CN103184214A - 一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用于血清、血浆样品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸快速提取的试剂，该提取试剂含有1-5％KCl(w/v)、0.01-0.5mg/ml表面活性肽、0.1-2％Triton X-100或Tween 20(v/v)、以及0.001-0.005％孔雀石绿(w/v)。使用时取所述核酸提取试剂，加入等体积HBV阳性血清或血浆，室温条件下用移液器吹打5-10次混匀，此时HBV DNA释放到混合液体中，可以在该液体中加入PCR缓冲液进行荧光PCR检测。本发明提供的HBV核酸快速提取试剂操作简便、使用安全，并且成本低廉。

Description

一种乙型肝炎病毒核酸快速提取试剂

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及生物样品中乙型肝炎病毒核酸提取。

背景技术

在临床乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)核酸定量检测中，HBV DNA提取是首先进行的第一步操作。目前，国内外临床应用的HBV核酸提取方法主要有：(1)碱裂解煮沸法，或同时先进行多聚糖浓缩沉淀HBV病毒，在沉淀中加入裂解液煮沸提取HBV DNA；(2)硅胶膜吸附柱法，采用硅胶膜层析柱吸附、清洗、洗脱获得HBV DNA；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脱获得HBV DNA。这三种方法都需要经过多步骤离心(或负压抽吸、磁棒分离)、换管或移液操作才能获得核酸，存在操作步骤繁多、过程中核酸容易丢失或污染的不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种HBV核酸快速提取试剂，它采用一步法操作完成生物样品血清、血浆中HBV DNA的快速释放提取，获得的核酸适用于荧光PCR等下游检测，具有操作简便、使用安全，成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。

技术方案

本发明提供一种HBV核酸快速提取试剂，它含有1-5％KCl(质量/体积比，w/v)、0.01-0.5mg/ml表面活性肽、0.1-2％Triton X-100或Tween 20(质量/质粒比，v/v)、以及0.001-0.005％孔雀石绿(w/v)，所述质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准。

本发明的HBV核酸快速提取试剂配制方法为：在灭菌去离子水中加入KCl终浓度达到1-5％(w/v)、加入表面活性肽终浓度达到0.01-0.5mg/ml、加入TritonX-100或Tween 20终浓度达到0.1-2％(v/v)、加入孔雀石绿终浓度达到0.001-0.005％(w/v)。配制的试剂可在室温保存。

本发明的HBV核酸快速提取试剂使用方法为：取上述配制的核酸快速提取试剂，加入等体积待处理的生物样品中，用移液器吹打5-10次混匀，HBV DNA即从病毒颗粒中提取释放。所述的生物样品为血清、血浆。提取试剂与样品混合后液体由蓝绿色转为无色，可以作为模板直接加入PCR反应液进行扩增检测。

本发明的核酸快速提取试剂采用蛋白变性剂和防腐剂，能快速破坏HBV病毒颗粒外壳蛋白结构，释放HBV DNA，提取试剂含有抑制核酸酶的组分且不对后续PCR实验产生影响；提取试剂中加入样品后颜色发生改变，避免引起是否加样的混淆。采用本发明所述的HBV核酸快速提取试剂，和目前常用的方法比较，无需加热、离心操作，只需要一支移液器即能在室温条件下一步法完成生物样品中HBV DNA的提取。获得的核酸能广泛应用于后续荧光PCR定量检测、PCR-基因芯片杂交检测等领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所涉及的主要试剂说明：

KCl为分析纯，Triton X-100和Tween 20等表面活性剂为生物级纯度，孔雀石绿为化学纯，上述试剂购自国药集团化学试剂有限公司，表面活性肽购自Sigma。实施方式中所用的Highpure Total Nucleic Acid Kit(硅胶膜法)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；台塑DNA/RNA萃取试剂(磁珠法)购自台塑生医科技股份有限公司；乙型肝炎病毒(HBV)核酸荧光定量PCR检测试剂盒为上海克隆生物高技术有限公司产品。

实施例1：和碱裂解煮沸法比较用于血清HBV DNA提取荧光PCR检测

(1)HBV核酸快速提取试剂配制

按照发明内容，首先配制HBV核酸快速提取试剂：在灭菌去离子水中加入KCl终浓度达到2％(w/v)、加入表面活性肽浓度达到0.5mg/ml、加入Triton X-100或Tween 20浓度达到0.5％(v/v)、加入指示剂孔雀石绿浓度达到0.001％(w/v)。

(2)HBV阳性血清核酸提取

对5例HBV阳性血清，采用发明内容中的提取方法处理：取3.5μl提取试剂加入0.2ml PCR扩增管，分别加入3.5μl血清，用移液器反复吹打5-10次，操作所需时间为5min。

同时，以乙型肝炎病毒(HBV)核酸荧光定量PCR检测试剂盒中传统的病毒沉淀-碱裂解煮沸提取HBV DNA方法为对照：各取50μl血清，分别加入50μl核酸提取液A，振荡混匀10秒种，13,000rpm离心10分钟，弃上清；分别加入50μl核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10秒钟，100℃沸水浴10分钟，13,000rpm离心2分钟，操作所需时间为30min。

(3)HBV DNA荧光定量PCR检测

两种方法提取的HBV DNA用HBV核酸荧光定量PCR试剂盒检测，取试剂盒HBV PCR缓冲液n×30μl、MgCl₂n×5μl、HBV荧光探针n×5μl、Taq酶n×3μl混于一离心管中(n为待扩增的样品数)，旋涡振荡器上振荡混匀10秒，低速离心数秒，按每管43μl分装PCR反应液。对本发明核酸快速提取试剂提取获得的HBV DNA，只要将PCR反应液加入上述含有提取试剂和血清混合液的扩增管中即可；对对照方法，则吸取7μl模板加入43μl分装的PCR反应液扩增管中。

在ABI7500荧光扩增仪上进行扩增检测，程序为：50℃2min、94℃5min后按照93℃30秒→60℃90秒循环扩增40次。反应结束后用仪器软件分析结果，两种方法对5例血清HBV DNA定量结果如表1，可知两种方法定量结果相近，但采用本发明提取试剂的方法操作更简便、时间更短，具有优势。

表1和碱裂解煮沸法比较用于血清HBV DNA提取荧光PCR检测结果

实施例2：和柱法、磁珠法比较用于血浆HBV DNA提取荧光PCR检测

(1)HBV核酸快速提取试剂配制

按照发明内容，首先配制HBV核酸快速提取试剂：在灭菌去离子水中加入KCl终浓度达到5％(w/v)、加入表面活性肽浓度达到0.01mg/ml、加入TritonX-100或Tween 20浓度达到2％(v/v)、加入指示剂孔雀石绿浓度达到0.004％(w/v)。

(2)HBV阳性血浆核酸提取

对5例HBV阳性血浆，采用发明内容中的提取方法处理：取3.5μl提取试剂加入0.2ml PCR扩增管，分别加入3.5μl血清，用移液器反复吹打5-10次，操作所需时间为5min。

同时，以罗氏Highpure Total Nucleic Acid Kit(硅胶膜柱法)、台塑生医DNA/RNA萃取试剂(磁珠法)处理HBV阳性血浆方法为对照，分别按照各自的说明书操作，经过裂解、清洗、洗脱步骤获得提取的HBV核酸，操作所需时间各约30min。

(3)HBV DNA荧光定量PCR检测

上述三种方法提取的HBV DNA用HBV核酸荧光定量PCR试剂盒检测，取试剂盒HBV PCR缓冲液n×30μl、MgCl₂n×5μl、HBV荧光探针n×5μl、Taq酶n×3μl混于一离心管中(n为待扩增的样品数)，旋涡振荡器上振荡混匀10秒，低速离心数秒，按每管43μl分装PCR反应液。对本发明核酸快速提取试剂提取获得的HBV DNA，只要将PCR反应液加入上述含有提取试剂和血浆混合液的扩增管中即可；对硅胶膜柱法、磁珠法对照方法，则吸取7μl洗脱的模板加入43μl分装的PCR反应液扩增管中。

在ABI7500荧光扩增仪上进行扩增检测，程序为：50℃2min、94℃5min后按照93℃30秒→60℃90秒循环扩增40次。反应结束后用仪器软件分析结果，三种方法对5例血浆HBV DNA定量结果如表2，可知三种方法定量结果相近，但采用本发明提取试剂的方法操作更简便、时间更短，具有优势。

表2和柱法、磁珠法比较用于血浆HBV DNA提取荧光PCR检测结果

Claims (2)

1.本发明为一种用于血清、血浆样品中乙型肝炎病毒(HBV)核酸快速提取的试剂，其特征在于，该提取试剂含有1-5％KCl(w/v)、0.01-0.5mg/ml表面活性肽、0.1-2％Triton X-100或Tween 20(v/v)、以及0.001-0.005％孔雀石绿(w/v)，所述质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准。

2.如权利要求1所述，其特征在于，使用时取该HBV核酸快速提取试剂，加入等体积HBV阳性血清或血浆，室温条件下用移液器吹打5-10次混匀，此时HBV DNA将释放到混合液体中，可以在该液体中加入PCR缓冲液进行荧光PCR检测。