燥后粉碎至120目。

实施例2

一、菌种培养

1.菌种：菌种为购自中科院微生物研究所中国被毛孢(Hirsutellasinensis)。

2.液体一级菌种培养：

一级菌种培养基：土豆粉30g；葡萄糖25g；MgSO₄·7H₂O0.5g；KH₂PO₄1.0g；蛋白胨5g；酵母膏6g；纯净水定容1000ml。分装在8个1L的锥形瓶中，灭菌：121℃，30分钟。

将菌种切成5mm²左右小片，添加至盛有上述液体培养基的1L锥形瓶中3片，在转速为180r/m的全温震荡培养箱中培养，培养温度为18℃，培养6d。

3.液体二级菌种培养：

二级菌种培养基：土豆粉720g；葡萄糖600g；MgSO₄·7H₂O12g；KH₂PO₄24g；蛋白胨120g；酵母膏144g；CaCO₃粉末24g；其余为纯净水，共24L。

将培养好的一级菌种2.4L投入到菌种发酵罐中，通气量为0.35L/min，在18℃下培养6d，得到液体二级菌种，在无菌条件下将菌种分装在1L的锥形瓶中。

二、固体发酵培养：

1.固体发酵配方及前处理：

配方：小麦20Kg，葡萄糖500g，蔗糖500g，蚕蛹粉1000g，玉米粉1000g，低聚半乳糖600g，水40Kg。

将葡萄糖和蔗糖添加到水中煮开，加入20Kg小麦，煮至开花，捞出沥干，添加蚕蛹粉、玉米粉、低聚半乳糖拌匀。

2.灭菌：将上述固体发酵培养基装入发酵玻璃罐中，每罐150g，随后放入高压灭菌锅内126℃灭菌30min，冷却后待接种。

3.接种：将上述二级菌种用接种枪透过玻璃罐盖子上的棉塞接种到固体培养基中，接种量为每瓶15ml。

4.发酵培养和采收：将发酵室温度控制在18℃，从第15天开始，每24h将环境温度调节到8℃～12℃2小时。暗光下经30d培养，至裸麦胚乳完全被菌丝体转化变成黑褐色，即可取出。

5.低温低压干燥粉碎：将取出的培养物用低温低压干燥法在70℃、90Pa的条件下干燥12h。干燥后粉碎120目。

将实施例1和实施例2得到的培养物进行检测。经谱尼测试检测各成分为：腺苷222～225mg/kg；虫草素117～175mg/kg；虫草多糖2.6～4g/100g。

根据本发明的固体发酵方法制备的产品的有效成分与野生冬虫夏草一致或接近，且成本低、过程控制简单、无污染，安全有效。

Claims (4)

1.一种冬虫夏草菌丝体的固体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、菌种培养：

(1)菌种：菌种为购自中科院微生物研究所的中国被毛孢(Hirsutellasinensis)；

(2)液体一级菌种培养：

将菌种切成5mm²左右小片，向盛有150ml一级菌种液体培养基的锥形瓶中添加2～3片，在转速为150～180r/m的全温震荡培养基中培养，培养温度为16～18℃，培养6～10d，即可得到冬虫夏草一级菌种；

所述一级菌种液体培养基构成为：土豆粉1.5～3.0％w/v；葡萄糖1.5～2.5％w/v；MgSO₄·7H₂O0.02～0.05％w/v，KH₂PO₄0.05g～0.10％w/v，蛋白胨0.3～0.5％w/v，酵母膏0.4g～0.6％w/v，其余为纯净水，pH值自然；

(3)液体二级菌种培养：

将培养好的一级菌种投入到菌种发酵罐中，接种量为二级菌种液体培养基用量的5％～10％，通气量为0.15～0.35L/min，在16～18℃下培养6～10d，即可得到液体二级菌种；

所述二级菌种液体培养基构成为：土豆粉1.5～3％w/v；葡萄糖1.5～2.5％w/v；MgSO₄·7H₂O0.02～0.05％w/v；KH₂PO₄0.05g～0.10％w/v；蛋白胨0.3～0.5％w/v；酵母膏0.4g～0.6％w/v；CaCO₃粉末0.05～0.10％w/v；其余为纯净水，pH值自然；

2)、固体发酵培养：

(1)固体培养基前处理：

固体培养基以小麦或燕麦为主，将其放进含有葡萄糖和蔗糖溶液的加热锅内蒸煮至涨裂开花；葡糖糖和蔗糖比例为1:1，糖浓度为1.5％～2.5％w/v；沥干水后添加低聚半乳糖1％～3％w/w、蚕蛹粉2％～5％w/w、玉米粉2％～5％w/w，搅拌均匀；

(2)灭菌：将上述固体培养基装入发酵罐中，121℃～126℃灭菌30min，冷却后待接种；

(3)接种：将上述所得的二级菌种用接种枪接种到经灭菌处理后的固体培养基中，接种量为固体培养基干重的10％～15％v/w；

(4)发酵培养和采收：将发酵室温度控制在16～18℃，暗光下经30～40d培养，至培养基变为黑褐色，即可取出；

(5)低温低压干燥粉碎：将取出的培养物用低温低压干燥法在60～70℃、60～90Pa的条件下干燥，时间8～12h，干燥后粉碎。

2.根据权利要求1所述的固体发酵方法，其中，在灭菌步骤中，

发酵罐盖子的中间留有管状通气道，用棉塞塞住，利于透过空气。

3.根据权利要求2所述的固体发酵方法，其中，

发酵罐的内直径不超过12cm，固体培养基厚度不超过5cm。

4.根据权利要求1所述的固体发酵方法，其中，在发酵培养和采收步骤中，

固体发酵期间从第15天开始，每隔24h将环境温度调节到8℃～12℃2小时。