CN104611324A - 一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，可对全血样本中白细胞及病原体的核酸进行快速提取，提取的核酸可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，可对全血样本中白细胞及病原体的核酸进行快速提取。
背景技术
核酸检测技术的快速发展将分子诊断推向了前所未有的高水平。核酸检测的第一步就是对样本进行核酸提取。从全血样本中提取白细胞的核酸一直是比较复杂的过程，首先涉及到对全血中的红细胞进行裂解，离心除去不含DNA的红细胞，然后使用细胞裂解液对白细胞进行裂解，释放出核酸。该样本还需进行多个抽提和纯化步骤，才能得到直接用于分子检测的核酸。对全血样本中的病原体进行检测也是临床上常见的检测项目，获得全血中病原体的核酸同样要经历上述复杂的抽提过程。而且临床样本中的病原体含量往往较低，因此病原体的核酸提取效率高低是至关重要的，直接影响到实验的阳性检出率。
现在检测机构用得较多的对全血中白细胞和病原体的核酸进行提取的方法包括Trizol提取法（如Life Technology公司等），柱提法（如Qiagen、Roche公司等）和磁珠法（Chemagen、Thermo公司等）。Trizol提取法提取的核酸得率相对较低，且步骤较为繁杂，整个提取过程耗时1-2小时，直接影响检测效率。柱提法和磁珠法的试剂盒在一定程度上提高了核酸提取效率，对部分核酸提取步骤进行了简化，对提取速度进行了一定的提升，但整个提取过程仍需0.5-1小时。除了提取时间长，这些提取试剂盒的价格都极为昂贵，每一个样本的的提取约需人民币30-50元不等。因此针对全血样本的基因诊断急需操作简单、快速、价格低廉的样本前处理试剂，尤其当临床检测样本量较大时，简单快速的核酸提取显得尤为重要。
由于目前使用的全血样本核酸提取试剂盒及检测方法存在操作时间长、成本高、检测灵敏度低等问题，本发明提出了一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法，仅需简单的三步就可以完成核酸提取，整个提取过程不超过10分钟，既简化核酸提取过程，同时也大大节约成本，且无需进行纯化便可直接用于扩增。由于本试剂盒具备核酸得率高、实验操作简单、实验条件简易、成本低等优点，可广泛用于对全血样本中白细胞以及病原体的核酸进行快速提取。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种全血样本快速裂解试剂盒，提取的核酸可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。
为了解决上述任务，本发明的具体技术路线为：
1）从各种去污剂着手，筛选裂解细胞能力强的去污剂和最佳配比，以使整个裂解过程只需2分钟加热便能最大程度地释放病毒样本核酸。
2）在裂解细胞、释放核酸的同时，由于核酸的质量会影响PCR扩增的效果，需采用防止核酸降解，尤其需要研究防止RNA降解的技术。
通过反复的摸索，确定了全血样本快速裂解试剂盒各组成成分及浓度，该试剂盒核酸得率高、实验操作简单，无需复杂的实验设备且成本低廉。
本发明所提供的全血样本快速裂解试剂盒包括：（1）装有全血样本裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于全血样本裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、TE（pH7.4）组成。
本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为12g/L。
本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中二硫苏糖醇的浓度为40mmol/L～200mmol/L。
本发明的另一个优选实施方案是全血样本裂解液中TE（pH7.4）由20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA组成，pH为7.4。
本发明提供的全血样本快速裂解试剂盒可以提取全血样本中白细胞和病原体的核酸，其中病原体包括细菌、DNA病毒及RNA病毒，核酸包括DNA和RNA。
本发明另一个目的是提供一种全血样本快速裂解的检测方法，包括如下步骤：
（1） 取抗凝全血25 μl置于离心管中，加入25 μl 全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
（2） 将混合物置于95 ℃孵育2 min；
（3） 将孵育后的混合物在12,000 rpm条件下离心3 min，收集上清，即为全血样本的核酸提取物。
该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：①全血样本无需分离白细胞，可直接用于核酸提取；②组分简单，且无昂贵的试剂，大大节约成本；③步骤简单，仅需三步；④提取速度快，整个提取过程不超过10分钟； ⑤样本中的核酸均保留在全血样本裂解液中，核酸没有损失，且无需纯化，即可用于PCR扩增或荧光PCR检测，灵敏度高于现有技术。⑥无需核酸提取仪等复杂的设备，仅需水浴锅和离心机即可完成操作。
因此，本发明的试剂盒可广泛用于对全血样本中白细胞以及病原体的核酸进行快速提取，特别是待测全血样本数量较多时尤为适用。
附图说明
图1 显示本试剂盒提取全血样本的核酸进行白细胞GAPDH基因DNA、mRNA以及金黄葡萄球菌荧光PCR检测结果。白细胞GAPDH基因DNA和mRNA以及金黄葡萄球菌扩增曲线均为S型曲线，Ct值分别为17.58、16.27和18.41，均为阳性。
图:2 显示本试剂盒对全血样本中提取的金黄色葡萄球菌进行灵敏度试验的结果。全血样本中不同浓度梯度的金黄葡萄球菌除浓度1×103CFU/ml的样本无Ct值判为阴性外，其余浓度的样本扩增曲线均呈S型，Ct值分别为18.41、21.36、24.29、26.67，可明确判为阳性。
图3 显示本试剂盒提取的核酸与Qiagen柱提法提取的核酸进行人GAPDH基因荧光定量PCR的对比实验结果。Qiagen柱提法结果Ct值为23.39，本试剂盒结果Ct值为21.98，比Qiagen柱提法的Ct值提前1.41。两条曲线均为S型曲线，且差异不大。
图4 显示本试剂盒提取的核酸与Qiagen柱提法提取的核酸进行金黄葡萄球菌荧光定量PCR的对比实验结果。Qiagen柱提法荧光PCR结果Ct值为25.44，本试剂盒荧光PCR结果Ct值为23.94，比Qiagen柱提法的Ct值提前1.5。两条曲线均为S型曲线，且本试剂盒荧光PCR的荧光值略高。
图5 显示本试剂盒对全血样本中提取的沙门氏菌进行荧光PCR检测结果。沙门氏菌阳性的全血样本扩增曲线为S型曲线，Ct值为23.64，检测为沙门氏菌阳性。
图6 显示本试剂盒对全血样本中提取的HCV进行荧光PCR检测结果。两份临床HCV阳性的全血样本扩增曲线均为S型曲线，Ct值分别为29.54和29.77，检测均为HCV阳性。
图7 使用本试剂盒对全血样本中提取的EBV进行荧光PCR检测结果。三份临床EBV阳性的全血样本扩增曲线均为S型曲线，Ct值分别为21.19、21.21和21.03，检测均为EBV阳性。
图8 显示本试剂盒对全血样本中提取的白细胞核酸进行PCR电泳检测结果。从图中可以看到从上到下三条带，分别为基因组DNA、28S rRNA (约5kb)、18S rRNA (约1.9kb)。
图9 显示不同二硫苏糖醇浓度的全血裂解液进行PCR电泳检测结果。泳道1-7分别对应二硫苏糖醇浓度0、20mM、40mM、80mM、120mM、160mM或200mM。
具体实施方式
本发明实施方式的描述，旨在通过举例说明更好地理解本发明的本质，而不是限制本发明。本发明实施方式所用的实验材料，如没有特别说明，均为市售产品。
实施例1：全血样本快速裂解试剂盒制备及其使用方法
1、制备全血样本快速裂解试剂盒（50测试/盒）：全血样本裂解液（1.25ml /管）1管。
2、标本采集、运送和保存
取受检者静脉血2 ml于含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂（禁止使用肝素抗凝）的无菌离心管中备用。
新鲜全血样本在室温条件下保存不超过6小时；后续全血样本用于DNA检测可在-20±5 ℃条件下长期保存，用于RNA检测可在-80 ℃±5 ℃条件下长期保存；样本应避免反复冻融，冻融次数不得超过3次。
冻存样本解冻后应充分混匀。
3、检测步骤
（1） 取抗凝全血25 μl置于离心管中，加入25 μl 全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
（2） 将混合物置于95 ℃孵育2 min；
（3） 将孵育后的混合物在12,000 rpm条件下离心3 min，收集上清，即为全血样本的核酸提取物。
该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。
实施例2：使用本试剂盒提取全血样本的核酸进行白细胞GAPDH基因DNA、mRNA以及金黄葡萄球菌荧光PCR检测。
1、 取EDTA抗凝全血25μl置于PCR管中，加入少量金黄色葡萄球菌菌体，震荡混匀；
2、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
3、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
4、 取2μl 核酸样本进行荧光PCR或荧光RT-PCR扩增。
1）使用上游引物GAPDH1 F，序列为5’ -CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’ (SEQ ID NO：1)，下游引物GAPDH1 R，序列为5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’ (SEQ ID NO：2)和荧光探针 GAPDH1 probe，序列为 5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’ (SEQ ID NO：3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对白细胞GAPDH基因DNA进行荧光PCR扩增，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
2） 使用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’ (SEQ ID NO：4)，下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’ (SEQ ID NO：5) 和荧光探针Staph probe ，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’ (SEQ ID NO：6) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增; 扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
3） 使用上游引物GAPDH2 F，序列为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (SEQ ID NO：7)，下游引物GAPDH2 R，序列为5’- GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (SEQ ID NO：8)和荧光探针GAPDH2 probe ，序列为5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’ (SEQ ID NO：9) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）（货号RR064A），按照试剂盒说明配制反应体系， 对人GAPDH mRNA进行荧光RT-PCR扩增，扩增条件为42℃ 20min (1 cycle), 95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
如附图1所示：本试剂盒提取全血样本的核酸进行白细胞GAPDH基因DNA、mRNA以及金黄葡萄球菌进行荧光PCR检测结果均为阳性。
实施例3：使用本试剂盒对全血样本中提取的金黄色葡萄球菌进行灵敏度试验。
1、取EDTA抗凝全血90μl置于PCR管中，加入1×109CFU/ml金黄色葡萄球菌10μl，震荡混匀；
2、 取该样本10μl加入90μl EDTA抗凝全血中，震荡混匀；依此进行稀释得到分别含有金黄色葡萄球菌浓度为1×107CFU/ml, 1×106CFU/ml, 1×105CFU/ml, 1×104CFU/ml、1×103CFU/ml的全血样本；
3、 取各稀释度的全血样本25μl置于PCR管中；
4、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，往上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
5、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
6、 取2μl 核酸样本进行进行荧光PCR扩增。使用上游引物Staph F ，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’ (SEQ ID NO：4)，下游引物Staph R 5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’ (SEQ ID NO：5) 和荧光探针Staph probe，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’ (SEQ ID NO：6) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增; 扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
如附图2所示检测结果可知，本试剂盒对全血样本中提取的金黄色葡萄球菌灵敏度为1×104CFU/ml。
实施例4：以添加金黄色葡萄球菌的全血为样本，本试剂盒提取的核酸与Qiagen柱提试剂（QIAamp DNA Mini Kit，货号51304）提取的核酸用于荧光定量PCR的对比实验结果。
两种核酸提取方法的操作步骤对比见下表：
| 操作步骤 | Qiagen柱提试剂 | 本试剂盒 |
| 样本处理 | 取200 μl全血，加入200 μl Buffer AL、20 μl Proteinase K，Vortex 15 s混匀 | 取25 μl全血，加入25 μl 全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀； |
| 裂解 | 56 ℃孵育10 min | 95 ℃孵育2min |
| 加入200 μl 无水乙醇，Vortex 15 s混匀 | ||
| 柱结合 | 将上步产物转移至DNA结合柱中，8000 rpm离心1 min | |
| 清洗1 | 向结合柱中加入500 μl Buffer AW1，8000 rpm离心1 min | |
| 清洗2 | 向结合柱中加入500 μl Buffer AW2，14000 rpm离心3 min | |
| DNA洗脱 | 将结合柱转移至1.5 ml离心管中，加入200 μl Buffer AE或H2O，室温放置1 min后，8000 rpm离心1 min洗脱 | 12000 rpm离心3 min |
取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。对白细胞GAPDH基因DNA进行荧光PCR扩增，使用上游引物GAPDH1 F，序列为5’ -CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’ (SEQ ID NO：1)，下游引物GAPDH1 R，序列为5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’ (SEQ ID NO：2)和荧光探针 GAPDH1 probe，序列为 5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’ (SEQ ID NO：3)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，金黄色葡萄球菌16S rDNA进行荧光PCR扩增，使用上游引物Staph F，序列为5’ -CAGCAGCCGCGGTAATA-3’ (SEQ ID NO：4)，下游引物Staph R，序列为5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3’ (SEQ ID NO：5) 和荧光探针Staph probe ，序列为5’-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3’ (SEQ ID NO：6) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，两者均使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
白细胞GAPDH基因DNA对比检测结果如附图3所示，本试剂盒的Ct值比Qiagen柱提法的Ct值提前1.41，说明本试剂盒的核酸得率比Qiagen柱提试剂高，约为对方的2.6倍。
金黄色葡萄球菌16S rDNA对比检测结果如附图4所示，本试剂盒的Ct值比Qiagen柱提法的Ct值提前1.5，本试剂盒荧光PCR的荧光值略高。说明本试剂盒的核酸得率比Qiagen柱提试剂高，约为对方的2.8倍。
实施例5 使用本试剂盒对全血样本中提取的沙门氏菌进行荧光PCR检测。
1、挑取单个菌落的沙门氏菌，加入100μl生理盐水中，震荡重悬；
2、 取该菌悬液1μl加入50μl EDTA抗凝全血中，震荡混匀；
3、 取该全血样本25μl置于PCR管中；
4、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，往上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
5、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
6、 取2μl 核酸样本进行进行荧光PCR扩增。使用上游引物invA F ，序列为5’ - CCGCCAAACCTAAAACCAG -3’ (SEQ ID NO：10)，下游引物invA R 5’- GAGCTTTTTCCAGATCTTCACGC -3’ (SEQ ID NO：11) 和荧光探针invA probe，序列为5’- CTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAG -3’ (SEQ ID NO：12) ，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对提取的核酸样本进行荧光PCR扩增; 扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
检测结果如附图5所示，本试剂盒提取沙门氏菌阳性全血样本进行荧光PCR检测为沙门氏菌阳性。
实施例6 使用本试剂盒对全血样本中提取的HCV进行荧光PCR检测。
1、取两份临床HCV阳性的EDTA抗凝全血25μl置于PCR管中；
2、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，往上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
3、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
4、 取2μl 核酸样本进行荧光RT-PCR扩增。使用上游引物HCV F，序列为5’ - GAAAGCGTCTAGCCATGGC -3’ (SEQ ID NO：13)，下游引物HCV R，序列为5’- CAACACTACTCGGCTAGCAGTC -3’ (SEQ ID NO：14)和荧光探针 HCV probe，序列为 5’- ATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAG -3’ (SEQ ID NO：15)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）（货号RR064A），按照试剂盒说明配制反应体系，对提取的核酸样本进行荧光RT-PCR扩增，扩增条件为42℃ 20min (1 cycle), 95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
检测结果如附图6所示，本试剂盒提取两份临床HCV阳性全血样本进行荧光PCR检测均为HCV阳性。
实施例7 使用本试剂盒对全血样本中提取的EBV进行荧光PCR检测。
1、取三份临床EBV阳性的EDTA抗凝全血25μl置于PCR管中；
2、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，往上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
3、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
4、 取2μl 核酸样本进行荧光PCR扩增。使用上游引物EBV F，序列为5’ - TTGCTCTTCGTGCTCTTC-3’ (SEQ ID NO：16)，下游引物EBV R，序列为5’- TTGCAAAATACTGCCACC-3’ (SEQ ID NO：17)和荧光探针 EBV probe，序列为 5’- TCTGGCACGACTGTTCCTATATGC-3’ (SEQ ID NO：18)，探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（货号RR390Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对提取的核酸样本进行荧光PCR扩增，扩增条件为95℃ 30s (1 cycle), 95℃ 10s, 58℃ 40s (40 cycles) 。
检测结果如附图7所示，本试剂盒提取三份临床EBV阳性全血样本进行荧光PCR检测均为EBV阳性。
实施例8 使用本试剂盒对全血样本中提取的白细胞核酸进行电泳检测。
1、 取EDTA抗凝全血25μl置于PCR管中；
2、 取实施例1的全血样本快速裂解试剂盒，往上述样本里加入25 μl全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
3、 将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
3、取10μl核酸样本进行电泳，电泳结果如附图8所示。从图中可以看到从上到下三条带，分别为基因组DNA、28S rRNA (约5kb)、18S rRNA (约1.9kb)，故该裂解液能有效提取白细胞中的DNA和RNA。
实施例9 摸索裂解液配方中二硫苏糖醇的最佳浓度。
1、 取EDTA抗凝全血25μl置于7个PCR管中，然后分别加入25 μl含不同浓度（0、20mM、40mM、80mM、120mM、160mM或200mM）二硫苏糖醇的全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀，测试裂解扩增的效果。
2、将混合物置于95 ℃孵育2 min，孵育后的混合物在12,000 rpm离心3分钟，收集上清，即得到样本的核酸；
3、取1μl 核酸样本进行PCR扩增。使用上游引物GAPDH3 F，序列为5’ - CGGCTACTAGCGGTTTTACG -3’ (SEQ ID NO：19)，下游引物GAPDH3 R，序列为5’- GGCTCGTAGACGCGGTTC -3’ (SEQ ID NO：20)，并使用Takara公司的Premix TaqTM Hot Start version（货号R028Q），按照试剂盒说明配制反应体系，对白细胞GAPDH基因DNA进行PCR扩增，扩增条件为95℃ 1min (1 cycle), 95℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 40s (30 cycles), 72℃ 5min (1 cycles)。
4、扩增结束后取10μl样本进行电泳，电泳结果如附图9所示。含各浓度二硫苏糖醇的裂解液均能得到目标条带（556bp），添加二硫苏糖醇能增强裂解扩增的效率。浓度在0-40mM的范围内效率随二硫苏糖醇浓度增加而递增，而在40mM-200mM的范围内，裂解扩增效率变化不大。所以全血样本裂解液中二硫苏糖醇浓度的优选范围为40mM-200mM。
序列表
<110> 南京美宁康诚生物科技有限公司
<120>一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法
<140>
<141>
<160>20
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 1
CCACTCCTCCACCTTTGAC
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 2
ACCCTGTTGCTGTAGCCA
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 3
TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 4
CAGCAGCCGCGGTAATA
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 5
GGACTACCAGGGTATCTAATCC
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 6
CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 7
GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 8
GAAGATGGTGATGGGATTTC
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 9
CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC
<210>10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
CCGCCAAACCTAAAACCAG
<210>11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
GAGCTTTTTCCAGATCTTCACGC
<210>12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 9
CTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTAC
<210>13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
GAAAGCGTCTAGCCATGGC
<210>14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
CAACACTACTCGGCTAGCAGTC
<210>15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 9
ATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAG
<210>16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
TTGCTCTTCGTGCTCTTC
<210>17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR引物。
<400> 9
TTGCAAAATACTGCCACC
<210>18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作荧光定量PCR探针。
<400> 9
TCTGGCACGACTGTTCCTATATGC
<210>19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400> 9
CGGCTACTAGCGGTTTTACG
<210>20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR引物。
<400> 9
GGCTCGTAGACGCGGTTC
Claims (7)
1.一种全血样本快速裂解试剂盒，试剂盒包括：（1）装有全血样本裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中全血样本裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、pH7.4的TE组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于全血样本裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为12g/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于全血样本裂解液中二硫苏糖醇的浓度为40mmol/L～200mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于全血样本裂解液中pH7.4的TE由20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA组成，pH为7.4。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，用于提取全血样本中白细胞和病原体的核酸，其中病原体包括细菌、DNA病毒及RNA病毒，核酸包括DNA和RNA。
6. 一种全血样本快速裂解的检测方法，包括如下步骤：
取抗凝全血25 μl置于离心管中，加入25 μl 全血样本裂解液，用枪头吹吸混匀；
将混合物置于95 ℃孵育2 min；
将孵育后的混合物在12,000 rpm条件下离心3 min，收集上清，即为全血样本的核酸提取物。
7. 根据权利要求6所述的检测方法，其中全血样本的核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 ℃长期保存。
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|---|---|---|---|
| CN201410251359.6A CN104611324A (zh) | 2014-06-09 | 2014-06-09 | 一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法 |
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| CN201410251359.6A CN104611324A (zh) | 2014-06-09 | 2014-06-09 | 一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法 |
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2014
- 2014-06-09 CN CN201410251359.6A patent/CN104611324A/zh active Pending
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