CN107119073A - 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途 - Google Patents

表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途 Download PDF

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Abstract

本文报道，对于瞬时转染，人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供增强的生产力(在LC‑HC‑SM组织中)，与使用SV40 polyA信号序列相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供增强的生产力，在包含hCMV启动子的载体中，向bGH PolyA信号序列加入HGT产生提高的生产力，载体组织LC(3`‑5′)‑HC‑SM产生改善的表达。对于稳定库，据报道，用包含hEF1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力，用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数，且用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示更高的IgG表达稳定性。对于单克隆，据报道，选择标记放置在下游的载体组织(LC‑HC‑SM)对单克隆的生产力具有积极作用，且用包含bGH polyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力。

Description

表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产 生多肽中的用途
本申请是申请人于2012年12月19日提交的题为“表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途”的中国专利申请201280062793.9的分案申请。
本文报道诸如启动子、polyA信号序列和转录终止子的表达载体元件的新组合，表达载体组织，其组合，以及用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
背景技术
基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响：启动子、polyA信号序列和(如果存在)转录终止子。
编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约57bp/19aa)、可变区VH(约350bp/115aa)和恒定区CH(约990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区VK或VL(约350bp/115aa)和恒定区CK或CL(约321bp/107aa)组成。
在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达***(见McCafferty,J.等,(编辑),Antibody Engineering,APractical Approach.,IRL Press(1997))。为了发展抗体表达***，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化(polyA)区。同样，产生包含重链编码核酸的重链表达盒，该重链编码核酸侧翼是启动子和polyA区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达盒，或者可以整合入两个分开的载体。
US 7,053,202中报道了免疫球蛋白DNA盒分子、单体(monobody)构建体、产生方法及其使用方法。在US 5,168,062中，报道了含有人巨细胞病毒立即早期启动子调节DNA序列的转移载体和微生物。US 5,225,348中报道了含有人多肽链延伸因子-1α的启动子区的DNA片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的DNA片段的表达质粒。在US 5,266,491中，报道了含有SV40复制起点及具有人多肽链延伸因子-1α基因的启动子区的DNA片段的表达质粒。US 5,122,458中报道了重组DNA化合物和诸如tPA的多肽的表达。在US 7,422,874中，报道了用于动物细胞的表达载体。
Sanna Pietro,P.报道了抗体Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达(Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395)。Higuchi,K.等(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)报道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗体的可变区的基因克隆的细胞展示文库。Kim,D.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达***(Biotechnol.Progress 19(2003)1620-1622)。Costa,R.A.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138)报道了用于单克隆抗体产生的细胞工程的指导。Kim,D.W.等报道了用人延伸因子1α启动子作为通用和有效的表达***(Gene 91(1990)217-223)。Buchman,A.R.等(Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405)报道了依赖内含子和不依赖内含子的基因表达的比较。Wang,F.等报道了哺乳动物细胞中的抗体表达(在Therapeutic monoclonal antibodies–From bench toclinic,Wiley(2009)557-572页中)。Li等(J.Immunol.Meth.318(2007)113-124)报道了用于重组IgG抗体的哺乳动物表达的不同载体设计的比较性研究。Ho,S.C.L.等报道了用于增强高单克隆抗体表达CHO细胞系的产生的IRES介导的三顺反子载体(J.Biotechnol.157(2011)130-139)。Hotta,A.等(J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303)报道了通过重组动物细胞产生抗-CD2嵌合抗体。Lee,J-C.等报道了肠道病毒71内部内糖体进入位点介导的高效蛋白质表达(Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662)。在WO 2008/142124中，报道了Avian细胞中的重组蛋白质产生。
发明概述
已发现，表达载体的性能主要取决于其预期用途，用于瞬时转染、稳定库和单克隆选择的最佳载体不同。
为了突出主要发现：对于瞬时转染，抗体轻链和重链的双向表达及包括内含子A的全长hCMV启动子的使用是有利的。但是，对于稳定转染，已显示1)抗体轻链、2)抗体重链和3)选择标记的成行排列是有利的。
虽然hEF1α启动子在稳定库中明显优于hCMV启动子，但发现了对单克隆水平的明显相反的作用。在此，用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(hCMV)克隆获得了最高的生产力。
此外，hCMV启动子性能可以进一步通过将它与bGH polyA信号和人胃泌素基因(hGT)的终止子序列组合来改善，其提高生产力和表达稳定性二者。
已发现，如果i)启动子是人巨细胞病毒启动子(hCMV)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGH polyA)，且终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hGT)，或2)启动子是人延伸因子1α启动子(hEF1α)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGHpolyA)，且终止子序列缺乏，则包含各含有启动子、结构基因和polyA信号序列及可选的终止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的产生/分泌抗体的细胞克隆。
通过使用上述表达载体，可以在转染后获得更高数目的产生/分泌抗体的细胞，从而减少了鉴定适合用于大规模重组抗体产生的高产细胞所需的努力。
因此，本文报道的一个方面是用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，和
从而获得大量重组哺乳动物细胞，
b)从该大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含以下的哺乳动物细胞
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，和
b)从该细胞或培养基回收抗体。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于稳定产生抗体。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于瞬时产生抗体。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
本文报道的一个方面是表达载体，其包含：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
已发现，对于稳定的重组抗体表达/分泌细胞系的产生，在将人延伸因子1α启动子(hEF1α)与bGH polyA信号序列组合使用时，hGT终止子序列的存在降低了可获得的表达产率。
本文报道的一个方面是用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒，和
从而获得大量重组哺乳动物细胞，
b)从该大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子包含内含子A。
在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含以下的哺乳动物细胞
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒，和
b)从该细胞或培养基回收抗体。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子包含内含子A。
在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
本文报道的一个方面是表达载体，其包含：
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒，和
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。
在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子包含内含子A。
在一个实施方案中，该表达载体不含任何转录终止子序列。在一个实施方案中，该终止子序列是hGT序列。
已发现，对于抗体的稳定重组产生，包含以下的表达载体的使用导致稳定转染的重组哺乳动物细胞中提高的表达产率：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
与上文相反，已发现，对于抗体的瞬时重组产生，包含以下的表达载体的使用导致瞬时转染的重组哺乳动物细胞中提高的表达产率：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
术语“按相反方向”指一个表达盒按5’->3’方向转录，一个表达盒按3’->5’方向转录。
因此，本文报道的一个方面是包含以下的表达载体在在哺乳动物细胞中稳定重组产生抗体中的用途：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEF1α启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是CHO细胞。
本文报道的一个方面是包含以下的表达载体：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此三个表达盒单向且按第一表达盒-第二表达盒-第三表达盒的顺序组织。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEF1α启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
本文报道的一个方面是包含以下的表达载体在在哺乳动物细胞中瞬时重组产生抗体中的用途：：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEF1α启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是HEK细胞。
本文报道的一个方面是包含以下的表达载体：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒，
由此该表达盒双向组织，由此该第一表达盒和该第二表达盒按相反方向排列。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hCMV启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，该转录终止序列存在且是hGT终止子序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子是hEF1α启动子，该第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，且该表达盒不含转录终止子序列。
此外，已发现，除了别的之外，包含含有内含子A的hCMV启动子和人EF1α启动子而不是不含内含子A的短的人CMV启动子的表达载体增强瞬时基因表达和库基因表达。
本文报道的一个方面是包含以下的表达质粒：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸和第一polyA信号序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸和第二polyA信号序列的第二表达盒，
其中该表达盒中的一个或两个还在该polyA信号序列后面包含人胃泌素终止子序列。
在一个实施方案中，该第一和第二polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信号序列和牛生长激素polyA信号序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子相互独立地选自人CMV启动子、SV40启动子和人延伸因子1α启动子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一表达盒和该第二表达盒单向排列。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记双向排列。
本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中的用途。
本文报道的一个方面是包含本文报道的表达质粒的真核细胞。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括步骤：
-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞或本文报道的细胞，
-从该真核细胞或培养基回收该抗体。
在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
本文报道的一个方面是包含以下的表达质粒：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸和第一polyA信号序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸和第二polyA信号序列的第二表达盒，
其中该第一和/或第二启动子是人延伸因子1α启动子。
在一个实施方案中，该表达盒中的一个或两个在该polyA信号序列后面不包含人胃泌素终止子序列。
在一个实施方案中，该表达盒中的一个或两个不含人胃泌素终止子序列。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子包含内含子A。
在一个实施方案中，该第一和第二polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信号序列和牛生长激素polyA信号序列。
在一个实施方案中，该第一和第二启动子相互独立地选自人CMV启动子、SV40启动子和人延伸因子1α启动子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。
在一个实施方案中，该第一表达盒和该第二表达盒单向排列。
在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。
在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记双向排列。
本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中的用途。
本文报道的一个方面是包含本文报道的表达质粒的真核细胞。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括步骤：
-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞或本文报道的细胞，
-从该真核细胞或培养基回收该抗体。
在一个实施方案中，该真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒，由此该IRES元件是EMCV-IRES元件。
在一个实施方案中，该核酸编码抗体重链。
在一个实施方案中，该选择标记是式A-C-S的融合蛋白质，由此A是可检测多肽，C是蛋白水解信号序列，而S是选择标记。
在一个实施方案中，该蛋白水解信号序列是鸟氨酸脱羧酶的PEST序列。
在一个实施方案中，该可检测多肽是绿色荧光蛋白。
在一个实施方案中，该选择标记是新霉素。
本文报道的一个方面是编码按N端至C端方向包含绿色荧光蛋白、鸟氨酸脱羧酶的PEST序列和新霉素的多肽的核酸。
本文报道的一个方面是编码按N端至C端方向包含绿色荧光蛋白、鸟氨酸脱羧酶的PEST序列和新霉素的多肽的核酸在选择抗体分泌细胞中的用途。
本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列的表达盒在选择抗体产生细胞中的用途，由此该IRES元件是EMCV-IRES元件。
在一个实施方案中，该核酸编码抗体重链。
在一个实施方案中，该选择标记是式A-C-S的融合蛋白质，由此A是可检测多肽，C是蛋白水解信号序列，而S是选择标记。
在一个实施方案中，该蛋白水解信号序列是鸟氨酸脱羧酶的PEST序列。
在一个实施方案中，该可检测多肽是绿色荧光蛋白。
在一个实施方案中，该选择标记是新霉素。
本文报道的一个方面是用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤：
-培养包含i)此方面中报道的表达质粒和ii)编码不由此方面中报道的表达质粒编码的各其他抗体链的核酸的真核细胞，
-选择表达该可检测多肽的细胞。
本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸和polyA信号序列的表达质粒，由此该IRES元件是EV71-IRES元件。
在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、SV40启动子序列，和含有或不含内含子A的人延伸因子1α启动子序列。
在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40polyA信号序列。
在一个实施方案中，该质粒在polyA信号序列3’包含人胃泌素终止子序列。
本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒在表达抗体中的用途，由此该IRES元件是EV71-IRES元件。
在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、SV40启动子序列，和含有或不含内含子A的人延伸因子1α启动子序列。
在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40polyA信号序列。
在一个实施方案中，该质粒在polyA信号序列的3’包含人胃泌素终止子序列。
本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
-培养包含本文报道的表达质粒的真核细胞，
-从该细胞或培养基回收该抗体，从而产生抗体。
在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ ID NO:01的序列。这是不含内含子A且不含5’UTR的hCMV启动子。
在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ ID NO:02的序列。这是不含内含子A而含有5’UTR的hCMV启动子。
在一个实施方案中，该hCMV启动子具有SEQ ID NO:03的序列。这是含有内含子A的全长hCMV启动子。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子具有SEQ ID NO:04的序列。这是不含内含子A的hEF1α启动子。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子具有SEQ ID NO:05的序列。这是含有内含子A的hEF1α启动子。
在一个实施方案中，该人延伸因子1α启动子具有SEQ ID NO:06的序列。这是含有内含子A且含有5’UTR的短的hEF1α启动子。
在一个实施方案中，该大鼠CMV启动子具有SEQ ID NO:07的序列。
在一个实施方案中，该SV40polyA信号序列具有SEQ ID NO:08的序列。
在一个实施方案中，该牛生长激素polyA信号序列具有SEQ ID NO:09的序列。
在一个实施方案中，该人胃泌素终止子具有SEQ ID NO:10的序列。
在一个实施方案中，该SV40启动子具有SEQ ID NO:11的序列。
在一个实施方案中，该鸟氨酸脱羧酶的PEST序列由SEQ ID NO:12的序列编码。
在一个实施方案中，该GFP序列由SEQ ID NO:13的序列编码。
在一个实施方案中，该新霉素选择标记具有SEQ ID NO:14的序列。
在一个实施方案中，该GFP-PEST-NEO融合多肽由SEQ ID NO:15的序列编码。
在一个实施方案中，该EMCV-IRES具有SEQ ID NO:16的序列。
在一个实施方案中，该EV71-IRES具有SEQ ID NO:17的序列。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该抗体是双特异性抗体。
在一个实施方案中，该双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且该双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
在一个实施方案中，该表达载体包含：
-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，
-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，
-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第四表达盒，
或
-按5’至3’方向包含启动子、编码抗体轻链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第一表达盒，
-按5’至3’方向包含启动子、编码第一抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第二表达盒，和
-按5’至3’方向包含启动子、编码第二抗体重链的核酸、polyA信号序列和可选的终止子序列的第三表达盒，
由此该抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含：
-抗体轻链表达盒，
-第一抗体重链表达盒，
-第二抗体重链表达盒，和
-选择标记表达盒，
其中该抗体重链表达盒的至少一个、该抗体轻链表达盒和该选择标记表达盒单向排列，且
其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列，或该单向表达盒按抗体轻链表达盒、抗体重链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，该表达载体包含：
-第一抗体轻链表达盒，
-第二抗体轻链表达盒，
-第一抗体重链表达盒，
-第二抗体重链表达盒，和
-选择标记表达盒，
其中该抗体重链表达盒之一、该抗体轻链表达盒之一和该选择标记表达盒单向排列，且
其中该单向表达盒按抗体重链表达盒、抗体轻链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列，或该单向表达盒按抗体轻链表达盒、抗体重链表达盒和选择标记表达盒的5’至3’顺序排列。
在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含臼(hole)突变的抗体重链。
在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含杵(knob)突变的抗体重链。
在一个实施方案中，该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CH1结构域的抗体轻链，和/或该抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
在一个实施方案中，该抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链，和/或该抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
发明详述
I.一般方面
如本领域技术人员已知，重组DNA技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或***来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999))。重组技术的使用使得本领域技术人员能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
重组DNA技术的使用使得能够产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如通过取代、改变、交换、缺失或***来在单个或几个位置中修饰。该修饰或衍生化可以例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,USA(1999)；Hames,B.D.和Higgins,S.J.,Nucleic acidhybridization–a practical approach,IRL Press,Oxford,England(1985))。
重组技术的使用使得能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但除了别的之外，隶属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓密码子选择。由此相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由一种或多种不同的核酸编码。另外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
定义
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这类改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的部分，该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“种类”指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“表达”指发生在细胞内的转录和/或翻译过程。可以根据存在于细胞中的相应mRNA的量来测定目的核酸序列在该细胞中的转录水平。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过RT-PCR或通过Northern杂交来定量(见Sambrook等,1999,上文)。目的核酸编码的多肽可以通过多种方法来定量，例如通过ELISA，通过测定该多肽的生物学活性，或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫测定(见Sambrook等,1999,上文)。
“表达盒”指包含在细胞中表达至少所含的核酸所必需的诸如启动子和聚腺苷酸化位点的调节元件的构建体。
“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒包含：例如用于大肠杆菌(E.coli)的原核质粒繁殖单位，其包含复制起点和选择标记；真核选择标记；及用于表达一个或多个目的结构基因的一个或多个表达盒，其各包含启动子、结构基因和聚腺苷酸化信号(polyA信号序列)。通常将基因表达置于启动子的控制下，并将这种结构基因称为与该启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则该调节元件和该核心启动子有效连接。
本文的术语“Fc区”用来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat,E.A.等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication91-3242中所述的EU编号***，也称为EU指数。
“Fc区”是众所周知的术语，根据抗体重链的木瓜蛋白酶切割定义。在一个实施方案中，本文报道的复合物可以包含人Fc区或衍生自人来源的Fc区作为抗体重链铰链区多肽。在另一实施方案中，该Fc区是IgG4亚类的人抗体的Fc区，或IgG1、IgG2或IgG3亚类的人抗体的Fc区，其以这样的方式修饰，使得没有Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合和/或没有C1q结合可被检测到。在一个实施方案中，该Fc区是人Fc区，且尤其是来自人IgG4亚类或来自人IgG1亚类的突变Fc区。在一个实施方案中，该Fc区来自具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。IgG4显示减少的Fcγ受体(FcγRIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。但是，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖类的丧失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和His435是在改变时也提供减少的Fcγ受体结合的残基(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434)。在一个实施方案中，本文报道的一个方面中待表达的抗体是关于IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的Fcγ受体结合，在L234、L235和/或D265中具有突变，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，该突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236(PVA236表示用PVA取代IgG1的从氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码给出)或IgG4的EFLG)。在一个实施方案中，该突变是IgG4的S228P及IgG1的L234A和L235A。抗体的Fc区直接涉及ADCC(依赖抗体的细胞毒性)和CDC(依赖补体的细胞毒性)。不结合Fcγ受体和/或补体因子C1q的复合物不引出抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。杵修饰表示抗体CH3结构域中的突变T366W(Kabat编号)。臼修饰表示抗体CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V。除杵和臼修饰外，一个CH3结构域中可以存在突变S354C，另一个CH3结构域中可以存在突变Y349C。
“构架区”或“FR”指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
“基因”表示核酸，其是例如染色体上或质粒上可以影响肽、多肽或蛋白质的表达的区段。除编码区(即结构基因)外，基因包含其他功能性元件来例如信号序列、一个或多个启动子、内含子和/或终止子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及从其衍生的后代，而不考虑传代数。后代的核酸含量可以并非与亲本细胞完全相同，但可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能和生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的区域中的每一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102(Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication 91-3242)。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在CDR的称为缩短的CDR或a-CDR的区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102(Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有说明，本文按照Kabat等,上文编号可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)。
“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述这样的序列，其在功能上促进独立于IRES的基因5'的翻译起始，并允许在动物细胞内从单个转录物翻译两个顺反子(可读框)。IRES提供独立的核糖体进入位点用于翻译刚好处于其下游(下游在本文中可与3’互换使用)的可读框。不像细菌mRNA(其可以是多顺反子，即编码从mRNA顺次翻译的几种不同多肽)，动物细胞的大多数mRNA是单顺反子，仅编码一种蛋白质的合成。对于真核细胞中的多顺反子转录物，翻译将从最靠近5’的翻译起始位点起始，在第一终止密码子处终止，转录物将从核糖体释放，导致仅翻译mRNA中的第一编码多肽。在真核细胞中，具有与转录物中的第二或后续可读框有效连接的IRES的多顺反子转录物允许连顺次翻译该下游可读框来产生由同一转录物编码的两种或多种多肽。之前已描述了IRES元件在载体构建中的用途，见例如Pelletier,J.等,Nature 334(1988)320-325；Jang,S.K.等,J.Virol.63(1989)1651-1660；Davies,M.V.等,J.Virol.66(1992)1924-1932；Adam,M.A.等,J.Virol.65(1991)4985-4990；Morgan,R.A.等Nucl.Acids Res.20(1992)1293-1299；Sugimoto,Y等,Biotechnology12(1994)694-698；Ramesh,N.等,Nucl.Acids Res.24(1996)2697-2700；和Mosser,D.D.等,BioTechniques 22(1997)150-152)。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了例如包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该群体的单种抗体相同和/或结合相同的表位。与通常包含抗不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体抗抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意具体的方法来产生抗体。例如，待按照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，其包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻链(CL)结构域。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配至两个类型之一，称为κ和λ。
本文所用的“核酸”指由单核苷酸(也称为碱基)a、c、g和t(或RNA中的u)组成的聚合物分子，例如DNA、RNA或其修饰。此多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。此定义还涵盖其中改变(例如通过诱变)、缺失或加入了一个或多个核苷酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分离的，或整合入另一核酸(例如表达盒)、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸同样表征为其由单核苷酸组成的核酸序列。
对本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转化为编码此氨基酸序列的相应核酸序列的流程和方法众所周知。因此，核酸表征为其由单核苷酸组成的核酸序列，并同样表征为由此编码的多肽的氨基酸序列。
本文所用的“核酸”指编码可以重组产生的多肽的天然存在或部分或完全非天然存在的核酸。核酸可以由分离的或通过化学手段合成的DNA片段建成。核酸可以整合入另一核酸，例如表达质粒或真核宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭质粒和表达质粒。通常，该质粒还将包含原核繁殖单位，该原核繁殖单位含有原核生物中的质粒的分别用于复制和选择的复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性基因)。
“有效连接的”指两种或多种成分的并列，其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，但并非必然，“有效连接的”DNA序列是相邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区(如分泌前导序列和多肽)时是相邻和符合(可读)框的。但是，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它冰粉必然与该编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则该增强子与该编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游，且距启动子相当的距离。如果聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游端，使得转录通过该编码序列进入该聚腺苷酸化序列，则它与该编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3’端)，使得翻译通过该编码序列行进至该终止密码子并在此处终止，则它与该外显子核酸序列有效连接。通过本领域已知重组方法来实现连接，例如，使用PCR方法和/或通过方便的限制位点处的连接。如果不存在方便的限制位点，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“多顺反子转录单位”是其中一个以上的结构基因处于同一启动子的控制下的转录单位。
本申请内所用的术语“聚腺苷酸化信号”指用来诱导特定核酸序列区段的初级转录物的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信号的3’非翻译区可以选自含有衍生自SV40、牛生长激素(bGH)基因、免疫球蛋白基因和胸苷激酶基因(tk，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶聚腺苷酸化信号)的聚腺苷酸化信号的3’非翻译区。
“启动子”指控制与它有效连接的基因/结构基因或核酸序列的转录的多核苷酸序列。启动子包含用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在考虑在其中表达所选择的序列的宿主细胞的细胞类型中具有功能。包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子的大量启动子为本领域公知(并在诸如GenBank的数据库中标识)，且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如从诸如ATCC的保藏机构以及其他商业或个人来源)。
“启动子”包含指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子定位在基因的5’非编码或非翻译区中，靠近结构基因的转录起始位点。启动子内在起始转录中发挥作用的序列元件常表征为共有核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee,R.E.等,Mol.Endocrinol.7(1993)551)、环AMP应答元件(CREs)、血清应答元件(SRE；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47)、糖皮质激素应答元件(GRE)及其他诸如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等,J.Biol.Chem.267(1992)19938)、AP2(Ye,J.等,J.Biol.Chem.269(1994)25728)、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253)和八核苷酸因子(一般见Watson等,(编辑),Molecular Biology of the Gene,第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.(1987))及Lemaigre,F.P.和Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)的转录因子的结合位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。还已知阻抑型启动子。例如，c-fos启动子在生长激素结合其在细胞表面上的受体时特异性激活。可以通过由例如CMV启动子及随后的两个Tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子来达到受四环素(tet)调节的表达。Tet阻抑物与两个Tet操纵基因位点结合，并阻断转录。加入诱导物四环素时，Tet阻抑物从Tet操纵基因位点释放，转录继续(Gossen,M.和Bujard,H.,PNAS 89(1992)5547-5551)。对于包括金属硫蛋白和热休克启动子的其他诱导型启动子，见例如Sambrook等(上文)和Gossen等,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。在已鉴定为用于高水平表达的强启动子的真核启动子有SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复序列、中国仓鼠延伸因子1α(CHEF-1，见例如US 5,888,809)、人EF-1α、泛素和人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV IE)。
“启动子”可以是组成型或诱导型。增强子(即作用于启动子来增加转录的顺式作用DNA元件)可以有必要与启动子结合发挥作用来提高单独用启动子所获得的表达水平，且可以作为转录调节元件包括。通常，含有启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如CMV或SV40)。
本申请内所用的术语“稳定转化的”、“稳定转染的”或“稳定的”指外源核酸可遗传地和稳定地整合入宿主细胞基因组/染色体。在选择性生长条件下(即在一种或多种选择标记的存在下)细胞选择过程之后获得稳定转染的细胞。
“结构基因”指不含信号序列的基因区域，即编码区。
术语“转录终止子”指向RNA聚合酶发出终止mRNA合成的信号的长度为50-750个碱基对的DNA序列。尤其是在使用强启动子时，在表达盒的3’端用非常有效(强)的终止子来防止RNA聚合酶通读是明智的。无效的转录终止子可以导致操纵子样mRNA的形成，其可以是不希望的(例如质粒编码的)基因表达的原因。
在本发明的范围内，可以用基本上本领域已知的转染方法中的任一种来获得转染的细胞。例如，可以借助电穿孔或显微注射来将核酸引入细胞。备选地，可以使用诸如FuGENE 6(Roche Diagnostics GmbH,德国)、X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH,德国)和LipofectAmine(Invitrogen Corp.,美国)的脂转染试剂。还备选地，可以通过基于反转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的适当的病毒载体***来将核酸引入细胞(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314)。
本申请内所用的术语“瞬时转染”指其中引入细胞的核酸不整合入该细胞的基因组或染色体DNA的方法。它实际上作为染色体外元件(例如作为附加体)维持在细胞中。附加体的核酸的转录过程不受影响，且例如产生由附加体的核酸编码的蛋白质。瞬时转染产生“瞬时转染的”细胞。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(见例如Kindt,T.J.等,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域筛选互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(见例如Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
抗体
本文提供的方法和组合物用于产生重组单克隆抗体。抗体可以具有多种结构，如但不限于单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、单价抗体、多价抗体(例如二价抗体)。
在某些实施方案中，该抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段即下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述见Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134。scFv片段的综述见例如Plueckthun,A.,In:ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore(编辑),Springer-Verlag,New York(1994),第269-315页；还见WO 1993/16185、US 5,571,894和US 5,587,458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论见美国专利号US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(见例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)。三抗体和四抗体还描述于Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134中。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如US 6,248,516 B1)。
可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。
在某些实施方案中，该抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如US 4,816,567；和Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用对应的来自非人抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并进一步描述于例如Riechmann,I.等,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US 5,821,337、US 7,527,791、US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.等,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn,J.等,Methods 36(2005)61-68；和Klimka,A.等,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”途径)中。
可以用来进行人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法选择的构架区(见例如Sims,M.J.等,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；衍生自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(见例如Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(见例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和衍生自筛选FR文库的构架区(见例如Baca,M.等,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等,J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
在某些实施方案中，该抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体通常描述于van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125，还见例如描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述技术的US 5,770,429；描述K-M 技术的US 7,041,870；描述技术的US 2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),51-63页；及Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li,J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562中。其他方法包括描述于例如US 7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)也描述于Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937及Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191中。
还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定区组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
可以针对具有一种或多种希望的活性的抗体筛选组合文库来分离抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37中，并进一步描述于例如McCafferty,J.等,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；及Lee,C.V.等,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132中。
在某些噬菌展示方法中，分别通过聚合酶链反应(PCR)克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按Winter,G.等,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述针对结合抗原的噬菌体筛选该文库。噬菌体通常作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段展示抗体片段。来自免疫的来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths,A.D.等,EMBO J.12(1993)725-734所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述，通过从干细胞克隆未重排V基因区段，并用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并实现体外重排来合成制备首次用于实验的文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如US 5,750,373、US 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936和US 2009/0002360。
本文将分离自人抗体文库的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
在某些实施方案中，该抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性中的一种针对第一抗原，另一种针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与同一抗原的两个不同表位结合。还可以用双特异性抗体来将细胞毒性剂定位至表达该抗原的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540；WO93/08829；及Traunecker,A.等,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵入臼”改造(见例如US5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(WO 2009/089004)；交联两种或多种抗体或片段(见例如US 4,676,980和Brennan,M.等,Science 229(1985)81-83)；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(见例如Kostelny,S.A.等,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(scFv)二聚体(见例如Gruber,M.等,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；按例如Tutt,A.等,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576)。
该抗体可以是含有与第一抗原以及另一不同抗原结合的抗原结合部位的“双重作用Fab”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
该抗体或片段还可以是WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO2010/145793中所述的多特异性抗体。
方法
在某些实施方案中，用本文提供的方法来改变(即提高或降低)抗体糖基化的程度。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于Fc区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297(见例如Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中附着于GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，所提供的方法导致产生具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的糖类结构的抗体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过例如WO 2008/077546中所述的MALDI-TOF质谱法测量的附着于Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的Kabat EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki,N.等,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；and WO 2003/085107)。
在某些实施方案中，所提供的方法可以用来产生具有二等分寡糖的抗体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878、US 6,602,684和US 2005/0123546中。还可以产生在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类变体描述于例如WO 1997/30087、WO1998/58964和WO 1999/22764中。
可以用例如US 4,816,567中所述的重组方法和组合物产生抗体。核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(或已用以下转化)：(1)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列和含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0)。在一个实施方案中，提供制备抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养上文提供的含有编码抗体的核酸的宿主细胞，并可选地从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗体，分离编码抗体的核酸，并***一个或多个载体用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生抗体。抗体片段和多肽在细菌中的表达见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523；还见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以从可溶级分中的细菌糊分离抗体，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株(见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主(见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用驯化为悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.Gen Virol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR阴性(DHFR-)CHO细胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2004),255-268页。
II.本发明的具体方面
已发现，取决于载体组织，表达载体的性能(1)因载体设计而不同，及(2)同一载体在瞬时转染和稳定转染之间不同。
已发现，用于瞬时转染和稳定转染的最佳载体组织可以明显不同。不受限于此理论，几点可以促成这些差异：1)宿主基因组中整合的载体拷贝之间的转录干扰现象，其取决于各载体设计并对各载体设计特异，且不存在于瞬时***中；2)选择方法和选择严格性的影响，其取决于各载体组织，且在稳定***中而不是在瞬时***中发挥重要作用；及3)最佳的LC与HC多肽的比值，其对单克隆抗体的瞬时表达和稳定表达而言明显不同，且在瞬时转染中低于稳定转染中。
已发现，对于瞬时转染，LC和HC的双向表达达到了所有测试的载体组织中最高的产物效价。不受限于理论，假定此载体设计满足最佳的IgG表达的两条标准A)LC和HC多肽的高表达水平和B)最佳的“瞬时”LC:HC多肽比，及C)LC和HC的双向表达也可以最小化转录干扰机制，如RNA聚合酶的通读作用。
但是，已发现，对于稳定转染，LC和HC的双向表达比成行组织LC-HC-SM更差。不受限于此理论：1)LC、HC和SM的表达盒的趋同组织可减少整合的载体拷贝之间的转录干扰现象；2)LC在HC的上游明显便于对稳定转染而言最佳(更佳)的LC:HC多肽比；及3)选择标记的下游放置明显提高了选择的严格性。此外，发现产生IgG的细胞的百分比和细胞系的生产力提高。对于在抗体表达盒上游双向包含选择标记的载体，虽然选择的严格性明显提高，但提高选择压力的浓度未提高稳定库或克隆的生产力(数据未显示)。
已发现，用hEF1α启动子和bGH polyA信号同时交换hCMV启动子和SV40poly信号在抗体表达盒单向组织时显著提高瞬时产物效价，但在双向放置LC和HC表达盒时降低产物效价。
已发现，hEF1α启动子产生大量产生良好的克隆及非常少量的非产生或低产生克隆。但是，hEF1α启动子的最好的单克隆在补料分批分析中的产物效价低于hCMV启动子的克隆。但hCMV启动子的排序靠前的克隆的总数相对低，它们的鉴定通常需要高筛选努力。
已发现，在瞬时转染中以及稳定转染中，对于含有hCMV启动子的载体，在与SV40或bGH polyA信号组合时，hGT的使用显著提高生产力。但是，对于含有hEf1α启动子的载体，在与bGH polyA信号组合时，它对产物效价的影响可忽略。因此，已发现，hGT对载体性能的影响依赖于所使用的启动子。
用于充分控制的大规模发酵中的最终评价的适当克隆的选择通常基于摇瓶中的分批或补料分批分析。已发现，一些表达载体或元件的性能和排序在分批和补料分批分析之间存在差异。在分批分析中而不是在补料分批分析中，对于含有hCMV启动子的载体，用bGH polyA信号取代SV40polyA提高了生产力。在分批分析中而不是在补料分批分析中，hGT对克隆的产物效价无显著影响。选择标记的放置或启动子(hEf1α或hCMV启动子)不同的载体之间的差异在分批分析中中度显著，但在补料分批分析中强烈显现。表达水平和比产生速率在补料分批模式中比在分批模式中高。
已发现大多数克隆的补料分批分析和2L发酵的性能的良好相关，不仅在绝对产物效价的水平上，还在不同载体和克隆之间的排序上。
已发现，与在抗体表达盒上游双向放置选择标记相比，选择标记的下游放置轻微减少了生产力丢失。不受限于理论，这可能是由于提高的选择严格性，因此更高的mRNA水平或改善的LC:HC mRNA或多肽比。两种因素都可导致对生产力变化的更高耐受性。
与SV40polyA信号相比，bGH polyA信号显著降低克隆中抗体表达的稳定性。但是，在bGH polyA信号下游***hGT明显提高了表达的稳定性。hGT对稳定性的积极作用在缺乏选择压力的情况下最明显。
稳定库的稳定性分析揭示，在用hCMV产生时，细胞快速丧失生产力，但在用hEf1α启动子产生时则不然。令人惊奇地，对于含有hEf1α启动子的载体，hGT降低克隆的生产力，但轻微提高它们的稳定性。
只有少部分克隆在选择过程之后显著产生抗体。但是，载体组织的修饰和/或元件的修饰显著提高产生IgG的克隆与不产生IgG的克隆的比值。不同的载体组织及因此决定选择严格性的选择标记的不同表达水平也明显影响产生IgG的细胞的百分比。基于筛选过程的数据的统计模拟证明，一些表达载体还具有显著减少筛选过程中的工作量的潜能。这一事实对生物制药公司的成本具有主要影响。
转录过程的改善
启动子的转录起始
启动子决定基因的转录水平，因此对细胞系的生产力和稳定性具有强烈影响：
-启动子介导的转录起始决定可以翻译为重组蛋白质的mRNA的量；
-尽管稳定整合，但克隆的长期生产力可以快速降低(由于遗传基因沉默(例如通过启动子甲基化))；
-启动子活性依赖于细胞类型。
描述了在多种细胞系中显示为强启动子的启动子。已知内含子可以包含增强子样元件。通常，第一内含子(内含子A)包含大多数调节元件。此内含子A是全长天然启动子序列/组织内第一个出现的内含子。
PolyA信号介导的mRNA的聚腺苷酸化
mRNA的聚腺苷酸化具有多种功能。它强烈影响mRNA的细胞核输出、翻译起始和mRNA稳定性。因此，聚腺苷酸化过程的效率对基因的表达水平和因此对生产力具有强烈影响。
几篇出版物已显示，聚腺苷酸化信号可以对蛋白质表达具有强烈影响。据报道，在取代SV40polyA信号时，由牛生长激素衍生的polyA信号(bGH polyA信号)可以产生增强的蛋白质表达。
已发现，牛生长激素polyA信号可以在抗体链的重组产生中具有改善的特性。
转录终止子支持的转录终止
包含在表达载体中的元件可以相互强烈干扰(转录干扰)。这是由于转录过程中的竞争。例如，由于空间限制和转录机器的资源的可用性降低，亚适启动子接近转录因子和/或RNA聚合酶。干扰还可以发生在不同的紧密相邻的表达盒之间。例如，可以出现由无效的(inefficient)转录终止引起的RNA聚合酶从第一表达单位通过第二表达单位的通读。
据报道，无效的转录终止可以导致转录干扰，其可以导致基因的无效表达。人胃泌素基因转录终止子(hGT)的使用可以改善转录终止，从而促成重组蛋白质的增强的表达。此作用取决于与hGT组合的启动子。已知其他有效的转录终止子。
已发现，通过在抗体表达盒的早期SV40polyA信号之后***人胃泌素转录终止子的序列，可以达到增强转录终止和防止例如抗体轻链和抗体重链的表达盒之间的转录干扰。
结果
本文报道用于增强一个或多个编码核酸，例如编码抗体链的结构基因的表达的表达载体。
已发现，在正确选择和排列转录所需的遗传元件时，表达该结构基因的重组细胞的生产力改善。
-polyA信号序列和转录终止子序列
在载体p5068中，表达盒由SV40polyA信号终止。
在载体px6001中，表达盒还包含放置在SV40PolyA信号下游的人胃泌素转录终止子(hGT)。
在载体px6007中，表达盒由bGH polyA信号和hGT转录终止子终止。
在载体px6008，表达盒由不含附加的转录终止子的bGH polyA信号终止。
将这些载体瞬时转染入CHO-K1细胞，转染6天后，收集细胞培养物上清，并通过ELISA测定培养上清中所产生的抗体的量。
与对照载体p5068相比，bGH polyA信号取代SV40polyA信号和SV40polyA信号后面加入/***人胃泌素终止子(hGT)导致瞬时表达的生产力提高约45％至30％。与对照载体p5068相比，bGH polyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合导致最大的效价提高(+58％)。
载体 上清中抗体的量[μg/ml] 载体元件
p5068 4.6 仅SV40polyA
px6001 6.1 SV40polyA和hGT终止子
px6007 7.4 bGH polyA+hGT终止子
px6008 6.8 仅bGH polyA
因此，已发现，在瞬时表达***中，bGH polyA信号的聚腺苷酸化和通过加入人胃泌素转录终止子改善的转录终止增强了抗体分泌。
用载体p5068、px6001、px6007和px6008来产生稳定的抗体表达细胞系。
用载体p5068产生的最好的15个单克隆在分批抗体产生中的平均生产力为624μg/ml。与载体p5068相比，用载体px6001(含有人胃泌素终止子(hGT))或载体px6007(含有bGHpolyA信号和hGT的组合)产生的克隆具有分别提高了23％和40％的生产力(载体px6001为770μg/ml，载体px6007为872μg/ml)(见图1)。此生产力的提高还反映在排序靠前的克隆的水平上(载体px6001为+23％(939μg/ml)，载体px6007为+31％(1001μg/ml))；计算用各载体获得的三个最好的克隆的值)。
用载体px6008产生的克隆具有576μg/ml的15个最好的克隆的平均生产力。
载体px6008的三个最好的克隆的平均生产力为760μg/ml。
-启动子序列
在载体px6051中，表达盒包含含有内含子A的全长人CMV启动子和SV40polyA信号。
在载体px6052中，表达盒包含人Ef1α启动子和SV40polyA信号。
在载体px6062中，表达盒包含含有内含子A的全长人CMV启动子、bGH polyA信号和人胃泌素终止子。
在载体px6063中，表达盒包含人Ef1α启动子、bGH polyA信号和人胃泌素终止子。
载体 启动子 polyA信号 转录终止子
px6051 含有内含子A的全长hCMV SV40polyA信号 不含转录终止子
px6052 含有内含子A的Ef1α启动子 SV40polyA信号 不含转录终止子
px6062 含有内含子A的全长hCMV bGH polyA信号 人胃泌素转录终止子(hGT)
px6063 含有内含子A的Ef1α启动子 bGH polyA信号 人胃泌素转录终止子(hGT)
鉴定各载体所获得的最好的18个稳定克隆，并在分批分析中测试克隆的生产力。
bGH polyA信号和hGT的组合交换SV40polyA信号增强了平均生产力：在hEF1α启动子的情况下增强约19％(载体px6063的505μg/ml对载体6052的426μg/ml)，在全长hCMV启动子的情况下增强约71％(载体px6062的333μg/ml对载体px6051的195μg/ml)。
生产力的提高还可以在排序靠前的克隆的水平上观察到(载体px6063(693μg/ml)对载体px6052(511μg/ml)的+36％及载体px6062(529μg/ml)对载体px6051(262μg/ml)的+102％；针对每种载体的三个最好的克隆计算值)(见图2)。
因此，已发现，在使用选择标记表达盒在一个转录方向上而重链表达盒上游的轻链表达盒各在另一个转录方向上的双向载体组织(见px6052)的稳定转染中，hEF1α启动子与bGH polyA信号和hGT的组合增强生产力。
此外，已发现，在使用轻链表达盒处于重链表达盒上游而重链表达盒转而定位于选择标记表达盒上游的单向载体组织(LC-HC-SM表达盒的5’->3’方向)(见px9005)，或选择标记表达盒在一个转录方向上而重链表达盒上游的轻链表达盒各在另一个转录方向上的双向载体组织(见px6007)的hCMV启动子的稳定转染中，bGH polyA信号和hGT的组合增强生产力。
还将bGH polyA信号和hGT的组合用于瞬时转染方法。将载体px6062和px6063(包含具有bGH polyA信号和hGT的组合的全长hCMV启动子或hEF1α启动子)直接与载体px6051和px6052(包含具有SV40polyA信号的全长hCMV启动子或hEF1α启动子)比较。
与稳定转染不同，bGH polyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合在含有内含子A的全长人CMV启动子的情况下和含有内含子A的人EF1α启动子的情况下都未提高瞬时转染的生产力(载体px6052的2.38μg/ml对载体px6063的2.32μg/ml)。在含有内含子A的全长人CMV启动子的情况下，bGH polyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合导致载体px6062A的2.74μg/ml和载体px6051的3.64μg/ml的生产力。
在通过瞬时转染获得的细胞中，已发现，短的hCMV启动子与牛生长激素polyA信号序列和人胃泌素终止子的组合导致改善的抗体表达产率。
在通过转染和选择稳定细胞克隆获得的细胞系中，已发现，牛生长激素polyA信号序列和人胃泌素终止子的组合独立于所使用的启动子，导致改善的抗体表达产率。
在载体p5068中，编码抗体的轻链(LC)和重链(HC)二者的基因的表达由短的人CMV启动子(hCMV)驱动。此启动子在广范围的细胞类型中具有活性，且常用于哺乳动物表达质粒。由于启动子活性强烈依赖于细胞类型，且已知hCMV启动子对基因沉默作用敏感，启动子甲基化可能更强和/或存在在CHO-K1细胞中抗性更强的启动子。
构建了包含不同启动子的表达载体：i)包含不含内含子A的短hCMV；ii)含有内含子A的全长hCMV启动子；iii)含有内含子A的全长大鼠CMV启动子；和iv)含有内含子A的hEF1α启动子。
构建了包含全长hCMV启动子(px6051)、hEF1α启动子(px6052)和大鼠CMV启动子(px6053)的载体，并用于瞬时转染和稳定转染。
载体 启动子 polyA信号 转录终止子
p5068 不含内含子A的短的人CMV SV40polyA信号 不含转录终止子
px6051 含有内含子A的全长人CMV SV40polyA信号 不含转录终止子
px6052 含有内含子A的hEf1α启动子 SV40polyA信号 不含转录终止子
px6053 含有启动子A的大鼠CMV启动子 SV40polyA信号 不含转录终止子
通过核转染将表达载体p5068、px6051、px6052和px6053瞬时转染入CHO-K1细胞，转染后四天，收集细胞培养物上清，并通过ELISA测定生产力。
与表达载体p5068相比，包含含有内含子A的hEF1α启动子(px6052)或含有内含子A的全长hCMV启动子(px6051)的载体具有分别提高了53％和134％的生产力(载体px6051的3.64μg/ml、载体px6052的2.38μg/ml、载体p5068的1.56μg/ml)。但是，含有大鼠CMV启动子的载体p6053显示降低大约50％的生产力(见图3)。
还用包含全长人CMV启动子(载体px6051和px6062)或含有内含子A的hEF1α启动子(载体px6052和px6063)的载体进行了稳定转染。
通过核转染将表达载体p5068、px6051、px6052和px6053转染入CHO-K1细胞，并选择稳定库。在分批分析中分析了库的生产力。
稳定库的分批分析显示，来自用包含含有内含子A的hEF1α启动子的载体(载体px6052)转染的细胞的抗体效价比用包含短的hCMV启动子的载体(载体p5068)或用包含含有内含子A的全长hCMV启动子的载体(载体px6051)转染的细胞的抗体效价高4倍以上(载体px6052的78μg/ml、载体p5068的14μg/ml、载体px6051的17μg/ml、载体px6053的8.46μg/ml)(图4)。
用表达载体p5068、px6051和px6052产生了稳定克隆。此外，使用了载体px6062和px6063(二者都包含bGH polyA信号和人胃泌素终止子的组合来代替SV40polyA信号)。
每种载体所获得的最好的54个克隆的批次分析显示，来自用载体px6052转染的细胞的平均生产力为316μg/ml，载体p5068为341μg/ml。用包含全长hCMV启动子的载体px6051和px6062产生的克隆具有载体px6051的141μg/ml和载体px6062的220μg/ml的平均生产力。
所测试的用载体px6063(包含与bGH polyA信号和hGT组合的hEF1α启动子)转染的54个克隆在分批分析中的平均生产力具有367μg/ml的生产力。具有最高效价的最好的克隆衍生自载体px6063(分别为748和731μg/ml)。
已发现，用包含人EF1α启动子的载体(px6052和px6063)产生的克隆显示减少的低产克隆数。
针对抗体产生的稳定性测试了克隆。在存在和缺乏潮霉素B的情况下培养用载体p5068和px6052获得的12个克隆三代。
在缺乏选择压力(潮霉素B)三代的情况下，对于缺乏内含子A的短的hCMV启动子，观察到了所测试的12个克隆的平均生产力降低35％(p5068；264μg/ml对410μg/ml)。相反，对于含有内含子A的hEF1α启动子，观察到平均生产力仅降低18％(px6052；256μg/ml对312μg/ml)。
在存在选择压力的情况下，用载体p5068获得的克隆显示平均生产力降低27％(298μg/ml对410μg/ml)，来自用包含含有内含子A的hEF1α启动子的载体px6052获得的克隆的效价降低15％(266μg/ml对312μg/ml)。
测定了有选择压力或无选择压力三代之后，用包含缺乏内含子A的短的hCMV启动子的载体p5068或用包含含有内含子A的hEF1α启动子的载体px6052转染的稳定克隆的数目。为了确定克隆在三代之后是否“稳定”，将来自第0代的IgG效价设为100％，并定义80％的阈值。将在有选择压力或无选择压力三代之后，显示低于第0代(0代)的IgG效价的80％的相对IgG效价的克隆定义为不稳定。
与第0代的抗体效价相比，有选择压力或无选择压力三代后，来自用p5068转染的所有克隆的相对抗体效价都下降至80％以下。稳定的细胞克隆是在存在选择压力的情况下以及缺乏选择压力的情况下，与第0代的抗体效价相比，产生80％或更多的抗体效价的克隆细胞群体。
与第0代的IgG效价相比，有选择压力或无选择压力三代后，来自用px6052转染的克隆的相对效价在12个案例的8个中下降至低于80％，但4个克隆被定义为“稳定”。与用载体p5068产生的克隆不同，用载体px6052产生的12个克隆中的8个在存在选择压力的情况下“稳定”。相反，通过载体p5068衍生的克隆中只有一个在存在选择压力的情况下稳定。
载体px6014、px6014A和px6014B包含抗体轻链前面的hEF1α启动子和重链前面的短的hCMV启动子。这些载体在轻链的5`UTR中不同(px6014：含有PmeI限制位点的hEF1α启动子的5`UTR；px6014A：不含PmeI限制位点的hEF1α启动子的5`UTR；px6014B：hEF1α启动子的5`UTR加载体p5068的5`UTR)。用核转染将该载体瞬时转染入CHO-K1细胞。
与载体px6014相比，载体px6014A和px6014B显示生产力分别增强20％和40％(载体px6014B的2.01μg/ml、载体px6014A的1.71μg/ml、载体px6014的1.41μg/ml)。
已发现，在瞬时转染中，与载体p5068相比，包含人EF1α启动子或全长人CMV启动子(都含有内含子A)的载体显示提高的生产力。
已发现，与载体p5068相比，用包含人EF1α启动子的载体产生的稳定库在分批分析中显示提高的生产力。
已发现，通过用包含含有内含子A的人EF1α启动子的载体稳定转染获得的细胞克隆显示减少的低产克隆数。
已发现，通过用包含含有内含子A的全长人CMV启动子的载体稳定转染获得的细胞克隆在平均值和排序靠前的克隆的水平上显示强烈降低的生产力。
因此，已发现，使用选择标记表达盒在一个转录方向上而重链表达盒上游的轻链表达盒各在另一个转录方向上的双向载体组织(见px6052)，与SV40polyA相比，bGH polyA信号和hGT的组合在稳定转染中独立于所使用的启动子地增强生产力。
此外，已发现，在使用轻链表达盒处于重链表达盒上游而重链表达盒转而定位于选择标记表达盒上游的单向载体组织(LC-HC-SM表达盒的5’->3’方向)的hCMV启动子的稳定转染中，bGH polyA信号和hGT的组合增强生产力。
选择方法的改进
由于高数量的非产生和低产生克隆及基因表达的低稳定性，细胞系开发目前非常耗费时间和成本。在数千个克隆中，你通常仅找到几个稳定的“高产者”。
不受限于理论，选择策略的低选择性和低严格性的可能的原因可以是抗体和选择标记在所使用的载体***中的分开表达，该载体***不对抗体表达施加选择压力(见例如载体p5069)。
已发现此问题可以通过使用IRES元件来克服。
IRES元件是DNA元件，其作为内部核糖体进入位点发挥作用(在mRNA水平)，因此允许从一个mRNA表达两个基因。
选择标记和抗体链的IRES连锁表达对总抗体表达施加选择压力(即一个mRNA编码选择标记和抗体链二者)，从而保证选择的选择性。基因表达的稳定性可以提高。
具有弱IRES活性的IRES元件的使用允许选择标记的弱表达。选择标记的此弱表达可以提高选择的严格性。
通过选择标记和抗体链的IRES连锁共表达，可以通过以下来改进选择方法：
-增加产生细胞的数目，
-增强基因表达的稳定性，和
-增强选择方法的严格性。
对于抗体和选择标记的IRES连锁共表达，所使用的IRES元件必须满足两个要求：
-IRES元件可以不影响或仅最小地影响mRNA稳定性/抗体表达，和
-IRES元件必须显示弱IRES活性，使得选择标记仅轻微表达。
通过EV71-IRES、ELF4G-IRES和EMCV-IRES元件(载体px6015A、px6015B和px6015C)这几种IRES元件连接轻链和重链编码核酸。表达盒按5’至3’方向包含人CMV启动子、轻链编码核酸、IRES、重链编码核酸和polyA位点。
将作为参考的不含IRES元件的载体p5068，及载体px6015A、px6015B和px6015C瞬时转染入CHO-K1细胞，并通过ELISA测定生产力。
载体px6015B和px6015C(分别包含ELF4G和EMCV-IRES)显示0.1μg/ml至0.15μg/ml的IgG表达。载体p5068显示2μg/ml的IgG表达。包含EV71-IRES的载体px6015A显示1.7μg/ml的生产力。
备选地，选择标记新霉素可以通过IRES元件直接与抗体的重链连接。载体按5’至3’方向包含元件人CMV启动子、轻链编码核酸、polyA位点、人CMV启动子、重链编码核酸、IRES元件、新霉素选择标记核酸和polyA位点。
按所述将载体px6010A、px6010B和px6010C瞬时转染入CHO-K1细胞，并通过ELISA测定生产力。
包含EMCV-IRES的载体px6010C显示13μg/ml的生产力。载体p5069显示14μg/ml的生产力。包含EV71-IRES(载体px6010A)或ELF4G-IRES(载体px6010B)的载体分别显示4.3μg/ml和2.4μg/ml的生产力。
因此，已发现EMCV-IRES元件满足选择标记的IRES连锁表达所必须的要求：
-弱IRES活性(使得选择标记仅轻微表达)，
-该IRES元件至多对抗体表达具有最小的影响(选择标记各自IRES连锁的表达)。
因此，选择标记新霉素(介导对G418的抗性)可以通过EMCV-IRES连接至重链编码核酸。
在稳定转染中针对生产力和稳定性测试了载体p5069和px6010C，二者都在库水平和单克隆水平上进行。
通过核转染技术将载体转染入CHO-K1细胞。选择稳定库，并在分批分析中分析了该库的生产力。
用载体px6010C产生的库在分批分析中显示14μg/ml的生产力。用载体p5069产生的库在分批分析中显示5.4μg/ml的生产力(图5)。
已发现，用载体px6010C产生的库由更多的产生细胞(或更多好的产生细胞)组成和/或IgG表达的稳定性增强(与载体p5069相比)。
已发现，载体px6010C中的选择标记新霉素的IRES连锁表达还导致库的稳定性增强。在存在和缺乏选择压力的情况下培养稳定库30世代。在稳定性测试开始(＝第0代)和结束(＝第30代)时，在分批分析中测定库的生产力。
与用载体p5069产生的库相比，用载体px6010C产生的库在分批分析中显示增强的IgG表达稳定性。在存在和缺乏选择压力的情况下，30世代后，用载体p5069获得的库在分批分析中的生产力强烈降低(>80％；检测极限以下的值)。在缺乏选择压力的情况下，用载体px6010C产生的库的生产力也降低约70％。但是，在存在选择压力的情况下，用载体px6010C产生的库的生产力仅降低10％(图6)。
通过核转染将载体p5069和载体px6010C转染入CHO-K1细胞，按上文所述产生稳定克隆。筛选克隆，并在分批分析中分析了每种转染的最好的15个克隆的生产力。每种载体进行两次独立的转染。
用载体px6010C产生的克隆显示348μg/ml的平均生产力。用载体p5069产生的克隆显示239μg/ml的平均生产力。用载体px6010C产生的克隆的平均生产力提高不是由于更好的排序靠前的克隆，而是由于低产克隆的数目明显减少。与载体p5069不同，用载体px6010C产生的克隆在分批分析中未显示低于200μg/ml的生产力(图7)。
通过在存在和缺乏选择压力的情况下培养45世代，分别针对17个克隆(p5069)和14个克隆(px6010C)测试了抗体表达的稳定性。在稳定性测试开始(第0代)和第45代时，在分批分析中测量了克隆的生产力。将第45代的IgG效价与稳定性测试开始时克隆的生产力相比较。
在存在和缺乏选择压力的情况下，用载体p5069产生的17个克隆的平均生产力在45世代后都降低(生产力丧失约43％)。在缺乏选择压力的情况下，用载体px6010C产生的14个克隆的平均生产力降低约45％。但是，在存在选择压力的情况下，这些克隆的生产力的降低为4％。
在存在选择压力的情况下，通过载体p5069产生的17个所测试的克隆中只有6个显示仍高于第0代的生产力的80％的生产力。相反，用载体px6010C产生的14个所测试的克隆中的10个显示高于第0代的生产力的80％的生产力。
在缺乏选择压力的情况下，分别用载体p5069和载体px6010C产生的克隆之间稳定性无显著差异。
选择和筛选方法的改进
由于密集的筛选努力，细胞系开发目前非常耗费时间和成本。在数千个克隆中，你通常仅找到几个稳定的高产者。
目前，存在几种用于鉴定高产克隆的筛选策略：
-用于直接检测所产生的蛋白质的基于ELISA的筛选策略(耗费时间和成本)；
-用于直接检测所产生的蛋白质的基于荧光的筛选策略(耗费时间和成本)；
-用于间接检测/定量所产生的蛋白质的共表达定量筛选标记(表面蛋白质或荧光标记，如GFP)的细胞的基于FACS的分选。
在大多数情况下，荧光标记的表达不与抗体的表达连锁。这限制了荧光强度和生产力的依赖性，使得荧光强度和生产力之间常没有良好的相关性。
GFP蛋白质(作为荧光标记的实例)稳定且趋向于累积。细胞中荧光标记的表达水平(荧光强度)和它们的生产力之间没有(大多数情况下)良好的相关性。
已发现，通过使抗体表达和荧光标记表达连锁，鉴定细胞克隆的组合的选择和筛选策略具有增强的稳定性和生产力，同时简单，因此允许快速和容易地鉴定高产者。
已发现，融合蛋白的IRES连锁表达作为选择标记和定量筛选标记发挥作用。
构建了通过IRES元件直接连接至抗体重链的绿色荧光蛋白(GFP)和选择标记新霉素的融合蛋白。该融合蛋白中的绿色荧光蛋白和选择标记新霉素由PEST序列(对应于小鼠鸟氨酸脱羧酶基因(mODC)的密码子423-449的序列)分开。此PEST序列在蛋白质水平作为强烈的蛋白水解信号序列，因此明显减小了该蛋白质的半衰期。
GFP-PEST-Neo融合蛋白不仅作为选择标记还作为定量筛选标记发挥作用。
由于PEST介导融合蛋白的半衰期减小(选择严格性增强)，PEST序列的使用提供了改善的克隆选择。
由于抗体和选择标记的IRES连锁共表达，PEST序列的使用提供了融合蛋白的GFP荧光强度和抗体表达水平之间良好的相关性。
由于蛋白质的半衰期减小，PEST序列的使用减少了融合蛋白的累积。
通过FACS分析了稳定单克隆的GFP表达水平，并在分批分析中与生产力相关。通过FACS分选来自稳定库的具有不同GFP表达水平的群体，并分析所分选的群体的生产力。
满足此方法的要求的IRES元件：
-应提供弱IRES活性，使得融合蛋白仅轻微表达；
-应不影响抗体表达水平。
通过EV71-IRES、ELF4G-IRES和EMCV-IRES元件(见载体px6015A、px6015B和px6015C)这几个IRES元件连锁轻链和重链表达来测定IRES活性或强度。将作为参考的载体p5068(不含IRES元件)及载体px6015A、px6015B和px6015C瞬时转染入CHO-K1细胞，并通过ELISA测量生产力。
载体px6015B和px6015C(分别包含ELF4G和EMCV-IRES)显示0.1至0.15μg/ml的IgG表达。载体p5068显示2μg/ml的IgG表达。包含EV71-IRES的载体px6015A显示1.7μg/ml的生产力，表明EV71-IRES元件在CHO-K1细胞中具有强IRES活性。
GFP-PEST-Neo融合蛋白通过IRES元件直接连接至抗体的重链编码核酸(见图8)。
按所述将其中IRES元件将选择标记连接至包含在载体px6011A、px6011B和px6011C中的抗体重链的构建体瞬时转染入CHO-K1细胞，并通过ELISA测定生产力。
包含EMCV-IRES的载体px6011C显示8.7μg/ml的IgG生产力，载体p5059显示10.8μg/ml的IgG生产力。包含EV71-IRES的载体px6011A显示3.9μg/ml的IgG生产力。包含ELF4G-IRES的载体px6011B未显示相关生产力。
在稳定库和稳定克隆的分批分析中测试了含有IRES连接的GFP-PEST-Neo融合蛋白的载体px6011C、载体p5069和载体px6010C。
通过核转染将载体p5069、px6010C和px6011C转染入CHO-K1细胞。按所述选择稳定库，并在分批分析中分析了该稳定库的生产力。
用包含IRES连接的选择标记的载体px6010C产生的稳定库显示9.5μg/ml的IgG生产力。用载体p5069产生的稳定库显示5.4μg/ml的IgG生产力。用包含IRES连接的融合蛋白的载体px6011C产生的库显示36.3μg/ml的生产力(图9)。
这些数据表明，用载体px6010C和px6011C产生的库明显由比用载体p5069产生的库更多或甚至更好的产生细胞组成。px6010C和px6011C库的/中增强的IgG表达稳定性也可以促成提高的生产力。
为了在稳定克隆中将表达载体p5068的生产力与载体px6010C和px6011C比较，通过核转染将载体转染入CHO-K1细胞。按所述选择稳定克隆，并筛选克隆。在分批分析中分析了每种载体的最好的15个克隆的生产力。
对于载体p5068，384孔板中总计3072个孔中的95个显示高于2μg/ml的IgG产生(背景)。选择标记的IRES连锁表达(px6010C)使产生细胞/孔的数目倍增至195个，在IRES连接的融合蛋白(px6011C)的情况下，产生细胞/孔的数目进一步增加至超过280个。
此外，不仅产生细胞的数目，还有通过载体px6010C和px6011C产生的包含IRES的克隆的平均生产力也更高(对于每种载体的最好的100个克隆，载体p5069为3.4μg/ml，载体px6010C为4.2μg/ml，载体px6011C为8.1μg/ml；对于每种载体的最好的250个克隆，载体p5069为2.2mg/ml、载体px6010C为3.0μg/ml、载体px6011C为5.1μg/ml)。
用IRES载体px6010C和px6011C及p5059产生的克隆在24孔筛选中显示载体px6011C的212μg/ml、载体px6010C的178μg/ml和载体p5069的118μg/ml的平均生产力(细胞分开4天后在具有未确定的细胞计数的24孔培养物中测定)。对于载体px6010C和px6011C，可以观察到数目减少的非产生或低产生克隆及数目增加的好的产生克隆(图10)。
单克隆的分批分析显示，用载体px6010C产生的15个最好的克隆的平均生产力为348μg/ml，载体p5069为239μg/ml。用载体px6010C产生的15个最好的克隆的平均生产力为404μg/ml。具有最高总体效价的克隆衍生自载体px6011C的转染子。用载体px6010C和载体px6011C产生的克隆在分批分析中未显示低于200μg/ml的生产力。
为了测试克隆的抗体表达稳定性，在存在和缺乏选择压力(G418)的情况下培养用每种载体获得的14至19个克隆45代。在稳定性测试开始(第0代)和第45世代时在分批分析中测量克隆的生产力。将第45代的IgG效价与克隆在稳定性测试开始的第0代的生产力(值设为100％)相比较。
在存在和缺乏选择压力的情况下，45世代后，用载体p5069产生的17个克隆的平均生产力都降低(生产力丧失约43％)。在缺乏选择压力的情况下，分别用载体px6010C和px6011C产生的14至19个克隆的平均生产力也降低(生产力丧失约45-35％)，但在存在选择标记G418的情况下，45世代后，这些克隆的平均生产力的降低仅为0-4％。
在存在选择压力G418的情况下，通过载体p5069产生的17个所测试的克隆中的6个显示高于第0代的生产力的80％的生产力。相反，用载体px6010C产生的14个所测试的克隆中的10个及用载体px6011C产生的19个所测试的克隆中的17个显示高于第0代的生产力的80％的生产力。
在缺乏选择压力的情况下，用载体p5069、px6010C和px6011C产生的克隆显示相当的行为。
已发现，在存在选择标记的情况下，包含IRES的载体及因此从其获得的克隆具有增强的稳定性。
但是，在缺乏选择标记的情况下，用含有IRES的载体或不含IRES的载体获得的克隆之间稳定性无差异。
GFP-PEST-Neo融合蛋白用作定量筛选标记。用载体px6011C产生的克隆的GFP荧光水平是它们的生产力的预测。
测定单克隆的GFP表达水平/荧光强度，并使结果与克隆在分批分析中的生产力相关，通过FACS从稳定库分选具有不同GFP表达水平/荧光强度的群体(每种载体1,000个细胞)，然后在分批分析中分析了这些不同群体的生产力。分选了三个不同的群体：
群体1：无GFP表达，FL1-H(＝GFP)的几何平均值(GM)0-4
群体2：低GFP表达水平，GM 4-5.5
群体3：高GFP表达，GM 5.5-7
分批和FACS分析显示，克隆/库的GFP荧光和它们的生产力之间在单克隆和库两个水平上都存在良好的相关性。具有高GFP荧光的克隆或库通常显示比显示低GFP荧光的细胞高的生产力。通常，克隆/库的生产力随荧光强度提高(图11和12)。
可以通过基于FACS从稳定库分选高GFP荧光的单克隆来直接鉴定高产克隆。通过FACS分选显示无GFP表达或高GFP表达的单克隆。将克隆扩大至摇动的6孔板，并在分批分析中测定克隆的生产力。
已发现，选择标记或GFP-PEST-Neo融合蛋白的EMCV-IRES连锁表达明显增强选择的选择性(产生更多的产生克隆)，它还增强选择的严格性(产生克隆的平均生产力更高)。因此，明显减少了筛选努力。
与IRES连接的选择标记(px6010C)相比，IRES连接的融合蛋白(px6011C)更强的作用可能是由于该融合蛋白中的PEST序列，其介导该融合蛋白的半衰期减小和/或该融合蛋白对选择剂的亲和力更低——两种因素都明显增强选择的严格性。
与载体组织组合的载体元件
在瞬时转染中、在稳定库中及一些在单克隆水平，在CHO-K1宿主细胞系中测试了以下载体。
载体 组织 启动子 polyA信号 转录终止子
px9001 SM(3′-5`)-LC-HC hCMV SV40polyA 不存在
px9002 LC-HC-SM hCMV SV40polyA 不存在
px9003 LC-HC-SM hEF1α SV40polyA 不存在
px9004 LC-HC-SM hCMV bGH polyA 不存在
px9005 LC-HC-SM hCMV bGH polyA hGT
px9006 LC-HC-SM hEF1α bGH polyA 不存在
px9007 LC-HC-SM hEF1α bGH polyA hGT
px9010 LC(3′-5′)-HC-SM hEF1α bGH polyA 不存在
px9011 LC(3′-5′)-HC-SM hCMV SV40polyA hGT
核转染入CHO-K1细胞后测试了不同载体在瞬时转染中的性能。
与使用hCMV启动子相比，取决于所使用的polyA信号序列，包含人延伸因子1α启动子(hEF1α)(基于载体组织LC-HC-SM)的载体分别具有提高了约+34％(px9003对px9002；SV40polyA信号序列)和+30％(px9006对px9004；bGH polyA信号序列)的生产力。
向bGH polyA信号序列加入人胃泌素终止子(hGT)对包含hCMV的启动子的生产力具有积极作用(px9005对px9004；+13％)。
基于抗体的轻链和重链的双向表达的表达载体显示改善的性能。取决于所使用的启动子(hEF1α或hCMV)和所使用的polyA信号序列(SV40或bGH polyA信号序列)，与对照载体px9001相比，产物效价提高约2.7至3.4倍。
已发现，在载体组织LC-HC-SM(+50％；比较px9006和px9002)中，而不是在载体组织LC(3`-5`)-HC-SM(-28％；比较px9010和px9011)中，人延伸因子1α启动子和bGH polyA信号序列的使用对生产力具有积极作用。
为了比较表达载体px9002和载体px9003-9007的生产力，通过核转染将载体转染入CHO-K1细胞，并选择稳定库。在分批分析中分析了库的生产力(见图10)。
稳定库的分批分析显示，来自用包含人延伸因子1α启动子的载体(px9003、px9006、px9007)转染的库的抗体效价比用包含短的hCMV启动子的参考载体(载体px9002)转染的细胞的抗体效价高约7-8倍(载体px9003、px9006和px9007的97.5μg/ml、112.5μg/ml和95.6μg/ml与载体px9002的14.0μg/ml相比较)。
通过核转染将载体px9001、px9002和px9004至px9007转染入CHO-K1细胞，通过经典筛选方法鉴定出最好的单克隆。在分批分析中分析了每种载体的最好的36个克隆的生产力，并在补料分批分析中测试了分批分析中最好的15个克隆。
用载体px9001产生的最好的36个单克隆在分批分析中的平均生产力为356μg/ml。与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和9005(还包含bGH PolyA信号(单独或与HGT组合)代替SV40PolyA信号)产生的克隆显示生产力分别提高37％(px9002)、61％(px9004)至53％(px9005)。载体px9006和px9007的克隆显示生产力分别提高约19％和7％。
在补料分批实验中，在超过14天的补料分批分析中测试了用每种载体获得的在分批分析中最好的15个克隆。
(用载体px9001产生的)最好的15个单克隆在补料分批分析中的平均生产力为1345μg/ml。与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和px9005(还包含bGHPolyA信号序列(单独或与hGT组合)代替SV40PolyA信号序列)产生的克隆显示生产力分别提高80％(px9002)、58％(px9004)至92％(px9005)。
除平均生产力提高(见上文)外，排序靠前的克隆的性能也强烈改善。就前5个克隆的生产力而言，与对照载体px9001相比，载体px9002、px9004和px9005显示约64％(px9002)、50％(px9004)和88％(px9005)的提高。
在下文中，直接比较了每种不同载体的产生细胞或非产生细胞的百分比。用载体px9001产生的14.2％的克隆产生抗体，在其余抗性克隆中，抗体表达沉默或克隆具有其他缺陷。
载体px9002的载体组织几乎使产生细胞的百分比倍增(至26.0％)。还包含bGHPolyA信号序列单独取代单独(载体px9004)或与hGT组合(载体px9005)的SV40polyA信号序列的载体显示产生细胞的百分比(分比为39％和43％)提高约3倍。
用人延伸因子1α启动子取代hCMV启动子使产生细胞的数目提高了至多5倍(选择方法后获得的超过70％的克隆确实产生抗体)。
在存在和缺乏潮霉素B的情况下培养通过用载体px9001-9007转染获得的15个最好的克隆(基于补料分批结果)15代(＝约60世代)。将15代后克隆在分批分析中的产物效价与稳定性测试开始时克隆在分批分析中的产物效价相比较。
在存在选择压力的情况下，15代后，每种载体的15个克隆之间产物效价的变化从载体px9007的-14.7％至载体px9002的+0.2％变动。
在缺乏选择压力的情况下，产物效价的降低从载体px9004的25.5％至载体px9005的5.9％变动。
满足所定义的稳定性标准(如在存在和缺乏选择标记的情况下，与起始点(G0)的值相比，分批分析中的产物效价>80％)的克隆的数目从4个至10个变动。同样在存在和缺乏选择压力/选择标记的情况下，载体px9005、px9007和px9002产生最高数目的稳定克隆(px9005：10个；px9007：7个；px9002：6个)。
因此，已发现，尤其是在缺乏选择压力的情况下，载体px9005的组织显示对稳定性和增加稳定克隆数目的积极作用。
已发现，与不含转录终止子(hGT)的SV40polyA相比，bGH polyA和hGT的组合独立于所使用的启动子地明显提高稳定克隆的生产力。
瞬时转染
-人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供了增强的生产力(在LC-HC-SM组织中)
-与SV40polyA信号序列的使用相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供了增强的生产力
-向bGH PolyA信号序列加入HGT在包含hCMV启动子的载体中导致提高的生产力
-载体组织LC(3`-5′)-HC-SM导致改善的表达
稳定库
-用包含hEF1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力
-用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数
-用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示更高的IgG表达稳定性
单克隆
-选择标记位于下游的载体组织(LC-HC-SM)对稳定单克隆的生产力具有积极作用
-用包含bGH polyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力和稳定性
总结
已将几种不同的转录相关遗传元件及其组合与参考遗传元件组合相比较。根据比较性瞬时实验，针对选择标记表达盒处于与轻链和重链的表达盒相反的方向的双向载体组织(轻链表达盒在重链表达盒上游)获得了以下结果(见下表)。
将不同的启动子与bGH polyA信号和hGT转录终止子组合(见下表)。
已将几种转录相关遗传元件及其组合与参考载体(px9001，载体组织SM(3’-5’方向)-LC-HC(5’-3’方向))相比较。根据比较性实验，与参考载体(px9001，双向载体组织SM(3’-5’)-LC-HC(5’-3’))相比，针对轻链和重链(轻链表达盒在重链表达盒上游)及选择标记的表达盒处于相同方向的单向载体组织获得了以下结果(见下表)。
所使用的启动子
已发现，可以用本文报道的载体元件/元件组合来达到提高的表达(生产力)：
人CMV启动子：
Xu等,J.Control.Release,81(2002)155-163.
Xia等,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
大鼠CMV启动子：
Xia等,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
人EF1α启动子：
Teschendorf等,Anticancer Res.22(2002)3325-3330.
Li等,J.Immunol.Methods 318(2007)113-124.
MPSV启动子：
Xia等,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
Artelt等,Gene 68(1988)213-219.
Stocking等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)5746-5750.
Lin等,Gene 147(1994)287-292.
MPSV-CMV杂合启动子：
Liu等,Anal.Biochem.246(1996)150-152.
通过用IRES连接的表达盒来表达选择标记，可以提供高选择性和高严格性的选择方法：
-对抗体表达的选择压力导致高选择性
-抗体和选择标记的连接表达导致高选择性
-已发现，具有弱活性的IRES元件的使用导致高严格性，即高抗体产生和低选择标记产生
-通过IRES元件连接抗体和选择标记的表达
-鉴定确实或多或少地改变IgG表达的具有弱活性的IRES元件(EMCV/Gtx)
-用融合蛋白作为选择标记和筛选标记
-双功能GFP-新霉素融合蛋白
-鸟氨酸脱羧酶的PEST序列是强蛋白水解信号序列，赋予蛋白质减小的半衰期
-融合蛋白的IRES连接表达导致高选择性
-蛋白水解信号序列的短半衰期导致高严格性
-由于融合蛋白的弱表达和短半衰期，需要强表达
-通过FACS快速鉴定高产者(高GFP表达克隆的分选提供了高产者的选择)
选择标记通过IRES元件与抗体重链连接
GFP-Neo融合蛋白通过不同的IRES元件与抗体重链连接
Gtx EV71ELF4G EMCV
GFP表达：++++-+
抗体表达：---+
Gtx-IRES：
Komuro等,EMBO J.12(1993)1387-1401.
EMCV-IRES：
Mountford等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1991)4303-4307.
EV71-IRES：
Lee等,Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662.
ELF4G-IRES：
Wong等,Gene Ther.9(2002)337-344.
Gtx(合成的)-IRES：
Chappell等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)1536-1541.
已发现，通过EV71-IRES元件，可以用轻链表达盒与重链表达盒的连接达到提高的表达(生产力)：
本文报道的一个方面是包含优化的5’UTR的优化的人延伸因子1α启动子，其具有SEQ ID NO:06的序列。
提供以下实施例、附图和序列来辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中显示。应理解，可以在所示方法中进行修改而不背离本发明的精神。
序列
SEQ ID NO:01 不含内含子A的短的CMV启动子
SEQ ID NO:02 含有5’UTR的不含内含子A的短的人CMV启动子
SEQ ID NO:03 含有内含子A的全长人CMV启动子
SEQ ID NO:04 不含内含子A的全长人EF1α启动子
SEQ ID NO:05 含有内含子A的全长人EF1α启动子
SEQ ID NO:06 含有5’UTR的含有内含子A的短的人EF1α启动子
SEQ ID NO:07 含有内含子A的全长大鼠CMV启动子
SEQ ID NO:08 SV40polyA信号序列
SEQ ID NO:09 bGH polyA信号序列
SEQ ID NO:10 hGT终止子序列
SEQ ID NO:11 SV40启动子
SEQ ID NO:12 鸟氨酸脱羧酶的PEST序列
SEQ ID NO:13 编码GFP的核酸序列
SEQ ID NO:14 新霉素选择标记
SEQ ID NO:15 GFP-PEST-NEO融合蛋白编码核酸
SEQ ID NO:16 EMCV-IRES
SEQ ID NO:17 EV71-IRES
附图简述
图1.用载体p5068、px6001、px6008和px6007产生的稳定克隆的生产力。所显示的是总计三次独立转染的用每种载体获得的最好的15个克隆在分批分析中的平均生产力。
图2.用载体px6051、px6062、px6052和px6063产生的稳定克隆的生产力。所显示的是总计三次独立转染的每种载体的最好的18个克隆在分批分析中的平均生产力。
图3.载体p5068、px6051、px6052和px6053在使用来自Amaxa的96孔穿梭***的瞬时转染中的生产力。所显示的是在转染后第4天通过ELISA测量的每种载体的八个独立转染的平均生产力。
图4.用载体p5068、px6051、px6052和px6053产生的不同稳定库在分批分析中的生产力。所显示的是每种载体的三个库在第7天的平均生产力。
图5.用载体p5069和px6010C产生的稳定库的生产力。所显示的是每种载体的两个(px5069)或三个(px6010C)不同库在分批分析第7天的平均生产力。
图6.用载体p5069和px6010C产生的稳定库中基因表达的稳定性。所显示的是在第0代(设为100％，黑色柱)及有选择压力(G418)(白色柱)和无选择压力(有图案的柱)的第30代，每种载体的两个不同库在分批分析第7天的平均生产力。
图7.通过载体p5069和px6010C产生的最好的15个克隆的生产力。总计两次独立转染的每种载体最好的15个克隆在分批分析中的平均生产力。
图8.介导IRES介导的GFP-PEST-NEO融合蛋白表达的载体px6011C的载体设计的示意图。GFP-PEST-Neo融合蛋白通过EMCV-IRES与抗体的重链连接。抗体重链的编码序列和融合蛋白的编码序列由短的人CMV启动子转录在一条mRNA中。此mRNA的翻译产生抗体的重链和GFP-PEST-NEO融合蛋白。
图9.通过载体p5069、px6011C和px6010C产生的不同稳定库在分批分析中的生产力。所显示的是每种载体的两个不同库在第7天的平均生产力。
图10.通过载体p5069、px6010C(通过与抗体的重链连接的EMCV-IRES元件来表达选择标记新霉素的载体)和px6011C(通过与抗体的重链连接的EMCV-IRES元件来表达GFP-PEST-新霉素的融合蛋白的载体)产生的最好的15个克隆的生产力。(A)总计两次独立转染的每种载体的最好的15个克隆在分批分析中的生产力分布。(B)总计两次独立转染的每种载体的最好的15个克隆在分批分析中的平均生产力。
图11.所显示的是用载体px6011C产生的11个克隆的GPF表达水平/荧光强度和分批分析中的生产力的依赖性。在24孔筛选形式中随机挑取克隆，然后扩大，最后在分批分析中分析。通过FACS测定GFP荧光强度的几何平均值(GM)和每个克隆的GFP阳性细胞的百分比。(A)11个单克隆的GFP荧光强度和分批分析中的生产力的依赖性。(B)11个单克隆的每个克隆的GFP阳性细胞百分比和分批分析中的生产力的依赖性。
图12.具有不同GFP荧光强度的稳定库在分批分析中的生产力。通过FACS分选具有不同GFP表达水平/荧光强度(低(1)、中(2)和高(3))的细胞。扩大库，并在分批分析的第7天测定库的生产力。
图13.px6007的质粒图谱。
图14.px6053的质粒图谱。
图15.px6062的质粒图谱。
实施例
表达载体p5068和p5069
表达质粒p5068和p5069包含用于表达WO 2005/100402中报道的抗-P-选择蛋白抗体的表达盒(保留外显子-内含子组织的基因组组织表达盒)。
分别将抗-P-选择蛋白HuMab轻链和重链编码基因装入哺乳动物细胞表达载体。
从而连接编码抗-P-选择蛋白HuMab轻链可变区(VL)和人κ轻链恒定区(CL)的基因区段，正如抗-P-选择蛋白HuMab重链可变区(VH)和人γl重链恒定区或人γ4重链恒定区(CH1-铰合部-CH2-CH3)的基因区段一样。
关于可以从其推断密码子选择的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication No 91-3242中提供。
抗-P-选择蛋白HuMabκ轻链的转录单位由以下元件组成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期增强子和启动子，
-合成的包括Kozak序列的5'-UT，
-包括信号序列内含子的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的抗-P-选择蛋白HuMab可变轻链cDNA，在5’端放置了唯一BsmI限制位点，在3’端放置了剪接供***点和唯一的NotI限制位点的，
-基因组人κ基因恒定区，包括内含子2小鼠Ig-κ增强子(Picard,D.和Schaffner,W.Nature 307(1984)80-82)，和
-人免疫球蛋白κ聚腺苷酸化(“polyA”)信号序列
抗-P-选择蛋白HuMabγl重链的转录单位由以下元件组成：
-来自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期增强子和启动子，
-合成的包括Kozak序列的5'-UT，
-包括信号序列内含子的修饰的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的抗-P-选择蛋白HuMab可变重链cDNA，在5’端放置了唯一BsmI限制位点，在3’端放置了剪接供***点和唯一的NotI限制位点的，
-基因组人γl重链基因恒定区，包括小鼠Igμ增强子(Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378)，和
-人γl免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polyA”)信号序列。
除抗-P-选择蛋白HuMabκ轻链或γ1重链表达盒外，这些质粒还包含：
-潮霉素抗性基因，
-EB病毒(EBV)的复制起点oriP，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许此质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
重组DNA技术
用Sambrook等,1999(上文)中所述的标准克隆技术进行克隆。所有分子生物学试剂均为市售(除非另有说明)，且按照厂家的说明使用。
核酸合成
不同遗传元件的DNA由Geneart AG,Regensburg合成。
核酸序列测定
通过在SequiServe(SequiServe GmbH,德国)进行的双链测序来测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
用Vector NTI Advance suite 9.0版进行序列创建、作图、分析、注释和说明。
细胞培养技术
CHO-K1细胞培养在补充了1x HT补充物(Invitrogen Corp.,目录号11067-030)的CD-CHO培养基(Invitrogen Corp.,目录号10743-011)中。
为了选择稳定转染的CHO-K1库/细胞系，加入400至800μg/ml G418或200至400μg/ml潮霉素(Roche Diagnostics GmbH,Roche Applied Sciences,德国,目录号843555)。
所有细胞系都在120至140转/分钟的恒定搅拌下维持在37℃、5％CO2的增湿培养箱中。每3至4天将细胞分入新鲜培养基。用Casey TT或Cedex Hires细胞计数仪(Rocheinnovates AG,Bielefeld)测定培养物的密度和活率。通过Amaxa核转染技术(Lonza GmbH,德国)进行细胞的转染。
此外，按例如Bonifacino,J.S.等,(编辑),Current Protocols in CellBiology,John Wiley and Sons,Inc.(2000)中所述应用标准细胞培养技术。
细胞计数和细胞活率测定
a)电场细胞技术***(CASY)
Technology TT型细胞计数仪(Roche Innovatis AG,Bielefeld)用电流进行细胞计数。用脉冲面积分析(Pulse Area Analysis)来从细胞通过低压电场中的测量孔时产生的信号获得信息。细胞膜的结构完整性是细胞活率的度。因此活率(viability)的测定无需诸如台盼蓝的染料。
b)自动台盼蓝排阻法(Cedex)
用Cedex HiRes***(Roche Innovatis AG,Bielefeld)来在库选择期间测定细胞活率，并进行自动细胞计数。
台盼蓝是不能通过完整细胞膜进入细胞的染料。仅染色具有损伤的细胞膜的那些细胞，并标记为死亡。染色过程、细胞计数和结果的图形分析由Cedex***通过数字图像识别自动进行。其他测量参数是细胞大小、形态和聚集率。使用多重进样器，连续测量至多20个样品。
质粒制备及用于精确比较转染中的质粒的质量检验
诸如DNA的量和质量的几种因素强烈影响转染效率和从而影响生产力。为了确保每种载体等同的起始条件，在转染前集中检验了所有载体的DNA量和质量。
-表达载体的同时制备
按照厂家的说明通过High Speed Maxi质粒分离试剂盒(Qiagen GMBH,Hilden)同时制备所有载体。
-酚/氯仿纯化和乙醇沉淀
通过酚/氯仿纯化同时纯化所有载体。将各500μg线性化的质粒DNA与200μl Tris缓冲的50％(v/v)酚、48％(v/v)氯仿、2％(v/v)异戊醇溶液混合，13,000转/分钟离心1分钟。然后将上层水相转入新管，并与200μl96％(v/v)氯仿、4％(v/v)异戊醇混合，13,000转/分钟离心1分钟。再次将上相转入新管，并与1/10(总体积)的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍(总体积)的100％乙醇混合。混合并在室温孵育反应5分钟后，13,000转/分钟离心混合物5分钟来沉淀DNA。弃上清，用900μl 70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，并在室温孵育5分钟。按最大速度进行最后的离心步骤5分钟后，弃上清，干燥沉淀，并重悬在无菌水中。
-DNA测定
用BioPhotometer(Eppendorf；Hamburg)测定每种载体的DNA量。DNA测量总是通过1:20稀释在Tris pH8.0中来重复进行三次。
-琼脂糖凝胶
在0.8％琼脂糖凝胶上检验了每种质粒的DNA质量。测定了DNA降解、载体构象和DNA浓度。用显示相当的数量和质量(凝胶上无DNA降解、相似的超螺旋(ccc)形式、相似的DNA量)的载体进行瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染
按照厂家的说明通过Amaxa 96孔穿梭***(Lonza GmbH,德国)来将所有载体转染入CHO-K1细胞。每种载体重复转染8次。按照1μg参考表达质粒(p5068或p5069)将转染载体的DNA量归一化至等摩尔量/拷贝数。为了测定生产力，在转染后第4至7天通过一步法通用ELISA(Dianova)分析了无细胞的细胞培养物上清的IgG效价。
Amaxa96孔穿梭***：
通过850转/分钟离心5分钟来沉淀培养在细胞培养瓶中的CHO-K1细胞，并重悬在培养基中。将环状质粒按1μg参考表达载体p5068或p5069的等摩尔浓度铺板在96孔核转染板中。然后按每孔4x 105细胞的浓度将细胞加入平板。通过Amaxa程序DN-137进行转染。转染后孵育细胞10分钟，然后转入包含200μl培养基的96孔平底孵育板。然后静置培养细胞。在转染后第4至6天，用一步法通用ELISA测定IgG水平。
稳定转染和重组CHO细胞系的产生
按照厂家的说明通过核转染技术(Amaxa Biosystems,Lonza cologne AG)进行稳定转染。转染前，通过限制酶SgrA I线性化转染质粒。每种质粒转染两次或三次。每次转染使用5x 106细胞和1.2pmol线性化质粒。(Nucleofector Kit T,Amaxa程序A33)。
对于转染，将细胞重悬在Nucleofector溶液T中，并分装入2ml管。加入质粒后，通过施加脉冲来进行转染。然后将细胞转入包含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的T25组织培养瓶中。转染后24小时通过加入250μg/ml潮霉素B来施加选择压力。
稳定库的产生
通过Amaxa核转染技术将载体转染入CHO-K1细胞，并用潮霉素B或G418作为选择剂来选择稳定库。每个转染进行三次。为了产生稳定库，通过用SgrAI限制消化来均一地线性化所有质粒。用Amaxa的Nucleofector Kit T进行稳定转染，每种质粒转染三次。
按以下建立稳定库：每次转染使用5x 106细胞和1.2pmol线性化质粒。将细胞重悬在溶液T中，并分装入2ml管。加入质粒后，通过施加脉冲来进行转染(Amaxa程序A33)。在包含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的T25组织培养瓶中静置培养所转染的细胞库。
转染后24小时，施加选择压力：800转/分钟离心细胞5分钟，重悬在3ml含有300μg/ml潮霉素B的培养基中。转染后3天将细胞转入平底6孔板。然后培养细胞两周，直至细胞活率降至最低并再次升高至99％以上。经常用Cedex HiRes***(Innovatis,Bielefeld)测定细胞数目和活率。培养期间，通过离心去除细胞碎片，并总是将细胞重悬在3ml新鲜培养基中。
用Caliper机器人***产生稳定克隆
按上文所述将载体转染入CHO-K1细胞。转染48小时后，施加选择压力(潮霉素B或G418)，并用自动化高通量克隆分离***(Sciclone ALH3000工作站，Caliper LifeSciences GmbH,Mainz)将细胞按每孔350至700个细胞的浓度接种在384孔平底板上。
10至14天后，用基于ELISA的超高通量筛选(ELSIA uHTS)针对IgG水平筛选384孔板。从初步的筛选选择最好的产生克隆，并转入平底96孔板。3至6天后，在第二轮中针对IgG水平筛选细胞。再次选择最好的产生克隆，并手动转入平底24孔板。再一个基于ELISA的筛选步骤之后，选择最好的克隆，并转入平底6孔板。通过ProtA测量来测定6孔板中的IgG水平，以鉴定最终的最好克隆，用于摇动的6孔板中的分批培养。
库/单克隆的分批分析
为了检测生产力和稳定性的差异，用Casey细胞计数仪计数克隆/库的细胞数，并按3x 105细胞/ml的浓度和3.0ml的总体积均一地接种入平底6孔板。所有分批培养物均培养12天，并在第4、7、9、11或12天针对人IgG水平筛选细胞培养物上清。
IgG定量
通过使用一步法通用ELISA来测定瞬时实验中及筛选形式(384孔至24孔)中的IgG效价。通过蛋白A HPLC来测定稳定库和稳定单克隆在分批实验中的生产力。
一步法通用ELISA
用一步法通用ELISA(Dianova)来测定来自细胞培养物上清的人IgG水平。使用稀释缓冲液(PBS+5％(w/v)RPLA1)，用抗-P-选择蛋白抗体(F.Hoffmann-La Roche AG,Basle,瑞士)的0.3125-20ng/ml范围的系列稀释物制备标准曲线。向链霉抗生物素蛋白包被的96孔MTP(StreptaWell,Roche Diagnostics GmbH)中加入95μl含有0.5μg/ml生物素化F(ab’)2-抗-人Fc抗体(Jackson laboratories)和0.1μg/ml过氧化物酶缀合的F(ab’)2-抗-人Fcγ抗体(Jackson laboratories；Suffolk)的抗体混合物。向平板中加入5μl 1:20.000稀释的细胞培养物上清，并孵育1小时。用200μl洗涤缓冲液(PBS+0.05％(v/v)Tween20)洗涤抗体包被的平板三次。向平板中加入100μl ABTS(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)，并用492nm的参考波长在405nm测量吸光度。
ProtA测量
与一步法通用ELISA组合，用基于HPLC的层析通过蛋白A来测定分批分析的IgG效价。
FACS
用荧光激活细胞分选来测定稳定或瞬时转染的细胞的转染效率(根据表达GFP的细胞)或GFP表达水平。通常，用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,San Diego,CA)测量每个克隆或库的5x 106个细胞。用前向和侧向散射数据来测定细胞大小、活率和细胞形态。
序 列 表
<110> 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
<130> 30789 WO
<150> EP11195361
<151> 2011-12-22
<160> 17
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> 人巨细胞病毒
<400> 1
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
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<210> 3
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<212> DNA
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<211> 575
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgtt 575
<210> 5
<211> 1571
<212> DNA
<213> 人
<400> 5
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca 600
gaacacaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 660
cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag 720
cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct 780
cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac 840
cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct 900
gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact 960
ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt 1020
tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct 1080
ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca 1140
aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct 1200
gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca 1260
caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg 1320
gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg atcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg 1380
ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg 1440
ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg 1500
ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtggtttaa 1560
acgccgccac c 1571
<210> 6
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有内含子A和最佳5'UTR 的人延伸因子-1α启动子
<400> 6
cccgggctgg gctgagaccc gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga 60
gatggcaagg ctgaggacgg gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata 120
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 180
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 240
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 300
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 360
gagaagagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 420
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg 480
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 540
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca 600
gaacacaggt aagtgccgtg tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc 660
cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag 720
cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct 780
cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac 840
cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct 900
gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact 960
ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt 1020
tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct 1080
ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca 1140
aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct 1200
gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca 1260
caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg 1320
gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg atcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg 1380
ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg 1440
ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg 1500
ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga 1560
ggaattagct ctgggagagg agcccagcac tagaagtcgg cggtgtttcc attcggtgat 1620
cagcactgaa cacagaggaa gcttgccgcc acc 1653
<210> 7
<211> 2473
<212> DNA
<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）
<400> 7
gatattttta tggaaatttt aaaaaattct ggtaagctat ttaaaaaaat gaactttatt 60
atgaaactat tgcccttttc tctaaaaaac aacacaattt cacggaatat cctatgatta 120
attatgacct tttagccagt tcccatatta agaatgagtt atagatgact ctctttaaaa 180
aattattcga tttaaaccat ctgttttaaa gcacagcatt tgtgaataat gtgaagaact 240
tagaagtata atctactcca aggtctgatg tatttttcaa ggccacgtta aagtgtatgc 300
ttgtaacaga gtgcttacat tcaagccaaa tgttaatata acaatcctga attcgtacat 360
aatgtgaata agacactcaa ctctatttaa atccagatct aaatagttac ttttatctaa 420
atgtcaccat ctgtttctac ttagaataat aaacttctta aaggtcacgt atcgggctga 480
ttataaatca ttataattat aacaaaacag atgatttgtt taaaggtcac atcccgttcc 540
gtggtctttt tagtcgaaat aactattaat cttcattatg tttctgagaa agtttaaata 600
tcacgatttc cacccataac agtcattatg agtcagtggg agtcatactg aatcagggta 660
ttttaactgg aaattttttg aaaaacatga gtttttctta aggtcaacat ctggtcttat 720
aaacagaact gagatttatg gccggtaatt accactggac gatttcccgg gaaatcgcta 780
tgggaacggc ccgttttgca acttctttga ccaaaatata tcgagttaag caacttttaa 840
ggccaagtca ctatgactat gccaaataaa gcaactatta aggtcatttc actatggaaa 900
cacccaattc agcaacattg taagccaaat ctccatagaa acctcataag tcagccaaaa 960
gtcaacgacc taccatctgt ttctgcttat ttctctaatt ttaattgcag actttgtcat 1020
tttatgttcc tcttattctg agaatacgtg acgcccgctc gttaaggaca ccgaaactgc 1080
ataagagtca cgttgactca gatgacctcg acatctggtc tggtttttct gccaattttt 1140
cgtctaaact gtggaaaatc cccacagatg acctacaaaa ctccgatttc tattggacga 1200
tgaccgtcag acgtaggtat aaatctccta acgccgttcg ggcagtcaca gtcttcggat 1260
cggacgccgt ggaacgcagt tctcagcgaa gaaggacacc gcccgactcc agaagacacc 1320
gctgcccgaa gaagagaaga cttcatcggt aagagaccca gcttctcctc cccggagctt 1380
cggccacgcc gctccacacc cgggaaccga ggcttcggag cccgataccc ggacagaagc 1440
ttctccccgg ccgctccaca tcagggagcc ttgaccggcg agcctgctat ccgggtagag 1500
actgtcctgc ggccgcttca gcagctccac gatcgacgac tgtgaccgtt gagcccgccg 1560
tttaggcaga ggctccgctt caactaccct accgacacat tcgcggttct tcctccagaa 1620
catcttaccc tctactcggc cactctacaa ggaccggtaa gcaattttta tatactagac 1680
ttaaatgttt ctatgatcat tatgtggtga tggttctgtg tatgaagaga gctaggtgga 1740
ggctatcttt cgcttcggtg atggaacact actcttacaa tggcggctct aatgacggtt 1800
ttctcaacat cggtggcggc tctaattacg gttctctcaa catcggtggt ggtcttcgca 1860
tgcgagctct agattttttt tatctgtaaa ataagattga agatggttga ctgtgtatca 1920
attctttttc ataggcatca gatcttgtca accgttatta atctttagga tcagatgaac 1980
ttgcgagctc gatatctaga atagaatccc cgtgactgct aagatcatct ccgttcatac 2040
accagatgtt acaggccacg gctaccatta tgaatccaaa catgaacaga attgccagaa 2100
tggtgctcaa tggttgtatc catctcgctg gtctattttc tctcaccgac gagaccccaa 2160
catcgagagt tccgtttatt tcatgagtcg accttttagt tcgtgattta ttttctgtgt 2220
taagaaaatc agtgagatca attattgtca gtctatacga ttacaataat gtctgaatta 2280
tcgacgtgca taagatcgtc tcacccggcg cagattccaa cagatctttg tcgccatgcc 2340
ttccgttaga aaggtagtat agtaatatga taccagcaat gcacagaatc gaacatttga 2400
taacaatttt gttgatgtcg tatatctgtt aaaaattaat aaatatatta cagtcagttt 2460
aaacgccgcc acc 2473
<210> 8
<211> 129
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 8
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcacc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 120
tcatgtctg 129
<210> 9
<211> 225
<212> DNA
<213> 黄牛（Bos taurus）
<400> 9
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 10
<211> 73
<212> DNA
<213> 人
<400> 10
caggataata tatggtaggg ttcatagcca gagtaacctt tttttttaat ttttatttta 60
ttttattttt gag 73
<210> 11
<211> 288
<212> DNA
<213> 猿猴病毒 40
<400> 11
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 60
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 120
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 180
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 240
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcg 288
<210> 12
<211> 81
<212> DNA
<213> 人
<400> 12
catggcttcc cgccggaggt ggaggagcag gatgatggca cgctgcccat gtcttgtgcc 60
caggagagcg ggatggaccg t 81
<210> 13
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 绿色荧光蛋白编码核酸
<400> 13
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagatga 798
<210> 14
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 新霉素选择标记
<400> 14
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 15
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP-PEST-NEO融合多肽编码核酸
<400> 15
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780
tccaccggat ctagacatgg cttcccgccg gaggtggagg agcaggatga tggcacgctg 840
cccatgtctt gtgcccagga gagcgggatg gaccgtagtt taaacattga acaagatgga 900
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 960
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 1020
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 1080
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 1140
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 1200
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 1260
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 1320
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 1380
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 1440
acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 1500
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 1560
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 1620
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctga 1677
<210> 16
<211> 583
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 16
ggcgcgcccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 60
ggccggtgtg cgtttgtcta tatgtgattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 120
agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 180
gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 240
tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 300
aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 360
cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 420
ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 480
cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 540
aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgga tcc 583
<210> 17
<211> 655
<212> DNA
<213> 肠道病毒71
<400> 17
ggcgcgcccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca 60
ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg 120
cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac 180
catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc 240
actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa 300
tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagagcct attgagctag ctggtagtcc 360
tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg 420
gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt 480
ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg 540
attggccatc cggtgtgcaa cagggcaatt gtttacctat ttattggttt tgtaccatta 600
tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaac 655

Claims (92)

1.用于选择重组瞬时转染哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；以及
由此第一表达盒和第二表达盒双向排列，
从而获得大量重组哺乳动物细胞；
b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)瞬时转染的重组哺乳动物细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
3.权利要求1至2任一项的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
4.权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于所述表达载体包含：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第四表达盒；
或
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
由此所述抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其特征在于所述表达载体编码双特异性抗体。
10.权利要求8或9的方法，其特征在于所述双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且所述双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
11.权利要求8至10中任一项的方法，其特征在于所述表达载体包含：
-抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
12.权利要求8至11中任一项的方法，其特征在于所述表达载体包含：
-第一抗体轻链表达盒；
-第二抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
13.权利要求8至12中任一项的方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体重链。
14.权利要求8至13中任一项的方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体重链。
15.权利要求8至14中任一项的方法，其特征在于所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CH1结构域的抗体轻链变体，和/或所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
16.权利要求8至15中任一项的方法，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
17.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含以下的哺乳动物细胞：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和
b)从所述细胞或培养基回收所述抗体，
所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于瞬时产生抗体。
18.权利要求17的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
19.权利要求17或18的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
20.权利要求17至19中任一项的方法，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
21.权利要求17至20中任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
22.权利要求17至21中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
23.权利要求17至22中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
24.表达载体，其包含：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，
所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
25.权利要求24的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
26.权利要求24或25的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
27.权利要求24至26中任一项的表达载体，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
28.权利要求24至27中任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
29.权利要求24至28中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体包含：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第四表达盒；
或
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
由此所述抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
30.权利要求24至29中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体编码双特异性抗体。
31.权利要求24至30中任一项的表达载体，其特征在于所述双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且所述双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
32.权利要求24至31中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体包含：
-抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
33.权利要求24至32中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体包含：
-第一抗体轻链表达盒；
-第二抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
34.权利要求24至33中任一项的表达载体，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体重链。
35.权利要求24至34中任一项的表达载体，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体重链。
36.权利要求24至35中任一项的表达载体，其特征在于所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CH1结构域的抗体轻链变体，和/或所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
37.权利要求24至36中任一项的表达载体，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
38.用于选择重组瞬时转染哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：
a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒；和
所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞，
从而获得大量重组哺乳动物细胞；
b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)瞬时转染的重组哺乳动物细胞。
39.权利要求38的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
40.权利要求38或39的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
41.权利要求38至40中任一项的方法，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
42.权利要求38至41中任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
43.权利要求38至42中任一项的方法，其特征在于所述人延伸因子1α启动子含有内含子A。
44.权利要求38至43中任一项的方法，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
45.权利要求44的方法，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
46.权利要求38至45中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
47.权利要求46的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。
48.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含以下瞬时转染的哺乳动物细胞：
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒；和
所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞，
b)从所述瞬时转染的细胞或培养基回收所述抗体。
49.权利要求48的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
50.权利要求48或49的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
51.权利要求48至50中任一项的方法，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
52.权利要求48至51中任一项的方法，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
53.权利要求48至52中任一项的方法，其特征在于所述人延伸因子1α启动子含有内含子A。
54.权利要求48至53中任一项的方法，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
55.权利要求54的方法，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
56.权利要求48至55中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
57.权利要求56的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于瞬时产生抗体的HEK细胞。
58.表达载体，其包含：
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体轻链的核酸和bGH polyA信号序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hEF1α启动子、编码抗体重链的核酸和bGH polyA信号序列的第二表达盒，
所述第一表达盒和所述第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。
59.权利要求58的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
60.权利要求58或59的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
61.权利要求58至60中任一项的表达载体，其特征在于所述表达质粒进一步包含选择标记。
62.权利要求58至61中任一项的表达载体，其特征在于所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。
63.权利要求58至62中任一项的表达载体，其特征在于所述人延伸因子1α启动子含有内含子A。
64.权利要求58至63中任一项的表达载体，其特征在于所述表达载体不含任何转录终止子序列。
65.权利要求64的表达载体，其特征在于所述终止子序列是hGT序列。
66.包含以下的表达载体用于在哺乳动物细胞中瞬时重组产生抗体的用途：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒；
由此所述表达盒双向组织，由此所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排列。
67.权利要求66的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
68.权利要求66至67中任一项的用途，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
69.权利要求66至68中任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
70.权利要求66至69中任一项的用途，其特征在于所述第一和第二启动子是hEF1α启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH polyA信号序列，所述表达盒不含转录终止子序列。
71.权利要求66至69中任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
72.权利要求66至71中任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞是HEK细胞。
73.权利要求66至72中任一项的用途，其特征在于所述表达载体包含：
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第四表达盒；
或
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第一抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和
-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码第二抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第三表达盒；
由此所述抗体轻链是两条抗体重链的共同轻链。
74.权利要求66至73中任一项的用途，其特征在于所述表达载体编码双特异性抗体。
75.权利要求66至74中任一项的用途，其特征在于所述双特异性抗体具有特异性结合第一抗原或抗原上的第一表位的第一结合特异性或结合部位，且所述双特异性抗体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异性或结合部位。
76.权利要求66至75中任一项的用途，其特征在于所述表达载体包含：
-抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
77.权利要求66至76中任一项的用途，其特征在于所述表达载体包含：
-第一抗体轻链表达盒；
-第二抗体轻链表达盒；
-第一抗体重链表达盒；
-第二抗体重链表达盒；和
-选择标记表达盒。
78.权利要求66至77中任一项的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体重链。
79.权利要求66至78中任一项的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体重链。
80.权利要求66至79中任一项的用途，其特征在于所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CH1结构域的抗体轻链变体，和/或所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体轻链。
81.权利要求66至80中任一项的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的抗体重链。
82.表达载体，其包含：
-按5’至3’方向包含第一启动子、编码抗体轻链的核酸、第一polyA信号序列和可选的第一转录终止子序列的第一表达盒；
-按5’至3’方向包含第二启动子、编码抗体重链的核酸、第二polyA信号序列和可选的第二转录终止子序列的第二表达盒；和
-按5’至3’方向包含第三启动子、赋予对选择剂的抗性的核酸、第三polyA信号序列和可选的第三转录终止子序列的第三表达盒；
由此所述表达盒双向组织，由此所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排列。
83.权利要求82的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。
84.权利要求82或83的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。
85.权利要求82至84中任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGHpolyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子序列。
86.权利要求82至84中任一项的表达载体，其特征在于所述第一和第二启动子是hEF1α启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGHpolyA信号序列，所述表达盒不含转录终止子序列。
87.表达质粒，其按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列，由此所述IRES元件是EMCV-IRES元件。
88.按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体重链或抗体轻链的核酸、IRES元件、编码选择标记的核酸序列和polyA信号序列的表达盒的用途，用于选择产生抗体的细胞，由此所述IRES元件是EMCV-IRES元件。
89.用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤：
-培养包含i)权利要求87的表达质粒和ii)编码不由权利要求87的表达质粒编码的另一抗体链的核酸的真核细胞；
-选择表达所述可检测多肽的细胞。
90.表达质粒，其按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和polyA信号序列，由此所述IRES元件是EV71-IRES元件。
91.按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、IRES元件、编码抗体重链的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒的用途，用于表达抗体，由此所述IRES元件是EV71-IRES元件。
92.用于选择表达抗体的真核细胞的方法，其包括以下步骤：
-培养包含i)权利要求90的表达质粒和ii)编码不由权利要求90的表达质粒编码的另一抗体链的核酸的真核细胞；
-选择表达所述可检测多肽的细胞。
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