CN106661263B - 多孔性纤维素介质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供制作多孔性纤维素介质的技术，其中，在多孔性纤维素介质的制造中，针对溶解有作为原料的乙酸纤维素的溶液，通过不发生伴随物质的移动的反应的凝胶化而制作多孔性纤维素介质。具体而言，本发明提供多孔性纤维素介质的制造方法，其包括：使包含乙酸纤维素、有机溶剂、水的流动性的均一组合物降低温度而使其凝胶化的工序，和对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工序。

Description

多孔性纤维素介质的制造方法
技术领域
本发明涉及多孔性纤维素介质的制造方法。
背景技术
以纤维素为代表的多糖及其衍生物已利用于各种用途。对它们的微多孔体而言，其自身可作为吸附剂，另外，可以通过向其表面进行某些化学修饰，而赋予吸附、分离的功能。
以下举出这些的一个例子。由于酶利用的普及、生物医药的开发等，以蛋白质为代表的生物高分子的分离纯化成为了重要的技术课题之一。用于解决该问题的重要的方法为色谱。在色谱中，可使用将与目的物质或者作为除去对象的杂质进行相互作用的某些原子团(常常将它们称为选择物(selector))结合至称为基质的固体而成的分离剂。
没有蛋白质的非特异性吸附这一点，是作为用于分离生物高分子的材料极其重要的特性，因此，多糖类作为基质得到重用。另外，由于多糖类在分子内具有较多的羟基，因此，可以将其作为立足点而经过醚键、酯键容易地与选择物结合，这也是得到重用的较大原因。
另外，为了分离纯化生物高分子，通常使用以下方法：将对目标的分子具有某些亲和性的选择物结合至基质，在吸附目的分子后，用某些方法使被吸附的目的分子游离并进行回收。为了获得大量的目的分子，可以结合大量的选择物，并且使该选择物与分子量大的生物高分子有效地相互作用，要求基质为使得目的分子可以自由地出入的多孔质结构。换言之，将该基质填充于柱并进行空间(size)排阻色谱时，必须表现出大于需要纯化的分子与配体合起来的尺寸的排阻界限。
这样的基质多数情况以粒子的形式填充于称为柱的管中进行使用。但是，近年来备受瞩目的新的形态，是称为整块(monolith)的一体的多孔体。它通过容纳于称为毛细管的细管、或柱等容器中而用于相同的用途。但是，比较薄的面积大的整块也可以作为过滤膜使用。
作为这样的基质的使用容易度的主要原因，除了相对于分离对象的选择性以外，可列举其物理强度。即，弹性模量低的基质由于在色谱、过滤中在液体、气体进行流动时，受到压缩变形、断裂，结果导致色谱柱内的液体的流动变得不均一，进而阻塞，从而导致柱的分离效率显著降低。从这方面考虑，物理强度的高低为重要的特性，在这点上，纤维素即使在多糖类中也为优异的材料。
此外，纤维素存在以下优点：作为多糖的一般的特征在其表面具有醇性羟基，因此可以通过化学反应结合多种原子团，及可以大量地、比较廉价地得到高纯度的原料等。
从以上的原因考虑，开发了以生物高分子的分离纯化为主要目的的多孔性纤维素粒子。作为用于制造该多孔性纤维素粒子的方法，多为将纤维素以某些方法溶解之后进行再生的方法，但也可见若干将有机酸酯作为起始原料的方法。与将纤维素本身直接溶解，存在需要特殊溶剂、溶液的粘度非常高等困难相对，这些方法利用了以下优点：有机酸酯能够溶解于众多溶剂，纤维素的有机酸酯可以利用与各种有机酸的各种结合率、或聚合度，在稳定的品质下供应于工业上，还可以容易地分解酯键来对纤维素进行再生等。
作为这样的纤维素粒子的制造方法，例如在专利文献1中，记载了将纤维素有机酸酯溶解于卤代烃那样的有机溶剂中而成的溶液分散于水性介质中，使其形成酯溶液的微小液滴，向其中添加铵盐等水解促进剂进行该酯的水解，从而形成纤维素微小粒子。
另外，在专利文献2中，记载了通过以下制造多孔球状粒子的方法：将纤维素脂肪酸酯与纤维素脂肪酸酯的胶凝剂溶解于有机溶剂而制成溶液，向水性介质中搅拌添加该溶液并使其形成液滴，进一步添加促凝剂将液滴中的纤维素脂肪酸酯制成凝胶粒子，从生成的粒子除去胶凝剂、促凝剂及溶剂。
在非专利文献1中，记载了通过将乙酸纤维素溶解于水溶解性的有机溶剂(丙酮和DMSO的混合溶剂)，并使其在水中分散，从而包含乙酸纤维素的溶液与水接触而凝固，形成多孔性的粒子。
在非专利文献2中，记载了将纤维素二乙酸酯溶解于DMSO，之后添加无水硫酸钠并搅拌，将混合物投入酸凝集浴槽(盐酸)而获得纤维素粒子(珠)。另外，记载了为了提高珠的多孔性，将提取之后的珠浸渍于大量温水中来除去硫酸钠的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭62-277401号
专利文献2：日本特开昭63-95237号
非专利文献
非专利文献1：Chen,L.F.；Tsao,G.T.Biotechnol.Bioeng.1976,18,1507
非专利文献2：Bai,Y.-X.；Li,Y.-F.Carbohydr.Polym.2006,64,402
非专利文献3：A.J.Reuvers等,J.Polym.Sci.,1986,24,793
发明内容
发明要解决的问题
在专利文献1和2的技术中，在任意方法中均使用了包含卤代烃的溶剂，为了在制作粒子时利用汽化进行该溶剂的除去，需要较大能量和用于回收已汽化的溶剂的装置。另外，在使用了专利文献2中记载的那样的促凝剂的情况下，由于在形成的液滴之中，在与促凝剂接触的部分形成了致密的纤维素脂肪酸酯的膜，从而变成了走形的粒子形状的情况。另外，在专利文献2记载的那样的利用伴随物质的移动的工艺的情况下，存在反应产生偏移的可能性。
另外，在非专利文献1中，记载了用甲醛和盐酸使已形成的珠发生交联反应，使珠进行交联，在非专利文献2中，记述了为了对粒子设置细孔而使用了细孔形成剂，两者均包括在形成粒子时对其表面进行处理的工序，为了获得多孔性纤维素粒子，需要除去表面处理中使用的物质。
本发明的目的在于提供制作多孔性纤维素介质的技术，其中，在可以应用于分离剂的多孔性纤维素介质的制造中，通过对于包含作为原料的乙酸纤维素、水和有机溶剂的均一组合物，不伴随向体系外的物质的移动而进行凝胶化，获得多孔性乙酸纤维素，通过使其水解而制作多孔性纤维素介质。
解决问题的方法
本发明是鉴于上述情况而完成的。论文中(非专利文献3)报告了包含水、有机溶剂和乙酸纤维素的均一组合物在某温度以下时，发生相转变(液态-凝胶状)而凝胶化。
本发明人等发现，如果利用该性质，可以对于上述组合物不依赖物质的移动，例如溶剂的蒸发、非溶剂(胶凝剂)的添加等，获得块状、粒子状等相应于目标的形状的凝胶，随后通过水解而获得保持多孔质结构并具有优异的特性的纤维素介质。
即，本发明的要旨如下所述。
[1]多孔性纤维素介质的制造方法，其包括：使包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物降低温度而使其凝胶化的工序，和对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工序。
[2]球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物，分散至与该均一组合物不混合的分散介质中获得分散液的第一工序，和降低获得的分散液的温度而使所述组合物凝胶化，从而形成由所述组合物构成的凝胶化粒子的第二工序，和对获得的凝胶化粒子中包含的乙酸纤维素进行水解的第三工序。
[3]根据[2]所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括在所述第二工序和第三工序之间，将用于分离获得的凝胶化粒子的分离溶剂，添加至形成有凝胶化粒子的分散液中，在分离溶剂中分离凝胶化粒子的工序。
[4]根据[3]所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其中，所述分离溶剂为水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺、或它们的混合物。
[5]根据[2]～[4]中任一项所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括向所述分散介质中添加分散稳定剂。
[6]根据[2]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，所述分散介质为碳原子数20以上的烃、硅油或氟化烃。
[7]多孔性纤维素整块(monolith)的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物加入至成型容器，降低温度而使其在该成型容器内凝胶化的工序，和对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工序。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物中的有机溶剂为沸点为120℃以上，与水混合、且与饱和烃不混合的物质。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物中包含的有机溶剂为非质子性极性溶剂。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物在0℃～100℃的温度范围具有作为透明的流动性液体的温度范围，和在低于该温度范围的温度失去流动性的相转变温度。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，所述乙酸纤维素为选自纤维素二乙酸酯及纤维素单乙酸酯中的1种以上。
[12]吸附体的制造方法，其包括：将亲和配体固定至用[1]所述的制造方法获得的多孔性纤维素介质、用[2]～[6]任一项中所述的制造方法获得的多孔性纤维素粒子、或用[7]所述的制造方法用获得的多孔性纤维素整块的工序。
[13]根据[12]所述的吸附体的制造方法，其中，所述亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体中的一种以上。
[14]目标物质的纯化法，其包括：将用根据[12]或[13]所述的制造方法获得的吸附体与包含目标物质的混合物进行接触，使目标物质结合至固定于吸附体的亲和配体的第一工序，和对结合至吸附体的亲和配体的目标物质进行分离的第二工序。
发明的效果
根据本发明，在制造多孔性纤维素粒子那样的多孔性纤维素介质时，不需要使用用于溶解乙酸纤维素的卤代烃那样的有机氯类溶剂，不仅如此，在对包含乙酸纤维素的组合物进行凝胶化时，由于利用了不伴随物质移动的、由温度的变化导致的凝胶化，因此可以使获得的乙酸纤维素介质的细孔的大小均匀。
附图说明
[图1]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例1)的光学显微镜照片。
[图2]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例1)的扫描型电子显微镜照片。
[图3]显示用实施例1中获得的多孔性纤维素粒子，进行标准聚氧乙烯的分离得到的标准曲线的图。
[图4]为用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例3)的扫描型电子显微镜照片。
[图5]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例6)的扫描型电子显微镜照片。
[图6]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例7)的扫描型电子显微镜照片。
[图7]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例8)的扫描型电子显微镜照片。
[图8]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例9)的扫描型电子显微镜照片。
[图9]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例10)的扫描型电子显微镜照片。
[图10]用本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子(实施例11)的扫描型电子显微镜照片。
具体实施方式
本发明的多孔性纤维素介质的制造方法为，利用包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的均一组合物会根据温度变化而发生液体-凝胶的相转变，由于温度变化使所述均一组合物形成凝胶，然后对凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解而转换为纤维素。
在本发明中，由温度变化导致的液体-凝胶的相转变是指，在某温度具有流动性的液态的组合物，在温度改变时失去流动性的现象。例如，虽然众多的均一溶液组合物中可确认到温度下降时粘度升高的现象，但在由液体形成的凝胶化中，流动性完全消失，多数情况下会白浊。
在本发明中，不添加用于引起凝胶化的试剂等，通过温度变化而发生凝胶化。
<乙酸纤维素>
就本发明使用的乙酸纤维素而言，只要是包含水、有机溶剂和该乙酸纤维素的组合物通过温度引起相转变即可，可以是任意的。
作为乙酸纤维素的代表性的物性，可列举聚合度和取代度。
对于聚合度，为了提高获得的多孔性纤维素粒子的机械强度，防止使用时向溶剂等的溶出，优选重量平均为50以上。另一方面，对于上限，只要是能够取得的，也可以使用任意的。
取代度对乙酸纤维素的溶解性提供较强的影响。
取代度是表示，在纤维素的1个葡萄糖残基具有的3个羟基之中有几个被取代的数值，在乙酸酯的情况下，有时也利用乙酸含量、乙酰基含量进行表现，但这些可以互相换算。通常，将取代度在2.8～2.9附近的作为三乙酸酯，2.5附近的作为二乙酸酯进行流通。在本发明中，只要是可以提供发生相转变的组合物的乙酸纤维素，可以是任何取代度。取代度是指，纤维素中1个葡萄糖残基具有的3个羟基之中，取代成其他取代基的数量的平均值。
对于乙酸纤维素而言，通常流通的有：作为纤维材料等广泛应用的所谓纤维素二乙酸酯(其中，典型的产品为乙酰基取代度为2.5，以乙酸的含量形式表示为(乙酰化度)55％附近)，和作为照片、液晶显示用的膜材料使用的三乙酸酯(乙酰基取代度为2.8～2.9，以乙酸的含量形式表示为(乙酰化度)60％附近)。对取代度为1附近的(虽然应称之为单乙酸酯，但由于通常不流通，因此，未作为通称建立)乙酸纤维素而言，有时也能溶解于水，极性溶剂类的选则较广。像这样，对于获得通常不流通的等级，可以通过例如：向比其取代度高的乙酸纤维素的溶液中添加计算量的碱进行溶剂分解，或将其的含水乙酸溶液利用硫酸等酸催化剂进行水解，并在适当的时机停止反应(中和硫酸)等而获得。例如，可以以二乙酸酯(纤维素二乙酸酯)作为起始物质，使其与每葡萄糖单元1.5当量的碱发生作用而获得。作为碱，易于使用由于为中性分子因此易于与众多有机溶剂混合，且反应迅速的肼、羟胺，但重要的是，只要是与原料溶液混合的碱，也可以利用氢氧化物，例如季铵氢氧化物等。
对于乙酰化的程度中的三乙酸酯、二乙酸酯、单乙酸酯的边界没有明确的区别，但在本发明中，为了方便，将2.7以上作为三乙酸酯，1.5以上且低于2.7作为二乙酸酯，0.5以上且低于1.5作为单乙酸酯。
<本发明中的组合物>
本发明的制造方法中使用的组合物，为包含所述乙酸纤维素、有机溶剂和水的均一组合物。均一组合物是指，水与有机溶剂与乙酸纤维素为均一混合的状态的组合物。
在本发明中，由温度变化导致的液体-凝胶的相转变是指，在某温度具有流动性的液态的组合物，在温度改变时失去流动性的现象。
在本发明中，可以通过适宜调整该组合物的组成、含有的乙酸纤维素的聚合度、取代度，来调整液体-凝胶的相转变发生的温度。
优选所述均一组合物在0℃和100℃的温度范围具有作为透明的流动性液体的温度范围，和在低于该温度范围的温度失去流动性的相转变温度。
对所述组合物中的乙酸纤维素、有机溶剂、水的含量而言，只要该组合物在给定的温度范围发生相转变即可，可以是任意的。
对该组合物中的乙酸纤维素的含量而言，优选为了使获得的多孔性纤维素具有适于实用的细孔直径和适度的硬度，优选为1～20重量％，进一步优选为5～15重量％。
对于所述组合物中含有的水与有机溶剂的比率，只要是可发生凝胶化的即可，可以采用任意比例。可列举例如，以重量比计为10:90～90:10的方式。
对本发明的制造方法中使用的所述组合物中的有机溶剂的种类和水的重量组成比而言，如上所述，只要是可发生相转变的即可，也可以是任意的。虽然可以使用所述非专利文献3中报告的相对于CDA的丙酮-水混合体系，相同的二噁烷-水混合体系，但对这些有机溶剂而言，由于在液体石蜡中溶解相当多的量、蒸气压高，因此，由于在分散处理的过程中伴随温度以外的物质移动的原因，容易发生未预期的凝胶化等，难以操作。因此，期望即使相对于液体石蜡等非极性液体，溶解性也低，且难以发生由蒸发导致的浓度变化，作为具有这样属性的溶剂，优选为相对于己烷那样的饱和烃不均一地混合，且沸点为120℃以上的有机溶剂。
作为相对于乙酸纤维素全体的溶解力高、并且具备所述性质的溶剂，被称为非质子性极性溶剂的溶剂有很多符合，可例示选自：DMSO、环丁砜、二甲基砜、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、N,N’-二甲基咪唑烷酮、六甲基磷酰三胺、四甲基脲等中的一种以上。
作为实际的组合物，可列举以下的例子。
[使用纤维素单乙酸酯的情况的一例]
对包含纤维素单乙酸酯5重量％、水55重量％、DMSO 45重量％的组合物而言，在高于55℃附近的温度显示透明粘稠的液态，在该温度以下成为白浊的凝胶状，该转换为可逆的。
[使用纤维素二乙酸酯的情况的例子]
对包含纤维素二乙酸酯5重量％、水20重量％、DMSO 80重量％的组合物而言，在70℃以上为液态，在50℃以下成为凝胶状，该变化为可逆的。
对包含纤维素二乙酸酯6.8重量％、NMP(N-甲基吡咯烷酮)71.6重量％、水21.6重量％的组合物而言，在20℃以下为凝胶状，在40℃以上成为透明液态，该变化为可逆的。
对包含纤维素二乙酸酯7.7重量％、N,N-二甲基乙酰胺73.7重量％、水18.6重量％的组合物而言，在20℃以下为凝胶状，在50℃以上成为透明液态，该变化为可逆的。
对所述相转变的温度而言，通常为有机溶剂的比率变大则降低，水的比率变大则升高。
从多孔性纤维素介质的制造中的操作容易程度方面，优选相转变温度为0℃到100℃，进一步优选为30～70℃。
<水解>
对获得的由包含乙酸纤维素的均一组合物形成的凝胶而言，通过对该凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解而转换成亲水性高的纤维素。为此，对乙酸纤维素的乙酰基进行除去。
对于乙酰基的除去，可以使用将其与金属氢氧化物(氢氧化钠、氢氧化钾)、季铵氢氧化物、氢氧化钡、氢氧化钙等进行反应的方法。另外，也可以在用于进行该乙酰基的除去的反应中使用胺类。作为胺类的例子，可列举氨、肼、羟胺、胍、烷基胺类等。
对于反应条件而言，由于所述化合物具有的相对于溶剂的溶解性、反应速度不同，因此，不能一概地决定，可以使用公知的方法，只要可将乙酰基除去至适合利用目的的程度即可。
反应结束后，利用不会对获得的多孔性纤维素造成不良影响的溶剂进行洗涤，根据需要添加防腐剂。
<多孔性纤维素介质的形状>
根据本发明的制造方法制造的多孔性纤维素介质，既可以以球状粒子形式也可以以整块形式利用。
在制作球状粒子或整块的情况下，虽然与在降低所述特定的组合物的温度而使其凝胶化后，对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工艺没有实质差异，但用于控制形状的工艺不同。为了制造整块，在具有任意形状的容器中使所述均一组合物发生相转变，但为了制造微粒，通常使溶液状的均一组合物以分散于与其不混合的分散介质中的状态进行温度变化，从而使其发生相转变。以下，对这些具体的方法进行简单说明。
<球状粒子>
作为本发明的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，可例举以下方式，其包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物，分散至与该均一组合物不混合的分散介质中而获得分散液的第一工序，和通过降低获得的分散液的温度而使所述组合物凝胶化，从而形成由所述组合物构成的凝胶化粒子的第二工序，和对获得的凝胶化粒子中包含的乙酸纤维素进行水解的第三工序。
另外，可以在所述第二工序和第三工序之间，包括将用于分离获得的凝胶化粒子的分离溶剂，添加至形成有凝胶化粒子的分散液中，在分离溶剂中分离凝胶化粒子的工序。
在本发明的球状多孔性纤维素粒子的制造方法中，使用了用于对所述组合物进行分散的分散介质。作为本发明可以使用的分散介质，只要是不会通过与所述组合物中的水、有机溶剂进行混合而引起所述组合物的不期望的凝胶化、相转变温度的极端变化，对目标的球状多孔性纤维素粒子的孔径造成不良影响即可，可以为任意的。
为了防止在分散所述组合物时所述组合物发生凝聚，优选分散介质在组合物的分散时具有某种程度的粘度。
作为分散介质的粘度，可列举于25℃为0.2～20Pa·s。
对分散介质而言，优选不会与所述组合物中包含的水、有机溶剂混合的非极性的分散介质，可列举例如：液体石蜡、凡士林那样的碳原子数20以上的烃、硅油、氟化烃。
由于凡士林在为特定的软化温度以下时会迅速地失去流动性，因此，在分散的凝胶化液的粒子容易进行再凝聚而形成团块的情况下，可以首先在软化温度以上制备分散液，将其先降低至软化温度以下，使凝胶化液滴彼此不能移动、接触，对提高粒子的收率的目的有效。凡士林的软化温度根据其种类而不同，可以适当地选择。
对本发明中的包含乙酸纤维素的组合物而言，被分散于分散介质中后，在从使其温度降低到使其凝胶化之间，需要保持分散状态。为此，优选向分散介质添加适当的分散稳定剂。
对分散稳定剂而言，只要具有提高所述组合物的分散状态的稳定性、延缓由组合物形成的粒子进行凝聚的速度的效果即可，可以是任意的。
作为这样的分散稳定剂，可列举：甘油、山梨糖醇酐、聚甘油、蔗糖等多元醇与高级羧酸的酯、包含少量极性基团的改性硅油等，也可以使用除此以外的市售的分散稳定剂。
作为将包含乙酸纤维素的所述组合物分散至所述分散介质中的方法，已经进行了形形色色的提案，从提供宽范围的粒径分布的方案到提供单分散的粒径的方案等各种各样。例如，就使用通常称为微反应器的容器，将液态的分散介质以适当的速度的流动中，从较细的喷嘴向其中注入凝胶化的均一组合物的方法而言，适于制造粒径均一的情况。
另外，可以使用如下各种方法：将本发明的流动性的均一组合物从孔径一定的膜向分散介质中挤出的方法，将本发明的流动性的均一组合物放入开有一定大小的孔的内筒，在分散介质中使其进行旋转，利用离心力挤出已凝胶化的均一组合物的方法，将根据需要包含分散稳定剂的分散介质与流动性的均一组合物送液至填充有一定大小的珠的柱中的方法，通过振动喷嘴将流动性的均一组合物注入分散介质中的方法，使用(超)声波的方法等。
在实施例中虽然提供了各种粒径的混合物，例示了最简单的利用搅拌的方法。该方法为通过将上述均一组合物向上述分散介质添加后，于相转变温度以上的温度进行搅拌混合，从而生成由上述组合物构成的大致球状的粒子，随后通过冷却至相转变温度以下，使变为分散液滴的均一组合物凝胶化。搅拌混合的条件可以根据目标的平均粒径适当进行选择。
需要说明的是，对于向上述分散介质添加包含乙酸纤维素的上述组合物时的上述分散介质的温度，可列举使得上述组合物保持液态的温度的方式。具体而言，可列举将分散介质的温度设定为高于上述组合物发生相转变的温度范围的温度的方式。通过将分散介质设定为这样的温度，上述组合物的搅拌混合变得容易。另一方面，由于即使流动性的均一组合物从相转变温度以上变为以下，到凝胶化为止也需要一些时间，因此进行添加时的凝胶化液和/或分散介质的温度不需要必须为相转变温度以上。
但是，优选在上述均一组合物保持流动性的状态下，将上述均一组合物添加至分散介质来进行分散。
在不满足该条件的情况下，生成的粒子为不规则的破碎形状，变得不适合于色谱的目的。但是，也能够在以凝胶状态发生破碎、分散后，使温度上升高于相转变温度来暂时融解凝胶，再次降低温度而使其凝胶化。
最终将上述分散介质冷却至低于上述组合物发生相转变的温度范围的温度时，上述组合物凝胶化。
<分离溶剂>
对这之后的程序没有特别限定，但在本发明的实施例中，可列举为了从分散介质取出凝胶化的乙酸纤维素而使用分离溶剂的方式。
可列举例如，为了从凝胶化的由上述组合物构成的粒子之中，仅将乙酸纤维素作为凝胶状粒子从分散介质中分离，因而向分散有上述组合物的分散介质添加分离溶剂的方式。
作为分离溶剂，使用与分散介质不混合的、在凝胶化的上述组合物之中，乙酸纤维素不溶但与其中的水及该组合物中的有机溶剂混合的溶剂。由此，可以防止凝胶化的上述组合物之中的乙酸纤维素再次溶解。
作为这样的分离溶剂，可列举水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺、或它们的混合物。
虽然可以将分散于分散介质中的状态的乙酸纤维素凝胶直接进行滤过，但通常由于分散介质粘度较高，因此，过滤中需要压力，变形或者破坏凝胶粒子的危险性升高。也能够通过向分散介质中添加可与其混合的低粘度的液体，而降低过滤时的压力。
需要说明的是，优选在分离溶剂中添加用于将乙酸纤维素分解而转换为纤维素(脱乙酰化)的试剂，例如，氢氧化钾、氢氧化钠那样的金属氢氧化物、胺类那样的碱，在分离工序时进行使其变化为纤维素的脱乙酰基反应。
在不向分离溶剂添加碱、不进行脱乙酰基反应的情况下，也可以在提取分离的包含乙酸纤维素的凝胶状的粒子之后，使其与碱发生反应。
对进行了脱乙酰基反应的多孔性纤维素粒子而言，通过用水等的适当的方法进行洗涤，通常以水湿的状态进行保存。在使其干燥的情况下，适量添加糖类、甘油等。在利用水湿进行长期保存的情况下，为了防止腐败，添加醇、叠氮钠等防腐剂。另外，也可以在添加了甘油、糖类、尿素等的状态下进行干燥。在使用时，通过常规方法填充至柱进行使用。
可以通过公知的适当的分级，从根据本发明的制造方法获得的多孔性纤维素粒子之中，筛选粒径(最大直径)为30～300μm的具有大致球状～球状的形状的粒子，将其用作色谱用的填充剂。作为色谱，可列举空间排阻色谱。可以利用于空间排阻色谱，也就是说，表示也可以通过结合适当的配体，利用于基于除了空间排阻以外的各种模式的色谱分离。其中，包括离子交换、疏水性、亲和(Affinity)等模式。
一般而言，对于分离纯化诸如利用生物技术制造的高分子，例如，激素、酶、抗体药物等，优选具有使得这些物质可充分进入的大小的细孔的基质。即，可以期待：使用填充了该粒子的柱，在以水作为流动相进行凝胶过滤层析时，在以聚乙二醇的分子量进行换算为大致103～107的范围的某些分子量区域发生分级。在实施例1的GPC中，分子量104～106的标准物质(聚乙二醇)在不同的时间洗脱，这表示可以通过本法制造的基质的细孔直径适于进行这些物质的分离纯化。对细孔的大小而言，可以通过改变待凝胶化的包含水、有机溶剂和乙酸纤维素的组合物中的乙酸纤维素的浓度，或凝胶化的条件(例如，调整均一组合物的冷却速度等)而进行精细调整。
以下，对于制作亲和色谱模式中使用的吸附体的方法进行说明。
可以使用蛋白质作为亲和配体。对本发明可以使用的蛋白质而言，可列举分子量为3～300kDa，优选为30～150kDa，且对于那些作为分离对象的例如为抗体那样的相对于蛋白质有亲和性的物质。
其中，作为亲和配体，蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体在抗体的蛋白质的分离中使用时的选择性较高，故优选。
在以分离抗体作为主要目的的情况下，作为配体，优选能够与免疫球蛋白的一部分进行特异性结合的那些。
所述功能性变异体，指天然氨基酸序列中具有至少1个变性，仍保持了伴随天然排列的至少1个功能的蛋白质。天然排列包括原本自然产生的氨基酸序列。作为氨基酸的变化，可列举将1个以上的氨基酸置换为另外的氨基酸，1个以上的氨基酸的删除和/或1个以上的氨基酸的追加或这些的任意组合。也可以举出相对于天然排列进行的追加、删除及取代的组合那样的方式。功能性变异体也可以包含蛋白质的片段或结构域。对功能性变异体的氨基酸序列而言，可以与天然氨基酸序列至少有70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同，且仍保持伴随天然排列的至少1个功能。
对相对于所述多孔性纤维素粒子的蛋白质的负载量而言，相对于多孔性纤维素粒子100重量份，优选为1.0～25重量份。
另外，可列举相对于多孔性纤维素粒子的体积每1ml，为1～50mg的方式。
在利用本发明的制造方法制作成的多孔性纤维素介质的制造方法中，可以进一步包括固定所述亲和配体的工序，从而制作结合有亲和配体的吸附体。
该吸附体也可以用作亲和层析用的分离剂。
作为其制造工序，可列举如下的方式。
首先，可以包含以下工序：对于利用所述的制造方法制造成的多孔性纤维素介质之中球状粒子的那些，用交联剂使其发生交联反应。
对于交联方法没有特别的限制，可以使用例如：环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、二氯丙醇等卤代丙二醇(ハロヒドリン)、双环氧乙烷、聚环氧乙烷那样的交联剂。
其次，可以包含对交联的纤维素粒子进行活化的工序。
为了使其活化，可以通过导入公知的反应性官能团进行活化。可以通过利用例如：溴化氰(CNBr)、N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、环氧化物及活化羧酸(NHS酯)等进行活化，从而变为比多孔性纤维素粒子本来具有的官能团更容易与作为配体的固定化化合物发生反应的官能团。然后，可列举随后，经过使其与作为配体的固定化的化合物发生反应，将配体与多孔性纤维素粒子固定化的工序的制造吸附体的方法。
与上述不同，作为吸附体的制造方法，可列举通过向存在多孔性纤维素粒子与作为配体的固定化的化合物的体系中，添加碳二亚胺那样的缩合试剂，或戊二醛那样的在分子中具有多个官能团的试剂进行缩合、交联，从而将多孔性纤维素粒子与配体固定，并获得吸附体的方法。
作为使多孔性纤维素粒子与亲和配体进行结合的另外的方式，可列举向纤维素、纤维素粒子导入甲酰基，使该甲酰基与蛋白质的氨基发生反应的方式。
对于导入甲酰基的反应，可列举例如：通过过碘酸氧化法对具有频哪羟基的多糖类进行氧化，在糖链上生成甲酰基的方法。
另外，可列举经由通过将环氧基的开环得到的甘油基与过碘酸盐发生作用的方法等得到的各种间隔基团(spacer)来导入甲酰基的方法。例如：作为间隔基团可以使用葡糖胺等那样的氨基糖。
作为使多孔性纤维素粒子的甲酰基与蛋白A那样的蛋白质进行结合的方法，可以使用公知的方法，可列举例如：将葡糖胺等那样的氨基糖作为间隔基团导入而成的多孔性纤维素粒子，与含有蛋白A的溶液发生反应的方式。作为这样的方法，可列举例如，日本特开2008-279366号公报中记载的方法。
<整块>
整块为将多孔性原料制成一体的团块而成。在使用上述粒子状填充剂的色谱中，展开液虽然也通过粒子的微小孔，但更多地通过粒子间间隙。与此相对，在整块中，通过的是一体的多孔体的微小孔。因此，一般而言，虽然与粒子状填充剂的情况相比，多数情况使得固体成分含量降低，而相对展开液的流动的阻力减少，但除了用作过滤材料的情况以外，本质的分离机理与用作填充剂的情况完全没有改变。
本发明的多孔性纤维素整块的制造方法包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物加入至成型容器，降低温度而使其在该成型容器内凝胶化的工序，和对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工序。
该方法使用的乙酸纤维素、有机溶剂，可以使用与用于球状粒子的制作中相同的物质。
在液相色谱中，展开液在分离剂之中的任一部分均以相同的速度进行移动，形成所谓活塞式流动(piston flow)是极其重要的。在填充剂中，各个粒子的特性的偏差通过混合而变得平均，因此允许粒子间的性质存在一些差异，但是承担液体的流动的大部分的粒子间空隙的均一性变得重要。因此，将填充剂填充到称为柱的容器时的技术变得重要。
与此相对，在整块中，极其重要的是生成的多孔质结构在相对于展开液的流动成直角的方向上为均一的，及整块与容器之间不能存在液体容易流动的间隙。对于制备在此叙述的在直角方向上均一的多孔体，不能通过与胶凝剂(沉淀剂)的接触、和作为公知技术的溶剂的蒸发来进行。
对本发明的利用乙酸纤维素的温度变化来导致凝胶化的方法而言，由于如果原料组合物的温度的均一化快于凝胶化速度，则可提供均一的凝胶，因此优选用于制备整块。
在制作整块时，将所述包含水、有机溶剂及乙酸纤维素的均一组合物投入任意形状的成型容器，随后通过使其温度降低而形成由该组合物形成的凝胶，将其直接、或者通过适当的方法进行干燥后，对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解。对用于水解的碱、水解的方法而言，可以使用与制作球状多孔性纤维素粒子中使用的相同的碱、方法。
评价制备成的整块，需要如已经叙述的那样，以没有间隙、没有局部压紧的方式容纳于适当的容器中。用于此的方法可以是公知的、非公知的任意方法。通常，利用凝胶化而生成整块时，很多情况产生一些收缩，与容器之间存在间隙。这样的情况下，可以将容器壁面修饰为与纤维素类物质的亲和性强的化学结构(例如在表面结合纤维素)使得不存在间隙，或者通过使得凝胶的环境变化导致的收缩、溶胀，或容器的尺寸为可调整等而无间隙地容纳。
实施例
以下举出实施例，对本发明进一步加以详细的说明，但不言而喻，本发明的范围不仅限于相关实施例。
<实施例1>
1.纤维素单乙酸酯溶液的制备
将于100℃真空干燥了1小时的纤维素二乙酸酯(乙酰化度54.75％，6％丙酮溶液粘度0.117Pa·s(25℃))14.70g溶解于78mL的DMSO(东京化成(株)制GR级)。在另一容器中量取单水合肼(Hydrazine monohydrate)>98％(东京化成(株)制)4.20g、DMSO 12.01g，混合之后，将总量滴加至上述纤维素二乙酸酯溶液，进行混合使得不留沉淀。将该液体于70℃保持17小时，获得了纤维素单乙酸酯溶液。向获得的液体20.2g中添加水12.1g，充分搅拌混合之后，浸于温水浴中，在逐步升温、降温时，在高于40～45℃的温度为粘稠但具有流动性的透明液体，但在此以下的温度变得白浊并失去了流动性。
2.多孔性纤维素粒子的制备
将液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.87，(Chemicals Industrial productsCollect Associate)鹿1级)154g、乳化剂TSG10(Nihon Emulsion制)0.41g加入至塑料(PE)容器中，在烘箱中保持于70℃。一方面，将1制备的纤维素单乙酸酯溶液与水各自6.6g于60℃进行充分混合，冷却至室温时形成了白浊的果冻状固体。将其投入所述加温了的液体石蜡，继续加温30分钟之后，使用直径4cm的搅拌桨，以950～1000rpm进行搅拌了5分钟。将获得的分散液移至1L烧杯，进行了水冷却。于20℃保持3小时之后，向其中添加氢氧化钾0.75g、水20g、乙醇150mL的混合液，缓慢搅拌1小时。保持原样静置一夜，则确认到在以乙醇为主的下层的底部，有白色的微粒沉降。图1中显示了本沉淀的显微镜照片，可知基本为接近正球的形状。另外，在将该粒子反复水洗之后，用叔丁醇置换水，并冷冻干燥后进行的电子显微镜照片中，可见多孔质的表面(图2)。另外，将经洗涤的粒子于100℃进行真空干燥，利用KBr压片法测定了红外吸收光谱，完全观察不到源于乙酰基的1720cm-1附近的羰基伸缩振动。
3.空间排阻色谱
收集三批同样进行所获得的粒子，以水分散的状态直接利用不锈钢制筛进行分级，收集150μm～106μm的部分，沉降体积为约10mL。将其约8mL填充至内径10mm、高度100mm的柱，利用下述要领，以超纯水作为流动相，注入表1所示的标准聚氧乙烯的样品，利用差示折光检测器进行了检测。将按照常规方法描绘的标准曲线示于图3。
使用柱 HR10/100(GE Healthcare)
Tricorn10/100(GE Healthcare)
流量 0.05ml/min(分析时间180min～240min)
◇PEO
洗脱液 超纯水(排气)
标准物质(种类、浓度、灌注量)
[表1]
TSKgel标准聚氧乙烯(从东曹(株)购入)
分子量 concn(mg/ml)
PEO 940,000 5.0
SE-150 610,000 5.0
SE-70 240,000 5.0
SE-30 120,000 5.0
SE-8 92,000 5.0
SE-5 37,000 5.0
SE-2 13,000 5.0
Blue dextran 2000 2,000,000 3.0
进样量10μL
<实施例2>
多孔性纤维素粒子的制备
将VTR纤维素二乙酸酯(乙酰化度54.75％，6％丙酮溶液粘度0.117Pa·s(25℃))16.27g溶解于DMSO 182.49g。取本溶液39.19g于烧杯中，一边加温至80℃一边添加DMSO11.01g与水11.01g的混合液，进行搅拌混合。提供了透明的粘性液体，但自然冷却至室温时发生了凝胶化。
一方面，向750mL的液体石蜡(关东化学，鹿1级)添加了乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)2.04g，保温于90℃。向其中投入所述凝胶时，凝胶溶解，集中于下层。将放入了该液的容器浸于80℃的水浴，同时向内容液***
Figure BDA0001216349140000181
的分散器，以400rpm旋转、搅拌5分钟。搅拌结束后，将容器浸于水浴，进行冷却。3小时后，在容器底沉淀了粒状物和一部分块状的凝聚物。这里，添加将KOH 3.09g溶解于水50mL而成的溶液，以约10rpm进行缓慢搅拌。放置一夜后，添加400mL的水缓慢搅拌，之后对下层进行分液。利用少量的干冰对其进行中和，之后用水洗涤。利用显微镜观察，为直径约50μm的球状物。在该物质的红外光谱中，未确认到表示乙酸酯的羰基的1720cm-1附近的吸收。
<实施例3>
多孔性纤维素粒子的制备
将纤维素二乙酸酯(乙酰化度54.75％，6％丙酮溶液粘度0.117Pa·s(25℃))2.60g溶解于NMP(N-甲基吡咯烷酮)25.01g和水5.00g。将本溶液加温至55℃，同时添加NMP3.71g与水3.70g的混合液，搅拌混合。提供了透明的粘性液体，但利用冰浴冷却时发生了凝胶化。
一方面，向400mL的液体石蜡(关东化学，鹿1级)添加了乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)0.64g，保温于55℃。向其中投入所述凝胶时，凝胶溶解，集中于下层。将放入有该溶液的容器浸于55℃的水浴，同时向内容液***
Figure BDA0001216349140000182
的分散器，以350rpm旋转、搅拌10分钟。搅拌结束后，将容器浸于水浴，进行冷却。2小时后，在容器底沉淀了粒状物和一部分块状的凝聚物。这里，添加水200mL，以约10rpm缓慢搅拌，对下层进行分液。接着添加水200mL，重复该操作，从下层提取了凝胶。向其中添加KOH2.51g，缓慢搅拌，放置两夜后，废弃上清液。利用玻璃过滤器滤过残渣，利用水反复洗涤。将获得的粒子的显微镜照片示于图4，可知基本为接近正球的形状。
<实施例4>
多孔性纤维素二乙酸酯整块的制备
将与实施例1中使用的相同的包含纤维素二乙酸酯6.8重量％、NMP(N-甲基吡咯烷酮)71.6重量％、水21.6重量％的组合物充满内径19mm的玻璃小瓶，于60℃形成透明的溶液，之后自然冷却至15℃。一夜后，组合物变成了白浊不透明的多孔性纤维素二乙酸酯的凝胶。将其反复用水洗涤而获得的白色圆柱状纤维素二乙酸酯，直径为约18mm。
多孔性纤维素整块的制备
将获得的多孔性纤维素二乙酸酯整块的小片0.38g浸于由氢氧化钾0.2g、水1mL、乙醇10mL形成的液中1昼夜之后，利用水反复洗涤。就获得的物质而言，大小虽然缩至氢氧化钾处理前的约85％，但为白色且形状完全没有变化。切取该整块的小片，在滤纸上滚动，除去表面的附着水后进行称量时，为104.9mg。将该物质放至聚苯乙烯的称量皿，利用90℃的烘箱干燥了1小时后时，呈收缩的半透明的坚固小片，其重量为9.9mg，即使进一步延长干燥，重量也不再减少。该整块的固体成分率为9.4％。将该经干燥的整块片破碎，根据通用的方法将极少的量与溴化钾共同成型为压片，测定了红外吸收光谱，但完全观察不到源于乙酰基的1720cm-1附近的羰基伸缩振动，明确显示已转换为纤维素。
<实施例5>
多孔性乙酸纤维素整块及纤维素整块的制备
将与实施例1中使用的相同的包含纤维素二乙酸酯7.7重量％、N,N-二甲基乙酰胺73.7重量％、水18.6重量％的组合物，通过与实施例4相同的操作，获得了多孔性乙酸纤维素凝胶。该物质水洗之后的直径为约17mm。利用与实施例4相同的条件对该整块的小片进行氢氧化钾处理，水洗后时，大小虽然缩至74％，但形成了形状没有变化的白色固体，其固体成分率为12.7％。在红外线吸收光谱中，未检测到乙酰基。
<实施例6>
1.多孔性纤维素粒子的制备
将液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.87，鹿1级)385g、乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)2.05g加入至500mL可拆卸式烧瓶，利用水浴保持于60℃。一方面，将实施例1-1制备的纤维素单乙酸酯溶液16.5g、DMSO3.5g、水24.5g于60℃进行充分混合。将其投入所述加温了的液体石蜡，继续加温10分钟之后，使用直径6cm的搅拌桨，以250rpm搅拌了5分钟。将获得的分散液移至平坦的金属制容器，进行了冰冷却。于10℃保持30分钟使其凝胶化后，移至1L三角烧瓶，添加氢氧化钾1.9g、水20g、乙醇150mL的混合液及庚烷150mL，缓慢搅拌1小时。保持原样静置一夜之后，添加水，对包含凝胶化的微粒的下层进行分离，添加乙酸进行中和之后，利用乙醇和水对获得的微粒进行洗涤。收集四批同样进行所获得的粒子，以水分散的状态直接利用不锈钢制筛进行分级，收集50～106μm的部分，则沉降体积形成约10mL。
2.交联多孔性纤维素粒子的制备
向100mL三颈烧瓶中添加实施例6-1中获得的多孔性纤维素粒子7.9mL、将硫酸钠8.7g溶解于水23.6g而成的溶液，于50℃进行搅拌。添加45重量％的氢氧化钠水溶液0.48g和硼氢化钠75mg，进行搅拌。将45重量％氢氧化钠水溶液4.86g和环氧氯丙烷4.98g，以分别进行7等分的量隔30分钟进行添加，花费了大约3小时。添加结束后，于50℃反应16小时。冷却至40℃以下后，添加乙酸0.52g进行中和。过滤反应混合物并回收粒子，利用纯水进行过滤并洗涤，获得了目标的交联多孔性纤维素粒子。
3.蛋白A向交联多孔性纤维素粒子的固定化和柱的制作
利用玻璃过滤器滤过实施例6-2中获得的交联多孔性纤维素粒子，利用乙腈进行洗涤，获得了载体3.3mL。将载体移液至烧瓶，添加包含乙腈2.5mL与碳酸二(N-琥珀酰亚胺)55mg的乙腈溶液10mL，于4℃、180rpm进行振荡。然后，添加包含N,N-二甲基氨基吡啶41mg的乙腈溶液1mL，振荡22小时进行反应。利用玻璃过滤器进行滤过，按照乙腈30mL、包含5％乙酸的二噁烷30mL、甲醇30mL、2-丙醇30mL的顺序进行洗涤，获得了活化载体。取活化载体1mL至玻璃过滤器中，利用偶联缓冲液(0.1M磷酸钠，pH 7.0)进行洗涤。将活化载体移至烧瓶，添加蛋白A为53.6mg/mL的含蛋白A溶液168μL、偶联缓冲液2mL，于5℃、130rpm振荡22小时，进行固定。利用玻璃过滤器进行滤过，利用偶联缓冲液洗涤。利用Bradford法测定了反应之后的滤液，结果可知，每1mL载体固定了蛋白A 9.0mg。然后将载体转移至烧瓶，添加1M Tris盐酸(pH 8)2mL，于25℃、130rpm振荡2小时，封闭未反应活性基团。利用玻璃过滤器进行滤过，将洗涤液1(0.1M Tris盐酸、0.5M氯化钠，pH 8.0)、洗涤液2(0.1M乙酸铵缓冲液、0.5M氯化钠，pH 4.0)交替3个循环进行洗涤。利用纯水洗涤固定化载体1mL，装入Tricorn 5/50Column。另外，将Sepharose 4FastFlow(GE Healthcare)也以相同的操作制作成柱(蛋白A固定量10mg/mL)。
4.蛋白固定柱的抗体吸附容量
将实施例6-3中制作的蛋白A固定柱设置于液相色谱装置AKTAexplore(GEHealthcare Bioscience)，使吸附缓冲液(20mM磷酸缓冲液、150mM氯化钠，pH 7.2)以1mL/min.或者0.4mL/min.的条件进行流动，使其平衡化之后，注入制备成1mg/mL的源自人血清的γ-球蛋白(和光纯药)。持续注入，直至达到洗脱液的280nm的吸光度的15％为止，之后利用吸附缓冲液进行洗涤，之后将吸附缓冲液置换为20mM柠檬酸(pH 2.4)。
动态吸附容量(DBC)根据洗脱液的280nm时除了非吸附成分以外的吸光度达到注入样品的吸光度的10％为止所注入的样品量进行计算。将各固定柱的DBC示于表2。
[表2]
Figure BDA0001216349140000211
<实施例7>
多孔性纤维素粒子的制备
将液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.87，鹿1级)771g、乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)4.11g加入至1L可拆卸式烧瓶，利用水浴保持于60℃。一方面，将实施例1-1制备的纤维素单乙酸酯溶液33g、DMSO 7g、水49g于60℃进行充分混合。将其投入所述已加温的液体石蜡，继续加温10分钟之后，使用直径6cm的搅拌桨，以200rpm搅拌了10分钟。将获得的分散液移至平坦的金属制容器，进行了水冷却。花费15分钟冷却至20℃，之后一边向水浴一点点添加冰，一边进一步花费15分钟冷却至10℃，使其凝胶化。于10℃保持30分钟之后，移至2L三角烧瓶，添加氢氧化钾3.1g、水200g、乙醇200mL的混合液及庚烷200mL，缓慢搅拌1小时，获得了微粒。保持原样静置一夜之后，添加水，对包含凝胶化的微粒的下层进行分离，添加乙酸进行中和之后，利用乙醇和水洗涤获得的微粒。微粒以水分散的状态直接利用不锈钢制筛进行分级，收集50～106μm的部分，沉降体积约8mL。通过与实施例6相同的操作进行交联，对蛋白A进行固定而制作成的柱的动态吸附容量为，于流速1.0mL/min.为7mg，于流速0.4mL/min.为18mg。
<实施例8>
多孔性纤维素粒子的制备
将液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.87，鹿1级)13g、乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)75mg加入至20mL样品管，利用水浴保持于60℃。一方面，将实施例1-1制备的纤维素单乙酸酯溶液1.65g、DMSO 0.35g、水2.45g于60℃进行充分混合。将该纤维素单乙酸酯溶液1.5g投入所述加温了的液体石蜡，继续加温5分钟之后，用手摇动1分钟进行了搅拌。将样品管进行冰冷却，于10℃保持30分钟而进行了凝胶化，之后移至100mL三角烧瓶，添加氢氧化钾0.1g、水1g、乙醇20mL的混合液及庚烷20mL，缓慢搅拌1小时，获得了微粒。保持原样静置一夜之后，添加水，对下层的微粒进行分离，利用乙醇和水进行洗涤。
<实施例9>
多孔性纤维素粒子的制备
将液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.87，鹿1级)13g、乳化剂TSG10(NihonEmulsion制)75mg加入至20mL样品管，利用水浴保持于60℃。一方面，将实施例1-1制备的纤维素单乙酸酯溶液1.65g、DMSO 0.35g、水2.45g于60℃进行充分混合。将该纤维素单乙酸酯溶液1.5g投入所述加温了的液体石蜡，继续加温5分钟之后，用手摇动1分钟进行了搅拌。将样品管进行水冷却，花费15分钟冷却至20℃，之后一边向水浴一点点添加冰，一边进一步花费15分钟冷却至10℃。于10℃保持30分钟而进行了凝胶化之后，移至100mL三角烧瓶，添加氢氧化钾0.1g、水1g、乙醇20mL的混合液及庚烷20mL，缓慢搅拌1小时，获得了微粒。保持原样静置一夜之后，添加水对下层的微粒进行分离，利用乙醇和水进行洗涤。
<实施例10>
多孔性纤维素粒子的制备
将实施例9的纤维素单乙酸酯溶液的DMSO变为NMP(N-甲基吡咯烷酮)，以与实施例9相同的操作制备了多孔性纤维素粒子。
<实施例11>
多孔性纤维素粒子的制备
将实施例9的纤维素单乙酸酯溶液的DMSO变为N,N-二甲基乙酰胺，以与实施例9相同的操作制备了多孔性纤维素粒子。
工业实用性
本发明的制造方法利用包含乙酸纤维素的特定的组合物可根据温度变化而发生凝胶化的性质，进行了多孔性纤维素介质的制造。
在乙酸纤维素的凝胶化的过程中，细孔的大小为均一的。这方面与传统的多孔性纤维素介质的制造方法中，在细孔的形成的过程中发生溶剂的蒸发，从而产生物质的移动的方式不同。另外，根据本发明的制造方法获得的多孔性纤维素介质的细孔的大小，为数千
Figure BDA0001216349140000231
左右的较大的大小。根据本发明的制造方法获得的多孔性纤维素介质的硬度，与目前存在的市售品为同程度。根据本发明的制造方法获得的多孔性纤维素介质，其形状为球状粒子、为整块，均作为分离剂有用。

Claims (12)

1.球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物，分散至与该均一组合物不混合的分散介质中获得分散液的第一工序，和降低获得的分散液的温度而使所述组合物凝胶化，从而形成由所述组合物构成的凝胶化粒子的第二工序，和对获得的凝胶化粒子中包含的乙酸纤维素进行水解的第三工序，其中所述分散介质为碳原子数20以上的烃、硅油或氟化烃。
2.根据权利要求1所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括：在所述第二工序和第三工序之间，将用于分离获得的凝胶化粒子的分离溶剂，添加至形成有凝胶化粒子的分散液中，在分离溶剂中分离凝胶化粒子的工序。
3.根据权利要求2所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其中，所述分离溶剂为水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺、或它们的混合物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的球状多孔性纤维素粒子的制造方法，其包括向所述分散介质中添加分散稳定剂。
5.多孔性纤维素整块的制造方法，其包括：将包含乙酸纤维素、有机溶剂和水的流动性的均一组合物加入至成型容器，降低温度而使其在该成型容器内凝胶化的工序，和对获得的凝胶中包含的乙酸纤维素进行水解的工序。
6.根据权利要求1～3、5中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物中的有机溶剂为沸点为120℃以上，与水混合、且与饱和烃不混合的溶剂。
7.根据权利要求1～3、5中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物中包含的有机溶剂为非质子性极性溶剂。
8.根据权利要求1～3、5中任一项所述的制造方法，其中，所述均一组合物在0℃～100℃的温度范围具有作为透明的流动性液体的温度范围，和在低于该温度范围的温度失去流动性的相转变温度。
9.根据权利要求1～3、5中任一项所述的制造方法，其中，所述乙酸纤维素为选自纤维素二乙酸酯及纤维素单乙酸酯中的1种以上。
10.吸附体的制造方法，其包括：将亲和配体固定至用权利要求1～4中任一项所述的制造方法获得的多孔性纤维素粒子、或用权利要求5所述的制造方法获得的多孔性纤维素整块的工序。
11.根据权利要求10所述的吸附体的制造方法，其中，所述亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体中的一种以上。
12.目标物质的纯化法，其包括：将用权利要求10或11中所述的制造方法获得的吸附体与包含目标物质的混合物进行接触，使目标物质结合至固定于吸附体的亲和配体的第一工序，和对结合至吸附体的亲和配体的目标物质进行分离的第二工序。
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