CN106905142A - 一种s‑诱抗素的分离纯化方法 - Google Patents

一种s‑诱抗素的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种S‑诱抗素的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：(1)将经过发酵后产生的含有S‑诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；(2)将所述萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥得到纯度为95％以上的S‑诱抗素成品。所述分离纯化方法通过提取精制处理，能够逐步提高S‑诱抗素的纯度，使最终产品中S‑诱抗素的纯度达到95％以上。此外，分离纯化条件温和，分离纯化过程环保，有利于S‑诱抗素的产业化生产。

Description

一种S-诱抗素的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种S-诱抗素的分离纯化方法。
背景技术
S-诱抗素(天然脱落酸)，与生长素、乙烯、赤霉素、细胞***素并列为植物五大类天然生长调节剂，是植物体的“抗逆诱导因子”，能够启动植物的抗逆基因，诱导激活植物体内的抗逆免疫***，提高植物自身对寒冷、干旱、病虫害、盐碱的抗性，通过施用S-诱抗素，可减少化学农药的使用量，在提高农产品品质等许多方面有着重要的生理活性作用和应用价值。
目前，S-诱抗素的制备方法主要有直接提取法、化学合成法、生物发酵法三种。其中生物发酵法制备的S-诱抗素产量高，不会有非天然脱落酸产生，是目前综合较好的S-诱抗素制备方法，然而该方法仍存在一些技术上的问题，例如，发酵产生的副产物较多，对提取造成了一定的困难，且提取的过程参数不易控制造成大量S-诱抗素的浪费，另外也因为工艺的缺陷和过程参数的控制不易造成最终的S-诱抗素产品纯度不高，只有不到95％，产品质量无法得到提升。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种S-诱抗素的分离纯化方法，具体是一种发酵法生产S-诱抗素的分离纯化方法，通过提取精制处理，能够逐步提高S-诱抗素的纯度，使最终产品中S-诱抗素的纯度达到95％以上。此外，分离纯化条件温和，分离纯化过程环保，有利于S-诱抗素的产业化生产。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种S-诱抗素的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；
(2)将所述萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥得到纯度为95％以上的S-诱抗素成品。
优选的，步骤(1)所述板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4-7。
优选的，步骤(1)所述板框过滤中，控制压力0.05-0.5MPa。
优选的，步骤(1)所述膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序。
更为优选的，步骤(1)所述微滤工序具体为：在压力为0.05-0.6MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行微滤。
更为优选的，步骤(1)所述超滤工序具体为：在压力为0.05-1.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行超滤。
更为优选的，步骤(1)所述纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤具体为：在压力为0.1-2.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行一级纳滤；所述二级纳滤具体为：在压力为0.5-10.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行二级纳滤。
优选的，步骤(1)所述萃取中，采用的萃取剂为至少一种选自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇，萃取体系的pH值为1-4。
优选的，步骤(2)所述浓缩结晶、重结晶、干燥的温度为40-80℃。
本申请技术方案提供了一种S-诱抗素的分离纯化方法，具体是一种发酵法生产S-诱抗素的分离纯化方法，通过从发酵液中提取和精制过程，得到的S-诱抗素产品具有95％以上的纯度。
在上述的本申请技术方案中，步骤(1)中，将含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液。其中在板框过滤之间，先加入固体NaOH调节pH值至4-7，以起到更好的助滤作用；此外，通过膜过滤对板框过滤后的滤液进一步过滤，该膜过滤包括有依次设置的微滤、超滤和纳滤，在微滤过程中，板框过滤后的滤液中的悬浮颗粒、菌种以及其他大颗粒杂质被滤除；在超滤过程中，微滤后的滤液中的大分子蛋白质、葡萄糖等被滤除；在纳滤过程中，对超滤后的滤液进一步过滤，滤除部分小分子，得到较为纯净的S-诱抗素溶液。控制微滤、超滤以及纳滤过程中的进口压力和出口压力，可以提高过滤的效率，同时避免滤液的浪费。经过膜过滤后的溶液通过萃取进行进一步分离，采用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇中的至少一种作为萃取剂，控制萃取的体系为pH值为1-4的酸性环境，实现S-诱抗素与油类、酯类物质的分离。通过以上的过滤和萃取工序，提高溶液中S-诱抗素的含量。
步骤(2)中，萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥可以得到重量百分比为95％以上的S-诱抗素成品。在浓缩结晶、重结晶过程中，得到S-诱抗素结晶体，使其与萃取液中的可溶无机盐类分离，提高了其纯度，控制浓缩结晶、重结晶、干燥的温度在40-80℃之间，可以加快浓缩结晶、重结晶、干燥的速度，同时避免对S-诱抗素的结构造成破坏，影响其生理活性。
与现有技术相比，本申请技术方案所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，通过提取精制处理，能够逐步提高S-诱抗素的纯度，使最终产品中S-诱抗素的纯度达到95％以上。此外，分离纯化条件温和，分离纯化过程环保，有利于S-诱抗素的产业化生产。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本申请所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，具体是一种发酵法生产S-诱抗素的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)提取：将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；其中，在板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4-7，板框过滤中，控制压力0.05-0.5MPa；其中，膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序，在微滤工序中，压力为0.05-0.6MPa，过滤温度不大于60℃；在超滤工序中，压力为0.05-1.0MPa，过滤温度不大于60℃；纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤中，压力为0.1-2.0MPa，过滤温度不大于60℃；所述二级纳滤中，压力为0.5-10.0MPa，过滤温度不大于60℃。在萃取过程中，萃取剂为至少一种选自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇，萃取体系的pH值为1-4；
(2)精制：将所述萃取液经过40-80℃温度下的浓缩结晶、重结晶、干燥得到所述S-诱抗素成品。
为了验证本申请技术方案的技术效果，在上述具体实施方式要求的基础上，采用具体参数进行试验验证，得到以下具体实施例。
实施例1
发酵液pH值对板框过滤效果的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，在板框过滤前，采用不同的发酵液pH值，采用前述的过滤参数进行过滤，结果见表1。
表1发酵液pH值对板框过滤效果的影响
备注：本次实验发酵液重量为50L，含量为8000ppm。
实施例2
板框过滤参数对板框过滤效果的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，采用不同的板框过滤参数进行过滤，结果见表2。
表2板框过滤参数对板框过滤效果的影响
实验1 实验2 实验3 实验4 实验5
压力(MPa) 0.05 0.15 0.25 0.35 0.5
过滤时间 15min 13min 12.5min 11min 10min
过滤效率 3.33L/min 3.85L/min 4L/min 4.55L/min 5L/min
滤液中S-诱抗素含量(ppm) 6032 6120 6216 6250 6340
滤渣中S-诱抗素(ppm) 600 580 570 560 555
备注：本次实验发酵液重量为50L,含量为8000ppm。
实施例3
膜过滤参数对膜过滤效果的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，采用不同的膜过滤参数进行过滤，结果见表3。
表3膜过滤参数对膜过滤效果的影响
备注：本次实验所用板框滤液、微滤清液、超滤清液、一级纳滤残液重量分别为100L、90L、80L、70L。
实施例4
萃取剂组分对萃取效果的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，采用不同的萃取剂成分对滤液进行萃取，结果见表4。
表4萃取剂组分对萃取效果的影响
备注：本实验所用浓缩液含量为20000ppm。
实施例5
萃取体系pH值对萃取效果的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，采用不同的萃取体系pH值对滤液进行萃取，结果见表5。
表5萃取体系pH值对萃取效果的影响
备注：本实验所用浓缩液含量为20000ppm。
实施例6
浓缩结晶、重结晶、干燥温度对S-诱抗素纯度的影响
采用单因素实验方法，在其他条件均一致的情况下，采用不同的浓缩结晶、重结晶、干燥温度，结果见表6。
表6浓缩结晶、重结晶、干燥温度对S-诱抗素纯度的影响结果
实施例7
本实施例所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；其中，在板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至5，板框过滤中，控制压力0.2MPa；其中，膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序，在微滤工序中，压力为0.3MPa，过滤温度50℃；在超滤工序中，压力为0.5MPa，过滤温度50℃；纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤中，压力为1.0MPa，过滤温度50℃；所述二级纳滤中，压力为5.0MPa，过滤温度50℃。在萃取过程中，萃取体系的pH值为3，萃取剂为乙酸乙酯。
(2)将所述萃取液经过60℃温度下的浓缩结晶、60℃温度下的重结晶、60℃温度下的干燥得到所述S-诱抗素成品。
在本实施例中，得到的S-诱抗素成品为粉剂，S-诱抗素质量百分数纯度为92.6％，水分含量为0.43％，杂质7′-OH-ABA含量为0.37％，1,4-trans-diolofABA含量为0.58％，5′-OH-ABA含量为0.28％，trans-，trans-ABA含量为0.24％。
实施例8
本实施例所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；其中，在板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4，板框过滤中，控制压力0.05MPa；其中，膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序，在微滤工序中，压力为0.05MPa，过滤温度40℃；在超滤工序中，压力为0.05MPa，过滤温度40℃；纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤中，压力为0.1MPa，过滤温度40℃；所述二级纳滤中，压力为0.5MPa，过滤温度40℃。在萃取过程中，萃取体系的pH值为1，萃取剂为乙酸乙酯。
(2)将所述萃取液经过40℃温度下的浓缩结晶、40℃温度下的重结晶、40℃温度下的干燥得到所述S-诱抗素成品。
在本实施例中，得到的S-诱抗素成品为粉剂，S-诱抗素质量百分数纯度为96.5％，水分含量为0.56％，7′-OH-ABA含量为0.18％，1,4-trans-diolofABA含量为0.38％，5′-OH-ABA含量为0.08％，trans-，trans-ABA含量为0.07％。
实施例9
本实施例所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；其中，在板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至7，板框过滤中，控制压力0.5MPa；其中，膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序，在微滤工序中，压力为0.6MPa，过滤温度60℃；在超滤工序中，压力为1.0MPa，过滤温度60℃；纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤中，压力为2.0MPa，过滤温度60℃；所述二级纳滤中，压力为10.0MPa，过滤温度50℃。在萃取过程中，萃取体系的pH值为4，萃取剂为乙酸乙酯。
(2)将所述萃取液经过80℃温度下的浓缩结晶、80℃温度下的重结晶、80℃温度下的干燥得到所述S-诱抗素成品。
在本实施例中，得到的S-诱抗素成品为粉剂，S-诱抗素质量百分数纯度为88％，水分含量为0.1％，7′-OH-ABA含量为0.38％，1,4-trans-diolofABA含量为0.68％，5′-OH-ABA含量为0.23％，trans-，trans-ABA含量为0.19％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)将经过发酵后产生的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液；
(2)将所述萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥得到纯度为95％以上的S-诱抗素成品。
2.根据权利要求1所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述板框过滤前，向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4-7。
3.根据权利要求1所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述板框过滤中，控制压力0.05-0.5MPa。
4.根据权利要求1所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述膜过滤包括依次设置的微滤、超滤和纳滤工序。
5.根据权利要求4所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述微滤工序具体为：在压力为0.05-0.6MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行微滤。
6.根据权利要求4所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述超滤工序具体为：在压力为0.05-1.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行超滤。
7.根据权利要求4所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤，所述一级纳滤具体为：在压力为0.1-2.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行一级纳滤；所述二级纳滤具体为：在压力为0.5-10.0MPa，过滤温度不大于60℃的条件下进行二级纳滤。
8.根据权利要求1所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)所述萃取中，采用的萃取剂为至少一种选自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇，萃取体系的pH值为1-4。
9.根据权利要求1所述的一种S-诱抗素的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)所述浓缩结晶、重结晶、干燥的温度为40-80℃。
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