CN106987587A

CN106987587A - 一种用于荧光定量pcr检测的快速提取核酸方法

Info

Publication number: CN106987587A
Application number: CN201710234694.9A
Authority: CN
Inventors: 卿志荣; 田青
Original assignee: Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Rui Rui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-07-28

Abstract

本发明涉及一种用于荧光定量PCR检测的快速提取核酸方法。该方法适用于提取支原体、革兰氏阴性菌、病毒等病原微生物的DNA，提取产物DNA可用于荧光定量PCR检测。该发明将含有支原体、革兰氏阴性菌、病毒等病原微生物的样本用生理盐水洗一次，在沉淀中加入pH11‑12的含5％Chelex‑100、0.5％NP‑40、0.5％Triton X‑100、1mM EDTA的溶液，重悬，80‑90℃加热10min，12000rpm离心5min，取上清用于荧光定量PCR检测。与现有的核酸提取方法比较操作简单、快速，避免样本之间交叉污染的现象，并且提高样本的DNA得率，提高了荧光定量PCR的扩增效率。

Description

一种用于荧光定量PCR检测的快速提取核酸方法

技术领域

本发明属于分子生物学和医学检测领域，涉及一种用于荧光定量PCR检测的快速提取核酸方法，具体是指采用简便可靠的方法抽提临床样本DNA，再采用荧光定量PCR方法对抽提的核酸进行检测。

背景技术

核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量及其完整性都会直接影响到随后的实验结果。目前，提取核酸常用的传统的基于溶液的抽提方法包括：碱抽提法、异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法和溴化十六烷基三甲胺(CTAB)抽提法。

碱抽提方法是用碱和十二烷基磺酸盐使细胞裂解，碱可以在保持共价闭合环状DNA双链状态的同时，使高分子量染色体DNA变性，十二烷基磺酸盐与细胞蛋白、破碎的细胞壁和变性的染色体DNA形成复合物，离心后这些复合物沉淀，而质粒DNA存在于上清中。这种方法只适用于提取质粒DNA，具有局限性。

异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法是用异硫氰酸胍裂解细胞后，用酚使蛋白变性，同时抑制了DNase的降解作用，而蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。氯仿能够去除核酸溶液中残留的酚，加速有机相和液相分离。但这种方法中酚和氯仿对人体伤害较大。

CTAB抽提法是用CTAB溶解细胞膜,并结合核酸，使核酸便于分离，再用酚-氯仿去除蛋白质和糖类。这种方法虽然提取的DNA纯度较高，但操作繁琐，耗时较长。

Chelex-100对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，能够抑制核酸酶对DNA的消化作用，防止了DNA在煮沸过程中的降解,同时在高温、低离子强度条件下还有催化DNA释放的作用，这样的处理过程既达到了分离提取DNA的目的，同时除去了一些对扩增反应有抑制作用的因子(如重金属离子)，提高了PCR扩增的效率。该方法简便快速，提取过程始终在同一试管中进行，可减少DNA的损失。同时，由于操作步骤简单，减少了样本之间交叉污染的机会。目前，该方法已广泛应用于微量血液、精斑、组织块、牙齿、毛发和骨骼等材料DNA的提取。

发明内容

本发明的目的是提出一种快速提取核酸的方法。为了实现本发明的发明目的，所采用的技术方案为本发明涉及一种快速提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

1.取少量生物样本，所述生物样本选自血斑精斑或***样本、组织液样本、脑脊液样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本；

2.将样本10000-13000rpm离心3-10min，弃上清；

3.加入1ml生理盐水重悬沉淀，10000-13000rpm离心3-10min，弃上清；

4.在沉淀中加入50μl含5％Chelex-100，0.5％-1％NP40，0.5％-1％TritonX-100，1mMEDTA，pH＝9-12的核酸提取液，重悬沉淀；

5.80-90℃下加热5-15min；

6.10000-13000rpm离心3-10min，收集上清为用于PCR反应；

其中，本发明的第一优先技术方案为，所述的核酸提取液中NP40为0.5％-1％，优选0.5％-0.7％；

本发明的第二优先技术方案为，所述的核酸提取液中TritonX-100为0.5％-1％，优选0.5％-0.7％。

本发明的第三优先技术方案为，所述的核酸提取液的pH为9-12，优选11-12。

本发明的第四优先技术方案为，所述的加热温度为80-90℃，优先80-85℃。

本发明的第五优先技术方案为，所述的加热时间为5-15min，优选8-10min。

本发明的的第六优选技术方案为，所述的离心转速为10000-13000rpm，优选11000-12000rpm。

本发明的第七优先技术方案为，所述的离心时间为3-10min，优先4-6min。

其中，本发明的生物样本选自血斑精斑或***样本、组织液样本、脑脊液样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本；

本发明的技术优势为：

1.本发明操作简单，时间短。传统方法中需用溶菌酶裂解细胞，蛋白酶K来去除样本中的蛋白质，这个过程需耗时1-2小时，再进行柱纯化DNA，离心步骤多。本发明的方法操作简单，采用高温加热来裂解样本，使样本中的蛋白质变性，DNA释放出来，直接离心即可得到DNA。裂解时间仅为10min，大大缩短了所需时间。

2.本发明80-90℃加热温度避免了离心管在加热中崩盖的现象。传统热裂解的温度多为100℃，离心管很容易发生崩盖现象，导致样本之间的DNA交叉污染。本发明中的加热温度为80-90℃，避免了离心管崩盖导致的样本DNA之间的交叉污染，提高了检测结果的准确性。

3.本发明使用Chelex-100防止了DNA在加热过程中的降解，减少了DNA的损失。

4.本发明NP40和TritonX-100促进了样本的裂解，NP40和TritonX-100都是PCR的增效剂，提高了PCR的扩增效率。

附图说明

图1为具体实施方式中两种不同提取方法所提取DNA的荧光定量PCR检测结果。

附图标记：

1：1号样本用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取的DNA检测结果；

2：1号样本用本发明方法提取的DNA检测结果；

3：2号样本用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取的DNA检测结果；

4：2号样本用本发明方法提取的DNA检测结果；

5：3号样本用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取的DNA检测结果；

6：3号样本用本发明方法提取的DNA检测结果。

具体实施方式

1.用两种方法提取尿道分泌物中的DNA，分别用这两种抽提方法同时提取3个样本，平行比较。

1.1 用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)抽提尿道分泌物中的DNA。

1.1.1 取200μl含尿道管分泌物的细胞保存液，加入400μl缓冲液GA。

1.1.2 加入20μl Proteinase K溶液，旋涡10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次。

1.1.3 加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

1.1.4 加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

1.1.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

1.1.6 向吸附柱CR2中加入已加入无水乙醇的500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

1.1.7 向吸附柱CR2中加入600μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。

1.1.8 重复操作步骤7。

1.1.9 12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.1.10 将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。

1.2 用本发明的方法抽提尿道分泌物中的DNA。

1.2.1 取200μl含尿道管分泌物的细胞保存液，12000rpm离心5min，弃上清。

1.2.2加入1ml生理盐水重悬沉淀，12000rpm离心5min，弃上清。

1.2.3 在沉淀中加入50μl含5％Chelex-100(Sigma公司)，0.5％NP40，0.5％TritonX-100，1mMEDTA，pH＝11核酸提取液，重悬沉淀。

1.2.4 85℃下加热10min。

1.2.5 12000rpm离心5min，收集上清，取5μl用于PCR反应。

2.DNA鉴定方法

选择人Gapdh基因的Taqman探针和引物，用荧光定量PCR方法检测上述两种不同提取方法所提取DNA。引物和探针由Primer Express 3.0软件设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物探针信息如下：

用于检测Gapdh基因的上游引物为5-GCCTCAAGATCATCAGGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)；

用于检测Gapdh基因的下游引物为5-AGAAAGGTGGGAGCCTCAGT-3’(SEQ ID NO:2)；

用于检测Gapdh基因的探针为5-FAM-CACCACCAACTGCTTAGCACCCCTG-BHQ1-3’(SEQID NO:3)。

2.1 荧光定量PCR检测

PCR扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

3.结果分析

通过对提取产物DNA的荧光PCR检测可发现，该方法提取产物的扩增检测Ct值均小于天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)提取产物DNA的扩增检测Ct值，而荧光信号值高于天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)提取产物DNA的检测荧光信号值。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏睿玻生物科技有限公司

<120> 一种用于荧光定量PCR检测的快速提取核酸方法

<130> 20160926

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctcaagat catcaggtga g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaaaggtgg gagcctcagt 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccaccaac tgcttagcac ccctg 25

Claims

1.一种应用于荧光定量PCR的快速核酸提取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)取少量生物样本，所述生物样本选自血斑、精斑、***、组织液样本、脑脊液样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本；

(2)将样本10000-13000rpm离心3-10min，弃上清；

(3)加入1ml生理盐水重悬沉淀，10000-13000rpm离心3-10min，弃上清；

(4)在沉淀中加入含5％Chelex-100、0.5％-1％NP40、0.5％-1％TritonX-100、1mMEDTA、pH＝9-12的核酸提取液，重悬沉淀；

(5)80-90℃下加热5-15min；

(6)10000-13000rpm离心3-10min，收集上清为用于PCR反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取液含有Chelex-100、NP40、TritonX-100、EDTA，其pH＝9-12。

3.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于，所述的提取液中Chelex-100的浓度为5％。

4.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于，所述的提取液中NP40的浓度为0.5％-1％，优选0.5％-0.7％。

5.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于，所述的提取液中TritonX-100的浓度为0.5％-1％，优选0.5％-0.7％。

6.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于，所述的提取液中EDTA的浓度为1mM。

7.根据权利要求1和2中所述的方法，其特征在于，所述的提取液的pH为9-12，优选11-12。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加热温度为80-90℃，优先80-85℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加热时间为5-15min，优选8-10min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心转速为10000-13000rpm，优选11000-12000rpm。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的离心时间为3-10min，优先4-6min。