CN106687111A - 加速创面愈合的药物 - Google Patents

Abstract

提出一种含有式(I)衍生物的药物其中R¹是氢或甲基，用于加速创面愈合。

Description

加速创面愈合的药物

发明领域

本发明属于药物领域并且涉及特别用于加速创面愈合的药物，其含有具备檀香气味的化合物。

背景技术

创面愈合是指通过最大程度上复原受损身体组织封闭创面的身体内生过程。这是一种在受伤仅几分钟后就已经开始的自然生物过程，如可通过酶组织化学方法确定。血小板到达受伤区域并尝试封闭创面。在有些情况下通过渗出物(分泌流体)结痂，其通常引起伴随创面愈合的发痒。

创面愈合分为不同的阶段。在损伤血管通过凝血封闭以后，最初不会发生宏观或微观上可见的反应。第一潜伏阶段过渡为渗出阶段，在该阶段异物和细菌通过创面分泌物的渗出被洗出创面。参与这一阶段的主要是免疫***的细胞和激素，不仅杀死侵入的细菌或病毒，而且促进了愈合过程。凝血形成过程中形成血纤蛋白网，其使得相邻的创面边缘相互黏合。清澈的由血清构成的创面分泌物中混有炎症细胞。在该阶段进展过程中创面区域的有丝***增多。在创面区域单核白血球成长为巨噬细胞，其清除了细胞碎片和血栓。由渗入以及在创面边缘的***细胞产生并通过细胞***增殖的成纤维细胞在下一阶段进行真正的构建工作。

在接下来的肉芽形成阶段创面缺损通过新的***增多地填充。在创面缺损细胞丰富的填充时，血纤蛋白网通过纤溶酶分解(纤溶)。血管化，即血管数量增多，通过毛细血管生长实现。成纤维细胞产生含有己糖胺的酸性粘多糖，其用作***的细胞外底物，并通过细胞内的初始阶段形成细胞外的胶原***纤维。时间进程非常复杂并且受到很多生长因子(细胞因子)的影响。

最后在再生阶段创面表面通过上皮形成封闭。形成良好肉芽的创面的直径三分子一仅通过萎缩封闭，三分之二通过表皮细胞的新生或细胞***以及借助纤维蛋白由创面边缘向创面中部的细胞迁移封闭。其下的肉芽组织形成增多地胶原纤维，由此所有皮肤层的重建基本完成。疤痕组织强度的进一步增强取决于胶原纤维的结网、固化和取向。组织的含水量减少，则最初稍微高出皮肤层的疤痕通常萎缩至低于皮肤层。疤痕组织的血管化同样减少。最初新鲜红色的疤痕变白。

现有技术中已知大量促进创面愈合的药物活性成分。例如氨基噻唑(EP 0967980B1)、(EP 1070058 B1)、氰基邻氨基苯甲酰胺(EP 1387838 B1)、抗胰糜蛋白酶多肽(EP 1392354 B1)或联吡啶二氢吡唑(EP 1877396B1)。这些物质的作用机制完全不同：覆盖从分泌生长因子或特殊的白细胞介素，抑制HIF‐脯氨酰基‐4‐羟化酶，至产生整联受体拮抗剂。

同样参考以下文献：

US 5,759,556 A(CHESEBROUGH)的主题是皮肤护理剂，其含有0.001‐10％视黄醇、0.0001‐50％脂环族不饱和化合物(例如婆罗门檀香(Brahmanol))，和化妆品可接受载体。该制剂用于治疗银屑病。

WO 2008/068683 A1(FIRMENICH)涉及香料组合物，其含有抗微生物关键成分和任选至少一种常用的香料成分(例如檀香醇(Sandalore)和婆罗门檀香(Brahmanol))，其中抗微生物关键成分含有3,4‐二甲基苯酚和一种或多种抗微生物香料成分，其抑制两种或多种菌株的各自最小抑制浓度为1000ppm或更小，所述菌株选自具核梭杆菌(FusobacteriumNucleatum)、Fusobacterium sp.、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas Gingivalis)、中间普氏菌(Prevotella Intermedia)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella Pneumoniae)、产碱韦荣菌(Veillonella Alcalescens)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides Melaninogenicus)/福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、生痰新月形單胞菌(Selenomonas Sputagena)、牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas Endodontalis)、产黑色素普氏菌(PrevotellaMelaninogenica)和变形链球菌(Streptococcus Mutans)。这些制剂用于治疗牙周炎。

由WO 2009/153572 A1(UNIV ABERYSTWITH)已知使用檀香木提取物或檀香木油成分的类似物(例如檀香醇)作为动物饲料的添加剂，从而减少反刍动物和马消化***中致病菌的生长。

长久以来檀香木油被认为是促进创面愈合的天然物质。由热带檀香木通过水蒸汽蒸馏得到的精油含有多种单一性能目前仍未知的物质。特别地，哪种成分具备消炎作用仍未知。应当注意由于作为香水原料的广泛使用，天然檀香木油已经成为一种稀少并且非常昂贵的原料。

因此本发明的任务是确定檀香木油的消炎成分，并以这种方式生产加速创面愈合的药物，其特别有益于创面愈合并且刺激细胞增殖以及白细胞介素IL‐1α的表达和分泌。确定该活性成分可以同时为合成这种物质奠定基础，从而保护自然资源并有助于保护自然多样性。

发明内容

本发明涉及含有式(I)衍生物的药物

其中R¹是氢或甲基，用于加速创面愈合。

式(I)衍生物优选具备檀香木气味的香料如(R¹＝甲基)或(R¹＝氢)。两种物质均市售可得并且到目前为止仅用作具备檀香气味的香味物质。

令人惊讶地发现，没有任何一种檀香木油的已知成分在测试条件下表现出消炎或加速创面愈合。反之，这两种合成物质檀香醇和婆罗门檀香，其与檀香木油成分具备相似的结构关系，并且也具备类檀香木的气味，被确认为是特别位于皮肤的嗅觉受体OR2AT4的唯一激动剂，并且也是唯一能够激活该受体的激动剂。在钙成像实验中80至90％的HaCaT‐细胞样品以及原代角质形成细胞被这两种物质重复刺激，钙信号表现出显著的致敏作用，以及每次施用后信号幅度增大。

随着激活受体和引发信号级联放大HaCaT‐细胞增殖和迁移增多。由此表现出这两种物质刺激MAP‐激酶p38和Erk1/2的磷酸化，其参与表皮创面愈合。在体外创面‐划痕‐试验中显示，当用500μM Sandalore或Brahmanol处理细胞，HaCaT‐细胞的划痕封闭快26％，角质形成细胞快34％。

最后该结果确定，通过两种合成的檀香木香味物质提高到了IL‐1α的表达和分泌，并且活化了参与人类角质形成细胞的分化过程的蛋白质激酶Akt。

这一发现更令人惊异在于两种非檀香木油成分的合成物质仅是为了参考目的而进行测试。

由该结果可以毫无疑义地的推断，使用和/或优选通过局部应用于皮肤，可以加快创面愈合，即，通过活化受体OR2AT4以及由此引发的刺激MAP‐激酶磷酸化后的细胞增殖和迁移，和提高的白细胞介素IL‐1α‐分泌。

药物

根据本发明的药物通常局部使用。因此可以是洗剂、霜剂、乳剂、凝胶剂、膏剂、喷雾剂。也可以是用所述制剂浸渍或涂布的相应敷料，如膏药。

活性成分相对于最终药物制剂(活性成分加上药物可用的载体和任选添加剂)的浓度为0.001至约2重量％，优选约0.01至约1重量％并且特别是约0.1至约0.5重量％。

该药物可以含有其他典型助剂和添加剂，如温和的表面活性剂、油体、乳化剂、珠光蜡、粘度调节剂、增稠剂、富脂剂、稳定剂、聚合物、硅氧烷化合物、脂肪、蜡、卵磷脂、磷脂、UV防晒因子、润滑剂、生物活性成分、抗氧化剂、助水溶剂、增溶剂、防腐剂、芳香油、染料等。

表面活性剂

作为表面活性剂的物质可以是阴离子、非离子、阳离子和/或两性或两性离子表面活性剂，其含量通常为约1至70，优选5至50，并且特别是10至30重量％。阴离子表面活性剂的典型实例为肥皂、烷基苯磺酸盐、烷烃磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷基醚磺酸盐、甘油醚磺酸盐、α‐甲酯磺酸盐、磺基脂肪酸、烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、甘油醚硫酸盐、脂肪酸醚硫酸盐、羟基混合醚硫酸盐、单甘油酯(醚)硫酸盐、脂肪酸酰胺(醚)硫酸盐、单‐和二烷基磺基丁二酸盐、单‐和二烷基磺基琥珀酰胺酸盐、磺基甘油三酯、酰胺皂、醚羧酸及其盐、脂肪酸羟乙磺酸盐、脂肪酸肌氨酸盐、脂肪酸牛磺酸盐、N‐酰氨酸，例如酰基乳酸盐、酰基酒石酸盐、酰基谷氨酸盐和酰基天冬氨酸盐、烷基低聚葡糖苷硫酸盐、蛋白质脂肪酸缩合物(特别是小麦基植物产品)和烷基(醚)磷酸盐。如果阴离子表面活性剂含有聚乙二醇醚链，则它们可具有常规的同族分布，但优选具有窄同族分布。非离子表面活性剂的典型实例是脂肪醇聚乙二醇醚、烷基酚聚乙二醇醚、脂肪酸聚乙二醇酯、脂肪酸酰胺聚乙二醇醚、脂肪胺聚乙二醇醚、烷氧基化三甘油酯、混合醚或混合的甲醛缩二甲醇、任选部分氧化的烷基(烯基)寡葡糖苷或葡糖醛酸衍生物、脂肪酸‐N‐烷基葡糖酰胺、蛋白水解产物(尤其是基于小麦的植物产物)、多元醇脂肪酸酯、糖酯、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和胺基氧化物。如果非离子表面活性剂含有聚乙二醇醚链，则它们可具有常规的同族分布，但优选具有窄同族分布。阳离子表面活性剂的典型实例是季铵化合物，如二甲基二硬脂基氯化铵和酯季铵盐，特别是季铵化的脂肪酸三链烷醇胺酯盐。两性或两性离子表面活性剂的典型实例是烷基甜菜碱、烷基酰氨基甜菜碱、氨基丙酸盐、氨基甘氨酸盐、咪唑啉鎓甜菜碱和磺基甜菜碱。上述表面活性剂指的都是已知的化合物。特备适当的温和，即对皮肤特别温和的表面活性剂的典型实例是脂肪醇聚乙二醇醚硫酸盐、单酸甘油酯硫酸盐、单和/或双烷基磺基丁二酸酯、脂肪酸羟乙磺酸盐、脂肪酸肌氨酸盐、脂肪酸牛磺酸盐、脂肪酸谷氨酸盐、α‐烯属磺酸酯、醚羧酸、烷基寡葡聚糖苷、脂肪酸葡糖酰胺、烷基酰氨基甜菜碱、两性缩醛(amphoacetals)和/或蛋白质脂肪酸缩合物，其中蛋白质脂肪酸缩合物优选基于小麦蛋白。

油体

油体是，例如，基于含有6至18个，优选8至10个碳原子的脂肪醇的Guerbet醇，直链C₆‐C₂₂‐脂肪酸与直链或支链C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯或支链C₆‐C₁₃‐羧酸与直链或支链C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯，如例如肉豆蔻酸十四烷酯、棕榈酸十四烷酯、硬脂酸十四烷酯、异硬脂酸十四烷酯、油酸十四烷酯、山嵛酸十四烷酯、芥酸十四烷酯、肉豆蔻酸十六烷酯、棕榈酸十六烷酯、硬脂酸十六烷酯、异硬脂酸十六烷酯、油酸十六烷酯、山嵛酸十六烷酯、芥酸十六烷酯、肉豆蔻酸十八烷酯、棕榈酸十八烷酯、硬脂酸十八烷酯、异硬脂酸十八烷酯、油酸十八烷酯、山嵛酸十八烷酯、芥酸十八烷酯、肉豆蔻酸异十八烷酯、棕榈酸异十八烷酯、硬脂酸异十八烷酯、异硬脂酸异十八烷酯、油酸异十八烷酯、山嵛酸异十八烷酯、油酸异十八烷酯、肉豆蔻酸油醇酯、棕榈酸油醇酯、硬脂酸油醇酯、异硬脂酸油醇酯、油酸油醇酯、山嵛酸油醇酯、芥酸油醇酯、肉豆蔻酸二十二烷酯、棕榈酸二十二烷酯、硬脂酸二十二烷酯、异硬脂酸二十二烷酯、油酸二十二烷酯、山嵛酸二十二烷酯、芥酸二十二烷酯、肉豆蔻酸芥醇酯、棕榈酸芥醇酯、硬脂酸芥醇酯、异硬脂酸芥醇酯、油酸芥醇酯、山嵛酸芥醇酯和芥酸芥醇酯。同样适当的是直链C₆‐C₂₂‐脂肪酸与支链醇，特别是2‐乙基己醇的酯、C₁₈‐C₃₈‐烷基羟基羧酸与直链或支链C₆‐C₂₂‐脂肪醇的酯，特别是苹果酸二辛酯、直链和/或支链脂肪酸与多元醇(如，例如丙二醇、二聚二元醇(dimerdiol)或三聚三元醇(trimertriol))和/或Guerbet醇的酯、基于C₆‐C₁₀‐脂肪酸的甘油三酯、基于C₆‐C₁₈‐脂肪酸的液态单‐/二‐/三酸甘油酯混合物、C₆‐C₂₂‐脂肪醇和/或Guerbet醇与芳族羧酸，特别是苯甲酸的酯、C₂‐C₁₂‐二羧酸与具有1至22个碳原子的直链或支链醇或者具有2至10个碳原子和2至6个羟基的多元醇的酯、植物油、支链伯醇、取代环己烷、直链和支链C₆‐C₂₂‐脂肪醇的碳酸酯，如例如碳酸二辛酯( CC)、基于具有6至18个优选8至10个碳原子的脂肪醇的Guerbet碳酸酯、苯甲酸与直链和/或支链C₆‐C₂₂‐醇的酯(例如 TN)、每个烷基具有6至22个碳原子的直链或支链、对称或非对称的二烷基醚，如例如二辛基醚( OE)、环氧化脂肪酸酯与多元醇的开环产物、硅油(环聚二甲基硅氧烷、硅酮甲基硅油类，等)和/或脂肪烃或环烷烃，如例如角鲨烷、角鲨烯或二烷基环己烷。

乳化剂

乳化剂可以是例如选自至少下组之一的非离子表面活性剂

·2至30摩尔环氧乙烷和/或0至5摩尔环氧丙烷与直链C8‐22脂肪醇、与C12‐22脂肪酸、与烷基中具有8‐15个碳原子的烷基苯酚以及烷基中具有8‐22个碳原子的烷基胺的加成产物；

·在烷(烯)基中具有8至22个碳原子的烷基和/或烯基低聚苷及其乙氧基化类似物；

·1至15摩尔环氧乙烷与蓖麻油和/或氢化蓖麻油的加成产物；

·15至60摩尔环氧乙烷与蓖麻油和/或氢化蓖麻油的加成产物；

·甘油和/或脱水山梨糖醇与含有12至22个碳原子的不饱和、直链或饱和、支化脂肪酸和/或含有3至18个碳原子的羟基羧酸的偏酯及其与1至30mol环氧乙烷的加成产物；

·聚甘油(平均自缩合度为2‐8)、聚乙二醇(分子量为400‐5000)、三羟甲基丙烷、季戊四醇、糖醇(如山梨糖醇)、烷基葡糖苷(如甲基葡糖苷、丁基葡糖苷、月桂基葡糖苷)和聚葡糖苷(如纤维素)与含有12至22个碳原子的饱和和/或不饱和、直链或支化脂肪酸和/或含有3‐18个碳原子的羟基羧酸的偏酯及其与1至30mol环氧乙烷的加成产物；

·季戊四醇、脂肪酸、柠檬酸与脂肪醇的混合酯和/或含有6至22个碳原子的脂肪酸、甲基葡萄糖与多元醇，优选甘油或聚甘油的混合酯；

·磷酸单烷基酯、磷酸二烷基酯和磷酸三烷基酯和磷酸单PEG烷基酯、磷酸二PEG烷基酯、磷酸三PEG烷基酯及其盐；

·羊毛蜡醇；

·聚硅氧烷‐聚烷基‐聚醚共聚物和相应的衍生物；

·嵌段共聚物，如聚乙二醇30二聚羟基硬脂酸酯；

·聚合物乳化剂，如获自Goodrich的Pemulen型(TR‐1，TR‐2)或Cognis的SP；

·聚亚烷基二醇；和

·碳酸甘油酯。

以下详细给出特别适当的乳化剂：

烷氧基化合物。环氧乙烷和/或环氧丙烷在脂肪醇、脂肪酸、烷基苯酚或蓖麻油上的加成产物是市售可得的产品。在这里是指同系混合物，其平均烷氧基化度相当于进行加成反应的环氧乙烷和/或环氧丙烷和基质的用量比例。环氧乙烷与甘油加成产物的C_12/18脂肪酸单酯和二酯已知作为回脂剂用于化妆制剂。

烷基‐和/或烯基低聚苷。烷基‐和/或烯基低聚苷的生产和使用在现有技术中已知。尤其通过使用葡萄糖或具有8至18个碳原子的伯醇的低聚糖进行生产。对于糖苷基团，适合的不仅可以是单糖苷，其中环状糖基与脂肪醇通过糖苷键连接，而且也可以是低聚度优选为约8的低聚糖苷。低聚度是统计平均值，是对于这类技术产物常规的同系物分布的基础。

偏甘油酯。适当的偏甘油酯的典型实例是羟基硬脂酸单甘油酯、羟基硬脂酸二甘油酯、异硬脂酸单甘油酯、异硬脂酸二甘油酯、油酸单甘油酯、油酸二甘油酯、蓖麻酸单甘油酯、蓖麻酸二甘油酯、亚油酸单甘油酯、亚油酸二甘油酯、亚油酸单甘油酯、亚油酸二甘油酯、芥酸单甘油酯、芥酸二甘油酯、酒石酸单甘油酯、酒石酸二甘油酯、柠檬酸单甘油酯、柠檬酸二甘油酯、苹果酸单甘油酯、苹果酸二甘油酯及其仍含有少量源自生产过程的甘油三酯的技术混合物。1至30且优选5至10摩尔环氧乙烷与上述偏甘油酯的加成产物同样适当。

脱水山梨醇酯。脱水山梨醇酯是脱水山梨醇单异硬脂酸酯、脱水山梨醇倍半异硬脂酸酯、脱水山梨醇二异硬脂酸酯、脱水山梨醇三异硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇倍半油酸酯、脱水山梨醇二油酸酯、脱水山梨醇三油酸酯、脱水山梨醇单芥酸酯、脱水山梨醇倍半芥酸酯、脱水山梨醇二芥酸酯、脱水山梨醇三芥酸酯、脱水山梨醇单蓖麻酸酯、脱水山梨醇倍半蓖麻酸酯、脱水山梨醇二蓖麻酸酯、脱水山梨醇三蓖麻酸酯、脱水山梨醇单羟基硬脂酸酯、脱水山梨醇倍半羟基硬脂酸酯、脱水山梨醇二羟基硬脂酸酯、脱水山梨醇三羟基硬脂酸酯、脱水山梨醇单酒石酸酯、脱水山梨醇倍半酒石酸酯、脱水山梨醇二酒石酸酯、脱水山梨醇三酒石酸酯、脱水山梨醇单柠檬酸酯、脱水山梨醇倍半柠檬酸酯、脱水山梨醇二柠檬酸酯、脱水山梨醇三柠檬酸酯、脱水山梨醇单马来酸酯、脱水山梨醇倍半马来酸酯、脱水山梨醇二马来酸酯、脱水山梨醇三马来酸酯及其技术混合物。1至30且优选5至10摩尔环氧乙烷与上述脱水山梨醇酯的加成产物同样适当。

聚甘油酯。适当的聚甘油酯的典型实例是聚甘油‐2二聚羟基硬脂酸酯(PGPH)、聚甘油‐3‐二异硬脂酸酯( TGI)、聚甘油‐4异硬脂酸酯( GI 34)、聚甘油‐3油酸酯、聚甘油‐3二异硬脂酸酯( PDI)、聚甘油‐3甲基葡糖二硬脂酸酯(Tego450)、聚甘油‐3蜂蜡(Cera)、聚甘油‐4癸酸酯(聚甘油癸酸酯T2010/90)、聚甘油‐3鲸蜡基醚( NL)、聚甘油‐3二硬脂酸酯( GS 32)和聚甘油聚蓖麻酸酯( WOL 1403)、聚甘油二异硬脂酸酯(polyglyceryl dimerateisostearate)及其混合物。其它适当的多元醇酯的实例是任选与1至30摩尔环氧乙烷反应的月桂酸、椰油酸、牛油酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、山嵛酸等与三羟甲基丙烷或季戊四醇的单酯、二酯和三酯。

阴离子乳化剂。典型的阴离子乳化剂是具有12至22个碳原子的脂肪族脂肪酸，如例如棕榈酸、硬脂酸或山嵛酸，以及具有12至22个碳原子的二羧酸，如例如壬二酸或癸二酸。

两性和阳离子乳化剂。此外两性离子表面活性剂可以用作乳化剂。两性离子表面活性剂是分子中含有至少一个季铵基团和至少一个羧酸酯基团和一个磺酸酯基团的表面活性化合物。特别适当的两性离子表面活性剂为所谓的甜菜碱，如N‐烷基‐N,N‐二甲基甘氨酸铵，例如椰油烷基二甲基甘氨酸铵、N‐酰胺基丙基‐N,N‐二甲基甘氨酸铵，例如椰油酰胺基丙基二甲基甘氨酸铵、和烷基或酰基中具有8‐18个碳原子的2‐烷基‐3‐羧甲基‐3‐羟乙基咪唑啉和椰油酰胺基乙基羟乙基羧甲基甘氨酸盐。特别优选已知CTFA名为椰油酰胺丙基甜菜碱的脂肪酸酰胺衍生物。同样适当的乳化剂为两性表面活性剂。两性表面活性剂是除了C_8/18烷基或酰基外，分子中还含有至少一个游离氨基和至少一个‐COOH或‐SO₃H基团且能形成内盐的表面活性化合物。适当的两性表面活性剂的实例为烷基中具有约8‐18个碳原子的N‐烷基甘氨酸、N‐烷基丙酸、N‐烷基氨基丁酸、N‐烷基亚氨基二丙酸、N‐羟乙基‐N‐烷基酰胺基丙基甘氨酸、N‐烷基牛磺酸、N‐烷基肌氨酸、2‐烷基氨基丙酸和烷基氨基乙酸。特别优选的两性表面活性剂为N‐椰油烷基氨基丙酸酯、椰油酰胺基乙基氨基丙酸酯和C_12/18酰基肌氨酸。最后也可以使用阳离子表面活性剂作为乳化剂，如季铵盐类，尤其优选甲基季铵化的二脂肪酸三乙醇胺酯‐盐。

脂肪和蜡

脂肪的典型实例是甘油酯，即固体或液体的植物或动物产品，其主要由高级脂肪酸的混合甘油酯构成，作为蜡的是天然蜡，如例如小烛树蜡、巴西棕榈蜡、日本蜡、芦华草腊(Espartograswachs)、软木蜡、小冠椰子腊(Guarumawachs)、米糠油蜡、糖甘蔗蜡、小冠巴西棕蜡(Ouricurywachs)、褐煤蜡、蜂蜡、紫胶蜡(Schellackwachs)、鲸蜡、羊毛脂(Wollwachs)、尾脂脂肪(Bürzelfett)、(纯)地蜡、地蜡(石蜡)、凡士林、石油蜡、微蜡；化学改性的蜡类(硬蜡类)如例如褐煤酯蜡(Montanesterwachse)、德国沙索集团石油蜡(Sasolwachse)、氢化霍霍巴蜡(Jojobawachse)以及合成蜡类如例如聚亚烷基蜡类和聚乙二醇蜡类。除了脂肪，作为添加剂的还可以是类脂肪物质，如卵磷脂和磷脂。卵磷脂是指由脂肪酸、甘油、磷酸和胆碱通过酯化形成的甘油磷脂。因此在专业领域卵磷脂通常被称为磷脂酰胆碱(PC)。天然卵磷脂的实例为脑磷脂，其也被称为磷脂酸并且是1,2‐二酰基‐sn‐甘油基‐3‐磷酸的衍生物。与之相反磷脂是指磷酸与甘油的常规单酯和优选二酯(甘油磷酸酯)，其通常属于脂肪。此外还可以包括鞘氨醇和鞘类脂物。

珠光蜡

珠光蜡是例如：烷二醇酯，尤其是乙二醇二硬脂酸酯；脂肪酸烷醇酰胺，尤其是椰油脂肪酸二乙醇酰胺；偏甘油酯，尤其是硬脂酸单甘油酯；多元、任选羟基取代的羧酸与具有6‐22个碳原子的脂肪醇的酯，尤其是酒石酸的长链酯；具有总计至少24个碳原子的脂肪物质，如例如脂肪醇、脂肪酮、脂肪醛、脂肪醚和脂肪碳酸酯，尤其是月桂酮和二硬脂醚；脂肪酸如硬脂酸、羟基硬脂酸或山嵛酸、具有12‐22个碳原子的环氧烯烃与具有12‐22个碳原子的脂肪醇和/或具有2‐15个碳原子和2‐10个羟基的多元醇的开环产物、及其混合物。

清凉剂

清凉剂是在皮肤上产生清凉感受的化合物。一般涉及薄荷醇化合物，除了本体薄荷醇自身，选自例如组包括薄荷醇甲醚、薄荷酮甘油缩醛(FEMA GRAS¹3807)、薄荷酮甘油缩酮(FEMA GRAS 3808)、乳酸薄荷酯(FEMA GRAS 3748)、薄荷醇乙二醇碳酸酯(FEMA GRAS 3805)、薄荷醇丙二醇碳酸酯(FEMA GRAS 3806)、N‐乙基草氨酸薄荷酯、琥珀酸单薄荷酯(FEMA GRAS 3810)、谷氨酸单薄荷酯(FEMA GRAS 4006)、薄荷氧基‐1,2‐丙二醇(FEMA GRAS 3784)、薄荷氧基‐2‐甲基‐1,2‐丙二醇(FEMA GRAS 3849)以及薄荷烷碳酸酯和酰胺WS‐3、WS‐4、WS‐5、WS‐12、WS‐14和WS‐30及其混合物。

这类物质的第一种重要代表是琥珀酸单薄荷酯(FEMA GRAS 3810)。不仅琥珀酸酯，而且类似物谷氨酸单薄荷酯(FEMA GRAS 4006)也是基于二元或多元羧酸的单薄荷酯的重要代表。

这类物质的使用实例参见例如文献WO 2003 043431(Unilever)或EP 1332772 A1(IFF)。

本发明优选的下一组重要薄荷醇化合物包括薄荷醇和多元醇，如例如乙二醇、甘油或碳水化合物的碳酸酯，如例如薄荷醇乙二醇碳酸酯(FEMA GRAS MGC)、薄荷醇丙二醇碳酸酯(FEMA GRAS MPC)、2‐甲基‐1,2‐丙二醇碳酸薄荷醇酯(FEMA GRAS 3849)或相应的糖衍生物。同样优选薄荷醇化合物是乳酸薄荷酯(FEMAGRAS ML)并且特别是薄荷酮甘油缩醛(FEMA GRAS 3807)、或薄荷酮甘油缩酮(FEMA GRAS 3808)，市场上以名称 MGA出售。这类物质中特别有利是薄荷酮甘油缩醛/缩酮和乳酸薄荷酯、薄荷醇乙二醇碳酸酯或薄荷醇丙二醇碳酸酯，被申请人以名称 MGA、 ML、 MGC和 MPC市售。

在上世纪七十年代第一次发现薄荷醇化合物，其在3位有一个C‐C‐键并且同样有一系列可以使用的代表物。这类物质通常被称为WS‐类。本体是薄荷醇衍生物，其中羟基被羧基取代(WS‐1)。由该结构产生所有其他的WS‐类，如例如优选的WS‐3、WS‐4、WS‐5、WS‐12、WS‐14和WS‐30。

粘度调节剂和增稠剂

作为粘度调节剂可以首先考虑具有12至22并且优选16至18个碳原子的脂肪醇或羟基脂肪醇以及偏甘油酯、脂肪酸或羟基脂肪酸。优选的是这些物质与烷基低聚苷和/或相同链长的脂肪酸‐N‐甲基糖胺和/或聚甘油聚‐12‐羟基硬脂酸酯的结合。适当的增稠剂是如Aerosil‐类(亲水性二氧化硅)、多糖，更特别是黄原胶、瓜尔胶、琼脂、藻酸盐和纤基乙酸钠(Tylosen)、羧甲基纤维素和羟乙基和羟丙基纤维素、以及脂肪酸的高分子量聚乙二醇单酯和二酯、聚丙烯酸酯(例如Goodrich的和Pemulen‐类；Sigma的Kelco的Keltrol‐类；Seppic的Sepigel‐类；Allied Colloids的Salcare‐类)、聚丙烯酰胺、聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有效的是膨润土，如例如凝胶VS‐5PC(Rheox)，其涉及环戊硅氧烷、二硬脂基二甲基胺锂皂石和碳酸丙烯酯的混合物。

其他可以考虑的是表面活性剂如，例如乙氧基化脂肪酸甘油酯、脂肪酸与多元醇如季戊四醇或三羟甲基丙烷的酯、窄同系物分布的脂肪醇乙氧基化物或烷基低聚苷以及电解质如氯化钠和氯化铵。

富脂剂和稳定剂

作为富脂剂可以使用物质如例如羊毛脂和卵磷脂以及聚乙氧基化或酰基化羊毛脂和卵磷脂衍生物、多元醇脂肪酸酯、单甘油酯和脂肪酸烷醇酰胺，其中脂肪酸烷醇酰胺也可用作泡沫稳定剂。作为稳定剂可以使用脂肪酸的金属盐，如例如硬脂酸或蓖麻酸镁、铝和/或锌。

聚合物

适当的阳离子聚合物是例如，阳离子纤维素衍生物，例如以商品名Polymer JR由Amerchol得到的季铵化羟乙基纤维素、阳离子淀粉、二烯丙基铵盐和丙烯酰胺的共聚物、季铵化乙烯基吡咯烷酮/乙烯基咪唑聚合物如，例如(BASF)、聚乙二醇和胺的缩合产物、季铵化胶原多肽如，例如月桂基二甲基铵羟丙基胺水解胶原( L,Grünau)、季铵化小麦多肽、聚乙烯亚胺、阳离子硅氧烷聚合物如，例如氨基二甲聚硅氧烷(Amodimethicone)、己二酸和二甲基氨基羟丙基二亚乙基三胺的共聚物(Sandoz)、丙烯酸与二甲基二烯丙基氯化铵的共聚物(550,Chemviron)、聚氨基聚酰胺及其交联水溶性聚合物、阳离子角质素衍生物如，例如任选以微晶分布的季铵化壳聚糖、

二卤代烷基如二溴丁烷与双二烷基胺的缩合产物，例如双‐二甲基氨基‐1,3‐丙烷、阳离子瓜尔胶如，例如Celanese公司的 CBS、 C‐17、 C‐16、季铵盐聚合物如，例如Miranol公司的 A‐15、 AD‐1、 AZ‐1以及各种聚季铵盐类。

阴离子、两性离子、两性和非离子聚合物是例如，乙酸乙烯酯/巴豆酸共聚物、乙烯基吡咯烷酮/丙烯酸乙烯酯共聚物、乙酸乙烯酯/马来酸丁酯/丙烯酸异冰片酯共聚物、甲基乙烯基醚/马来酸酐混合共聚物及其酯、未交联的和与多元醇交联的聚丙烯酸、丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵/丙烯酸酯共聚物、

辛基丙烯酰胺/甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯/甲基丙烯酸2‐羟丙酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮/甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯/乙烯基己内酰胺三元共聚物和任选衍生的纤维素醚和硅氧烷。

硅氧烷化合物

适当的硅氧烷化合物是，例如二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、环硅氧烷以及氨基、脂肪酸、醇、聚醚、环氧、氟、糖苷和/或烷基改性的硅氧烷化合物，在室温下它们可以是液态以及呈树脂态。其它适当的是有机硅树脂，其为平均链长为200至300个二甲基硅氧烷单元的二甲基硅油与氢化硅酸盐的混合物。

UV‐防晒因子

UV‐防晒因子是指例如在室温下以液态或晶体存在的有机物质(光保护过滤物质)，其吸收紫外光线并将吸收的能量以长波辐射的形式，例如热，再次放出。通常UV‐防晒因子的用量为0.1至5优选0.2至1重量％。UVB‐过滤物质可以是油溶或水溶的。作为油溶物质可以是，例如：

·3‐亚苄基樟脑或3‐亚苄基降樟脑及其衍生物，例如3‐(4‐甲基亚苄基)‐樟脑；

·4‐氨基苯甲酸衍生物，优选4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐2‐乙基己酯、4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐2‐辛酯和4‐(二甲基氨基)苯甲酸‐戊酯。

·肉桂酸酯，优选4‐甲氧基肉桂酸2‐乙基己酯、4‐甲氧基肉桂酸丙酯、4‐甲氧基肉桂酸异戊酯、2‐氰基‐3,3‐苯基肉桂酸‐2‐乙基己酯(Octocrylene)；

·水杨酸酯，优选水杨酸2‐乙基己酯、水杨酸‐4‐异丙基苄酯、水杨酸高薄荷酯；

·苯甲酮衍生物，优选2‐羟基‐4‐甲氧基苯甲酮、2‐羟基‐4‐甲氧基‐4‘‐甲基苯甲酮、2,2‘‐二羟基‐4‐甲氧基苯甲酮；

·亚苄丙二酸酯，优选4‐甲氧基亚苄丙二酸二‐2‐乙基己酯；

·三嗪衍生物，如例如2,4,6‐三苯胺基‐(对‐羰基‐2‘‐乙基‐1‘‐己氧基)‐1,3,5‐三嗪和辛基三嗪酮或二辛基丁酰胺三嗪酮( HEB)

·丙‐1,3‐二酮如例如1‐(4‐叔丁基苯基)‐3‐(4‘‐甲氧基苯基)丙‐1,3‐二酮；

·挂式三环(5.2.1.0)癸烷衍生物。

作为水溶性物质可以考虑：

·2‐苯基苯并咪唑‐5‐磺酸及其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、烷基铵盐、烷醇基铵盐和葡糖铵盐；

·1H‐苯并咪唑‐4,6‐二磺酸，2,2‐(1,4‐亚苯基)双，二钠盐(Neo AP)；

·苯甲酮的磺酸衍生物，优选2‐羟基‐4‐甲氧基苯甲酮‐5‐磺酸及其盐

·3‐亚苄基樟脑的磺酸衍生物，如例如4‐(2‐氧‐3‐冰片烯基甲基)苯甲酰基磺酸和2‐甲基‐5‐(2‐氧‐3‐冰片烯基)磺酸及其盐。

作为典型的UVA过滤物质尤其考虑苯甲酰基甲烷，如例如1‐(4‘‐叔丁基苯基)‐3‐(4‘‐甲氧基苯基)丙‐1,3‐二酮、4‐叔丁基苯基‐4‘‐甲氧基二苯甲酰基甲烷(1789)、2‐(4‐二乙基氨基‐2‐羟基苯甲酰基)‐苯甲酸己酯( A Plus)、1‐苯基‐3‐(4‘‐异丙基苯基)‐丙‐1,3‐二酮以及烯胺化合物。UVA过滤物质和UVB过滤物质可以单独也可以混合使用。特别有利的是由苯甲酰基甲烷衍生物，例如4‐叔丁基苯基‐4‘‐甲氧基二苯甲酰基甲烷(1789)和2‐氰基‐3,3‐苯基肉桂酸‐2‐乙基己酯(Octocrylene)与肉桂酸酯，优选4‐甲氧基肉桂酸‐2‐乙基己酯和/或4‐甲氧基肉桂酸丙酯和/或4‐甲氧基肉桂酸异戊酯结合的结合物。有利的是这类结合物与水溶性过滤物质如例如2‐苯基苯并咪唑‐5‐磺酸及其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、烷基铵盐、烷醇基铵盐和葡糖铵盐结合。

除了上述溶解性物质，为实现目的也可以考虑不溶性的光保护颜料，即精细分散的金属氧化物和盐。适当的金属氧化物实例特别是氧化锌和二氧化钛，以及铁、锆、硅、锰、铝和铈的氧化物级其混合物。可使用的盐为硅酸盐(滑石)、硫酸钡或硬脂酸锌。氧化物和盐以颜料的形式用于皮肤护理和护肤乳液，以及修饰性化妆品。颗粒应具有小于100nm，优选5‐50nm，特别是15‐30nm的平均直径。它们可具有球形，但是也可使用具有椭圆形或以某种其它方法偏离球面形状的那些颗粒。

颜料也可以以表面处理的形式，即亲水化或疏水化存在。典型实例为涂覆的二氧化钛，例如二氧化钛T805(Degussa)或 T‐2000、 T、 T‐EC0、 T‐S、 T‐Aqua、 T‐45D(所有Merck)、Uvinul TiO₂(BASF)。疏水性涂层主要为聚硅氧烷，具体而言，三烷氧基辛基硅烷或二甲基硅油(Simethicone)。在防晒组合物中，优选使用所谓的微细颜料或纳米颜料。优选使用微粉化氧化锌，如或Z-COTE

湿润剂

湿润剂用于进一步优化组合物的感官性能并且调节皮肤湿度。同时本发明组合物的温度稳定性，特别是在乳液的情况下，提高。湿润剂的含量通常为0.1至15重量％，优选1至10重量％，并且特别是5至10重量％。

根据本发明适当的是氨基酸、吡咯烷羧酸、乳酸及其盐、乳糖醇、脲和脲衍生物，脲酸，葡糖胺，肌氨酸酐，胶原质水解产物，壳聚糖或壳聚糖盐/衍生物，特别是多元醇和多元醇衍生物(如丙三醇、二丙三醇、三丙三醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、赤藓醇、1,2,6‐己三醇、聚乙二醇如PEG‐4、PEG‐6、PEG‐7、PEG‐8、PEG‐9、PEG‐10、PEG‐12、PEG‐14、PEG‐16、PEG‐18、PEG‐20)、糖和糖衍生物(如果糖、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖醇、甘露醇、肌醇、山梨糖醇，山梨糖醇硅烷二醇，蔗糖，海藻糖，木糖，木糖醇，葡糖醛酸及其盐)、乙氧基化山梨醇(Sorbeth‐6、Sorbeth‐20、Sorbeth‐30、Sorbeth‐40)、蜂蜜和氢化蜂蜜、氢化淀粉水解物以及氢化小麦蛋白混合物和PEG‐20‐乙酸酯共聚物。根据本发明优选适当的湿润剂是丙三醇、二丙三醇、三丙三醇和丁二醇。

生物活性物质和抗氧化剂

生物活性物质是例如生育酚、生育酚乙酸酯、生育酚棕榈酸酯、抗坏血酸、(脱氧)核糖核酸及其碎裂产物、β‐葡聚糖、视黄醇、红没药醇、尿囊素、植烷三醇、泛醇、AHA酸、氨基酸、神经酰胺、假神经酰胺、香精油、植物提取物如、桃李提取物、班马纳坚果提取物和维生素络合物。

抗氧化剂打断UV辐射透过皮肤时触发的光化学反应链。其典型实例为氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其衍生物，咪唑(例如尿刊宁酸)及其衍生物，肽，例如D,L‐肌肽、D‐肌肽、L‐肌肽及其衍生物(例如鹅肌肽)，类胡萝卜素、胡萝卜素(例如α‐胡萝卜素、β‐胡萝卜素、番茄红素)及其衍生物，绿原酸及其衍生物，硫辛酸及其衍生物(例如二氢硫辛酸)，金硫葡糖，丙硫氧嘧啶和其它硫醇(例如硫氧还蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺及其糖基、N‐乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕榈酰基、油基、γ‐亚油基、胆甾烯基和甘油基酯)及其盐，硫代二丙酸二月桂酯、硫代二丙酸双十八酯、硫代二丙酸及其衍生物(酯类、醚类、肽类、脂类、核苷酸类、核苷类和盐)以及非常低的耐药剂量(例如pmol至mmol/kg)的亚砜亚胺化合物(例如丁硫氨酸亚砜亚胺、同型半胱氨酸亚砜亚胺、丁硫氨酸砜、五‐、六‐和七‐硫氨酸亚砜亚胺)、以及(金属)螯合剂类(例如，α‐羟基脂肪酸类、棕榈酸、植酸、乳铁蛋白)、α‐羟基酸类(例如柠檬酸、乳酸、苹果酸)、腐殖酸、胆汁酸、胆汁提取物、胆红素、胆绿素、EDTA、EGTA及其衍生物、不饱和脂肪酸及其衍生物(例如γ‐亚麻酸、亚油酸、油酸)、叶酸及其衍生物、泛醌和泛醇及其衍生物、维生素C及其衍生物(例如抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸乙酸酯)、生育酚及衍生物(例如维生素E乙酸酯)、维生素A及衍生物(维生素A棕榈酸酯)以及安息香树脂的苯甲酸松酯、芸香十烯酸及其衍生物、α‐糖基芸香苷、阿魏酸、亚糠基葡糖醇、肌肽、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、去甲二氢化愈创木酸()、去甲二氢愈创木酸木脂酸()、三羟基丁酰苯、尿酸及其衍生物，甘露糖及其衍生物，超氧化物歧化酶，锌及其衍生物(例如ZnO,ZnSO₄)、硒及其衍生物(例如硒代蛋氨酸)、芪及其衍生物(例如氧化芪、反氧化芪)和根据本发明合适的这些所述活性成分的衍生物(例如盐、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂类)。

助水溶物

此外助水溶物例如乙醇、异丙醇或多元醇类可以用于改善流动性；这些物质大部分相当于上述载体。适合的多元醇类优选包含2‐15个碳原子和至少2个羟基。多元醇类可以包含其他官能团，尤其是氨基或可以被氮修饰。典型的实例是:

·甘油；

·亚烷基二醇例如乙二醇、二乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇和具有100‐1000道尔顿平均分子量的聚乙二醇类；

·具有1.5‐10自缩合度的专用(technische)寡聚甘油混合物例如具有40‐50％重量二甘油含量的专用二甘油混合物；

·羟甲基化合物，特别是例如三羟甲基乙烷、三羟甲基丙烷、三羟甲基丁烷、季戊四醇和二季戊四醇；

·低级烷基糖苷类，特别是在烷基上包含1‐8个碳原子的那些，例如甲基和丁基糖苷；

·包含5‐12个碳原子的糖醇类例如山梨醇或甘露糖醇；

·包含5‐12个碳原子的糖类例如葡萄糖或蔗糖；

·氨基糖类例如葡萄糖胺；

·二醇胺类例如二乙醇胺或2‐氨基‐1,3‐丙二醇。

防腐剂

适当的防腐剂是例如苯氧乙醇、甲醛溶液、对羟苯甲酸类、戊二醇或山梨酸以及已知的名称为的银化合物和Kosmetikverordnung附录6中A部分和B部分中列举的其他类型的化合物。

芳香油和芳香剂

适当的芳香油是天然芳香剂与合成芳香剂的混合物。天然芳香剂是花(百合、薰衣草、玫瑰、茉莉、橙花、依兰)、茎和叶(天竺葵、广藿香、苦橙)、水果(茴香、胡荽、香菜、杜松)、果皮(佛手柑、柠檬、橙)、根(肉豆蔻、当归、芹菜、小豆蔻、木香、虹膜、菖蒲)、木材(松木、檀香、愈创木、雪松木、花梨木)、草本植物和禾本植物(龙蒿、柠檬草、鼠尾草、百里香)、松针和树枝(云杉、冷杉、松树、矮松)、树脂和香脂(格蓬、榄香脂、安息香、没药、乳香、红没药)的提取物。还可使用动物原料，例如麝猫香和海狸香。典型的合成芳香剂化合物是酯、醚、醛、酮、醇和烃类产物。酯类芳香剂化合物实例是例如乙酸苄酯，异丁酸苯氧基乙酯、环己基乙酸对叔丁酯、乙酸芳樟酯、乙酸二甲基苄基原酯(dimethyl benzyl carbinyl acetate)、乙酸苯乙酯、苯甲酸芳樟酯、甲酸苄酯、苯基甘氨酸乙基甲酯、环己基丙酸烯丙酯、丙酸苏合香酯和水杨酸苄酯。醚类包括，例如苄基乙基醚；醛类包括，例如含有8至18个碳原子的直链烷醛、柠檬醛、香茅醛、香茅基氧基乙醛、仙客来醛、羟基香茅醛、铃兰醛和波洁红醛；酮类是例如紫罗兰酮、α‐异甲基紫罗酮和甲基柏木酮；醇类是例如茴香脑、香茅醇、丁香酚、异丁香酚、香叶醇、芳樟醇、苯乙醇和松油醇；烃类主要包括萜烯类和香脂类。然而，优选使用不同芳香剂化合物的混合物，它们一起产生令人愉快的香味。其它适当的芳香油为大多用作芳香成分的挥发性较低的精油，实例是鼠尾草油、甘菊油、丁香油、蜂花油、薄荷油、肉桂叶油、莱姆花油、杜松子油、香根草油、乳香油、白松香油、岩蔷薇油和熏衣草油。以下为单独或以混合形式优选使用的物质：佛手柑油、二氢月桂烯醇、铃兰醛、新铃兰醛、香茅醇、苯乙醇、α‐己基肉桂醛、香叶醇、苄丙酮、仙客来醛、芳樟醇、乙氧基甲氧基环十一烷、龙涎呋喃、吲哚、二氢茉莉酮酸甲酯(Hedione)、Sandelice、柑橘类精油、柑橘油、橙油、乙醇酸烯丙基戊酯、Cyclovertal、醒目熏衣草油、鼠尾草油、大马酮、波旁香叶油、水杨酸环己酯、VertofixCoeur、Iso‐E‐Super、Fixolide NP、Evernyl、Iraldein gamma、苯乙酸、乙酸香叶酯、乙酸苄酯、玫瑰醚、Romilllat、2‐乙基‐己酸乙酯(Irotyl)和2‐叔丁基环己基乙基碳酸酯(Floramat)。

适合的芳香物质是例如辣薄荷油、荷兰薄荷油、茴香油、日本八角茴香油、藏茴香油、桉叶油、小茴香油、柠檬油、冬青油、丁香油、薄荷醇等。

染料

适合的染料是例如德国研究学会染料协会(Farbstoff‐kommission derDeutschen Forschungsgemeinschaft)的公开物“Kosmetische”，Verlag Chemie，Weinheim，1984，页81至106中列举的适于并批准用于化妆品的物质中的任何一种。实例包括胭脂红A(C.I.16255)、专利蓝V(C.I.42051)、靛蓝(C.I.73015)、叶绿酸(C.I.75810)、喹啉黄(C.I.47005)、二氧化钛(C.I.77891)、阴丹士林蓝RS(C.I.69800)和茜草红(C.I.58000)。鲁米诺(Luminol)也可用作荧光染料。基于总混合物，这些染料通常的使用浓度在0.001‐0.1重量％。

助剂和添加剂的总量为1至50，优选5至40总量％，基于制剂计。制剂的制备可以通过常用的冷或热步骤进行；优选根据相转化温度方法进行。

筛选方法

本发明的另一个主题涉及一种确认活性成分的方法，其有利于或加速创面愈合，其中

(a)提供一种角质形成细胞培养物，其含有嗅觉受体OR2AT4，

(b)向该培养物加入待测试的活性成分，以及

(c)确定细胞内钙浓度的变化。

当受体被活性成分活化并且在细胞内，优选HaCaT‐细胞内有增多的钙分泌，则该活性成分可能有利于甚至加速创面愈合。尤其是如果每次施用活性成分与前一次相比都能提高钙浓度幅度，则是这种情况。

实施例

OR2AT4在异源表达***中的表征

为了明确受体在组织中的功能，了解配体非常重要，从而保证受体在原生***中的活化能力。到目前为止大部分OR仍未去孤儿化。因此首先在异源表达***更准确的表征在人类角质形成细胞中确定的OR2AT4并确定受体域。

OR2AT4在Hana3A‐细胞中的异源表达

使用稳定表达内源性嗅觉传导因数的Hana3A‐细胞作为异源表达***，其有针对地协助OR嵌入细胞膜并改善其活性。此外，将视紫质的(Rho‐tag)20位第一N‐末端氨基酸加至OR编码序列的N端之前，也用于协助异源表达。

为了检测OR2AT4在Hana3A‐细胞中的异源表达，通过磷酸钙方法用受体质粒(pcDNA3‐OR2AT4)转染这些细胞48小时并用OR2AT4‐特异性抗体(α‐OR2AT4‐Ak)和视紫质‐特异性抗体(α‐Rho‐AK)进行免疫细胞化学染色。这两种抗体清晰可见的共染色使其可以显示α‐OR2AT4‐Ak特定结合至受体，并使受体能够在Hana3A细胞中异源表达。添加OR编码序列的N‐端同样可以协助异源表达。为了检测OR2AT4在Hana3A细胞中的异源表达，通过磷酸钙方法用受体质粒(pcDNA3‐OR2AT4)转染这些细胞48小时并用OR2AT4‐特异性抗体(α‐OR2AT4‐Ak)和视紫质‐特异性抗体(α‐Rho抗体)进行免疫细胞化学染色。这两种抗体清晰可见的共染色使其可以显示α‐OR2AT4‐Ak特定结合至受体，并使受体能够在Hana3A细胞中异源表达(图1，上)。

通过使用另一种可异源表达的OR，OR1A2的控制转染可以排除α‐OR2AT4‐Ak的非特异结合。在使用OR1A2转染的Hana3A细胞中，清楚的视紫质染色显示了受体的表达，但是无法识别α‐OR2AT4‐Ak的染色(图1，下)。作为进一步的对比不用初级抗体培育Hana3A细胞，从而排除二级抗体的非特异结合。

OR2AT4在Hana3A‐细胞中的膜表达

为了确保胞外配体结合至Hana3A细胞中异源表达的OR2AT4，必须将所述受体结合至细胞质膜。已知OR非常难以在异源***表达，其通常无法将受体由内质网运至细胞表面。因此有必要在进行去孤儿化研究前检验受体结合至膜，并确定转染率。为此可以进行根据Zhang和Matsunami(2008)的活细胞染色，其中只有表面蛋白被选择染色，因为细胞膜没有透化。

再次使用α‐Rho‐Ak染色，其检测重组表达OR的N‐端Rho tag。染色显示出，通过磷酸钙方法的48小时转染后，OR2AT4被成功结合至膜(图2a)。通过确定染色Hana3A细胞的数量(平均＝12细胞)相对于总细胞量(平均＝1050细胞)，染色率为约1.3％(图2b)。

本结果示出，OR2AT4以膜结合的方式在Hana3A细胞中表达，因此满足了表征受体受体域的要求。

重组表达OR2AT4的受体域

波鸿鲁尔大学的细胞生理学系建立的用于去孤儿化研究的方法是钙成像，其中使用荧光染料转染的细胞内的钙浓度变化使通过香味物质激活OR可视(cf.Wetzel etal.in:J.Neurosci.19,pp.7426‐7433(1999)；Spehr et al.in:Science 299,pp.2054‐2058(2003)；Neuhaus et al.in:J.Biol.Chem.284,pp.16218‐16225(2009))。在该方法中，Hana3A细胞使用香味物质短时(20s)刺激，并选择用于香味物质筛分的高浓度(高至1mM)，从而确定在Hana3A细胞中弱表达的OR的活性。

重组表达OR2AT4的潜在激动剂的研究。通过激活OR2AT4首先借助钙成像检查。使用1mM激活，短时OR2AT4转染的Hana3A细胞表现出特异钙信号，该细胞仅被檀香木气味激活一次(图3a)。在定量分析中，观察到Hana3A细胞相对于Ringer‐对比样表现出显著提高的响应率，其证明了檀香木气味激活受体。因为受体通常能够被多种结构相关的分子激活，使用六种其他合成檀香木香味物质(婆罗门檀香、黑檀醇、环己异龙脑酯、爪哇檀香(Javanol)、聚檀香醇(Polysantol)和Sandranol)以及天然檀香木油刺激OR2AT4并检测受体活性。在这种情况下，只有婆罗门檀香在钙成像实验中表现出提高的响应率，尽管该提高并不显著(图3b)。

通过进行未转染Hana3A细胞的对比测量，可以排除通过直接激活Hana3A‐细胞导致的两种檀香木香味物质响应率提高(图3b，右)。

为了检验钙成像结果并研究OR2AT4的剂量依赖性活性，使用了另一种基于双荧光素酶***的去孤儿化方法。在这种方法中，除了OR，两种荧光素酶被引入Hana3A细胞。当表达的OR被香味物质激活，并在信号级联放大的过程中形成cAMP，这引发了萤火虫荧光素酶通过CRE(cAMP响应元件)的表达。第二荧光素酶，海肾荧光素酶(Renilla荧光素酶)用作细胞转染和活力的对比样。通过计算两种荧光素酶值，可以确定OR被香味物质激活的能力。在CRE‐荧光素酶检测中香味物质在细胞上保持4小时，从而确保表达荧光素酶。由于香味物质的长培养时间以及在96孔激活更多受体的可能性，该方法比钙成像更敏感并且适用于建立剂量效果关系。

在CRE‐荧光素酶检测中，和表现出对在Hana3A‐细胞中表达的重组受体的显著的剂量依赖性的活性。然而，对于需要比更高的浓度(≥75μM)，从而在受体产生显著作用(图3c)。其在测定浓度下没有反应，用作另一种檀香木香味物质(图3c)。

由于在荧光素酶检测中4小时的培养使香味物质从一个特定浓度开始对Hana3A有毒性作用，不能使用过高的香味物质浓度 并因此无法建立完整的剂量‐效果曲线。这种毒性特别对比报告子海肾荧光素酶的低量中表现。因此只有一致高的海肾信号值用于评估(Zhuang和Matsunami,2008)。对于檀香木香味物质爪哇檀香、聚檀香醇、环己异龙脑酯和檀香木油最高可用浓度为10‐25μΜ。然而，在该浓度下没有表现出OR2AT4提高的活性。

重组表达OR2AT4的潜在拮抗剂的研究。香味物质不仅可以激活受体，还可以用作OR的拮抗剂。借助钙成像技术，香味物质覆盆子酮(Oxyphenylon)和2‐异丁酸苯氧基乙酯(Phenirat)被确定为拮抗剂，其与共用时(1:1，均为1mM)显著减小了引发的钙信号。使用香味物质(Dimetol)作为对比样，其在共用时不会影响引发的钙信号。2,6‐二甲基‐2‐庚醇、2‐异丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮单独都对Hana3A细胞没有影响。

总之发现对于异源表达的OR2AT4和为激动剂，覆盆子酮和2‐异丁酸苯氧基乙酯为拮抗剂。在图5中示出了OR2AT4的受体域以及研究的香味物质的结构式。

检测OR2AT4在人类角质形成细胞中的表达

为了确定OR2AT4在各种人类皮肤细胞和组织中的异位表达进行RT‐PCR分析。此外，OR2AT4在人类角质形成细胞中的表达分析通过免疫细胞化学染色进行。

通过RT‐PCR在人类皮肤细胞和组织中表达OR2AT4

为了在转录水平上检测OR2AT4，分离了各种皮肤细胞种类和皮肤活检标本的DNA，并进行RT‐PCR。在各个分化阶段的人类原代角质形成细胞，HaCaT细胞和人类活检标本(全层皮肤)中检测OR2AT4的转录本(图6)。除了角质形成细胞这一主要成分，人类皮肤也包括其他细胞，如***、色素细胞和免疫细胞，因此这些细胞种类分别通过RT‐PCR检测受体表达。发现树突细胞和黑色素细胞也表达OR2AT4。相反，在脂肪细胞和成纤维细胞中没有检测到受体表达(图6，中心)

为了确定受体是否仅在皮肤中表达，使用各种人类组织(脑，乳腺，结肠，肾，肺，和睾丸)的全部RNA样本进行进一步的RT‐PCR分析。发现OR2AT4不仅在皮肤，也在其他组织如脑、肾和睾丸中表达。相反在乳腺、大肠和肺中，没有发现转录本(图6，底部)。为了排除PCR‐产物由于难以分离或降解的RNA而未被检测到，对所有样本进行β‐actin‐对比以检测RNA‐量，该对比在所有RNA样品中为阳性(图6)。

通过免疫细胞化学法在人类角质形成细胞中表达OR2AT4

为了检测OR2AT4在蛋白质水平上的表达进行自生α‐OR2AT4‐Ak的免疫细胞化学染色。在OR2AT4瞬时转染的Hana3A‐细胞中检测抗体的特异性。通过使用α‐OR2AT4‐AkHaCaT细胞和角质形成细胞的清晰染色在共聚焦免疫荧光图像中可见(图7a)。

为了排除抗体非特异结合至皮肤细胞，使用封闭肽。该肽封闭了α‐OR2AT4‐Ak，其随后不能连接至结合点。通过使用封闭肽，仅有轻微染色的细胞核和核周边区域可见(图7b)。作为进一步的对比，不用初级抗体培育细胞，从而排除二级抗体的非特异结合(数据未示出)。因此α‐OR2AT4‐Ak的结合是特异的，并且确定了受体在蛋白质水平上在人类角质形成细胞中的表达。

除了培养的角质形成细胞，研究了OR2AT4在人类皮肤中的蛋白质表达。为此同样用α‐OR2AT4‐Ak染色皮肤切片。在染色中可见受体在表皮角质形成细胞中的清楚表达(图8，上部)，其中基底角质形成细胞与抗体的结合最强(图8a，截面图)。位于表皮下的真皮未显现特异染色。在对比染色中，其中初级抗体被兔血清替代，也没有观察到特异染色(图8b)。

在人类角质形成细胞中表征引发的钙信号

为了在皮肤细胞中表征OR2AT4的生理功能，重要的是通过确定的配体和在培养的人类角质形成细胞中检测受体的活性。在这部分工作中关注配体

在钙成像实验中，80‐90％的HaCaT细胞以及原代角质形成细胞由重复刺激，引发的钙信号表现出显著的致敏性，以及在每一次施用后信号幅度增大(图9a和9b)。

第一次应用幅度的更精确检测示出了HaCaT细胞通过的剂量依赖性活性，其起始于100μΜ并在约2mM达到饱和(图9c)。在第四次应用中，饱和出现在约500μΜ(图9d)。在第一次应用中ECR50R值为430μΜ并且在第四次应用中为112μΜ

引发的钙信号的致敏性研究

对于引发的钙信号，特征在于重复刺激提高幅度(图9)。为了研究细胞‐细胞通道(间隙连接)，通过该通道角质形成细胞可以交换分子如ATP或Ca²⁺，在致敏机制中的作用，使用两种间隙连接阻滞剂1‐辛醇和生胃酮。

在用阻滞剂1‐辛醇预培育角质形成细胞或HaCaT细胞后，可以在钙成像实验中检测到引发的钙信号的加强(图10a)。结果的定量分析示出，使用1‐辛醇对于HaCaT细胞通过引发的第一幅度提高约400％(图10b)，而对于角质形成细胞提高甚至约1000％(图10c)。在重复刺激中，相对于对比测量随后的钙信号连续减小。使用第二种间隙连接阻滞剂生胃酮产生相同结果(图10b)。

为了排除由于间隙连接的封闭导致的非特异效果，在生胃酮预培育后用另一种同样在皮肤细胞中引发钙信号的香味物质新铃兰醛(lyral)刺激细胞。对新铃兰醛引发的响应图案没有影响(图10b)。

引发的钙信号的药理特性

借助钙成像技术和使用用于信号级联放大蛋白的特异阻滞剂药理表征了HaCaT细胞和原代角质形成细胞中引发的信号级联放大。首先检测通过由细胞外空前的钙流入是否产生钙信号。为此使用加入螯合钙(EGTA)的无钙细胞外溶液。在无钙溶液存在下，‐引发的钙信号显著降低(图11a和11e)。为了研究腺苷酸环化酶的作用，使用特异阻滞剂SQ‐22536和MDL‐12330A。在各个阻滞剂的存在下同样表现出引发的钙信号的显著降低(图11b和11e)。反之排除了磷脂酶C的作用，因为PLC阻滞剂U‐73122对引发的钙信号没有作用(图11c和11e)。阻滞剂的效率使用组胺测试，其活化了PLC信号通路(图11c)。

为了确定钙通道，通过该通道钙离子由外流入皮肤细胞的细胞质，使用CNG通道阻滞剂L‐顺式‐硫氮酮。该阻滞剂同样显著降低引发的钙信号(图11d和11e)。为了借助钙成像技术检验药理特性数值，额外进行cAMP‐检验。为此使用不同的浓度刺激HaCaT细胞，并测定cAMP含量。结果示出剂量依赖性的cAMP增多，EC50‐值为197μM(图11f)。

总之，CNG通道参与的cAMP‐依赖的信号通道用于HaCaT细胞和原代角质形成细胞的引发的钙信号。

嗅觉信号级联放大成分和结构相关蛋白质的表征

在***细胞和肾脏中，除了OR的功能异位表达，检测到嗅觉信号级联放大的其他成分，如嗅觉G蛋白Gαolf和腺苷酸环化酶3(AC3)的亚单位。此外，除了OR的异位表达，研究显示嗅觉信号级联放大成分在多种组织中广泛分布。因此在本研究中，借助转录组分析(下一代测序，NGS)得到了对于在角质形成细胞中表达并参与嗅觉信号级联放大的信号级联放大蛋白质的概观。

嗅觉信号级联放大成分和结构相关蛋白质在转录水平上的表达

为了研究信号级联放大蛋白质评估了原代角质形成细胞的NGS‐数据。除了在嗅觉信号级联放大中出现的成分，如Gαolf、AC3、CNGA2和TMEM16B，研究了其他结构相关的信号级联放大蛋白质。通过评估原代角质形成细胞的转录组数据，可以确定Gαolf(FPKM＝3.6)和AC3(FPKM＝2.1)亚单位的表达。与相关蛋白质，如激动型G蛋白Gαs(FPKM＝69.2)的亚单位或AC6(FPKM＝14.1)相比，这种表达非常少。

此外，在角质形成细胞中检测到了C NG‐通道‐亚单位CNGA1(FPKM＝2.2)以及十种检测氯通道家族TMEM16中的七种的转录本(图12a)。为了确定NGS‐数据，使用原代角质形成细胞和HaCaT细胞进行RT‐PCR实验(图12b)。在两种细胞类中都确定了Gαolf和AC3的表达。此外，证明氯通道TMEM16H、TMEM16J、TMEM16F、TMEM16K以及CNGA1亚单位除了在原代角质形成细胞，同样在HaCaT细胞中表达。此处使用的NGS‐数据具备非常低的测序深度(≈18million reads)，因此低表达基因可能无法通过这种方法检测。因此，根据NGS‐数据无法表达的一些基因也可以通过RT‐PCR检测。在这种情况下发现除了CNGA1‐亚单位，CNGB1亚单位同样在HaCaT细胞和角质形成细胞中表达。

嗅觉信号级联放大成分和结构相关蛋白质在蛋白质水平上的表征

除了RT‐PCR‐实验，用于检测嗅觉信号级联放大成分Gαolf、RAC3和CNGA1的免疫细胞化学染色也可以用HaCaT细胞和原代角质形成细胞进行。对于两种细胞在免疫细胞化学染色中可以识别出Gαolf、AC3和CNGA1的清晰表达(图13a)。除了细胞质位置Gαolf‐和AC3‐染色示出清晰的核染色。不含初级抗体的染色用作对比并且没有二级抗体的非特异结合。

除了培育的角质形成细胞，在准备阶段通过皮肤切片的免疫细胞化学染色检测Gαolf。为了完善数据用α‐AC3‐Ak为人类皮肤切片染色。在表皮角质形成细胞中可见AC3的强表达。在使用兔血清替代初级抗体的对比染色中没有特异染色(图13b)。

OR2AT4对人类角质形成细胞中引发钙信号的作用。

人类角质形成细胞表达受体OR2AT4并且在配体刺激下表现出钙信号。为了检验引发的钙信号通过OR2AT4而不通过其他受体或机制传输，应当一方面进行RNA干扰实验并且另一方面检测上述的OR2AT4拮抗剂。

RNA‐干扰‐实验

在RNA干扰中将小干扰RNA引入细胞，由此具备siRNA的互补1T2T 1T2T核苷酸序列的mRNA分解，相应编码的1T2T 1T蛋白1T以及1T2T不再合成。为了进行该RNA干扰实验使用两种针对OR2AT4的自生siRNA。如果siRNA成功起效，OR2AT4的mRNA分解，使得没有功能蛋白被翻译，导致引发的钙信号降低。

为了排除非特异效果，使用两种对细胞没有作用的对比siRNA(scRNA)。首先在Hana3A‐细胞的对比实验中检测这两种自生siRNA是否成功导致OR2AT4转录本的分解。为此使用特定的荧光素酶‐和OR2AT4‐表达报告质粒(pmirGLO‐OR2AT4)和各个siRNA或scRNA共转染Hana3A细胞。如果OR2AT4的mRNA被siRNA分解，由于荧光素酶和OR2AT4的融合荧光素酶的mRNA被破坏，结果是荧光信号降低。

结果说明，两种siRNA变体导致OR2AT4转录本的分解，其通过荧光信号的显著降低而明显。这两种scRNA不起作用(图14a)。由此满足了成功敲除实验的前提，并且可以在HaCaT细胞上进行功能实验。首先验证通过siRN，AOR2AT4的表达在HaCaT细胞中是否同样减少。为此使用两种siRNAsscRNA的混合物转染HaCaT细胞两天，并进行使用特异OR2AT4抗体的免疫组化转染。成功录入该siRNA或scRNA的HaCaT细胞可以借助GFP确定，其同样通过pGeneClip‐载体表达。siRNA或cRNA‐表达细胞的α‐OR2AT4‐Ak染色的对比示出，染色以及OR2AT4的表达在使用siRNA时显著降低，因此siRNA在HaCaT细胞中有功能(图14b)。

为了确定OR2AT4在引发的钙信号中是否起作用，使用两种siRNA或scRNA的混合物转染HaCaT细胞两天(图14c)并用于钙成像实验。在测定中通过GEP共表达难以区别siRNA或scRNA表达以及非表达细胞(图14d)。使用重复刺激转染细胞，计算钙信号的幅度。在三次应用中，siRNA转染的HaCaT细胞表现出相对于scRNA‐表达细胞显著降低的引发钙信号(图14e和14f)。

人类角质形成细胞中拮抗剂引发钙信号的作用

借助拮抗剂受体活性也可以通过其特异配体确定，因为在异源***和原生细胞中配体引发钙信号的抑制示出了相同受体的活性。已经提到2‐异丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮是OR2AT4的拮抗剂，其在共同使用中分别抑制异源***中引发的钙信号。使用2,6‐二甲基‐2‐庚醇作为对比样，其与共同使用时不表现抑制作用。因此测试这两种拮抗剂在HaCaT细胞对引发钙信号的潜在抑制性，从而检验OR2AT4的作用。

为了表征拮抗剂，首先用(1mM)重复刺激HaCaT细胞。在第三次施用中，进行和一种拮抗剂的共刺激(1:1)。施用2‐异丁酸苯氧基乙酯或覆盆子酮，可以看到引发钙信号的显著降低，而与2,6‐二甲基‐2‐庚醇共使用，钙信号仅轻微降低(图15a和15b)。基于此应当进行抑制性的剂量依赖性表征。为此，不同浓度的和拮抗剂共刺激。在(500μΜ)与覆盆子酮(500μΜ)或2‐异丁酸苯氧基乙酯(500μΜ)的结合使用中，钙信号显著降低至对比(不含拮抗剂的)幅度的8％或9％。将拮抗剂浓度降低至250μΜ，引发钙信号的抑制降低并且幅度为对比幅度的39％或45％。进一步将拮抗剂浓度降低至100μΜ，两种拮抗剂的抑制作用完全消失(图15c)。测得的IC50值(平均抑制浓度)对于2‐异丁酸苯氧基乙酯和覆盆子酮分别为178μΜ和174μΜ(图15d)。

在恒定拮抗剂浓度下(500μM)并同时提高浓度(750μM)，拮抗剂阻滞同样降低。进一步提高至1mM则完全消除了拮抗剂的抑制性(图15c)。总之通过拮抗剂覆盆子酮和2‐异丁酸苯氧基乙酯剂量依赖的抑制了引发的钙信号。这支持了siRNA实验的结果并且证实了在HaCaT细胞中通过配体活化OR2AT4。

OR2AT4在人类角质形成细胞中的生理功能

在钙成像实验中，通过使用短时刺激(20s)导致皮肤细胞中胞内钙浓度的变化。然而，规律使用霜剂或香水，香味物质在皮肤上停留更长时间(几小时至几天)。通过活化皮肤细胞中的OR2AT4所引发的生理功能通过长时间刺激实验检验。

刺激对增殖和迁移的作用

为了得到活化OR2AT4所导致的可能的生理作用的初始证据，使用刺激HaCaT细胞和原代角质形成细胞5天。由此可能出现的细胞凋亡或坏死效果通过使用透射光显微镜和随后的碘化丙啶(PI)染色观察细胞形态揭示，其中只有凋亡或坏死细胞的穿孔膜通过。使用500μΜ的培育5天后，HaCaT细胞和角质形成细胞都没有表现出形态变化或PI染色。因此可以排除香味物质的致死效果(图16a)。

随后检验对皮肤细胞的生长行为是否有影响。为此再次使用刺激HaCaT细胞5天，并且借助增殖实验确定细胞数量。发现相对于对比样(0.1％DMSO)将HaCaT细胞增殖提高了33％(图16b)。为了证明增殖增长是由OR2AT4的活化引发的，使用siRNA或scRNA分别转染HaCaT细胞并再次进行增殖实验。用scRNA转染的HaCaT细胞表现出与未转染细胞相同的增殖增长。而siRNA转染却导致由所引发效果的显著减少(图16b)。

此外，确定使用与拮抗剂覆盆子酮(500μM)或2‐异丁酸苯氧基乙酯(500μM)共转染(1:1)后的细胞数。在拮抗剂的存在下增殖减少。覆盆子酮的效果显著。单独的覆盆子和2‐异丁酸苯氧基乙酯对HaCaT细胞增殖没有显著影响。

总之，siRNA和拮抗剂实验的结果示出的促生长活性通过OR2AT4活性调节。例如，在表皮再植过程中角质形成细胞的增殖出现细微增长。除了增殖，在该过程中皮肤细胞的迁移细微增长。因此借助琼脂糖迁移试验检验细胞生长的增多是否伴随着趋化行为。在试验中将HaCaT细胞接种至琼脂糖介质混合物，并且对细胞在500μM或0.1％DMSO方向上的增殖进行持续5天的观察。测量细胞通过的路径，或细胞生长的面积，证明HaCaT细胞在方向上的显著趋化迁移。

总之结果显示，通过OR2AT4引发信号级联放大，其导致HaCaT细胞增殖和迁移的增多。

刺激对MAP激酶磷酸化的作用

促***原活化蛋白(MAP)‐激酶在将细胞外刺激传输和转换为细胞内信号中起到重要作用，从而调节许多过程如细胞***、细胞增殖或细胞应激。信号通路包括至少三种通过磷酸化依次激活的激酶：上游MAP‐激酶‐激酶‐激酶(MAPKKK)，下游MAP‐激酶‐激酶(MAPKK)和端位MAP‐激酶(MAPK)。MAP信号通路根据其端位MAPK命名，其中最重要的三种是ERK1/2(细胞外信号调节激酶)‐MAPK，p38‐MAPK和JNK/SAPK(c‐Jun NH2‐端位激酶/应激激活磷酸化‐激酶)。

随后检验在皮肤细胞中‐刺激是否激活MAPK‐信号通路，如果是是哪种信号通路。为了检验用500μM刺激HaCaT细胞0‐30分钟，分离蛋白质并用于蛋白印迹分析检测。蛋白印迹结果显示在5‐30分钟内Erk1/2‐MAPK和p38‐MAPK磷酸化增多，但是没有由细胞刺激引发的JNK/SAPK磷酸化(图17a)。HaCaT细胞的蛋白印迹‐分析的定量化显示通过刺激三十分钟Erk1/2‐MAPK和p38‐MAPK磷酸化显著增多。额外培育MAPK抑制剂SB203580和U0126，分别用于p38MAPK和ERK1/2MAPK，磷酸化再次显著降低(图17b)

为了揭示两种MAPK‐信号通路的相互作用，在p38‐MAPK‐抑制剂SB203580或Erk1/2‐MAPK‐抑制剂U0126的存在下分别研究Erk1/2‐磷酸化和p38‐MAPK‐磷酸化。相对于仅使用刺激细胞，在各自抑制剂的存在下两种激酶的磷酸化都增多。对于p38‐MAPK效果更显著(图17c)。

总之，结果示出p38和ERK1/2MAPK通过刺激磷酸化并且存在信号通路的相互调节。

在体外创伤愈合试验中刺激对人类角质形成细胞的作用

MAP‐激酶p38和Erk1/2通常与表皮创伤愈合中增多的增殖和迁移相关。因此在进一步的生理实验中研究对HaCaT细胞或原代角质形成细胞的融合细胞层“创伤愈合”的作用。为此使用创面‐划痕‐试验，其是用于初始检验角质形成细胞中创面愈合过程所建立的体外方法。在创面‐划痕‐试验中使用移液管头在HaCaT细胞或原代角质形成细胞的融合细胞层划出划痕，并观察该“创面”两天。结果示出，当用500μM处理细胞后，HaCaT‐细胞和角质形成细胞上的划痕闭合封闭加快了26％和34％(图18a和18b)。

为了研究OR2AT4受体在该效果中的作用，检验两种拮抗剂覆盆子酮和2‐异丁酸苯氧基乙酯是否会使通过提高的创面愈合再次降低。为此以相同的比例将分别与一种拮抗剂混合，并再观察HaCaT细胞“创面愈合”效果48小时。发现共培养使“创面愈合”再次降至常规水平(图18c)。这两种拮抗剂单独对“创面愈合”没有影响(图18d)。MAP‐激酶n p38和Erk1/2的作用借助激酶的特异抑制剂检测。对于p38MAPK使用ERK1/2抑制剂SB203580，对于ERK1/2MAPK使用p38抑制剂U0126。在各个抑制剂的存在下，“创面愈合”再次降至常规水平(图18c)，其确定了p38MAPK和ERK1/2MAPK对‐引发的“创面愈合”过程的作用。这两种抑制剂单独对“创面愈合”没有影响(图18d)。

白细胞介素分泌和Akt蛋白激酶磷酸化的研究

如上所述，对于培养的角质形成细胞在体外创面‐划痕‐试验中的“创面愈合”有积极作用。创面愈合是一种复杂过程，包括各种生理过程。为了进一步获得OR2AT4‐活化的信号级联放大如何改善皮肤细胞创面愈合的信息，应当借助定量实时PCR和ELISA分析研究HaCaT‐细胞中刺激后白细胞介素的产生和分泌。此外，应当通过蛋白印迹‐分析检验，参与角质形成细胞分化过程的蛋白激酶Akt是否通过刺激磷酸化。

为了研究白细胞介素分泌，首先进行定量实时PCR。为此使用提前用刺激6或24小时的HaCaT细胞的RNA。使用各种白细胞介素的特异引物(IL‐1α、IL‐1β、IL‐6、IL‐8)和肿瘤坏死因子(TNFα)进行检测。发现24小时后，相对于对比样(0.1％DMSO)IL‐1α的表达提高了约10000％，白细胞介素IL‐1β的表达提高了约1700％。对于其他白细胞介素，表达率没有提高(图19a)。为了支持这一结果，进行ELISA‐试验，其中细胞上清液中分泌的白细胞介素可以通过免疫反应检测。借助使用的试验，研究了白细胞介素(IL‐1α、IL‐1β、IL‐2、IL‐4、IL‐6、IL‐8、IL‐10、IL‐12和IL‐17α)、TNFα、γ‐干扰素(IFNγ)、和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)的分泌。用刺激24小时后，仅对于IL‐1α可见相对于对比样(0.1％DMSO)显著提高的分泌。HaCaT细胞表现出极高的IL‐8分泌，但是并不显著高于对比样(0.1％DMSO)(图19b)。

除了已经检验的磷酸化激酶，研究蛋白质激酶Akt的磷酸化。为此用刺激HaCaT细胞0、5、15和30分钟并通过蛋白印迹‐分析和针对非磷酸化或磷酸化形式的Akt蛋白的特异抗体，研究磷酸化。发现Akt‐激酶在刺激五分中内磷酸化，并且刺激更长(15或30分钟)该效果进一步提高(图19c)。

总之结果证明通过提高了IL‐1α的表达和分泌，并且参与人类角质形成细胞分化过程的蛋白质激酶Akt被激活。

附图说明

在下文中本发明通过大量附图详细说明，其内容讨论如下。

图1

OR2AT4在Hana3A细胞中的异源表达。用OR2AT4瞬时转染的Hana3A细胞(顶行)在使用α‐Rho‐AKs(红色)和α‐OR2AT4‐AKs(绿色)的免疫细胞化学染色中表现出清楚的叠加。相反，在用OR1A2s瞬时转染的Hana3A细胞的对比染色中(底行)，只有视紫质染色可见。为了确定细胞的位置和数量，平行进行细胞核染色(DAPI，蓝色)。使用共聚焦显微镜获得荧光图像。尺寸：20μm。

图2

OR2AT4在Hana3A‐细胞中的膜表达。图2a示出了使用α‐Rho‐Ak的Hana3A细胞活细胞染色。左侧：OR2AT4瞬时转染的Hana3A细胞表现出膜染色。右侧：未转染的Hana3A细胞未表现出视紫质染色。使用共聚焦显微镜获得荧光图像。尺寸：20μm。图2b中给出了活细胞染色的定量分析。为了确定转染率，在荧光显微镜下计算总细胞数和转染细胞数。示出的是包括标准误差的三次独立转染的平均细胞数。

图3

重组表达OR2AT4受体域的确定。如3a示出了用(1mM)刺激两次(每次20s，水平杆)的瞬时OR2AT4‐表达Hana3A细胞的代表钙成像痕迹。作为对比，用刺激未转染的Hana3A细胞。在每次测试的最后使用100μΜATP作为阳性对照刺激。图3b示出钙成像测定的分析，其中使用各种檀香木香味物质(1mM)刺激瞬时OR2AT4‐表达Hana3A细胞。示出了相对于Ringer对比样的包括标准偏差的细胞平均响应率。测定量：Ringer(23)、(22)、(14)、爪哇檀香(15)、Sandranol(18)、聚檀香醇(14)、环己异龙脑酯(14)、檀木油(14)。Isobornyl.：环己异龙脑酯；S.：檀木油。多重比较的Kruskal‐Wallis试验。*:p<0.05。图3c示出了双萤光素酶测定的评价。确定了OR2AT4‐pcDNA3转染的Hana3A细胞和无***pcDNA3转染的Hana3A细胞之间的显著水准。点标记示出了包括标准偏差的平均归一化荧光素酶‐活性。曼‐惠特尼U检验(Mann‐Whitney U test)；n＝3次试验.*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001。

图4

重组表达OR2AT4的拮抗剂。该图示出使用(蓝色痕迹)、+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(淡蓝色痕迹)、Sandalore+2‐异丁酸苯氧基乙酯(灰色痕迹)或+覆盆子酮(黑色痕迹)刺激两次的瞬时OR2AT4‐转染Hana3A细胞的代表钙成像痕迹。在每次测试的最后使用100μΜATP作为阳性对照刺激。图4b示出了用不同香味物质(1mM)刺激的瞬时OR2AT4‐表达Hana3A细胞的代表钙成像测定分析。示出了相对于Ringer对比样包括标准偏差的细胞平均响应率。测定量：Ringer(23)、(22)、+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(11)、2,6‐二甲基‐2‐庚醇(11)、2‐异丁酸苯氧基乙酯(14)、+2‐异丁酸苯氧基乙酯(22)、覆盆子酮(12)和+覆盆子酮(20)。S:。多重比较的Kruskal‐Wallis试验.*:p<0,05。

图5

OR2AT4的受体域以及香味物质的结构式。受体域包括激动剂(内圈)、非活性物质(灰圈)、和拮抗剂(上部方形)。对于测试的檀香木油，使用例如两种主要成分α‐白檀油烯醇和β‐白檀油烯醇

图6

OR2AT4在不同人类细胞类型和组织中的表达。为了检测OR2AT4使用不同人类RNA‐样本(“+”)的cDNA进行PCR‐分析。基于‐RT样本(“‐”)排除了基因组DNA的污染。片段尺寸：OR2AT4(400bp)、β‐Aktin(250bp)。M:标记子，P:细胞培养通道。

图7

OR2AT4在HaCaT细胞和人类原代角质形成细胞中蛋白质水平上的表达。图7a示出HaCaT细胞和原代角质形成细胞，其在使用sα‐OR2AT4‐Ak(红色)中表现出清晰的免疫细胞化学染色。图7b示出在使用封闭肽(封闭肽，OR2AT4‐Ak与封闭肽的比例为1:2)的对比染色中染色显著降低。为了确定细胞的位置和数量，平行进行细胞核染色(DAPI，蓝色)。使用共聚焦显微镜获得荧光图像。尺寸：20μm。

图8

OR2AT4在人类皮肤切片中的表达。在图8a中使用α‐OR2AT4‐Ak(绿色)的表皮角质形成细胞表现出显著的免疫细胞化学染色。图8b示出对比染色，其中用兔血清替代初级抗体；在这种情况下，染色显著降低。上部：400倍放大；下部：截面图。E:表皮，D:真皮，B:基底层。

图9

OR2AT4配体对培养的角质形成细胞的细胞内钙浓度的作用。在A)原代角质形成细胞(n＝175细胞)和B)HaCaT细胞(n＝186细胞)中通过用(500μΜ)重复刺激在钙成像实验中引发钙信号(水平杆)。左侧：引发钙信号的代表钙成像痕迹。在每次测试的最后使用100μΜATP作为阳性对照刺激。右侧：4次施用(500μΜ)的钙信号的定量分析。示出了包括标准偏差的单次使用的平均值。曼‐惠特尼U检验*。:p<0.05。C)和D)：在钙成像实验中HaCaT细胞的剂量依赖活性。示出了第一次(C)和第四次(D)应用中不同浓度下的包括标准偏差的平均幅度。测量的细胞数：0.0125mM(39),0.025mM(30),0.1mM(46),0.5mM(34),1mM(63),2mM(41),10mM(36)。

图10

间隙连接阻滞剂对引发钙信号致敏性的作用。A)用间隙连接阻滞剂1‐辛醇(500μM)培育并随后用(500μM，水平杆)重复刺激的HaCaT细胞(左)和原代角质形成细胞(右)的代表钙信号痕迹(蓝色痕迹)。黑色痕迹是不用阻滞剂预培育的重复‐刺激(对比)。在每次测试的最后使用100μΜATP作为阳性对照刺激。用间隙连接阻滞剂1‐辛醇(500μM)或生胃酮(10μΜ)培育并随后用(500μM)或新铃兰醛(1mM)在钙成像实验中重复刺激的HaCaT细胞(B)和原代角质形成细胞(C)的定量分析。示出了相对于对比测量(不含阻滞剂，施用)单次施用的包括标准偏差的平均值。曼‐惠特尼U检验。测量的细胞数：+1‐辛醇(HaCaT(110)，角质形成细胞(26))，HaCaT(74)；或新铃兰醛+生胃酮:HaCaT(43)。***:p<0,001。

图11

在人类角质形成细胞中‐引发的信号级联放大的药理特性。A)‐D)。示出了在阻滞剂存在下原代角质形成细胞的代表钙成像痕迹(蓝色)。水平杆对应施用时间。在每次测试的最后使用100μΜ ATP作为阳性对照刺激。A)使用无钙细胞外液(+10mM EGTA)测试。B)使用腺苷酸环化酶阻滞剂SQ‐22536(100μΜ)测试。C)使用磷脂酶‐C阻滞剂U‐73122(10μΜ)。使用100μΜ组胺作为阳性对比。D)使用CNG通道阻滞剂L‐顺式‐硫氮酮(150μΜ)测试。E)HaCaT细胞和原代角质形成细胞(Kera)药理测试概览。给出了相对于对比测试(虚线)的平均幅度。MDL‐12330A(40μΜ)。EGTA：无钙Ringer(HaCaT n＝46,Kera n＝52)，SQ:SQ‐22536(HaCaT n＝60,Kera n＝26)，MDL:MDL‐12330A(HaCaT n＝69,Kera n＝24)，U‐73122(HaCaT n＝41,Kera n＝25)，L‐cis‐D.:L‐顺式‐硫氮酮(HaCaT n＝41,Kera n＝25)。曼‐惠特尼U检验。***:p<0.001。F)刺激后通过cAMP‐GloTM试验确定HaCaT细胞的cAMP含量。点标记示出了刺激(1μΜ‐10000μΜ)10分钟后包括标准偏差的平均cAMP含量。确定了用刺激的HaCaT细胞和用等体积DMSO(0.2％)刺激的HaCaT细胞之间的显著水准。多重比较的Kruskal‐Wallis试验；n＝3次试验。*:p<0.05。

图12

通过NGS‐数据和RT‐PCR进行信号级联放大成分和结构相关蛋白质的表达分析。A)NGS结果和进行的RT‐PCR概览。NGS‐数据结果以FPKM数值给出。用(√)标识RT‐PCR实验中成功检测到转录本；没有检测到用(x)表示。k.A.:没有数据。嗅觉信号级联放大成分用(*)表示。B)不同信号级联放大成分的RT‐PCR。片段尺寸：AC3(311bp)、ANO1(288bp)、ANO6(432bp)、ANO8(427bp)、ANO9(416bp)、ANO10(373bp)、CNGA1(2790bp)、CNGB1(288bp)、GNAL(485bp)。M：标记子，K:对比样，GNAL:GαolfR亚单元，GNAS:G·SR亚单元，ADCY:腺苷酸环化酶，ANO:anoctamin(透膜蛋白16)。

图13

通过免疫细胞化学染色进行的AC3和CNGA1的表达分析。A)使用特异抗体α‐Gαolf、α‐CNGA1和α‐AC3，HaCaT细胞和原代角质形成细胞表现出清晰的免疫细胞化学染色。仅用第二种抗体的染色用作对比。为了确定细胞的位置和数量，平行进行细胞核染色(DAPI，蓝色)。使用共聚焦显微镜获得荧光图像。尺寸：20μm。B)通过免疫细胞化学染色检测AC3在人类皮肤切片中的表达。当使用α‐AC3‐Ak时(绿色)表皮角质形成细胞表现出清晰的免疫细胞化学染色。在对比染色中，其中用兔血清替代初级抗体，不可见特异染色。400倍放大。E:表皮，D:真皮，B:基底层。

图14

用于验证OR2AT4在HaCaT细胞内Sandalore引发钙信号作用的RNA‐干扰‐实验。A)测定siRNA在Hana3A细胞中活性的双荧光素酶检测。示出了用siRNA或scRNA和受体载体pmirGLO‐OR2AT4共转染的Hana3A细胞相对于仅用pmirGLO‐OR2AT4转染的Hana3A细胞的归一化荧光信号(萤火虫/海肾)。曼‐惠特尼U检验，n＝3次试验。***:p<0.001。B)左侧：用siRNA或scRNA表达质粒和α‐OR2AT4‐Ak转染的HaCaT细胞的免疫细胞化学染色(红色)。通过GFP表达(绿色)确定siRNA或scRNA‐表达细胞。右侧：定量分析示出与scRNA‐表达细胞(n＝17个细胞)相比siRNA‐表达细胞(n＝17个细胞)中显著减少的α‐OR2AT4染色。示出了相对于scRNA‐表达细胞的包括标准偏差的siRNA‐表达细胞的平均荧光强度。曼‐惠特尼U检验。**:p<0.01。C)用两种siRNAs混合物转染的HaCaT细胞的透射光图像和荧光图像。尺寸：50μm。D)钙成像测定的荧光图像。通过GFP的共表达确定siRNA‐表达细胞(圆圈)并且示出了用刺激细胞内钙浓度没有增多。E)(500μΜ，水平杆)重复刺激siRNA(蓝色痕迹)或scRNA(黑色痕迹)转染的HaCaT细胞的代表钙成像痕迹。在每次测试的最后使用100μΜATP作为阳性对照刺激。F)siRNA和scRNA表达细胞中引发钙信号的定量分析。首先将钙信号的幅度标准化至ATP，并随后相对于scRNA‐表达HaCaT细胞表达siRNA‐表达细胞。示出了包括标准偏差的平均值。曼‐惠特尼U检验，n＝18个细胞(siRNA)，n＝17个细胞(scRNA)。*:p<0.05；**:p<0.01。

图15

OR2AT4拮抗剂对HaCaT细胞中引发钙信号的作用。A)使用(1mM)重复刺激的HaCaT细胞的代表钙成像痕迹。在第三次施用中，进行(蓝黑痕迹)刺激或+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(淡蓝色痕迹)、+覆盆子酮(黑色痕迹)或+2‐异丁酸苯氧基乙酯(棕色痕迹)的共刺激。在每次测试的最后使用100μΜ ATP作为阳性对照刺激。水平杆对应施用时间。香味物质：1mM。B)单独使用的刺激或与2,6‐二甲基‐2‐庚醇、2‐异丁酸苯氧基乙酯或覆盆子酮的共刺激的钙信号的定量分析。S.:。示出了包括标准偏差的第三次施用的平均值。曼‐惠特尼U检验。***:p<0.001。测定的细胞量：(121)、+覆盆子酮(43)、+2‐异丁酸苯氧基乙酯(67)、Sandalore+2,6‐二甲基‐2‐庚醇(120)。C)使用拮抗剂覆盆子酮和2‐异丁酸苯氧基乙酯研究引发钙信号的剂量依赖性抑制。在第三次施用中使用不同浓度的(500‐1000μΜ)和一种拮抗剂(100‐500μΜ)共刺激HaCaT细胞。为了可以比较香味物质引发的钙信号，将第三次施用的幅度标准化至前次施用。示出了包括标准偏差的标准化香味物质引发钙信号相对于对比细胞的平均值(未用拮抗剂，施用)。曼‐惠特尼U检验。***:p<0.001。D)由C)给出的500μΜ数据计算两种拮抗剂的IC50值。

图16

长期刺激对角质形成细胞形态、生长和迁移过程的作用。A)用(500μΜ)刺激或0.1％DMSO(对比)刺激五天后HaCaT细胞和原代角质形成细胞的相对比图像和PI染色。阳性PI染色中，细胞核被染成红色。尺寸：100μm。B)在用500μΜ或0.1％DMSO(对比)刺激五天后的HaCaT细胞上使用CyQuant细胞增殖试剂盒进行增殖试验的评估。对于RNA干扰实验，在刺激前用siRNA或scRNA转染细胞。示出了相对于未处理细胞的包括标准偏差的平均细胞量。曼‐惠特尼U检验；n＝3次试验。*:p<0.05；**:p<0.01。S:。C)测定HaCaT细胞迁移的琼脂糖试验。顶部：在(500μΜ)或0.1％DMSO方向上迁移的的HaCaT细胞的透射光图像。细胞的生长边界被黑色环绕。尺寸：250μm。底部：迁移试验的评估。测定了细胞的最长迁移路径以及生长面积并与对比样(0.1％DMSO)相比。双侧配对T检验。包括标准偏差的平均值；n＝4次试验。**:p<0.01；***:p<0.001。

图17

刺激对皮肤细胞中MAP激酶磷酸化的作用。A)用于检测(500μΜ)刺激0、5、15和30分钟的HaCaT细胞中MAP激酶磷酸化的蛋白印迹分析。为了确定均匀的蛋白质量，α‐微管蛋白被用作对比样。ERK1/2:42/44kDa；p38:43kDa；JNK/SAPK:46/54kDA；α‐微管蛋白:52kDa。B)用(500μΜ)或额外用p38抑制剂SB203580(10μΜ)或ERK1/2抑制剂U0126(10μΜ)刺激30分钟的HaCaT细胞的p38和ERK1/2磷酸化的定量分析。为了进行分析确定磷酸化(p)和未磷酸化蛋白质的比例并与未处理细胞相比。平均值包括标准偏差。曼‐惠特尼U检验。*:p<0.05；***:p<0.001。在C)中，使用了其他MAP激酶的抑制性以及磷酸化与单独使用(500μΜ)刺激的细胞相比。平均值包括标准偏差。曼‐惠特尼U检验。*:p<0.05。使用三种不同的蛋白分离物进行蛋白印迹分析。

图18

在体外“创伤愈合”实验中刺激对人类角质形成细胞的作用。在(500μΜ)或0.1％DMSO作为对比样的存在下，通过创面‐划痕‐试验研究A)原代角质形成细胞和B)HaCaT细胞的“创伤愈合率”。左侧：不同时间电观察的“创面”透射光图像。细胞的生长边界被黑色包围。尺寸：200μm。右侧：创面‐划痕‐试验的定量分析。测定创面的面积并与初始创面(0h)相比。平均值包括标准偏差。曼‐惠特尼U检验；n＝4次试验。*:p<0.05；***:p<0.001。C)在(500μΜ)和一种选自覆盆子酮(500μM)或2‐异丁酸苯氧基乙酯(500μM)的拮抗剂或p38MAPK抑制剂SB203580(10μΜ)或ERK1/2MAPK抑制剂U0126(10μΜ)的存在下进行创面‐划痕‐试验。测定的处理细胞的创面面积(刺激48小时后)与对比样(0.1％DMSO)相比。平均值包括标准偏差。多重比较的Kruskal‐Wallis试验；n＝3次试验。*:p<0.05。D)C)中使用覆盆子酮(500μM)或2‐异丁酸苯氧基乙酯(500μM)或SB203580(10μΜ)或U0126(10μΜ)进行的创面‐划痕‐试验的对比。将处理细胞的创面面积与对比样(0.1％DMSO)相比。包括平均值。

图19

刺激后白细胞介素分泌和Akt蛋白激酶磷酸化的研究。A)通过qRT‐PCR研究用(500μΜ)刺激6小时和24小时后的HaCaT细胞中白细胞介素的调节。0.1％DMSO用作对比样。GAPDH用作参考基因，并且确定了未处理和刺激细胞之间的相对表达。平均值包括标准偏差。n＝3次试验。B)ELISA试验检测用(500μΜ)刺激24小时后的HaCaT细胞上清液中的白细胞介素。0.1％DMSO用作对比样。表达了相对于背景测定的处理细胞在450nm的光密度。使用了三次独立刺激的上清液。平均值包括标准偏差。曼‐惠特尼U检验。*:p<0.05。C)用于检测(500μΜ)刺激0、5、15和30分钟的HaCaT细胞的Akt蛋白激酶的磷酸化的蛋白印迹。Akt(60kDA)；p‐Akt:磷酸化Akt蛋白质(60kDA)。

Claims (11)

1.含有式(I)衍生物的药物

其中R¹是氢或甲基，用于加速创面愈合。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其为

3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其为

4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其通过激活嗅觉受体OR2AT4加速创面愈合。

5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其通过刺激细胞的增殖和迁移加速创面愈合。

6.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其通过刺激MAP‐激酶的磷酸化加速创面愈合。

7.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，其通过刺激白细胞介素IL‐1α的表达和分泌加速创面愈合。

8.根据权利要求1至7至少一项所述的药物，其特征在于，其局部施用。

9.根据权利要求1至8至少一项所述的药物，其特征在于，其为洗剂、霜剂、乳剂、凝胶剂、膏剂、喷雾剂或者由其浸渍或涂布的相应敷料。

10.根据权利要求1至9至少一项所述的药物，其特征在于，含有0.001至约2重量％的式(I)的活性成分。

11.确认有利于创面愈合的活性成分的方法，其中

(a)提供一种角质形成细胞培养物，其含有嗅觉受体OR2AT4，

(b)向该培养物加入待测试的活性成分，以及

(c)确定细胞内钙浓度的变化。