CN109070054B - 多孔性纤维素介质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够由乙酸纤维素适宜地制造多孔性纤维素介质的新型方法。多孔性纤维素介质的制造方法包括：准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液的工序；以及将上述乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而得到混合溶液的工序。

Description

多孔性纤维素介质的制造方法
技术领域
本发明涉及多孔性纤维素介质的制造方法。
背景技术
以纤维素为首的多糖及其衍生物已被利用于各种各样的用途。例如，就它们的微多孔体而言，其自身可作为吸附剂，还可以通过对其表面进行一定的化学修饰而赋予吸附、分离的功能。
近年来，由于酶利用的普及、生物医药的开发等，以蛋白质为首的生物高分子的分离纯化成为了重要的技术课题之一。用于解决该课题的重要方法为色谱。在色谱中可使用分离剂，在所述分离剂中，与目标物或作为除去对象的杂质发生相互作用的一定原子团(常常将其称为选择物)和被称为基质的固体发生结合。
不具有蛋白质的非特异性吸附这一点，是作为用于分离生物高分子的材料极其重要的特性，因此，多糖类作为基质而得到了重用。另外，由于多糖类在分子内具有很多羟基，因此能够以此为立足点经由醚键、酯键而容易地与选择物结合，这也成为多糖类得到重用的重要原因。
另外，为了分离纯化生物高分子，通常采用以下方法：使与作为目标的分子具有一定亲和性的选择物结合于基质，从而使目标分子发生吸附后，利用一定的方法使被吸附的目标分子游离而进行回收。为了获得大量的目标分子，要求能够结合大量的选择物。进一步，为了使该选择物与分子量大的生物高分子有效地发生相互作用，要求基质具备能够使目标分子自由出入的多孔性结构。换言之，在将该基质填充于柱而进行空间排阻色谱时，需要显示出大于待纯化的分子与配体合起来的尺寸的排阻极限。
这样的基质多数情况下是以粒子的形式填充于被称为柱的管中来使用的。另一方面，近年来备受瞩目的新的形态是被称为整块(monolith)的一体的多孔体。其可通过收纳于被称为毛细管的细管、或柱等容器中而被用于相同的用途。比较薄的面积大的整块也可以作为过滤膜使用。
作为这样的基质的易使用度的主要原因，除了对分离对象的选择性以外，还可列举其高物理强度。即，弹性模量低的基质在色谱、过滤中在液体、气体流过时，会受到压缩变形、断裂，结果会导致色谱柱内的液体的流动变得不均一，进而发生堵塞，由此会导致柱的分离效率显著降低。高物理强度为重要的特性，在这点上，纤维素在多糖类中也是优异的材料。
此外，作为多糖的一般特征，纤维素具有以下优点：其表面具有醇性羟基，因此可以通过化学反应结合多种原子团；可以大量地且比较廉价地获取高纯度的原料等。
基于上述理由，已开发了以生物高分子的分离纯化为主要目的的多孔性纤维素介质。作为用于制造该多孔性纤维素介质的方法，已知有将纤维素以一定的方法溶解之后进行再生的方法。另一方面，也发现了若干种将有机酸酯作为起始原料的方法。与将纤维素本身直接溶解时存在需要特殊溶剂、溶液的粘度非常高等难点的情况相对，这样的方法利用了以下优点：有机酸酯能够溶解于多种溶剂；纤维素的有机酸酯可以基于与各种有机酸的各种结合率或聚合度，以稳定的品质实现工业上的供给；以及，能够容易地分解酯键而对纤维素进行再生等。
作为多孔性纤维素介质的制造方法，例如在专利文献1中记载了下述内容：将使纤维素有机酸酯溶解于诸如卤代烃这样的有机溶剂而成的溶液分散于水性介质中，以形成酯溶液的微小液滴，向其中添加铵盐等水解促进剂进行该酯的水解，由此形成纤维素微小粒子。
另外，在专利文献2中记载了下述方法：将纤维素脂肪酸酯与纤维素脂肪酸酯的凝胶化剂溶解在有机溶剂中而制成溶液，将该溶液搅拌添加至水性介质中以使其形成液滴，进一步添加促凝剂而使液滴中的纤维素脂肪酸酯成为凝胶粒子，从生成的粒子中除去凝胶化剂、促凝剂及溶剂，由此制造多孔球状粒子。
在专利文献3中记载了下述方法：将纤维素溶解于多聚甲醛和二甲亚砜的混合液中，将该溶解液分散于分散介质后，投入作为凝固剂的硅化合物而使纤维素的分散液滴发生凝胶化凝固，从而制作粒状纤维素凝胶。
在非专利文献1中记载了下述内容：将乙酸纤维素溶解于水溶性的有机溶剂(丙酮与DMSO的混合溶剂)并使其分散于水中，由此使包含乙酸纤维素的溶液与水接触而凝固，形成多孔性的粒子。
在非专利文献2中记载了下述内容：将乙酸纤维素溶解于DMSO，之后添加无水硫酸钠并进行搅拌，将混合物投入酸凝聚浴槽(盐酸)而得到纤维素粒子(珠)。并且记载了为了提高珠的多孔性而将采集后的珠浸渍于大量温水中来除去硫酸钠的方法。另外，在非专利文献3中报道了下述内容：在含有包含水的溶剂和乙酸纤维素的均一组合物达到某一温度以下时，会发生相转变(液态-凝胶态)而引起凝胶化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭62-277401号公报
专利文献2：日本特开昭63-95237号公报
专利文献3：日本特开昭57-159801号公报
非专利文献
非专利文献1：Chen,L.F.；Tsao,g.T.Biotechnol.Bioeng.1976,18,1507
非专利文献2：Bai,Y.-X.；Li,Y.-F.Carbohydr.Polym.2006,64,402
非专利文献3：A.J.Reuvers等,J.Polym.Sci.,1986,24,793
发明内容
发明要解决的问题
例如，在专利文献1和2的方法中，使用了包含卤代烃的溶剂，且为了在制作粒子时通过汽化而进行该溶剂的除去，需要较大的能量和用于回收发生了汽化的溶剂的装置。另外，在专利文献2、3中记载的那样的使用了促凝剂、凝固剂的方法中，在形成的液滴中，在与促凝剂等接触的部分会形成致密的纤维素脂肪酸酯的膜，因而有时会成为扭曲的粒子形式。因此，在如专利文献2、3中记载的那样在形成液滴后进行凝胶化的情况下，存在导致反应产生不均的可能性。
另外，在非专利文献1中记载了使用甲醛和盐酸使所形成的珠发生交联反应从而使珠交联。另外，在非专利文献2中记载了为了在粒子中设置细孔而使用细孔形成剂。然而，在非专利文献1及非专利文献2中均包括在形成粒子时对其表面进行处理的工序，而为了获得多孔性纤维素粒子，需要将用于表面处理的物质除去。
像这样，关于制造多孔性纤维素介质的方法，已知有各种各样，但仍进一步追求能够由乙酸纤维素适宜地制造多孔性纤维素介质的新型方法。
在这样的情况下，本发明的主要目的在于提供能够由乙酸纤维素适宜地制造多孔性纤维素介质的新型方法。
解决问题的方法
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究。结果发现，利用包括以下工序的多孔性纤维素介质的制造方法，可以适宜地制造多孔性纤维素介质，所述工序包括：准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液的工序，以及将该乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合的工序。更具体而言，在本发明中，发现了可以通过调整包含乙酸纤维素的混合溶液中的催化剂的量、种类而对基于脱乙酰化剂的乙酸纤维素的脱乙酰化速度进行调整。由此，例如在以多孔性纤维素粒子的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，通过调整催化剂的量、种类，可以使上述混合溶液以分散的状态按照期望的速度发生混合溶液的凝胶化，从而适宜地制造由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素粒子。另外发现，例如在以多孔性纤维素整块的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，通过调整催化剂的量、种类，可以以使整块中适宜地形成多孔性结构的速度发生混合溶液的凝胶化。本发明是基于这些见解并进一步经过反复研究而完成的。
项1.多孔性纤维素介质的制造方法，其包括：
准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液的工序；以及
将上述乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而得到混合溶液的工序。
项2.根据项1所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，上述催化剂为选自烷氧化物、胺化合物、弱碱性无机化合物及N-羟基胺衍生物中的至少一种。
项3.根据项2所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，上述胺化合物为叔胺，上述弱碱性无机化合物为碳酸盐。
项4.根据项1～3中任一项所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，使上述混合溶液以在成型容器内静置的状态进行上述乙酸纤维素的脱乙酰化反应，得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素整块。
项5.根据项1～4中任一项所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，将上述混合溶液和与上述混合溶液不混合的分散介质混合，使上述混合溶液以分散的状态进行上述乙酸纤维素的脱乙酰化反应，得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素粒子。
项6.根据项5所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，上述分散介质为液体石蜡。
项7.吸附体的制造方法，其包括：将亲和配体固定至利用项1～6中任一项所述的制造方法得到的多孔性纤维素介质的工序。
项8.根据项7所述的吸附体的制造方法，其中，上述亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体中的至少一种。
项9.标的物质的纯化方法，其包括：
使吸附体与包含标的物质的混合物接触而使上述标的物质结合于亲和配体的第一工序，所述吸附体是使上述亲和配体与利用项1～6中任一项所述的制造方法得到的多孔性纤维素介质结合而得到的；以及
对结合于上述吸附体的上述亲和配体的上述标的物质进行分离的第二工序。
发明的效果
根据本发明，可以提供能够由乙酸纤维素适宜地制造多孔性纤维素介质的新型的方法。
附图说明
[图1]实施例1中得到的固体的破裂面的电子显微镜照片的图像。
[图2]实施例2中得到的凝胶珠的光学显微镜照片。
[图3]实施例5中得到的珠的光学显微镜照片。
[图4]实施例5中测定的红外吸收光谱。
具体实施方式
本发明的多孔性纤维素介质的制造方法包括以下工序：准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液的工序；及将该乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而得到混合溶液的工序。通过使本发明的多孔性纤维素介质的制造方法具备这样的构成，可以由乙酸纤维素适宜地制造多孔性纤维素介质。以下，对本发明的多孔性纤维素介质的制造方法进行详述。
在本发明的多孔性纤维素介质的制造方法中，通过将乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合，在混合溶液中，乙酸纤维素的脱乙酰化得以进行，发生液体-凝胶的相转变，利用该过程来制造多孔性纤维素介质。
需要说明的是，在本发明中，基于脱乙酰化的液体-凝胶的相转变是指：具有流动性的液态的上述混合溶液随着脱乙酰基反应的进行而丧失流动性的现象。例如，在众多的溶液中确认到了在温度下降时粘度升高的现象，而在由液体起始的凝胶化中，流动性实质上完全丧失，在多数情况下得到的凝胶会发生白浊。在本发明中，通过将乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合，从而使乙酸纤维素的脱乙酰基反应进行而引起凝胶化。
在本发明的制造方法中，首先，准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液。就乙酸纤维素而言，只要是可通过脱乙酰化而发生上述相转变，则可以是任意的乙酸纤维素。作为乙酸纤维素的代表性的物性，可列举聚合度和取代度。可以通过适宜调整乙酸纤维素的聚合度、取代度而对引起液体-凝胶的相转变的发生的脱乙酰化的条件进行调整。
关于聚合度，为了提高获得的多孔性纤维素介质的机械强度、防止使用时向溶剂等溶出，优选以重均聚合度计为50以上。另一方面，对于上限，只要是能够取得的即可，可以使用任意的聚合度。
取代度会对乙酸纤维素的溶解性带来重要影响。取代度是表示在纤维素的1个葡萄糖残基具有的3个羟基中有几个被取代的数值。对于乙酸酯的情况，有时也利用乙酸含量、乙酰基含量来表现，但这些可以相互换算。通常，取代度在2.8～2.9附近的作为三乙酸酯进行流通、取代度在2.5附近的作为二乙酸酯进行流通。在本发明中，只要是会发生上述相转变的乙酸纤维素即可，可以为任何取代度。
对于乙酸纤维素而言，通常流通的有：被广泛用作纤维材料等的所谓二乙酸纤维素(其中，典型的产品为乙酰基取代度为2.5的二乙酸纤维素，以乙酸的含量表示时(乙酰化度)为55％左右)，和被用作照片、液晶显示的膜材料的三乙酸酯(乙酰基取代度为2.8～2.9的三乙酸酯，以乙酸的含量表示时(乙酰化度)为60％左右)。就取代度为1左右的乙酸纤维素(应称之为单乙酸酯，但由于通常不流通，因此未作为通称而被确立)而言，有时也溶于水，极性溶剂类的选择较广。像这样，对于通常不流通的等级，可以通过例如向比其取代度高的乙酸纤维素的溶液中添加计算量的碱进行溶剂分解，或利用硫酸等酸催化剂使其含水乙酸溶液发生水解并在适当的时刻停止反应(中和硫酸)等而获得。例如，可以以二乙酸酯(二乙酸纤维素)作为起始物质，使其与每葡萄糖单元为1.5当量的碱发生作用而获得。作为碱，由于为中性分子因此容易混合到众多有机溶剂中、且反应迅速的肼、羟基胺是易于使用的，但关键在于只要是与原料溶液混合的碱即可，也可以利用氢氧化物、例如季铵氢氧化物等。
在乙酰化程度方面，三乙酸酯、二乙酸酯、单乙酸酯的边界并没有明确区别，但在本发明中，为了方便，将2.7以上作为三乙酸酯、1.5以上且低于2.7作为二乙酸酯、0.5以上且低于1.5作为单乙酸酯。
作为溶解乙酸纤维素的溶剂，只要可使乙酸纤维素溶解的那些即可，没有特别限制，由于本反应使用碱催化剂，因此会导致其失活的酸性溶剂、例如乙酸等是不优选的，优选对脱乙酰化剂、催化剂的溶解性高的极性溶剂。作为这样的溶剂的例子，可例示：四氢呋喃(THF)、二甲基醚(DME)、乙二醇单甲醚、乙二醇单***、二乙二醇单甲醚、二乙二醇单***、三氟乙醇、乙酰胺、甲酰胺等极性溶剂；二甲亚砜(DMSO)、环丁砜、二甲基砜、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N’-二甲基咪唑烷酮、六甲基磷酰三胺、四甲基脲等非质子型极性有机溶剂。另外，在如后所述使其分散在分散介质中而制造粒子的情况下，需要使溶剂与分散介质不混合。作为满足这些条件且与例如作为廉价的分散介质的液体石蜡不混合的、一般流通的溶剂而特别优选的溶剂，可列举DMSO、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺、甲酰胺等，其中进一步优选DMSO。另外，在作为后述催化剂而使用弱碱性无机化合物的情况下，优选在弱碱性无机化合物中的溶解性良好的甲酰胺。溶剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。另外，也可以在不丧失所要求的条件的范围内包含20体积％以下的除上述以外的溶剂。
作为乙酸纤维素溶液中的乙酸纤维素的含量，没有特别限制，但从得到的多孔性纤维素介质具有适于实用的微孔直径和适度的硬度的观点出发，可优选列举1质量％～15质量％左右、更优选为3质量％～10质量％左右。
下面，在本发明的制造方法中，进行将乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而得到混合溶液的工序。在该工序中，通过将乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而使乙酸纤维素的脱乙酰化反应进行，引发混合溶液的凝胶化(液体-凝胶的相转变)。
作为脱乙酰化剂，只要可使乙酸纤维素发生脱乙酰化即可，没有特别的限制，可以使用公知的脱乙酰化剂。在本发明中，作为脱乙酰化剂的优选具体例，可列举醇、胺、氨基醇、水等。另外，作为醇的具体例，可列举甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-甲基丙醇等碳原子数1～4的脂肪族一元醇；苯甲醇等芳香族醇；乙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、甘油、丁烷-1,4-二醇、丁烷-1,2,4-三醇、季戊四醇、山梨糖醇、木糖醇等碳原子数2～6的多元醇，乙二醇、二乙二醇、三乙二醇等单甲基或单乙基醚。另外，作为胺，可列举氨、碳原子数1～5的脂肪族伯胺、碳原子数1～5的脂肪族仲胺、二胺、苄胺等。作为氨基醇的具体例，可列举2-氨基乙醇、3-氨基丙醇等。这些中，在作为后述的催化剂而使用烷氧化物的情况下，优选醇、特别优选为甲醇或乙醇。另外，在作为后述的催化剂而使用胺化合物的情况下，优选胺。脱乙酰化剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
作为脱乙酰化剂的使用量，只要在不妨碍乙酸纤维素的溶解的范围内即可，没有特别限制，但从良好地引起脱乙酰化的观点出发，可列举：相对于乙酸纤维素的乙酰基，优选为1.0摩尔倍～30摩尔倍左右、更优选为1.2摩尔倍～15摩尔倍左右。需要说明的是，在本发明中，可以在调整后述的催化剂的使用量的同时也对脱乙酰化剂的使用量进行调整，从而调整基于脱乙酰化的凝胶化速度，制造础具有期望的形态的多孔性纤维素介质。
作为催化剂，只要是可催化乙酸纤维素的脱乙酰化反应的那些即可，没有特别限制，可优选列举烷氧化物、胺化合物、弱碱性无机化合物、N-羟基胺衍生物等。作为烷氧化物，可列举作为上述脱乙酰化剂而例示出的醇的金属烷氧化物。作为构成金属烷氧化物的金属，可列举例如：钠、钾、锂、镁、钙、铝等。其中，优选为醇钠，特别优选乙醇钠、甲醇钠。另外，作为胺化合物，可列举4-二甲基氨基吡啶，4-吡咯烷基吡啶等叔胺。作为弱碱性无机化合物，可列举碳酸盐，特别是作为溶解性良好的那些，可列举碳酸钾、碳酸铯。作为N-羟基胺衍生物，可列举N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基苯并***等N-羟基亚胺与胺、或N-羟基亚胺与等摩尔以下的碱的组合等。另外，作为催化剂，也可列举例如：N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、1-羟基苯并***等具有基团:N-OH的化合物的盐等。催化剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
作为催化剂，其中，在作为上述脱乙酰化剂使用醇的情况下，优选烷氧化物。另外，在作为上述脱乙酰化剂使用胺的情况下，优选胺化合物。
作为催化剂的使用量，可根据使用的催化剂的活性、优选的反应速度等而自由选择，这是本发明的特征，没有特别限制，但在极少数情况下，存在由于空气中二氧化碳引起的失活、其它副反应(作为可考虑的例子，有以因甲酰胺的水解产生的甲酸、因乙酸纤维素的水解产生的乙酸为原因的失活等)而导致反应速度(凝胶化所需要的时间)变得不稳定的可能性。从良好地引起脱乙酰化的观点出发，催化剂的使用量可列举：相对于脱乙酰化剂1摩尔，优选为0.01摩尔～2摩尔左右、更优选为0.05摩尔～0.5摩尔左右。在本发明中，可以通过调整混合溶液中的催化剂的量、种类而对由脱乙酰化剂引起的乙酸纤维素的脱乙酰化速度进行调整。由此，如后所述，例如在以多孔性纤维素粒子的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，可以通过调整催化剂的量、种类而使上述混合溶液以分散的状态按照期望的速度发生混合溶液的凝胶化，从而可适宜地制造由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素粒子。另外，例如在以多孔性纤维素整块的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，可以通过调整催化剂的量、种类而以使整块中适宜地形成多孔性结构的速度发生混合溶液的凝胶化。
在混合溶液中，也可以混合其它溶剂。作为其它溶剂，也可以使用例如上述用于制备乙酸纤维素溶液的溶剂、上述脱乙酰化剂作为溶剂。另外，例如被用作上述催化剂的金属烷氧化物等，一般是以溶解或分散在溶剂中的状态被加入到混合溶液中，关于溶解或分散金属烷氧化物的溶剂，也可以成为该其它溶剂。关于其它溶剂而言，也是既可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
在混合溶液中，作为引起乙酸纤维素的脱乙酰化反应的温度，只要为混合溶液不发生沸腾或冻结凝固的范围即可，没有特别限制，可优选列举-10℃～100℃左右、更优选为0℃～80℃左右。
关于具体的脱乙酰化反应的条件，根据各成分在溶剂中的溶解性、反应速度而适当设定即可，不能一概地确定，但只要以使乙酸纤维素的乙酰基被除去至适合利用目的的程度的方式进行设定即可。例如，作为脱乙酰化需要的时间、即直到混合溶液发生凝胶化为止的时间，可列举例如1分钟～48小时左右、优选为5分钟～24小时左右。从在分散于分散介质而得到粒子的情况下抑制分散了的粒子的再凝聚的观点出发，优选脱乙酰化需要的时间尽可能地短。另一方面，如果凝胶化速度过大，则有时会引发在脱乙酰化剂或催化剂相对于乙酸纤维素溶液均一混合之前发生不均一的凝胶化的问题、在为了制作粒子而进行分散的操作之前或操作过程中发生凝胶化而无法得到球状粒子等问题，因此只要调节至可提供上述优选的凝胶化时间即可。在本发明中，可以通过例如增加上述催化剂量而缩短脱乙酰化需要的时间。其中，如果催化剂量过多，则有时会导致无法得到适当形态的多孔性纤维素介质，因此要适宜调整催化剂量。
在本发明中，在脱乙酰化反应结束后，利用不会对得到的多孔性纤维素造成不良影响的溶剂(例如，在后述分离溶剂中例示的溶剂)进行洗涤，并根据需要而加入防腐剂。
需要说明的是，在传统方法例如专利文献1中，是在进行凝胶化之后进行脱乙酰化的，但在本发明中，在乙酸纤维素的脱乙酰化的同时进行包含其的混合溶液的凝胶化。但有时在进行凝胶化而使粒子、整块的形状固定之后也会残存有一些未反应的乙酰基。对于这种情况，在对目标的功能不会造成不良影响的情况下，将凝胶直接利用于期望的用途即可。另外，在希望完全消除由未反应的乙酰基的残存引起的问题的情况下，在水、醇中，用稀薄的氢氧化碱(一般为氢氧化钠)、氨、肼等进行处理即可。需要说明的是，为了将得到的粒子、整块供于分离纯化的实用，通常可进行以提高强度为目的的交联处理、用于结合蛋白质等的官能团的被称为“Tether(テザー)”的利用活性基团进行修饰的处理。此时，多数情况下用强碱(通常为氢氧化钠水溶液)进行处理，因此虽然并非有意但残存的乙酰基也被从凝胶中除去。因此，由混合溶液生成的凝胶不需要是被完全脱乙酰化的。
在本发明的制造方法中，根据使混合溶液凝胶化时的形状，可以以粒子的形态(即，多孔性纤维素粒子)制造多孔性纤维素介质，也可以以整块的形态(即，多孔性纤维素整块)制造多孔性纤维素介质。
在本发明的制造方法中，例如在以粒子的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，将上述的混合溶液和与该混合溶液不混合的分散介质混合，使该混合溶液以分散的状态发生乙酸纤维素的脱乙酰化反应，由此得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素粒子。
作为分散介质，只要是与上述的混合溶液不混合，可以通过与该混合溶液共同搅拌而使混合溶液在分散介质中分散为粒子状的那些即可，没有特别限制。例如，为了防止在使上述混合溶液分散时该混合溶液发生凝聚，优选分散介质在分散混合溶液时具有一定程度的粘度。作为分散介质的粘度，可列举于25℃为0.2Pa·s～20Pa·s左右。
分散介质优选为使得与上述混合溶剂中包含的溶剂等不混合的非极性的分散介质，作为具体例，可列举液体石蜡、凡士林那样的碳原子数20以上的烃、硅油、氟化烃。其中，从成本出发，优选液体石蜡。分散介质可以单独使用一种，也可以组合使用两种以上。
由于凡士林达到特定的软化温度以下时会迅速地丧失流动性，因此，在分散了的混合溶液的粒子易发生再凝聚而形成团块的情况下，首先在软化温度以上配制分散液，将其先降到软化温度以下，对于达到使混合溶液的粒子彼此不能移动、接触，提高粒子的产率的目的而言，使用凡士林是有效的。凡士林的软化温度根据其种类而不同，可以适当地选择。但需要说明的是，在本发明的制造方法中，可以通过调整上述催化剂的量、种类而使上述混合溶液以分散的状态按照期望的速度发生混合溶液的凝胶化。因此，在本发明的制造方法中，如果调整催化剂的量、种类，则不需要使用凡士林等来抑制混合溶液的再凝聚等。
在将多孔性纤维素介质制成粒子状时，包含乙酸纤维素的混合溶液需要在分散于分散介质之后、直到因脱乙酰化反应的进行而发生凝胶化为止的期间保持分散状态。为此，可以根据需要向分散介质加入适当的分散稳定剂。
就分散稳定剂而言，只要具有提高上述混合溶液的分散状态的稳定性、减慢由混合溶液形成的粒子发生凝聚的速度的效果，则可以是任意的分散稳定剂。作为这样的分散稳定剂，可列举：甘油、山梨糖醇酐、聚甘油、蔗糖等多元醇与高级羧酸的酯、包含少量极性基团的改性有机硅等，也可以使用除此以外的市售的分散稳定剂。
作为将包含乙酸纤维素的上述混合溶液分散于分散介质的方法，可列举各种各样的方法，包括从可赋予宽范围的粒径分布的方法到可赋予单分散的粒径的方法等的各种各样的方法。例如，在使用通常被称为微反应器的那些使液态的分散介质以适当的速度在其中流动的过程中，从更细的喷嘴向其中注入发生了凝胶化的混合溶剂的方法，对于制备粒径均一的材料而言是适合的。
另外，可以采用如下所述的各种方法：将混合溶液从孔径一定的膜向分散介质中挤出的方法；将流动性的混合溶液加入到开有一定大小的孔的内筒中，使其在分散介质中旋转，利用离心力将发生了凝胶化的混合溶液挤出的方法；根据需要将包含分散稳定剂的分散介质与流动性的混合溶液送液至填充有一定大小的珠的柱中的方法；通过振动喷嘴将流动性的混合溶液注入分散介质中的方法；使用(超)声波的方法；等等。
在后述实施例中，例示除了基于搅拌的方法。该方法是将上述混合溶液添加至上述分散介质中之后，在施加强剪切力而使由上述混合溶液形成的大致球状的粒子生成的同时，使成为分散液滴的混合溶液发生脱乙酰化而进行凝胶化的方法。搅拌混合的条件可以根据目标的平均粒径而适当进行选择。基于搅拌的方法是可赋予各种粒径的混合物但不需要特别的装置的最简单的方法。
优选将分散在分散介质中的混合溶液放置例如1分钟～48小时左右、优选5分钟～24小时左右而使由混合溶液形成的粒子中进行脱乙酰基反应。
另外，在将多孔性纤维素介质制成粒子状的情况下，可以进一步进行以下工序：将用于分离分散在分散介质中的多孔性纤维素粒子的分离溶剂与已形成有多孔性纤维素粒子的分散介质混合后，从分离溶剂中分离出多孔性纤维素粒子。
作为分离溶剂，可以是下述溶剂：与上述的分散介质不混合，且对于混合溶液的凝胶中包含的成分中的纤维素不溶解但与其它成分(上述溶剂、催化剂、脱乙酰化剂、纤维素以外的反应产物等)混合的那些。由此，可防止混合溶液的凝胶中包含的成分中的生成的纤维素粒子发生再次溶解、或由于外力而发生变形，同时可以从分散介质等成分中分离出来。
作为这样的分离溶剂，可列举：水、甲醇、乙醇、2-丙醇、乙酰胺、甲酰胺或它们的混合物。其中，从操作的容易度出发，优选使用水。
也可以直接将在分散介质中分散的状态的多孔性纤维素粒子进行过滤分离，但由于分散介质的粘度通常较高，因此，在过滤中需要压力，多孔性纤维素粒子发生变形或者破坏的危险性升高。也可以通过向分散介质中添加可与其混合的低粘度的液体而降低过滤时的压力。
对于获得的多孔性纤维素粒子，通过使用水、甲醇、乙醇等醇的适当方法进行洗涤，并通常以水湿的状态保存。在使其干燥的情况下，适量添加糖类、甘油等。在以水湿进行长期保存的情况下，为了防止腐败，添加醇、叠氮化钠等防腐剂。另外，也可以在添加了甘油、糖类、尿素等的状态下进行干燥。在使用时，通过常规方法填充至柱中使用。
在利用本发明的制造方法得到的多孔性纤维素粒子(粒子状的多孔性纤维素介质)中，可以通过公知的适当的分级而筛选出粒径(最大直径)为10μm～300μm左右的具有大致球状～球状的形状的粒子，将其用作色谱用的填充剂。作为色谱，可列举空间排阻色谱。
能够利用于空间排阻色谱，也即表示还可以通过结合适当的配体而利用于基于除空间排阻以外的各种模式的色谱分离。其中，包括离子交换、疏水性、亲和性等模式。
一般而言，为了分离纯化利用生物技术制造的那样的高分子，例如激素、酶、抗体药物等，优选具有可使这些物质充分进入的大小的细孔的基质。即，在使用填充有多孔性纤维素粒子的柱、以水为流动相进行凝胶过滤色谱时，期待在换算为聚乙二醇的分子量大致为103～107的范围的一定的分子量区域内发生分级。
多孔性纤维素介质的细孔的大小可以根据乙酸纤维素的浓度、溶解该乙酸纤维素的溶剂、催化剂、脱乙酰化剂的量、种类，以及混合溶液的凝胶化条件(尤其是温度)而进行调整。
另一方面，在本发明的制造方法中，例如在以整块的形态制造多孔性纤维素介质的情况下，通过以将混合溶液在任意形状的成型容器内静置的状态下使乙酸纤维素的脱乙酰化反应进行，从而得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素整块。
整块是使多孔性材料为一体的团块的形态。在使用了上述粒子状填充剂的色谱中，虽然展开液也会通过粒子的微细孔，但展开液大多会通过粒子间间隙。与此相对，在整块中，展开液通过的是一体的多孔体的微细孔。因此，优选减少对于展开液的流动的阻力，选择可提供适于其的结构的条件，并与通常的粒子状填充剂的情况相比将固体成分含量设定得较低。但是，除了用作过滤材料的情况以外，其本质的分离机理与粒子状填充剂的情况没有变化。
在液相色谱中，展开液在分离剂中的任意部分均以同样的速度流动、形成所谓的活塞流是极其重要的。在填充剂中，各个粒子的特性的偏差因混合而变得平均化，因此容许粒子间的性质存在一定的差异，但是承担液体的流动大的部分的粒子间空隙的均一性变得重要。因此，将填充剂填充到被称为柱的容器时的技术变得重要。
与此相对，在整块中，生成的多孔性结构在相对于展开液的流动成直角的方向上均一、以及整块与容器之间不产生容易流动液体的间隙是极其重要的。这里的所述在直角方向上均一的多孔体的制备，不能通过与凝胶化剂(沉淀剂)的接触、或作为公知技术的溶剂的蒸发来进行。
在本发明的制造方法中，由于可以通过调整上述催化剂的量、种类而以使整块中适宜地形成多孔性结构的速度使混合溶液发生凝胶化，因此对于多孔性纤维素整块的制造而言是适宜的。
制作多孔性纤维素整块时，将上述混合溶液投入任意形状的成型容器，之后放置1分钟～48小时左右、优选4分钟～24小时左右，由此使乙酸纤维素的脱乙酰基反应发生。由此，使得混合溶液的凝胶形成，而通过将得到的凝胶直接、或在从容器中取出后利用适当的溶剂进行洗涤，可以将整块用作分离剂等。一般而言，干燥有时会引起整块的形状的变化、或导致微细孔结构丧失，因此优选避免干燥，但如果与合适的不挥发性添加剂共存则成为可能。作为不挥发性添加剂，甘油、蔗糖、海藻糖、糖稀等糖、糖醇、各种酰胺、DMSO等极性化合物是适宜的。
为了评价多孔性纤维素整块的特性，需要如已经阐述的那样，以没有间隙或局部压紧化的方式收纳于适当的容器中。为了达到该目的的方法可以是公知的任意方法。通常，通过凝胶化而生成多孔性纤维素整块时，很多情况会产生一定的收缩，与容器之间产生间隙。这样的情况下，通过将容器壁面修饰为与纤维素类物质亲和性强的化学结构(例如在表面结合纤维素)以使间隙无法产生，或者利用凝胶的基于环境变化的收缩/溶胀，或使得容器的尺寸为可适合的等，可以实现无间隙的容纳。
在本发明中，可以通过将亲和配体固定化至利用上述制造方法得到的多孔性纤维素介质而制造吸附体。即，在本发明的制造多孔性纤维素介质的方法中，可以通过进一步包括将亲和配体固定化的工序而制造结合有亲和配体的吸附体。该吸附体也可以用作亲和色谱用的分离剂。本发明的多孔性纤维素介质在例如为多孔性纤维素整块及多孔性纤维素粒子中的任意形态下，均可以通过结合亲和配体而用作亲和色谱用的分离剂、吸附体。
以下，对于在本发明中制造以亲和的模式使用的吸附体的方法进行详述。可以使用蛋白质作为亲和配体。就本发明可以使用的蛋白质而言，可列举分子量为3～300kDa、优选为30～150kDa，且对于那些作为分离对象的例如抗体那样的相对于蛋白质具有亲和性的物质。其中，作为亲和配体，蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体在用于抗体的蛋白质的分离时的选择性高，故优选。
在以分离抗体为主要目的的情况下，作为配体，优选能够与免疫球蛋白的一部分发生特异性结合的那些。上述功能性变异体是指，天然氨基酸序列中具有至少1个变性、仍保持了天然序列所伴有的至少1个功能的蛋白质。天然序列包括原本天然产生的氨基酸序列。作为氨基酸的变化，可列举将1个以上的氨基酸置换为另外的氨基酸、1个以上的氨基酸的删除和/或1个以上的氨基酸的追加或这些的任意组合。也可以举出诸如相对于天然序列进行的追加、删除及置换的组合那样的实施方式。功能性变异体也可以包含蛋白质的片段或结构域。就功能性变异体的氨基酸序列而言，可以与天然氨基酸序列有至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同，且仍保持了天然序列所伴有的至少1个功能。
就相对于上述多孔性纤维素介质的蛋白质的负载量而言，相对于多孔性纤维素介质100质量份，优选为1.0质量份～25质量份左右。另外，优选相对于多孔性纤维素介质的体积每1ml为1mg～50mg左右。
作为将亲和配体固定化至多孔性纤维素介质的具体方法，可列举例如使用交联剂的方法。作为交联剂，没有特别的限制，可列举例如：环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、二氯丙醇等卤代醇、双环氧乙烷、聚环氧乙烷等。
在使用交联剂的情况下，也可以在使多孔性纤维素介质交联之后、与亲和配体反应之前，使发生了交联的多孔性纤维素介质活化。例如，可以通过导入公知的反应性官能团而使发生了交联的多孔性纤维素介质活化。通过利用例如溴化氰(CNBr)、N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)、环氧化物及活化羧酸(NHS酯)等进行活化，可以转变为比多孔性纤维素介质原本具有的官能团更容易与待作为配体而固定化的化合物发生反应的官能团。进而，随后，经过使其与待作为配体而固定化的化合物发生反应而将配体与多孔性纤维素介质固定的工序，可以制造吸附体。
作为其它的吸附体的制造方法，可列举通过向存在多孔性纤维素介质与待作为配体而固定化的化合物的体系中添加碳二亚胺那样的缩合试剂、或戊二醛那样的分子中具有多个官能团的试剂并进行缩合、交联，从而将多孔性纤维素介质与配体固定化，获得吸附体的方法。
作为使多孔性纤维素介质与亲和配体结合的其它的实施方式，可列举向多孔性纤维素介质导入甲酰基，使该甲酰基与蛋白质的氨基发生反应的实施方式。对于导入甲酰基的反应，可列举例如：通过高碘酸氧化法使具有邻位羟基的多糖类氧化，使糖链上生成甲酰基的方法。
另外，可列举经由通过使由环氧基经开环得到的甘油基与高碘酸盐发生作用的方法等而得到的各种间隔基(spacer)而导入甲酰基的方法。例如：作为间隔基，可以使用葡糖胺等那样的氨基糖。
另外，作为使多孔性纤维素介质的甲酰基与诸如蛋白A那样的蛋白质结合的方法，可以使用公知的方法，可列举例如：使作为间隔基而导入了葡糖胺等那样的氨基糖的多孔性纤维素介质、与含有蛋白A的溶液发生反应的实施方式。作为这样的方法，可列举例如日本特开2008-279366号公报中记载的方法。
通过使用使亲和配体结合至上述说明的利用本发明的制造方法制作的多孔性纤维素介质而获得的吸附体，可以将各种各样的目标分子纯化。
作为目标分子，可列举例如免疫球蛋白这样的蛋白质。作为免疫球蛋白，可列举多克隆抗体、单克隆抗体及其功能性片段。
本发明的纯化法包括如下所述的工序。包括：使将亲和配体结合至利用本发明的制造方法制造的多孔性纤维素介质而获得的吸附体、与包含标的物质的混合物接触而使亲和配体与标的物质结合的第一工序；和将与吸附体的亲和配体结合的标的物质分离的第二工序。
作为将与吸附体的亲和配体结合的标的物质分离的方法，可列举在第一工序和第二工序之间，改变pH、改变盐浓度的方法。具体而言，可列举将第一工序的pH设定为6～8那样的中性、将第二工序的pH设定为低于6那样的酸性的方法。另外，关于盐浓度，可列举：在第一工序中低于0.1M且在第二工序中为0.1M以上，或在第一工序中为0.1M以上而在第二工序中低于0.1M。以上以免疫球蛋白的纯化为例进行了说明，但除此以外，也可以将离子交换基团、环糊精、色素(例如CIBA Chronblue)等作为配体而结合，利用于酶、血浆蛋白、疫苗等的纯化及脂多糖的吸附除去等各种各样的用途。
实施例
以下，结合实施例及比较例而详细地说明了本发明。但是，本发明并不限定于实施例。
<实施例1：多孔性纤维素整块的制备>
将二乙酸纤维素(乙酰化度55％、取代度2.5)0.40g溶解于DMSO 4.65g。向其中加入1.00mL的甲醇时暂时生成了沉淀，但若进行充分的混合则再次成为均一的溶液(二乙酸纤维素溶液)，将其冰浴冷却并静置。另一方面，将DMSO与甲醇各0.50mL混合，向其中混合20％乙醇钠/乙醇溶液(和光纯药公司制)1.04mg并进行冰浴冷却。接着将该溶液与二乙酸纤维素溶液快速地混合，流入1cm见方的柱状单元，继续进行冰浴冷却。柱状单元内的液体经约2小时凝固。继续冰浴冷却2小时之后，放置于室温过夜，之后从柱状单元取出四棱柱状的多孔性纤维素整块，反复进行水洗。得到的多孔性纤维素整块为7.0mm见方的柱状。
接着，切出得到的多孔性纤维素整块的一部分，得到了碎片(约5mm×3mm×2mm)。接着将得到的碎片干燥后，用KBr法测定了红外吸收光谱，其结果，在1740cm-1示出了痕量的C＝O伸缩振动，但推定多孔性纤维素整块实质上为纤维素。然后，吸去附着在该碎片表面的水后进行了称量。并且，于80℃进行恒重后进行称量而测定了多孔性纤维素整块中的纤维素成分率，为11.0质量％。将该碎片浸渍于甲醇中后，将切片投入液氮中时，在液氮中自然破裂。接着，用超临界二氧化碳干燥了液氮中的碎片后，残留有薄而模糊的固体。由重量与外形求出该固体的比重，约为0.25。由于纤维素的比重通常被认为在1.5附近，因此该固体显然为气凝胶。将该固体的破裂的(在液氮中自然发生破裂的)面的电子显微镜照片的图像示于图1。由图1的图像可知，在破裂的面观察到了网状多孔性结构。
<实施例2：多孔性纤维素粒子的制备>
向二乙酸纤维素(乙酸含量55％)的DMSO溶液(二乙酸纤维素：7.88质量％)51.6g加入甲醇10mL，充分搅拌而制成均一的透明溶液，对其进行冰浴冷却(溶液1)。另一方面，使液体石蜡约1000mL与DMSO/甲醇46.5:15(v/v)的混合溶液(约50ml)接触1天后，将后者分液除去，由此得到了被DMSO/甲醇饱和的液体石蜡(关东化学(株)制，比重0.89-0.91)800ml。将其放入1L容器中并进行冰浴冷却(溶液2)。另外，将DMSO 5.0mL、甲醇5.0mL、20％乙醇钠/乙醇溶液(和光纯药公司制)187mg混合并进行冰浴冷却(溶液3)。接着，将溶液1与溶液3混合并充分搅拌后投入溶液2中，使用直径2cm的搅拌桨在740rpm、5分钟的条件下进行了搅拌。在搅拌后静置4小时进行冰浴冷却，之后于室温放置过夜。接着，加入水约200mL，缓慢搅拌后，将下层(水相)吸出至另一容器中。将加入水并吸出下层的操作总共重复3次，萃取了纤维素成分。接着，静置得到的水相，将上清液倾析而进行浓缩直至200mL左右后，加入1g的NaOH并进一步静置过夜，得到了多孔性纤维素粒子。将得到的凝胶粒子的光学显微镜照片示于图2。由光学显微镜照片可确认，主要是多孔性纤维素粒子的直径约为50μm以下左右的球状粒子。
<实施例3：多孔性纤维素整块的制备>
将二乙酸纤维素16.03g溶解于DMSO129.42g中而制备了溶液。向本溶液3.04g缓慢混合甲醇7.6mL，得到透明的溶液，对其进行冰浴冷却。另一方面，制备了将甲醇锂的10％甲醇溶液(和光纯药(株)制)0.117g稀释于甲醇1.94g、DMSO2.77g中而成的液体，并进行冰浴冷却。将该甲醇锂的稀释液1.00mL混合于上述二乙酸纤维素溶液中，快速地混合后移液至二个1cm棱柱型的单元中。将其中的一个单元进行冰浴冷却，结果在约3小时后丧失了流动性，另一个浸渍于约20度的水中，结果在30分钟后丧失了流动性，均得到了白色半透明的凝胶状固体。
<实施例4：多孔性纤维素整块的制备>
将二乙酸纤维素(乙酸含量55％)7.22g分散至甲酰胺112.21g中，在搅拌的同时花费约30分钟加热至125℃，转变为透明的溶液，将其冷却至室温。次日，收集变为柔软的凝胶状的该溶液8.68g并与甲醇1.58g混合，结果最终形成了流动性的溶液。另一方面，将碳酸钾120mg溶解于甲酰胺2mL中，对两种液体进行冰浴冷却。将碳酸钾溶液的溶液1.00mL加入至上述添加了甲醇的溶液中，在充分搅拌的同时于0℃保持3分钟，之后将其注入两根一边为1.00cm的四棱柱状的塑料单元。一根保持于0℃，结果在2小时后丧失了流动性。另一根于室温于23℃静置时，在23分钟丧失了流动性。放置一昼夜后，将稍有收缩而与容器分离的凝胶状固体在纯水中在进行换水的同时充分洗涤了2天。得到的凝胶均为不透明白色固体。切出凝胶的一部分，将在表面附着的水用滤纸吸去后进行称量，进一步在80℃、常压下干燥3小时，接着在80℃、减压(约1Torr)下干燥3小时，称量了收缩而变小变透明的固体，考察了原来的凝胶的含水率。在0℃发生了凝胶化的固体为163.2mg，干燥后变为11.8g，因此含水率为92.8％。另外，在23℃发生了凝胶化的固体133.5mg在干燥后变为9.5mg，因此含水率为92.9％。
<实施例5>
向与实施例2同样地事先与甲酰胺和甲醇的1:4v/v混合液接触而达到饱和的液体石蜡790mL中，加入Nihon Emulsion公司制TSG-10 384mg，加温至60℃而使后者溶解后，保温于20℃(溶液5)。另一方面，向在实施例4中使用了的二乙酸纤维素的甲酰胺溶液109.2g中混合甲醇19.3g，制成流动性的溶液，保温于20℃(溶液4)。向溶液4投入将碳酸钾620mg溶解于甲酰胺12.9g而成的液体(溶液6)并混合。混合之后，迅速地将混合液投入溶液5中，使用搅拌桨以约400rpm搅拌了8分钟。静置一昼夜后加入水150mL，旋转容器而将生成的白色粉末状的珠萃取至水中，进行分液。将相同的操作再重复2次，将水萃取液合并。重复进行在水中的沉降、上清液的倾析，得到了沉降体积70mL的珠。将该光学显微镜照片示于图3。另外，将得到的粒子用甲醇与2-丙醇依次洗涤后进行干燥并用KBr压片法测定的红外吸收光谱示于图4。在红外吸收光谱中，在1735cm-1附近显示出被认为是乙酰基的羰基的吸收，但在2920cm-1附近的原本很微弱的吸收变得更弱了，视为实质上为纤维素。

Claims (7)

1.多孔性纤维素介质的制造方法，其包括：
准备乙酸纤维素溶解于溶剂而成的乙酸纤维素溶液的工序；
将所述乙酸纤维素溶液、脱乙酰化剂及催化剂混合而得到混合溶液的工序，其中在所述混合溶液中所述乙酸纤维素经历脱乙酰化反应，并发生液体-凝胶的相转变；以及
使所述混合溶液以在成型容器内静置的状态进行所述乙酸纤维素的脱乙酰化反应，得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素整块；或
将所述混合溶液和与所述混合溶液不混合的分散介质混合，使所述混合溶液以分散的状态进行所述乙酸纤维素的脱乙酰化反应，得到由多孔性纤维素介质构成的多孔性纤维素粒子。
2.根据权利要求1所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，所述催化剂为选自烷氧化物、胺化合物、弱碱性无机化合物及N-羟基胺衍生物中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，所述胺化合物为叔胺，所述弱碱性无机化合物为碳酸盐。
4.根据权利要求1所述的多孔性纤维素介质的制造方法，其中，所述分散介质为液体石蜡。
5.吸附体的制造方法，其包括：将亲和配体固定至利用权利要求1～4中任一项所述的制造方法得到的多孔性纤维素介质的工序。
6.根据权利要求5所述的吸附体的制造方法，其中，所述亲和配体为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L及它们的功能性变异体中的至少一种。
7.标的物质的纯化方法，其包括：
使吸附体与包含标的物质的混合物接触而使所述标的物质结合于亲和配体的第一工序，所述吸附体是使所述亲和配体与利用权利要求1～4中任一项所述的制造方法得到的多孔性纤维素介质结合而得到的；以及
对结合于所述吸附体的所述亲和配体的所述标的物质进行分离的第二工序。
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