CN105779299A

CN105779299A - 一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用

Info

Publication number: CN105779299A
Application number: CN201610023430.4A
Authority: CN
Inventors: 陆震鸣; 许正宏; 唐海涛; 史劲松; 唐仁茂; 赵辉; 朱青
Original assignee: XIZANG YUEWANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd; JIANGSU SZYY GROUP PHARMACEUTICAL Ltd; Jiangnan University
Current assignee: Suzhong Pharmaceutical Group Co ltd; Tibet Yuewang Biologic Technetronic Co ltd; Jiangnan University
Priority date: 2016-01-07
Filing date: 2016-01-07
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-01-07
Also published as: CN105779299B

Abstract

一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用。本发明公开了一株从青藏高原野生冬虫夏草中分离获得的高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其应用，菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11803。该菌株通过分离筛选获得，应用本发明公开的最优发酵培养基进行500L发酵罐生产，生物量可达36.1g/L，腺苷含量和产量分别为0.61％和220.1mg/L，甘露醇类物质含量和产量分别为12.8％和4.6g/L，高于目前报道的蝙蝠蛾拟青霉菌株最高腺苷(110.2mg/L)及甘露醇类物质(1.4g/L)产量。

Description

一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及应用。

背景技术

冬虫夏草是高级滋补名贵中药材，在民间应用历史较早，始载于《本草从新》，记有：“冬虫夏草有保肺益肾，止血化痰，已咳嗽......如同民间重现的补品燕窝一样”。冬虫夏草是由冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核(蝙蝠蛾幼虫尸体)构成的复合体，主要含虫草素、虫草酸、腺苷、多糖和麦角甾醇等成分，能抑制多种病菌的生长，增加免疫***细胞数量，促进抗体产生，对内分泌***和神经***具有良好的调节作用，并具有抗肿瘤活性物质，具有极高的保健和药用价值。

天然冬虫夏草资源稀少，生长环境特殊，生长周期长，加之过度采挖，严重破坏了生态环境，人工栽培难度又极大。为缓解市场供需矛盾，研究人员试图从冬虫夏草中分离出菌种，通过发酵生产菌丝体作为冬虫夏草药材的替代品，目前，研究人员已从冬虫夏草中分离出了572个真菌菌核，如中国拟青霉、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被孢霉等。但原***规定仅2种冬虫夏草菌种生产的菌丝体可用于保健食品，其中之一就是蝙蝠蛾拟青霉。

蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)液体发酵所得菌丝体与冬虫夏草的主要化学成分和药理作用极为相似。菌粉所含核苷类成分具有扩张心肺和外周血管的药效作用，其中腺苷的作用最为显著，能舒缓压力及紧张情绪，改善睡眠，增强体力，抗疲劳。所含甘露醇具有止咳平喘，减少呼吸道问题，降低颅压，缓解脑溢血和脑血栓病症。发酵虫草粉又较天然冬虫夏草价格低廉，易与控制生长环境和菌丝体重金属含量等优点。因此，蝙蝠娥拟青霉菌的大规模、高质量的工业发酵生产对于促进人们身体健康，提高生活质量具有重要意义。

专利CN101690463B提供了一种北冬虫夏草诱变菌株及培育方法，通过化学诱变得到一株高产北冬虫夏草新菌株，腺苷产量为70.0mg/L，甘露醇类物质产量为1.4g/L；专利CN104911109A提供了一种高产蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株及其培育方法，腺苷产量为110.2mg/L，甘露醇类物质产量为1.4g/L。本发明公开了一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株，经发酵优化后，其腺苷及甘露醇类物质产量分别达220.1mg/L和4.6g/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及发酵工艺，以提高蝙蝠蛾拟青霉工业生产腺苷及甘露醇类物质的产量。

为解决上述技术问题，本发明所提供的具体技术方案如下：

菌株分离：将青藏高原野生冬虫夏草经表面消毒后，切成2mm×2mm小块，接入PDA培养基中，25℃培养，待组织周围有气生菌丝长出时，用接种坏从菌落边缘挑取菌丝接入新的培养基，以多次挑取菌株边缘菌丝的方法分离纯化菌株，最终获得11株丝状真菌菌株。

摇瓶筛选：将上述11株丝状真菌种子液按5％(v/v)的接种量接入装有100mL发酵培养基(葡萄糖2～4％，豆饼粉1～3％，KH₂PO₄0.01～0.5％，MgSO₄0.01～0.5％)的500mL摇瓶中，25℃、150rpm培养6d后，6000rpm离心收集菌丝体，烘干后测定生物量并获得菌粉。按照2010版《中国药典》所述方法测定菌粉中腺苷及甘露醇类物质含量，发现9号菌株生长迅速，生物量较高，腺苷及甘露醇类物质含量最高，因此选择9号菌株作进一步研究。

菌种鉴定：9号菌株菌丝为白色绒状，较密集，菌落呈椭圆形，中间略微鼓起，边缘整齐，有隔膜，有椭球形或杆状孢子，孢子直径2.0～5.0μM。提取9号菌株总DNA，用真菌18SrDNA及ITS的通用引物扩增，得到的相应的基因序列，经测序比对，并结合菌株形态学特征，确定9号菌株为蝙蝠蛾拟青霉JNPF-PH01(PaecilomyceshepialiJNPF-PH01)，该菌株于2015年12月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11803。

发酵培养基优化：利用单因素实验和正交实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，的到最优培养基配方为：葡萄糖1～4％，酵母粉1～3％，蛋白胨1％～3％，豆饼粉1～3％，KH₂PO₄0.1～1.0％，MgSO₄0.01～0.5％，VB10.01～0.5％。培养条件为：接种量5％(v/v)，温度25℃，转速150r/min，装液量100mL/500mL，发酵周期6d。

100L发酵罐放大培养：将种子液按5％(v/v)接种量接入装有50L最优发酵培养基中的100L发酵罐中，25℃，150r/min，通气量8～14m³/h，罐压0.06～0.14MPa，培养5d。

500L发酵罐放大培养：将种子液按5％(v/v)接种量接入装有400L最优发酵培养基中的500L发酵罐中，25℃，150r/min，通气量8～14m³/h，罐压0.06～0.14MPa，培养4d。

本发明的有益效果在于：提供了一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株及其发酵工艺。将该菌株及最优发酵培养基应用于500L发酵罐生产，最终生物量可达36.1g/L，腺苷含量和产量分别为0.61％和220.1mg/L，甘露醇类物质含量和产量分别为12.8％和4.6g/L，高于目前报道的蝙蝠蛾拟青霉菌株最高腺苷(110.2mg/L)及甘露醇类物质(1.4g/L)产量。

具体实施方式

实施例1冬虫夏草内生真菌菌株的分离

1.培养基

PDA培养基：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。

种子培养基：葡萄糖3％，蛋白胨1％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄0.05％。

2.将青藏高原野生冬虫夏草经表面消毒后，切成2mm×2mm小块，接入PDA培养基中，25℃培养，待组织周围有气生菌丝长出时，用接种环从菌落边缘挑取菌丝接入新的培养基，以多次挑取菌株边缘菌丝的方法分离纯化菌株。经初步分离纯化，得到29株菌，根据形态观察，初步确定其中25株为真菌，3株为细菌，1株放线菌，选择生长较良好的菌株继续培养，最终得到11株丝状真菌。

实施例2摇瓶筛选与菌种鉴定

利用发酵培养基对分离到的11株丝状真菌进行摇瓶发酵，并检测生物量、腺苷含量及甘露醇类物质含量等指标，筛选出长势良好且腺苷及甘露醇类物质产量高的菌株进行菌种鉴定。

1.培养基

发酵培养基：葡萄糖3％，蛋白胨1％，豆饼粉2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄0.05％。

2.检测方法

(1)生物量检测

将发酵液6000r/min离心10min后弃上清，沉淀于105℃烘箱中烘至恒重，计算生物量。菌丝体粉碎后用于腺苷及甘露醇类物质含量检测。

(2)腺苷含量检测

参照中国药典2000年版二部附录VD，用高效液相色谱法测定菌粉中腺苷含量。操作步骤如下：精确称取菌粉0.25g，置于50mL量瓶中，加0.01mol/L磷酸钠溶液适量，充分振摇后，超声提取20分钟，放冷，加0.01mol/L磷酸钠溶液至刻度，摇匀，滤过，续滤液经0.22μm膜过滤后用于腺苷含量检测。色谱条件：色谱柱：WatcrsXBridgeC18柱，4.6×250mmCohumn(5μm)；检测器：紫外检测器；流动相：水-甲醇(85∶15)；流速：0.5mL/min；检测波长：260nm；柱温：30℃。

(3)甘露醇类物质检测

参照中国药典2000年版二部附录VD，用滴定法测定菌粉中甘露醇类物质含量。操作步骤如下：精确称量菌粉0.5g，置于100mL量瓶中，加入0.01mol/L磷酸钠溶液适量，振摇30分钟并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL置碘瓶中，精密加入高碘酸钠(钾)溶液[取硫酸溶液(1→20)90mL与高碘酸钠(钾)溶液(2.3→1000)110mL混合制成]50mL，置水浴上加热15分钟放冷，加入碘化钾试液10mL，放置5分钟，用的硫代硫酸钠溶液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示剂1mL，继续滴至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于0.3643mg的甘露醇(C₆H₁₄O₆)。

3.摇瓶发醇

将实施例1中所得的11株丝状真菌菌株种子液按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基(装液量100mL/500mL)中，25℃、150rpm培养6d。经生物量、腺苷及甘露醇类物质含量检测发现，9号菌株生物量(26.9g/L)较高，腺苷(0.47％)和甘露醇类物质(0.86％)含量最高故选取9号菌株做进一步研究。

表19号菌株摇瓶发醇结果

注：发酵条件为接种量5％(v/v)、装液量100mL/500mL、温度25℃、转速150rpm、培养6d。

4.菌种鉴定

提取9号菌株总DNA，用真菌18SrDNA及ITS的通用引物扩增，得到的相应的基因序列，经测序比对，并结合菌株形态学特征，确定9号菌株为蝙蝠蛾拟青霉JNPF-PH01(PaecilomyceshepialiJNPF-PH01)，并将该菌株于2015年12月2日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11803。

实施例3蝙蝠蛾拟青霉发酵培养基优化

以种子培养基为基础培养基，对碳源、氮源、无机盐、生长因子进行种类筛选及添加量优化。培养条件为：装液量100mL/500mL，接种量5％(v/v)，温度25℃，转速150r/min，培养6d。

1.碳源筛选

分别考察了葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖对蝙蝠蛾拟青霉发酵生物量、腺苷及甘露醇产量的影响，发现3％的葡萄糖效果最佳。

2.氮源筛选

以3％葡萄糖为最优碳源，分别考察了硝酸盐、豆饼粉、玉米浆、酵母粉、胰蛋白胨及牛肉膏对蝙蝠蛾拟青霉发酵生物量、腺苷和甘露醇类物质产量的影响，设置三次平行实验，发现添加1％蛋白胨、1％的酵母粉、2％的豆饼粉效果最佳。

3.无机盐筛选

以3％葡萄糖为最优碳源，1％酵母粉、1％蛋白胨、2％豆饼粉为氮源，分别考察了添加磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化锌及氯化铵对蝙蝠蛾拟青霉发酵生物量、腺苷和甘露醇类物质的影响，发现添加0.1％的磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁和0.025％氯化锌效果最佳。

4.生长因子筛选

在添加3％的葡萄糖、1％的酵母粉、1％的蛋白胨、2％豆饼粉、0.1％的磷酸二氢钾、0.05％的硫酸镁和0.025％的氯化锌的基础上，分别考察了维生素B1、生物素、烟酸、核黄素对蝙蝠蛾拟青霉发酵生物量、腺苷和甘露醇类物质的影响，发现添加0.01％的维生素B1效果最佳。

实施例3100L及500L发酵罐扩大培养

1.100L发酵罐放大培养

将种子液按5％(v/v)接种量接入装有50L最优发酵培养基中的100L发酵罐中，25℃，150r/min，通气量8～14m³/h，罐压0.06～0.14MPa，培养5d。最终生物量为36.7g/L，腺苷含量和产量分别为0.59％和216.5mg/L，甘露醇类物质含量和产量分别为12.28％和4.5g/L。

2.500L发酵罐培养

将种子液按5％(v/v)接种量接入装有400L最优发酵培养基中的500L发酵罐中，25℃，150r/min，通气量8～14m³/h，罐压0.06～0.14MPa，坫养4d。最终生物量为36.1g/L，腺苷含量和产量分别为0.61％和220.2mg/L，甘露醇类物质含量和产量分别为12.76％和4.6g/L。

序列表

Claims

1.一株高产腺苷及甘露醇类物质的蝙蝠蛾拟青霉菌株，现保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11803，保藏日期为2015年12月2日，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali。

2.保藏编号为CGMCCNo.11803的蝙蝠蛾拟青霉的发酵方法，其特征为发酵培养基组成为质量体积比1％～4％的葡萄糖，1％～3％的酵母粉，1％～3％的蛋白胨，1％～3％豆饼粉，0.1％～1.0％的磷酸二氢钾、0.01％～0.5％的硫酸镁、0.01％～0.5％的氯化锌及0.01％～0.5％的维生素B1中一种或几种的组合。