CN102845221A

CN102845221A - 一种冬虫夏草发酵生产方法

Info

Publication number: CN102845221A
Application number: CN2012103384292A
Authority: CN
Inventors: 王云
Original assignee: Individual
Current assignee: Ningxia Xiqilin Biological Technology Co ltd
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-14
Also published as: CN102845221B

Abstract

本发明模拟野生冬虫夏草的生长环境和条件，生产与野生冬虫夏草相近似的发酵冬虫夏草菌丝及产品，本发明的冬虫夏草发酵生产方法，包括将中国被毛孢菌种斜面培养后接入发酵罐进行发酵，其中培养和发酵所用的培养基按照其寄主蝙蝠蛾幼虫自身的营养成分确定。将中国被毛孢菌种斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，其中斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的培养基中含有黄粉虫幼虫粉作为培养基氮源，并添加维生素B1和B2。用本发明方法生产出的发酵菌丝体的外观和有效成分与天然野生冬虫夏草相同或相近。

Description

一种冬虫夏草发酵生产方法

技术背景

冬虫夏草主要生长在青藏高原海拔3000米至5000米的高山草地灌木带上面的雪线附近的森林草甸或草坡上。它是由子囊菌门麦角菌科虫草属的冬虫夏草菌寄生于高山草甸土中的蝙蝠蛾幼虫，吸收蝙蝠蛾幼虫体内组织的营养物质，使幼虫僵化，在适宜条件下，夏季由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成(即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核(幼虫尸体)构成的复合体)。

冬虫夏草为虫体与子座相连而成，全长9～12厘米，色偏暗褐色，背面有多条横向皱纹，虫体轻而脆，易折断，断面白色，微有弹性；子座从虫体的头部长出，呈4～7Cm，基部将虫体的头部包被，呈长棒状，上粗下细，灰褐色或黑褐色，质柔韧，断面多为中空。嗅之具草菇香气，味甘。子座单生，细长圆柱形，长4至7厘米，直径约3毫米；表面深棕色至棕褐色，有细纵皱纹，上部稍膨大，质柔韧，断面类白色。气微腥，味微苦。

冬虫夏草的药理功效部位是子座和菌核(即寄主的干燥虫体)，1757年吴仪洛《本草从新》始见有记载：“甘平保肺，益肾止血，化痰已劳歇。”中医作为助阳药，治痰饮、喘嗽、虚喘、痨嗽、咯血、自汗盗汗、阳痿遗精、腰膝酸痛、病后久虚不复等。《中华人民共和国药典》(2000年版，一部)记载其功用为：“补肺益肾，止血化痰。用于久咳虚喘、痨嗽咯血、阳痿遗精、腰膝酸痛。”。

由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身资源比较有限。近年来又由于冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。而冬虫夏草由于可以药食两用，且人们不断发现其新的药理作用，所以多个国家对它的需要倍增，价格逐年上涨，国际市场日益紧缺。

CN 10215061A公开了一种中华虫草的培育方法，是将黄粉虫和活蚯蚓用打浆机打成浆液，加入到鲜牛奶中，制成营养基，再加入啤酒酵母，玉米淀粉，土豆淀粉，银杏仁粉，带鱼粉，泥鳅肉粉，葡萄粉，生长素，赖氨酸，天门冬氨酰，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，亚西酸钠，维生素B 1等培养虫草产品。但是，该技术只是为获取虫草子实体，并非获得虫草菌丝体，而且培养基成分复杂，所生产的冬虫夏草子实体在化学成分和活性物质与天然虫夏有所差异。

中国被毛孢(Hirsutella sinensis)菌种是从青海玉树新鲜冬虫夏草中分离得到，经生物还原检验，是迄今唯一能够在人工环境下完成全部生活史的冬虫夏草菌菌株。

CN 101530042A公开了一种中国被毛孢菌粉发酵生产工艺，其活性蛋白培养基包括蛋类，奶汁，马铃薯汁液，胡萝卜汁液，硫酸镁；CN 101423799A公开了另一种中国被毛孢菌粉的生产方法，其特征在于包括在由谷类、豆类、水组成的培养基，接入菌种培养；补加由蛋、奶、马铃薯、胡萝卜汁、蛋白胨组成的液体培养基培养；将培养物干燥、粉碎得中国被毛孢菌粉。

正如上述两篇文献所记载的，目前国内许多个人和单位研究和公开冬虫夏草培养基和发酵生产方法，但是，这些技术多采用微生物发酵常用培养基，基本上以蛋、奶、马铃薯作为发酵食源，发酵生产中缺少过程控制，未完全采用冬虫夏草菌种天然生长所需的营养物质。培养基成分的选择，虽然都是按照微生物学的发酵原理使菌种能够生长，但食源的不同必然造成菌丝体的性质有所差异。此外，生产出的冬虫夏草菌丝体大多采用烘干方式干燥，因高温干燥造成菌丝体化学成分改变和生物活性物质部分丧失，所生产的冬虫夏草发酵产品在化学成分和活性物质与天然冬虫夏草有差异，因此，现有技术中的发酵冬虫夏草在学术界和医药行业并不认为可以替代野生冬虫夏草。

技术内容

本发明的目的是以工业生产的方法完全模拟野生冬虫夏草的生长环境和条件，生产与野生冬虫夏草相近似的发酵冬虫夏草菌丝及产品，用本发明方法生产出的发酵菌丝体的有效成分与天然野生冬虫夏草的有效成分相同或相近，可以成为野生冬虫夏草的替代品。

因此，本发明提供一种冬虫夏草发酵生产方法，该方法包括将中国被毛孢菌种斜面培养后接入发酵罐进行发酵，其中培养和发酵所用的培养基按照其寄主蝙蝠蛾幼虫自身的营养成分确定。

在一个具体的实施方案中，本发明的冬虫夏草发酵生产方法，包括将中国被毛孢菌种进行斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，其中斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的培养基中含有黄粉虫幼虫粉作为培养基氮源，并添加维生素B1和B2。

黄粉虫又叫面包虫，在昆虫分类学上隶属于鞘翅目，拟步行虫科，粉虫甲属。黄粉虫干品含脂肪30％，含蛋白质高达50％以上，此外还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素。干燥的黄粉虫幼虫中含蛋白质40％左右，被誉为“蛋白质饲料宝库”。现有技术中对黄粉虫幼虫中营养成分的研究很多，黄粉虫幼虫粉也是现有技术中能够获得的。

本发明人发现，黄粉虫幼虫粉中所含的水分、脂肪、蛋白质、灰分、氨基酸和其他微量元素接近蝙蝠蛾幼虫自身营养成分。由于近似的食源能够保持发酵菌丝的品质接近野生冬虫夏草。因此，本发明采用黄粉虫幼虫粉作为中国被毛孢培养和培养基的氮源，并添加冬虫夏草菌丝体生长所必须的维生素B1和B2，其目的就是实现菌种生长所获取的营养物质与野生冬虫夏草在寄主体内获取的营养物质近似。

本发明的关键是在培养基中含有黄粉虫幼虫粉作为碳源以及维生素B1和B2。除黄粉虫幼虫粉外，中国被毛孢菌种斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养所用培养基中的其他成分可以是与本领域已知的、与现有技术相同或相似的、适用于冬虫夏草培养的碳源、氮源成分、微量元素和营养物质。

在一个优选的实施方案中，中国被毛孢菌种的斜面培养基配方含有黄粉虫幼虫粉、豆汁、葡萄糖、米粉、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁，维生素B1和维生素B2。摇瓶培养基配方含有黄粉虫幼虫粉、蛋白胨、豆汁、葡萄糖、米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和B2。种子罐培养基和发酵罐培养基配方各自含有黄粉虫幼虫粉、米粉、葡萄糖、豆汁、鱼胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和维生素B2。

黄粉虫幼虫粉在各培养基中的含量可以是0.5％-2％，优选1.0％；维生素B1和B2在各培养基中的含量可以分别是0.005-0.02％，优选0.01％。其他的培养基成分不是本发明的关键，可以是本领域常规的范围，本领域技术人员可以通过简单选择便可以确定培养基其他成分的含量。

本发明的冬虫夏草发酵生产方法，其中斜面培养可以包括一级培养，即试管斜面培养；也可以包括二级培养，即试管斜面培养和烧瓶培养，烧瓶培养是对试管斜面培养的进一步扩大的斜面培养，以便更有利于随后的摇瓶培养。烧瓶可以选用茄形瓶(茄瓶)，其和一般烧瓶一样，只不过做成茄形有利于液体的引流，其没有特殊的用途，其他烧瓶也可以作为斜面培养容器。二级培养中所用的培养基成分都是彼此相同的。

本发明的冬虫夏草发酵生产方法，其中种子罐培养可以包括一级种子罐培养，也可以包括二级种子罐培养，或者三级种子罐培养。二级或三级种子罐培养是对一级种子罐培养的进一步扩大培养，以便更有利于随后的发酵培养。二级或三级培养中所用的培养基成分都是彼此相同的。

无论是斜面培养，还是种子罐培养，选择多级培养都是优选的，是为使菌丝体更加细密生长，更适合于大规模生产，并非必需的过程，小规模生产(例如，实验室培养)一级培养便足以达到本发明的目的。

各个阶段培养的工艺条件，包括温度、pH值、培养时间等，都是本领域常规的选择，是本领域技术人员可以通过简单选择便可以确定的。

优选，各个阶段的培养(包括斜面培养、种子罐培养、发酵罐培养)，其培养温度均为10-20℃，pH值均为pH 6-8；特别优选15℃±2℃，pH 7-7.5。斜面培养时间30-35天，摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的各阶段培养时间均为8-10天。

通过本发明发酵方法生产的冬虫夏草菌丝，与天然冬虫夏草进行对比分析，可以发现，天然冬虫夏草虫体与子座断面颜色为白色，微有弹性，气微腥，味微苦。采用本发明方法生产出发酵冬虫夏草菌丝颜色亦为白色，气味与味道与天然冬虫夏草具有相近似的微腥、微苦性状。

对本发明发酵方法生产的冬虫夏草菌丝，与天然冬虫夏草的化学成分进行分析，其中氨基酸成分和含量均接近或相同，包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯甲氨酸、赖氨酸、组氨酸，其他营养成分蛋白质、虫草多糖、虫草酸、虫草素、腺苷和甘露醇的含量也接近与相同。

本发明发酵方法中，发酵培养结束后，收集菌丝，例如可以将培养液离心收集，或者用转鼓真空过滤法收集菌丝；然后将收集的菌丝进行干燥，例如烘干或微波干燥等；之后将干燥的菌丝粉碎、制成发酵虫草菌丝成品。

优选，菌丝的干燥可以采用真空低温冷冻干燥，温度控制在-40～-60℃，以便保持菌粉的生物活性，不易造成菌粉氧化和化学性质的变化和活性成分丧失。

通过本发明发酵方法生产的冬虫夏草菌丝产品，可以成为野生冬虫夏草产品的替代品。

附图说明

图1是本发明冬虫夏草发酵生产方法工艺流程图，显示了一个首选的制备发酵虫草菌丝成品的实施方案。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的一个首选实施例的具体工业生产过程进行详细的描述，该实施例只是为了说明本发明的实施方式，本发明的保护范围不限于此。除非另有说明，本发明中的百分数均指重量百分比。

实施例1

一、配制培养基

1、斜面培养基配方：

黄粉虫幼虫粉	1.0％
		豆汁	1.0％
葡萄糖	2.5％
		米粉	1.0％
琼脂	1.0％
		磷酸二氢钾	0.02％
硫酸镁	0.01％
		维生素B1和维生素B2	各0.01％

其余为水。

2、摇瓶培养基配方：

黄粉虫幼虫粉	1.0％
		蛋白胨	0.2％
豆汁	1.0％
		葡萄糖	3.0％
米粉	1.5％
		磷酸二氢钾	0.02％
硫酸镁	0.01％
		维生素B1和B2	各0.01％

其余为水。

3、种子罐和发酵罐培养基配方：

黄粉虫幼虫粉	1.0％
		米粉	1.5％
葡萄糖	3％
		豆汁	2.0％
鱼胨	0.2％
		磷酸二氢钾	0.02％
硫酸镁	0.01％
		维生素B1和维生素B2	各0.01％
消泡剂	微量

其余为水。

各培养基调节pH＝7-7.5。

二、生产方法

(一)将黄粉虫幼虫粉、米粉称重后，按所需配量加水，高压灭菌，然后静置一夜。纱布过滤，取清液，加入葡萄糖、豆汁和KH₂PO₄及MgSO₄，溶解，用NaOH调pH值到7-7.5之间。

其中豆汁的制备可以是：选新鲜大豆或黄豆，用水浸泡务使吸胀，捞出并用水清洗，然后加入清水煮沸2～5h煮豆时注意补水，过滤，即得豆汁。每100g豆可制得5°Be’豆汁100mL。

用上配方从试管斜面扩大到茄瓶。斜面培养的培养温度为15℃±2℃，保持培养箱温度，每天打开箱通风半小时。培养30-45天。茄瓶培养后转入2-8℃的冰箱中保存。

(二)种子摇瓶培养

用5000ml的大三角瓶，装培养基量为1000-1500ml，每个三角瓶接种两个茄瓶(固体)，摇床转速为120转左右。

配制：配制方法同斜面培养，接种摇8-10天，培养温度15℃±2℃，此时，菌液转稠，待菌丝浓度＞20％，即可作为上罐菌种。

(三)种子罐培养

培养基配制方法同上。60立升的一级种子罐装培养液30-40立升，接1500ml装量的三角瓶一瓶。一级种子罐培养8-10天进入700立升的二级种子罐，培养基的放大量为接种液的5-10倍。二级种子罐培养8-10天进入2.5吨的三级种子罐，培养基的放大量为接种液的5-10倍。

培养条件：罐装量70％以下，培养温度15℃±2℃，搅拌速度110-120r/min，罐压0.065-0.075MPa，空气流量0.04-0.06m³/h。培养时间8-10天。

(四)发酵罐培养

培养基配比同种子罐。发酵培养条件：培养温度：15℃±2℃，罐压：0.04-0.1MPa，空气流量：1-4天控制在0.03-0.04m³/h，4-6天控制在0.05-0.06m³/h，6-10天控制在0.03-0.05m³/h。空气密度控制在0.774-0.903千克每立方米。溶氧量：1-4天控制在10％，4-6天控制在20％，6-10天控制在15％。

搅拌速度转速：1-4天100-110r/min，4-6天110-120r/min，6-10天90-105r/min。培养时间：8-10天。

获得冬虫夏草发酵菌丝体。

实施例2

过程基本上同实施例1，只是种子罐培养进行二级培养，不进入三级种子罐，在各阶段的培养基中还添加酵母膏0.2％，并且在发酵罐培养过程中，逐渐添加0.2％的甘油(糖醇醇类物质)。

将发酵罐体为夹层设计，通入不同温度的冷凝水控制罐内温度，通过搅拌器实现罐内发酵液温度均匀。

实施例3

过程同实施例1，在培养过程中，种子罐两天取样检测一次，发酵罐每天一次。测pH值；测还原糖，用裴林法；测氮，用甲醛法测氨基氮；测浓度，取均匀样液10ml，用4000转/分的离心机离心20分钟后看沉淀数量，浓度达15％以上为移罐标准，最好时可达35％。；测干重，将取样滤纸编号烘干(110℃，60分钟)称重，量10ml样液倒入布氏漏斗中称重后的滤纸上。真空干燥后烘干称重，减去纸重，即为菌丝干重。干重＞0.4％即可放罐。

此时，菌丝浓度增加缓慢，部分菌丝有自溶现象。氨基氮含量下降到200(mg/ml)左右；还原糖下降到1-1.5％左右；pH值降至5.5-5.8。菌丝浓度25-35％，对应干重为0.4-0.8％。

实施例4

过程同实施例3，液体发酵培养结束后，打开出料口，取出培养液，用转鼓真空过滤法收集菌丝，然后将收集的菌丝进行真空低温冷冻干燥，温度控制在-40～-60℃，完全保持菌粉的生物活性，其他技术的干燥方法是烘干或微波干燥等，容易造成菌粉氧化和化学性质的变化和活性成分丧失。

实施例5

将实施例4制得的发酵菌丝与天然冬虫夏草外观和成分进行对比：

(一)外观对比：冬虫夏草虫体与子座断面颜色为白色，微有弹性，气微腥，味微苦。采用本方法生产出发酵冬虫夏草菌丝颜色亦为白色，气味与味道与天然冬虫夏草具有相近似的微腥、微苦性状。

(二)化学成分比较：

通过本领域常规检测方法进行测定(各项指标均相差不足1％)。

有效成分比较(各项指标均相差不足1％)

样品	天然冬虫夏草(％)	发酵冬虫夏草菌丝体(％)	差别
				蛋白质	29.60	30.00	0.4
虫草多糖	4.12	5.00	0.88
				虫草酸	5.49	5.03	0.46
虫草素	0.0053	0.01	0.0047
				腺苷	0.028	0.037	0.009
甘露醇	0.07	0.08	0.01

由此可见，通过本发明发酵方法生产的冬虫夏草菌丝，可以成为野生冬虫夏草的替代品。

Claims

1.一种冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，该方法包括将中国被毛孢菌种斜面培养后接入发酵罐进行发酵，其中培养和发酵所用的培养基按照其寄主蝙蝠蛾幼虫自身的营养成分确定。

2.根据权利要求1的冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，该方法包括将中国被毛孢菌种进行斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，其中斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养所用的培养基中含有黄粉虫幼虫粉作为培养基氮源，并添加维生素B1和B2。

3.根据权利要求2的冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，中国被毛孢菌种的斜面培养基配方含有黄粉虫幼虫粉、豆汁、葡萄糖、米粉、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁，维生素B1和维生素B2；摇瓶培养基配方含有黄粉虫幼虫粉、蛋白胨、豆汁、葡萄糖、米粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和B2；种子罐培养基和发酵罐培养基配方各自含有黄粉虫幼虫粉、米粉、葡萄糖、豆汁、鱼胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和维生素B2。

4.根据权利要求2或3的冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，斜面培养包括一级培养，即试管斜面培养；或者包括二级培养，即试管斜面培养和烧瓶培养，二级培养中所用的培养基成分都是彼此相同的。

5.根据权利要求2、3或4的冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，种子罐培养包括一级种子罐培养，或者包括二级种子罐培养，或三级种子罐培养，二级或三级培养中所用的培养基成分都是彼此相同的。

6.根据权利要求2-5任一项的冬虫夏草发酵生产方法，其特征在于，黄粉虫幼虫粉在各培养基中的含量是0.5％-2％，优选1.0％；维生素B1和B2在各培养基中的含量分别是0.005-0.02％，优选0.01％。

7.根据权利要求2-5任一项的冬虫夏草发酵生产方法，各阶段培养的培养温度均为10-20℃，pH值均为pH 6-8，培养时间为斜面培养30-35天，摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养中的各阶段培养时间均为8-10天。

8.根据权利要求1或2的冬虫夏草发酵生产方法，发酵培养结束后，收集菌丝，然后将收集的菌丝进行干燥，制成发酵虫草菌丝成品。

9.根据权利要求8的冬虫夏草发酵生产方法，其中菌丝的干燥采用真空低温冷冻干燥，温度控制在-40～-60℃。