CN106536561A - 抗‑因子d抗体变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗‑因子D抗体变体，其制备及其在制备用于治疗与过度或不受控的补体激活相关的疾病和病症的组合物和药物中的用途。

Description

抗-因子D抗体变体及其用途

对相关申请的交叉引用

本申请要求2014年5月1日提交的美国临时专利申请号61/987298和2014年11月6日提交的美国临时专利申请号62/076372的利益，所述各申请通过引用完整地结合。

序列表

本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII形式经电子提交并且通过引用完整地结合于此。所述ASCII拷贝，于2015年4月27日生成，被命名为P05826-WO_SL.txt并且大小为31,825字节。

发明背景

治疗性抗体的开发代表着人类医药的悠久历史中的革命性纪元。超过30种抗体已被批准用于人类治疗，并且在世界范围内超过250种抗体处于临床开发阶段以用于多种主要疾病，包括癌症、自身免疫、炎症、心血管病、传染病和眼病。在过去十年，单克隆抗体产品的市场呈指数增长，其受轰动性药物如曲妥珠单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、英夫利昔单抗和阿达木单抗的推进。这些第一代抗体治疗剂已经使众多患者受益，同时抗体技术的进步和对作用机制的更深理解为具有甚至更佳效力和更少副作用的改进版本的抗体铺平了道路。

与作为小的有机和无机分子的常规药物相比，抗体治疗剂的成功开发和可行的利用具有许多独特的挑战。与所有蛋白质一样，抗体的生物物理性质对于其行为是重要的决定因素并且显著影响涉及表达、纯化、制剂、存储、递送、药物动力学、免疫原性和用药方案的治疗剂的开发。在众多性质中，蛋白质稳定性是决定候选抗体品质及其作为成功治疗剂的预期性的主要特征。

蛋白质疗法通常需要将高剂量的蛋白质递送至患者以便实现所需的效力。同时，某些给药途径与限制如递送时间、体积和体力有关，其需要高剂量蛋白质在高浓度制剂(例如，至少100mg/ml)中。然而，高浓度蛋白质制剂提出了关于稳定性、溶解性、粘性及其他蛋白质性质的特别挑战。

蛋白质可以是不稳定的并且经由多种物理和化学分解途径而被分解。物理不稳定性主要经由两种途径发生-变性和聚集，而化学不稳定性可以经由多种途径发生，如脱酰胺、异构化、交联、氧化和片段化。抗体不稳定性对于药物开发是不利的，因为其可能导致活性药物量的减小和较低的体内效力，治疗剂的各批次间的可变性增加，并且可能是最重要的，患者中针对聚集物和降解物的免疫原性。Wang等(2007)J.Pharm.Sci.96：1-26；Moore等(1980)J Clin Endocrinology&Metabolism 51：691-697；Rosenberg等(2006)AAPSJ 8：E501-7；Joubert等(2011)J Biol Chem 286：25118-25133；Joubert等(2012)J Biol Chem(2012)286：25266-79)。

抗体是大的多结构域蛋白质，并且对其稳定性和聚集倾向性有作用的因素是复杂的，包括许多外在条件如温度、pH、浓度、离子强度和物理应力。同样重要的是蛋白质本身的一级序列。虽然在特定同种型的抗体之间Fc区域的性质在很大程度上相同，但是Fab区有很大不同。因此，很大程度上由于Fab序列差异和抗体的特别的抗原特异性，在抗体之间在稳定性和聚集倾向方面存在显著差异。Lowe等(2011)Adv.Protein Chem.Struct Biol.84：41-61。

补体***在免疫复合物的清除和对传染剂、外部抗原、病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫反应方面发挥中心作用。然而，补体也参与病理炎症和自体免疫病。因此，抑制过度的或不受控的补体级联激活可以为患有此种疾病和病症的患者提供临床益处。

补体***包括两种不同的激活途径，其被指定为经典途径和备选途径(V.M.Holers In Clinical Immunology：Principles and Practice，ed.R.R.Rich，MosbyPress；1996，363-391)。经典途径是钙/镁依赖性级联，其通常通过形成抗原-抗体复合物而激活。备选途径是镁依赖性级联，其通过C3在某些易感表面(例如酵母和细菌的细胞壁多糖，和某些生物聚合材料)上的沉积和活化而激活。补体途径的激活产生补体蛋白质的生物活性片段，例如C3a、C4a和C5a过敏毒素和C5b-9膜攻击复合物(MAC)，其介导涉及白细胞趋化性、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞的激活、血管通透性、细胞溶解和组织损伤的炎性活动。

因子D是对于备选补体途径的激活必要的高度特异性的丝氨酸蛋白酶。其切割与C3b结合的因子B，产生作为备选途径C3/C5转化酶的活性组分的C3b/Bb酶。因子D可以作为抑制的合适靶标，因为其在人中的血浆浓度非常低(1.8μg/ml)，并且已经证明其是备选补体途径的激活的限速酶(P.H.Lesavre和H.J.Müller-Eberhard.(1978)J.Exp.Med.148：1498-1510；J.E.Volanakis等(1985)New Eng.J.Med.312：395-401)。

已经证明，在动物模型中以及在离体研究中，补体激活的下调在治疗若干疾病适应证方面是有效的，所述疾病适应证例如是***性红斑狼疮和肾小球肾炎、类风湿性关节炎、心肺转流术和血液透析、器官移植中的超急性排斥、心肌梗塞、再灌注损伤和成人呼吸窘迫综合征。此外，其他炎性病症和字体免疫/免疫复合物疾病也与补体激活密切相关，所述疾病包括热损伤、严重哮喘、过敏性休克、肠炎、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化、重症肌无力、膜性增生性肾小球肾炎和舍格伦综合征。

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是中央视网膜的进行性的慢性疾病，其对视觉敏锐性有显著后果。Lim等(2012)Lancet 379：1728。在工业化国家中，该疾病的晚期形式是视力丧失的主要原因。对于≥40的高加索人群，早期AMD的普遍性估计在6.8％而晚期AMD在1.5％。de Jong(2006)N.Engl.J.Med.355：1474。在80岁后，晚期AMD的普遍性随年龄显著增加至11.8％。存在两种类型的AMD，非渗出性(干性)和渗出性(湿性)AMD。更常见的干性形式AMD包括中央视网膜(黄斑)下的视网膜色素上皮(RPE)的萎缩和肥大性改变以及RPE上的沉积物(玻璃疣)。晚期干性AMD可能导致显著的视网膜损伤，包括地图样萎缩(geographic atrophy，GA)，以及不可逆的视力丧失。此外，患有干性AMD的患者可能进展至湿性形式，其中在视网膜下发展出被称为脉络膜新生血管膜(CNVM)的异常血管，渗液和渗血，并且最终导致视网膜中和视网膜下的致盲性盘状瘢痕。

靶向新血管形成(新血管形成)的药物已经是治疗湿性AMD的主要依靠。雷珠单抗，一种抗-VEGFA抗体片段，已被证明可以高效地提高患有湿性AMD的患者的视力。最近的研究暗示了AMD与补体级联中的关键蛋白质之间的关联性，并且正在开发多种靶向具体补体组分的疗法用以治疗干性AMD。通过结合因子D上的外部位点而有效抑制因子D及备选补体途径的人源化抗-因子D Fab片段(aFD，lampalizumab；FCFD4514S)目前处于临床开发中以用于治疗与干性AMD相关的GA。Katschke等(2012)J.Biol.Chem.287：12886。最近的II期临床试验显示每月玻璃体内注射lampalizumab有效地显示患有晚期干性AMD的患者中的GA病变的进展。

眼睛具有许多独特的生物物理和解剖学特征，其使得眼部药物递送更具有挑战性。例如，血-眼屏障是保护眼睛免于感染的防御机制，但是同时使得药物难于渗入，尤其是对于眼睛后段中的疾病。因此，通常需要高剂量给药来实现和保持药物的原位生物利用度(例如，眼保留时间)以便提高效力。同时，眼睛后部中的有限空间限制了递送的药物体积，其又要求递送的药物在高浓度制剂中。

患有眼病的患者也可以受益于治疗剂的长效/缓释递送。较低频率的用药将为患者提供提高的便利性，具有降低感染率和增加临床效力的潜在益处。高剂量药物的受控释放还可以使药物副作用最小化。两种有希望的用于长效递送的***是基于PLGA的固体植入物和可植入端口递送***(PDS)。两种***都有可能提供接近零级的释放动力学达延长的时间。对于PLGA植入物，蛋白质药物被包封在疏水聚合物基质中并且药物释放经由聚合物的缓慢水解实现。释放速率可以通过改变药物载量、聚合物疏水性或聚合物分子量来控制。PDS是一种可再填充的设备，其中向玻璃体内的释放通过包含钛玻璃料的多孔金属膜来控制。因为储库具有小的体积，所以利用PDS进行有效递送需要高的蛋白浓度。

除了高浓度和长效递送以外或作为高浓度和长效递送的替代，药物的增加的生物利用度(例如，眼保留时间)可以通过翻译后修饰实现或受其促进，其中蛋白质药物与天然的或合成的聚合物共价缀合，如聚唾液酸化、HES化(与羟乙基淀粉缀合)和PEG化。Chen等(2011)Expert.Opin.Drug Deliv.8：1221-36；Kontermann(2009)BioDrugs 23：93-109。PEG化，即将聚合物聚乙二醇(PEG)共价连接至蛋白质，是一种尤其可用于延长抗体片段治疗剂的半衰期的已知技术。Jevsevar等(2010)Biotech.J.5：113-128。

药物所暴露的条件根据使用的递送***而变化。对于在固体PLGA植入物中的结合，使用冻干的或喷雾干燥的药物。使用热熔挤出法来制备植入物，使得药物短暂地暴露于接近90℃的温度。虽然药物在释放过程中保持固态，PLGA的分解可以将药物暴露于低pH环境。相反，利用PDS递送的药物被保持在高浓度、呈液态并被暴露于玻璃体，玻璃体被表征为一种具有减小的生理离子强度和pH的环境。

因此，对于具有提高的稳定性，优选地适合于高浓度制剂和/或长效递送的抗-因子D抗体存在强烈的需求。

发明概述

本发明部分基于这样的发现，即抗体中对鉴定的热点的靶向氨基酸置换可以有效地提高抗体的稳定性和作为治疗剂的整体效力。

在一个方面，本发明涉及具有提高的稳定性的抗-因子D抗体变体。本发明包括抗-因子D抗体变体，其包含在参比抗-因子D抗体的高变区(HVR)内的至少一个靶天冬氨酸(D或Asp)残基的置换，其中所述靶Asp残基被鉴定为倾向于异构化并且所述置换是Asp至谷氨酸(E或Glu)，并且其中当与所述参比抗-因子D抗体相比时，所述抗-因子D抗体变体显示提高的稳定性而不显著丧失因子D结合亲和力。在一些方面，进行置换的靶Asp残基在Asp-Xaa基序内，其中Xaa是Asp、Gly、His、Ser或Thr。在一个方面，靶Asp残基是Asp-Asp(DD)基序中的第一个Asp。在一个方面，抗-因子D抗体变体包含在参比抗-因子D抗体的HVR内的另外的Asp位点处的一个或多个置换，其中所述置换是Asp至丝氨酸(S或Ser)以减少抗体的整体电荷，由此提高抗体的溶解性。在一个方面，抗-因子D抗体变体包含在被鉴定为倾向于脱酰胺的天冬酰胺(N或Asn)位点处的一个或多个置换，其中所述置换是Asn至Ser以减少或消除抗体的脱酰胺。

在一个方面，用于产生本发明的抗体变体的参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变结构域序列，SEQ ID NO：4的重链可变结构域序列，或两者。随后，所得的抗体变体可以包含SEQ ID NO：11的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列，或可以包含SEQ ID NO：13的轻链HVR3(HVR-L3)序列，或可以包含SEQ ID NO：14的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列，或可以包含SEQ ID NO：15的重链HVR3(HVR-H3)序列。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体变体是参比抗-因子D抗体的变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：1的轻链序列和SEQ ID NO：2的重链序列，并且其中所述变体相对于参比抗-因子D抗体包含以下序列修饰：SEQ ID NO：11的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列。此种变体在本文以下的实施例中被称为“TM”变体(AFD.v6)(见，例如，表1)。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体变体是参比抗-因子D抗体的变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：1的轻链序列和SEQ ID NO：2的重链序列，并且其中所述变体相对于参比抗-因子D抗体包含以下序列修饰：SEQ ID NO：11的轻链HVR1(HVR-L1)序列，SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列和SEQ ID NO：13的轻链HVR3(HVR-L3)序列。此种变体在本文以下的实施例中被称为“TM.D92E”变体(AFD.v7)(见，例如，表1)。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体变体是参比抗-因子D抗体的变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：1的轻链序列和SEQ ID NO：2的重链序列，并且其中所述变体相对于参比抗-因子D抗体包含以下序列修饰：SEQ ID NO：14的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列。此种变体在本文以下的实施例中被称为“SIESD”变体(AFD.v8)(见，例如，表1)。在一个实施方案中，“SIESD”变体(AFD.v8)包含SEQID NO：26的轻链序列和SEQ ID NO：27的重链序列。在一个实施方案中，Cys修饰版本的“SIESD”变体包含SEQ ID NO：30的重链序列。在一个实施方案中，Cys-Pro-Pro-Cys修饰版本的“SIESD”变体包含SEQ ID NO：31的重链序列。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体变体是参比抗-因子D抗体的变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：1的轻链序列和SEQ ID NO：2的重链序列，并且其中所述变体相对于参比抗-因子D抗体包含以下序列修饰：SEQ ID NO：14的轻链HVR1(HVR-L1)序列，SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列和SEQ ID NO：15的重链HVR3(HVR-H3)序列。此种变体在本文以下的实施例中被称为“SIESD-N103S”变体(AFD.v14)(见，例如，表1)。在一个实施方案中，“SIESD.N103S”变体(AFD.v14)包含SEQ ID NO：28的轻链序列和SEQ ID NO：29的重链序列。在一个实施方案中，Cys修饰版本的“SIESD.N103S”变体包含SEQ ID NO：32的重链序列。在一个实施方案中，Cys-Pro-Pro-Cys修饰版本的“SIESD”变体包含SEQ IDNO：33的重链序列。

在一个方面，本发明涉及抗-因子D抗体变体，其包含在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个置换。在一个方面，参比抗-因子D抗体包含以下HVR序列：

HVR-L1：ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：5)；

HVR-L2：GGNTLRP(SEQ ID NO：6)；

HVR-L3：LQSDSLPYT(SEQ ID NO：7)；

HVR-H1：GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：8)；

HVR-H2：WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：9)；和

HVR-H3：EGGVNN(SEQ ID NO：10)。

并且相应的变体包含一个或多个以下置换：

(a)SEQ ID NO：5中的D5S；

(b)SEQ ID NO：5中的D7E；

(c)SEQ ID NO：5中的D8S(SEQ ID NO：22中公开的a、b和c)；

(d)SEQ ID NO：9中的D13E(SEQ ID NO：23)；

(e)SEQ ID NO：7中的D4E(SEQ ID NO：24)；或

(f)SEQ ID NO：10中的N5S(SEQ ID NO：25)。

在一个方面，本发明的变体结合以上置换(b)-(d)。在另一个方面，所述变体结合以上置换(b)-(e)。在另一个方面，所述变体结合以上置换(a)-(d)。在另一个方面，所述变体结合以上置换(a)-(d)和(f)。

在一个方面，本发明涉及抗-因子D抗体，所述抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：16、18或19的轻链可变结构域氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及抗-因子D抗体，所述抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：17或20的重链可变结构域氨基酸序列。在另一个方面，抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：16、18或19的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：17或20的重链可变结构域氨基酸序列。例如，抗-因子D抗体可以是包含SEQ ID NO：16的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：17的重链可变结构域氨基酸序列的“TM”变体(AFD.v6)；包含SEQ IDNO：18的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：17的重链可变结构域氨基酸序列的“TM.D92E”变体(AFD.v7)；包含SEQ ID NO：19的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：17的重链可变结构域氨基酸序列的“SIESD”变体(AFD.v8)；或包含SEQ ID NO：19的轻链可变结构域氨基酸序列和SEQ ID NO：20的重链可变结构域氨基酸序列的“SIESD.N103S”变体(AFD.v14)。

在一个方面，本发明涉及抗-因子D抗体，所述抗-因子D抗体具有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含具有SEQ ID NO：11或14的序列的HVR-L1，具有SEQ ID NO：6的序列的HVR-L2，和具有SEQ ID NO：7或13的序列的HVR-L3；所述可变重链包含具有SEQ ID NO：8的序列的HVR-H1，具有SEQ ID NO：9或12的序列的HVR-H2，和具有SEQ ID NO：10或15的序列的HVR-H3。例如，抗-因子D抗体可以是包含以下六个HVR序列的“SIESD”变体(AFD.v8)：HVR-L1(SEQ ID NO：14)，HVR-L2(SEQ ID NO：6)，HVR-L3(SEQ ID NO：7)，HVR-H1(SEQ ID NO：8)，HVR-H2(SEQ ID NO：12)，和HVR-H3(SEQ ID NO：10)；或包含以下六个HVR序列的“SIESD.N103S”变体(AFD.v14)：HVR-L1(SEQ ID NO：14)，HVR-L2(SEQ ID NO：6)，HVR-L3(SEQ ID NO：7)，HVR-H1(SEQ ID NO：8)，HVR-H2(SEQ ID NO：12)，和HVR-H3(SEQ ID NO：15)。

在一个方面，本发明涉及不具有可检测的Asp异构化的抗-因子D抗体变体，其通过用于除去或减少异构化的方法制备，所述方法包括：(a)鉴定在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个倾向于Asp异构化的Asp残基；(b)用Glu置换步骤(a)中鉴定的Asp残基；(c)针对Asp异构化筛选所得的候选变体；和(d)选择不具有可检测的Asp异构化的那些变体。在一个方面，将以上方法与用于除去或减少脱酰胺的方法相结合，所述方法包括(a)鉴定在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个倾向于脱酰胺的Asn残基；(b)用Ser置换步骤(a)中鉴定的Asn残基；(c)针对脱酰胺筛选所得的候选变体；和(d)选择具有减少的或消除的脱酰胺的那些变体。在另一个方面，将用于除去或减少异构化的方法与用于减少抗体总体电荷的方法相结合，所述方法是通过：(a)选择在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个带负电的氨基酸残基D或E；(b)用Ser置换步骤(a)中选择的残基；(c)针对溶解性筛选所得的候选变体；和(d)选择与所述参比抗-因子D抗体相比具有提高的溶解性的那些变体。

在一个方面，当与所述参比抗-因子D抗体相比时，本发明的抗-因子D抗体变体在保持因子D结合亲和力的同时具有提高的稳定性。在一个方面，本发明的抗体以至少约10^-9至10^-12M的结合亲和力结合因子D。在一个方面，本发明的抗体包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在一个方面，本发明的抗体是抗体片段(例如抗原结合片段)。本发明的抗体片段可以例如是Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、(scFv)₂、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微抗体、双抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体。

在本发明的其他方面，本发明包括组合物，所述组合物包含本发明的抗体。在另一个方面，本发明涉及物质的组合物，所述物质的组合物包含与载体结合的如本文所述的本发明的抗体。任选地，所述载体是药用载体。

在一个方面，本发明包括药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效浓度的以上所述的抗体或抗体变体。在一些方面，所述药物制剂包含至少100mg/ml、100-150mg/ml、100-200mg/ml、100-300mg/ml、100-400mg/ml、100-500mg/ml；至少200mg/ml、至少300mg/ml、至少400mg/ml或至少500mg/ml的浓度的抗体或抗体变体。在一些方面，制剂中抗体或抗体变体的浓度为约200、250、300、350、400、450或500mg/ml。在一个方面，制剂中抗体或抗体变体的浓度小于450mg/ml。

本发明的另一个方面是本发明的抗体用于治疗与过度或不受控的补体激活相关的病症的用途。其包括心肺转流术期间的补体激活；由急性心肌梗塞、动脉瘤、卒中、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克、肠缺血或导致缺血的其他事件后的缺血-再灌注所致的补体激活。补体激活也已经被证明与炎性病症如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞性贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎相关。所述病症可以是由不良药物反应、药物过敏、IL-2引起的血管渗漏综合征或放射摄影造影介质过敏所致。其还包括自体免疫疾病如***性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)和多发性硬化。在另一个实施方案中，补体激活还与移植排斥相关联。在另一个实施方案中，补体激活还与眼病(病理学涉及补体(包括补体的经典和备选途径)的所有眼部病症和疾病)相关联，所述眼部如，例如，不限于，黄斑变性病，如所有阶段的年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式，糖尿病视网膜病(diabeticretinopathy)和其他缺血相关性视网膜病，脉络膜新血管形成(choroidalneovascularization，CNV)，葡萄膜炎(uveitis)，糖尿病黄斑水肿(diabetic macularedema)，病理性近视(pathological myopia)，希佩尔-林道病(von Hippel-Lindaudisease)，眼的组织胞浆菌病(histoplasmosis)，视网膜中央静脉闭塞(Central RetinalVein Occlusion，CRVO)，角膜新血管形成(corneal neovascularization)和视网膜新血管形成(retinal neovascularization)。在一个实例中，补体相关性眼部病症包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎(endophthalmitis)和葡萄膜炎。在另一个实例中，非渗出性AMD可以包括硬玻璃疣，软玻璃疣，地图样萎缩和/或色素簇集的存在。在另一个实例中，补体相关性眼部病症包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD(例如包括多个小的至一个或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)，中期AMD(例如包括大量的中等玻璃疣至一个或多个大玻璃疣)和晚期AMD(例如包括地图样萎缩或晚期湿性AMD(CNV)。在另一个实例中，中期干性AMD可以包括大的汇合的玻璃疣。在另一个实例中，地图样萎缩可以包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在另一个实例中，地图样萎缩的面积可以是小的或大的和/或可以是在黄斑区域中或在***视网膜中。在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

在另一个方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体及使用说明。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体以及用于施用所述抗体以治疗补体相关病症的说明。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含第一容器，所述第一容器包含组合物，所述组合物包含一种或多种本发明的抗体；和第二容器，所述第二容器包含缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药用的。在一个实施方案中，包含本发明的抗体的组合物还包含载体，在一些实施方案中，所述载体是药用的。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于将所述组合物(例如抗体，或其抗体片段(例如抗原结合片段)施用于受试者的说明。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含使用所述试剂盒的说明。

在一个方面，本发明涉及制造品，所述制造品含有可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症的材料。在一个实施方案中，本发明涉及制造品，所述制造品包含：(a)容器；(b)容器上的标签；和(c)用所述容器盛放的物质组合物，所述物质组合物包含本发明的抗体，其中所述容器上的标签指示所述组合物可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症。

在一个方面，本发明提供本发明的抗-因子D抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如补体相关性眼部病症。在一个实施方案中，补体相关性眼部病症选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎和葡萄膜炎。在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

在一个方面，本发明提供本发明的制造品在制备药物中的用途，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如补体相关性眼部病症。在一个实施方案中，补体相关性眼部病症选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎和葡萄膜炎.在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

在一个方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于治疗性和/或预防性治疗疾病，如补体相关性眼部病症。在一个实施方案中，补体相关性眼部病症选自年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎和葡萄膜炎.在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

在一个方面，本发明提供因子D拮抗剂和HTRA1拮抗剂。在一个实施方案中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。在另一个实施方案中，抗-因子D抗体是本文所述的抗-因子D抗体变体。在一个实施方案中，HTRA1拮抗剂是抗-HTRA1抗体。

在一个方面，治疗患有与过度或不受控的补体激活相关的病症的人受试者中的与过度或不受控的补体激活相关的病症包括向所述受试者施用有效量的治疗化合物，如因子D拮抗剂，并且还包括向所述受试者施用有效量的第二治疗化合物，如HTRA1拮抗剂。在一个实施方案中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。在一个实施方案中，抗-因子D抗体是本文所述的抗-因子D抗体变体。在一个实施方案中，HTRA1拮抗剂是抗-HTRA1抗体。在一个实施方案中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体并且HTRA1拮抗剂是抗-HTRA1抗体。

在一个方面，因子D拮抗剂和任何第二治疗化合物的施用可以同时进行，例如，作为单个组合物或作为两种以上的不同组合物，使用相同或不同的给药途径。备选地或另外地，所述施用可以以任意顺序相继进行。

附图简述

图1显示参比抗-因子D抗体WT(aFD WT)及其选择的变体的氨基酸序列(1A：WT的轻链和重链序列；1B：轻链和重链可变结构域的比对；1C：SIESD(AFD.v8)的轻链和重链序列；1D：SIESD.N103S(AFD.v14)的轻链和重链序列)。可变结构域内的HVR具有下划线。变体中的残基置换以粗体显示。在图1C和1D中，Cys和Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：21)修饰以斜体显示。

图2显示在延长的时间内在限定的条件下不同抗体Fab片段的抗原结合能力(2A：10mg/mL的Fab蛋白浓度，在pH5.5缓冲剂中；2B：100mg/ml的Fab蛋白浓度，在PBS中；2C：100mg/ml的Fab蛋白浓度，在PBS中)。

图3显示在限定的条件下不同抗体Fab片段随时间的降解，由此通过离子交换色谱法(IEC)确定主峰(3A：10mg/mL的Fab蛋白浓度，在pH5.5缓冲剂中；3B：100mg/ml的Fab蛋白浓度，在PBS中)。

图4显示在限定的条件下不同抗体Fab片段随时间的异构化和脱酰胺(4A：Fab蛋白浓度为10mg/mL，在pH5.5缓冲剂中；4B：Fab蛋白浓度为100mg/ml，在PBS中)。

图5显示在限定的条件下在延长的时间内不同抗体Fab片段的聚集(Fab蛋白浓度为100mg/ml，在PBS中)，通过分子排阻色谱法(SEC)测量单体峰来确定。

图6显示aFD WT、AFD.v2、AFD.v6和AFD.v8在pH 6以及低离子强度(～100mg/ml，在20mM His-HCl，pH 6中)的溶解性。

图7显示抗体Fab片段在pH 6和低离子强度(～100mg/ml，在20mM His-HCl，pH 6中)的溶解性。aFD WT的不溶性通过经由透析交换到PBS(一种含盐(NaCl)的缓冲剂)中而改变。

图8显示227mg/ml(aFD WT)，269mg/ml(AFD.v8)和344mg/ml(AFD.v14)的抗体Fab片段在PBS(pH 7.3)中的溶解性。

图9显示在2-8℃孵育3周前通过分子排阻色谱法(SEC)测量的SIESD.N103S(AFD.v14)在PBS中的％聚集。

图10显示在兔中进行玻璃体内注射后抗体Fab片段的药物动力学。

图11显示在pH 5.5缓冲剂中的抗体Fab片段的粘度的蛋白浓度依赖性。

发明详述

定义

本申请中使用的术语被解释为具有对本领域技术人员来说的普通的和典型的含义。然而，申请人希望的是，以下术语被给予以下限定的具体定义。

术语″抗体″以最广义使用，并且具体地涵盖全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，只要其显示所需的生物学活性如抗原结合活性即可。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特性的糖蛋白。抗体显示对特定靶标的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其他缺少靶特异性的抗体样分子。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，之后是若干个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(V_L)而在其另一端具有恒定结构域。如本文中所使用的术语“抗体”清楚地包括保持抗原结合活性的抗体片段。

″抗体片段″是指包含完整抗体与结合所述完整抗体的抗原结合的部分的不同于完整抗体的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和多特由抗体片段形成的异性抗体。

如本文使用的，“抗-因子D抗体”是指以这样的方式特异性结合因子D从而抑制或充分减少补体激活的抗体。

本文中使用术语“因子D”来表示天然序列和变体因子D多肽。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，各结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(见，例如，Kindt等.KubyImmunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007).)单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的一种抗体的VH或VL结构域来分离，从而分别筛选互补VL或VH结构域的文库。见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature352：624-628(1991)。

术语“可变”是指这样的事实，即在抗体之间可变结构域的某些部分在序列上差异很大并且被用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的可变结构域上并不是均匀分布的。其集中于在轻链和重链可变结构域中的三个被称为高变区的区段。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，其大多采取β折叠构型，通过三个高变区连接，所述三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β折叠结构的部分。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段(各自具有单个抗原结合位点)和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。木瓜蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab′)2片段.

Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加有几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab′片段生成的，在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的、非共价缔合的二聚体组成。在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之，六个高变区将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，然而亲和性低于完整结合位点。

如本文使用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的各区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。据信HVR-H3在赋予抗体优良的特异性方面发挥独特的作用。参见，例如，Xu等.(2000)Immunity 13：37-45；Johnson和Wu(2003)in Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，N.J.)。“框架区”或“FR”残基是不同于如本文所限定的高变区残基的那些可变结构域残基。如本文使用的，HVR区包含位于位置24-36(对于L1)，46-56(对于L2)，89-97(对于L3)，26-35B(对于H1)，47-65(对于H2)和93-102(对于H3)内的任意数目的残基。因此，HVR包括在前述位置中的残基：

A)24-34(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；

B)L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65和H3的95-102(Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。

C)30-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35(H1)，47-58(H2)，93-100a-j(H3)(MacCallum等.J.Mol.Biol.262：732-745(1996)。

高变区可以包含“延长的高变区”如下：在VL中的24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97(L3)以及在VH中的26-35B(H1)，50-65，47-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每个，可变结构域残基根据Kabat等(见上)进行编号。

除了VH中的CDR1以外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR被包含在CDR的被称为简短CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR的区域内。示例的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在氨基酸残基L1的31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102处。(参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008).)

参比抗体(也称为“起始抗体”或“亲本抗体”)的“抗体变体”或“修饰的抗体”是包含与参比/起始抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体，其中参比抗体的一个或多个氨基酸残基被修饰。通常，抗体变体与参比抗体具有至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性，并且最优选地至少98％序列同一性。百分比序列同一性例如通过Fitch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1382-1386(1983)，Needleman等.，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)描述的算法版本，在将参比抗体的序列与候选抗体变体比对以提供最大同源性后确定。同一性或相似性在本文中被限定为，在对序列进行比对并且在需要的情况下引入间隙(gap)以实现最大百分比序列同一性后，候选变体序列中与亲本抗体残基相同(即相同的残基)或相似(即来自基于共有侧链性质的相同组的氨基酸残基，见下)的氨基酸残基的百分比。抗体的氨基酸序列变体可以通过将合适的核苷酸改变引入到编码抗体的DNA中或通过肽合成制备。此种变体包括，例如，自目的抗体的氨基酸序列的缺失和/或向目的抗体的氨基酸序列的***和/或对目的抗体的氨基酸序列内的残基的置换。进行缺失、***和置换的任意组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所需的特性。氨基酸变化也可以改变抗体的翻译后程序，如改变糖基化位点的数目或位置。用于产生抗体的抗体序列变体的方法类似于例如美国专利号5,534,615中所述的用于产生多肽的氨基酸序列变体的方法，所述专利通过引用清楚地结合于此。

如果包括抗体在内的蛋白质基本上保持完整的构象结构和生物学活性，则称其为“稳定的”。多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术是本领域中可获得的并且在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90中被综述。具有“提高的稳定性”的抗体变体是指与起始参比抗体相比更稳定的抗体变体。优选地，具有提高的稳定性的抗体变体是天然(野生型)抗体的变体，其中特定的氨基酸残基被改变以用于提高天然抗体的物理稳定性，和/或化学稳定性，和/或生物学活性，和/或降低其免疫原性。Walsh(2000)Nat.Biotech.18：831-3。

术语“异构化”通常是指这样一种化学过程，所述所述化学过程化学化合物被转化为其任意异构形式，即，具有相同的化学组成但是具有不同的结构或构型并且因此通常具有不同的物理和化学性质的形式。本文中具体使用的是天冬氨酸异构化，其是这样一种过程，其中多肽的一个或多个天冬氨酸(D或Asp)残基被转化为异天冬氨酸残基。Geiger和Clarke(1987)J.Biol.Chem.262：785-94。

术语“脱酰胺”通常是指这样的化学反应，其中酰胺官能团被从有机化合物除去。本文中具体使用的是天冬酰胺脱酰胺，这是这样的过程，其中多肽的一个或多个天冬酰胺(N或Asn)残基被转化为天冬氨酸(D或Asp)，即中性酰胺侧链被转化为整体具有酸性的残基。Xie和Schowen(1999)J.Pharm.Sci.88：8-13。

氨基酸残基“倾向”于某些鉴定的物理或化学过程(例如，异构化或脱酰胺)是指特定蛋白质分子内被鉴定为具有进行鉴定的过程如异构化或脱酰胺的倾向的那些残基。其倾向通常通过其在蛋白质的一级和/或构象结构内的相对位置确定。例如，已经证明，Asp-XXX基序(其中XXX可以是Asp、Gly、His、Ser或Thr)中的第一个Asp由于其相邻残基的参与而倾向于Asp异构化，其中相同蛋白质内的其他一些Asp可能不具有此种倾向。用于在具体蛋白质分子内鉴定残基对某过程的倾向性的测定是本领域中已知的。参见，例如，Cacia等(1996)Biochem.35：1897-1903。

在本发明的抗-因子D抗体的语境中，“有活性的”或“活性”或“生物学活性”是对抗(部分或完全抑制)因子D的生物学活性的能力。因子D拮抗剂的生物学活性的一个实例是实现可测量的因子D相关疾病或病症的状态(例如病理学)的改善的能力，所述因子D相关疾病或病症诸如例如补体相关的眼疾。可以在体外或体内测试中使用相关动物模型或人临床试验来确定活性，所述测试包括结合测定，备选途径溶血测定(例如测量备选途径补体活性或激活的抑制的测定)。

术语“补体相关病症”以最广义使用并且包括与过度或不受控的补体激活相关的病症。其包括心肺转流术期间的补体激活；由急性心肌梗塞、动脉瘤、卒中、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克、肠缺血或导致缺血的其他事件后的缺血-再灌注所致的补体激活。补体激活还被证明与炎性病症如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞性贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎相关。所述病症可以是由不良药物反应、药物过敏、IL-2引起的血管渗漏综合征或放射摄影造影介质过敏所致。其还包括自体免疫疾病如***性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病和多发性硬化。补体激活还与移植排斥相关联。补体激活还与眼病如年龄相关性黄斑变性，糖尿病视网膜病和其他缺血相关性视网膜病，脉络膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病黄斑水肿，病理性近视，希佩尔-林道病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉闭塞(CRVO)，角膜新血管形成和视网膜新血管形成相关联。

术语“补体相关性眼部病症”以最广义使用并且包括病理学涉及补体(包括经典和备选途径，并且特别是补体的备选途径)的所有眼部病症。补体相关性眼部病症包括但不限于，黄斑变性病，如所有阶段的年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括于性和湿性(非渗出性和渗出性)形式，脉络膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性和其他缺血相关性视网膜病，及其他眼内新生血管疾病，如糖尿病黄斑水肿，病理性近视，希佩尔-林道病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉闭塞(CRVO)，角膜新血管形成和视网膜新血管形成。在一个实例中，补体相关性眼部病症包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎和葡萄膜炎。在另一个实例中，非渗出性AMD可以包括硬玻璃疣，软玻璃疣，地图样萎缩和/或色素簇集的存在。在一个实例中，补体相关性眼部病症包括年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD(例如包括多个小的至一个或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)，中期AMD(例如包括大量的中等玻璃疣至一个或多个大玻璃疣)和晚期AMD(例如包括地图样萎缩或晚期湿性AMD(CNV)。(Ferris等.，AREDS Report No.18；Sallo等，Eye Res.，34(3)：238-40(2009)；Jager等，New Engl.J.Med.，359(1)：1735(2008))。在另一个实例中，中期干性AMD可以包括大的汇合的玻璃疣。在另一个实例中，地图样萎缩可以包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在另一个实例中，地图样萎缩的面积可以是小的或大的和/或可以是在黄斑区域中或在***视网膜中。在一个实例中，补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

“治疗”是以防止疾病的发展或改变疾病的病理学为目的进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性的或预防的方法。那些需要治疗者包括已经患有疾病者以及要防止其患有疾病者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗性药剂可以直接改变免疫响应的组分的响应的程度，或者通过其他治疗性药剂例如抗生素、抗真菌剂、消炎剂、化疗剂等使疾病对治疗更敏感。

疾病诸如补体相关的眼疾的“病理学”包括危及患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不可控细胞生长(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)、抗体产生、自身抗体产生、补体产生、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌性产物、抑制或加重任何炎症或免疫反应、炎症细胞(嗜中性细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)渗入到细胞空间中等。

当在本文中使用时，术语“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、高等灵长类、家养和农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物，如马、猪、牛、狗、猫和雪貂等。在本发明一个实施方案中，哺乳动物是人。

“结合”一种或多种此外的治疗性药剂给药包括同时(并行)和以任何次序的连续给药。

“治疗有效量”是实现可测量的目标疾病或病症的状态(例如病理学)的改善所需要的“因子D拮抗剂”的量，所述疾病或病症诸如例如补体相关的眼疾。

“氨基酸置换”是指将预先确定的氨基酸序列中的至少一个现有的氨基酸残基替换成另一种不同的“替代”氨基酸残基。替代残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即，由遗传密码编码的)并且选自由以下各项组成的组：丙氨酸(ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。用一个或多个非天然存在的氨基酸残基进行的置换也被包括在本文中氨基酸置换的定义中。“非天然存在的氨基酸残基”是指不同于以上列出的那些天然存在的氨基酸残基的残基，其能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物如Ellman等，Meth.Enzym，202：301-336(1991)中所述的那些。为了产生此种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等，Science，244：182(1989)和Ellman等(见上)的方法。简言之，这些方法包括化学活化具有非天然存在的氨基酸残基的抑制tRNA，之后体外转录和翻译所述RNA。

“氨基酸***”是指将至少一个氨基酸结合到预先确定的氨基酸序列中。虽然***通常由一个或两个氨基酸残基的***组成，但是本申请预期更大的“肽***”，例如***约三至约五个或甚至多达约十个氨基酸残基。***的残基可以是如以上公开的天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。

“氨基酸缺失”是指从预先确定的氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。

术语″长效递送″、″持续释放″和″受控释放″通常用于描述利用制剂、剂型、设备或其他类型的技术以实现治疗药物的延长的释放或生物利用度的递送机制。其可以涉及至全身总体循环或受试者或受试者中的局部作用位点(包括但不限于细胞、组织、器官、关节、区域等)提供药物的延长释放或生物利用度的技术。此外，这些术语可以指用于延长药物自制剂或剂型的释放的技术或其可以指用于延长药物的生物利用度或药物动力学或对受试者的作用持续时间的技术或其可以指用于延长制剂产生的药物动力学效应的技术。″长效制剂″、″持续释放制剂″或″受控释放制剂″是用于提供长效递送的药物制剂、剂型或其他技术。在一个方面，受控释放用于提高药物的局部生物利用度，具体地在眼部递送的语境中，其用于提高眼部保留时间。“增加的眼部保留时间”是指递送后的时间期间递送的眼部药物在质量(保持活性)和数量(有效量)方面都保持有效。除了高剂量和受控释放以外或作为高剂量和受控释放的替代，药物可以被翻译后修饰，如提高PEG化，以实现增加的体内半衰期。

抗-因子D抗体及其变体

本发明包括抗-因子D抗体及其变体的制备和使用。在一个方面，形成用于产生本发明的变体的碱基的亲本参比抗-因子D抗体是人源化抗-因子D抗体。用于将非人抗体人源化的方法是本领域中已知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为″进口″残基，其典型地取自″进口″可变结构域。人源化可以基本上遵循Winter及同事(Jones等.(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等.(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等.(1988)Science 239：1534-1536)的方法，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列进行。因此，此种″人源化″抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变结构域被来自非人物种的相应序列置换。实际上，人源化抗体典型地是这样的人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基置换。

在欲将抗体用于人治疗用途时，在一些情况下，用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择可能对于降低抗原性和/或HAMA反应(人抗小鼠抗体)是重要的。减少或消除HAMA反应通常是临床开发合适的治疗剂的重要方面。参见，例如，Khaxzaeli等(1988)J.Natl.Cancer Inst 80：937；Jaffers等(1986)Transplantation 41：572；Shawler等(1985)J.Immunol.135：1530；Sears等(1984)J..Biol.Response Mod.3：138；Miller等(1983)Blood 62：988；Hakimi等(1991)J.Immunol.147：1352；Reichmann等(1988)Nature 332：323；Junghans等(1990)Cancer Res.50：1495。如本文所述，本发明提供被人源化从而减少或消除了HAMA反应的抗体。这些抗体的变体可以进一步使用本领域已知的常规方法获得，所述方法中的一些在下文中被进一步描述。根据所谓的″最佳-配合(best-fit)″方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库来筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。鉴定与啮齿动物的V结构域序列最接近的人V结构域序列并且其中的人框架区(FR)被接受用于人源化抗体(Sims等(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法使用来源于所有特定轻链或重链亚组的人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285；Presta等(1993)J.Immunol.151：2623)。

例如，来自如本文所述的的抗体的氨基酸序列可以充当用于框架和/或高可变序列的多样化的起始(亲本)序列。选择的与起始高可变序列相连的框架序列在本文中被称为受体人框架。虽然受体人框架可以来自或来源于人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，但是当此种框架被证明在人受试者中具有最小免疫原性或没有免疫原性时，受体人框架可以来自或来源于人共有框架序列。用于本文用途的“受体人框架”是这样的框架，其包含来源于人免疫球蛋白框架或来自人共有框架的VL或VH框架的氨基酸序列。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或可以含有预先存在的氨基酸序列改变。当存在预先存在的氨基酸改变时，优选地存在不超过5个并且优选地4以下或3个以下预先存在的氨基酸改变。在一个实施方案中，VH受体人框架与VH人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。“人共有框架”是这样的框架，其代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择好最常出现的氨基酸残基。通常，自可变结构域序列的亚组进行人免疫球蛋白VL或VH序列的选择。通常，所述序列亚组是如在Kabat等中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如在Kabat等中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如在Kabat等中的亚组III。

当受体来源于人免疫球蛋白时，可以在人框架序列的集合中任选地选择基于其与供体框架序列的同源性(通过将供体框架序列与不同人框架序列比对)选择的人框架序列，并且选择同源性最高的框架序列作为受体。受体人框架可以来自或来源于公众数据库中可获得的人抗体种系序列。

在一个实施方案中，本文中的人共有框架来自或来源于VH亚组VII和/或VLκ亚组I共有框架序列。

在一个实施方案中，用于产生抗-因子D抗体的人框架模板可以包含来自包含对于VH链的VI-4.1b+(VH7家族)和JH4d的组合和/或对于VL链的DPK4(VκI家族)和JK2的组合的模板的框架序列。

虽然受体可以与选择的人框架序列在序列上相同而不论其是来自人免疫球蛋白还是人共有框架，本发明预期受体序列相对于所述人免疫球蛋白序列或人共有框架序列可以包含预先存在的氨基酸置换。这些预先存在的置换优选地是最少的；通常是相对于所述人免疫球蛋白序列或共有框架序列的四个、三个、两个或一个氨基酸差异。

非人抗体的高变区残基被结合到VL和/或VH受体人框架中。例如，可以结合对应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。任选地，结合如下的延长的高变区残基：24-36或24-34(L1)，46-56或50-56(L2)和89-97(L3)，26-35B(H1)，50-65，47-65或49-65(H2)和93-102，94-102，或95-102(H3)。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体或抗体变体包含轻链结构域和重链可变结构域。在一个方面，本发明的参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变结构域。在一个方面，本发明的参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：4的重链可变结构域。

此外，抗-因子D抗体可以包含任何合适的恒定结构域序列，前提是抗体保持结合因子D的能力。例如，在一些实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含至少部分的重链恒定结构域。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含α、δ、ε、γ或μ重链中的一个或其组合的重链恒定结构域。根据其重链恒定结构域(C_H)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分配至不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其重链分别被指定为α、δ、ε、γ和μ。基于在C_H序列和功能上相对小的差异，γ和α类被进一步划分为亚类，例如，人表达一下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含在对效应物功能(例如结合亲和力)产生所需影响的氨基酸位置处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含重链恒定结构域，所述重链恒定结构域包含在对效应物功能(例如结合亲和力)不产生影响的氨基酸位置处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含IgG型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定结构域并且进一步包含在位置114(Kabat编号；相当于EU编号中的118)，168(Kabat编号；相当于EU编号中的172)，172(Kabat编号；相当于EU编号中的176)和/或228(EU编号)处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)型的重链恒定结构域并且进一步包含在位置114处的置换，其中位置114是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，位置168是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，位置172是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)和/或位置228是脯氨酸(P)、精氨酸(R)或丝氨酸(S)。

此外，例如，在一些实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含至少部分的轻链恒定结构域。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含κ或λ轻链中的一个或其组合的轻链恒定结构域，因为来自任何脊椎动物物种的轻链都可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而被分配至两个明显不同的类别(称为κ和λ)中的一个。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含轻链恒定结构域，所述轻链恒定结构域包含在对效应物功能(例如结合亲和力)产生所需影响的氨基酸位置处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含轻链恒定结构域，所述轻链恒定结构域包含在对效应物功能(例如结合亲和力)不产生影响的氨基酸位置处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含κ型的轻链恒定结构域并且进一步包含在位置110、144、146和/或168(Kabat编号)处的置换。在一个实施方案中，本发明的抗-因子D抗体包含κ型的轻链恒定结构域并且进一步包含在位置110、位置144、位置146和/或位置168处的置换，其中110是半胱氨酸(C)或缬氨酸(V)，144是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，146是异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)，168是半胱氨酸(C)或丝氨酸(S)。

可以修饰包括人源化抗-因子D抗体在内的亲本或参比抗-因子D抗体以产生修饰的抗-因子D抗体或抗-因子D抗体变体。在一个实施方案中，修饰的抗-因子D抗体及其变体相比于亲本抗体可以具有改善的物理、化学、生物学或均一性性质。

在一个实施方案中，本发明的抗体的一个或多个氨基酸改变(例如置换)成亲本抗体高变区的一个或多个氨基酸。备选地，或另外地，可以在亲本抗体中引入一个或多个框架区残基的改变(例如置换)。修饰的框架区残基的实例包括直接与抗原非共价结合(Amit等，(1986)Science，233：747-753)；与CDR相互作用/影响CDR的构象(Chothia等.(1987)J.Mol.Biol.，196：901-917)和/或参与V_L-V_H界面(EP 239 400B1)的那些。在某些实施方案中，一个或多个此种框架区残基的修饰导致抗体对抗原的结合亲和力增强。例如，在本发明的该实施方案中，约一个至约5个框架残基可以被改变。修饰的框架或HVR区残基的实例包括这样的位点，其中在所述位点处的修饰导致产生脱酰胺的变体(例如，天冬酰胺(N或Asn)残基被修饰成天冬氨酸(D或Asp)，氧化变体(例如，甲硫氨酸(M或Met)残基和/或色氨酸(W或Trp)残基被修饰成砜或亚砜)或焦谷氨酸变体(例如，谷氨酰胺(Q或Gln)残基被修饰成焦谷氨酸)。修饰的框架区残基或HVR区残基的实例包括可能的脱酰胺位点(即天冬酰胺(N或Asn))，氧化位点(即甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp))或焦谷氨酸转化位点(即谷氨酰胺(Q或Gln))，其中在所述位点处的修饰分别防止脱酰胺和/或氧化和/或焦谷氨酸转化。

为了防止形成脱酰胺变体，可以将天冬酰胺(N或Asn)突变成丙氨酸(A或Ala)、谷氨酰胺(Q或Gln)或丝氨酸(S或Ser)。为了防止形成氧化变体，可以将甲硫氨酸(Met)或色氨酸(W或Trp)突变成亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。为了防止形成焦谷氨酸变体，可以将谷氨酰胺(Q或Gln)突变成谷氨酸(E或Glu)。(Amphlett，G.等，Pharm.Biotechnol.，9：1-140(1996))。备选地，或另外地，一个或多个框架区残基的改变(例如置换)可以在亲本抗体的Fc区中。

一种可用于产生此种修饰抗体的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基代替从而影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在所述置换位点处或针对所述置换位点引入另外的或其他突变精修对所述置换显示功能敏感性的那些高变区残基。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，突变本身的性质不需要预先确定。筛选以此方式产生的ala突变体的生物学活性(即结合亲和力或溶血测定)，如本文所述。

即使在抗体或其片段(例如抗原结合片段)中有更多的修饰，也可以通过选择在其对保持(a)置换区域中多肽主链的结构，例如，呈折叠或螺旋构型，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的影响方面显著不同的置换实现生物学性质。基于共有的侧链性质，天然存在的残基被划分成多组：

(1)疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性：asp、glu；

(4)碱性：his、lys、arg；

(5)影响链定向的残基：gly、pro；以及

(6)芳香性：trp、tyr、phe。

非保守置换需要将这些类型中的一个类型的成员换成另一个类型。

在另一个实施方案中，修饰被选择用于修饰的位点，并且通过噬菌体展示选择具有提高的结合亲和力的那些修饰。

编码氨基酸序列突变体或修饰的氨基酸序列的核酸分子通过本领域中已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，对亲本抗体的早先制备的变体或非变体版本进行寡核苷酸介导的(或位点定向)诱变、PCR诱变和盒诱变。一种用于制备突变体或变体或修饰的氨基酸序列的方法是位点定向诱变(参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488)。

在某些实施方案中，修饰的抗体将仅具有单个置换的高变区残基。在其他实施方案中，亲本抗体的高变区残基中的两个或更多个被置换，例如约两个至约十个高变区置换。通常，修饰的抗体的氨基酸序列与亲本抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，并且最优选地至少95％氨基酸序列同一性或相似性(以上在定义部分被定义)。

在制备修饰的抗体后，确定所述分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所述，这可以包括确定抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的结合亲和力和/或其他生物学活性。在本发明的一个实施方案中，制备一系列修饰的抗体并筛选其对抗原如因子D或其片段的结合亲和力。任选地对选自该初筛的一个或多个抗体突变体或修饰的抗体进行一种或多种进一步的生物学活性测定以确认所述抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)确实可用于例如临床前研究。

可以对本文所述的修饰的抗-因子D抗体进行进一步修饰，通常这取决于修饰的抗体的目的用途。所述修饰可以包括氨基酸序列的进一步改变，与异源多肽融合和/或共价修饰如以下详述的那些。关于氨基酸序列改变，以上详述了示例的修饰。例如，不参与保持修饰的抗体的合适构型的任何半胱氨酸残基也都可以被置换，通常置换成丝氨酸，以提高分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键添加至抗体以提高其稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时)。

另一种类型的氨基酸突变体具有改变的糖基化形式。这可以通过缺失在抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点来实现。抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一种在多肽中的存在产生可能的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)相连。向抗体添加糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列方便地完成(用于N-连接糖基化位点)。所述改变也可以通过向原抗体的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行置换来进行(用于O-连接糖基化位点)。

本发明的抗体和抗体变体还可以通过将所述抗体缀合于多种非蛋白质聚合物分子中的一种而被进一步共价修饰。抗体-聚合物缀合物可以使用适用于利用聚合物对抗体进行衍生化的技术来制备。可以理解的是，本发明不限于在抗体或抗体片段与聚合物之间使用任何特定类型的连接的缀合物。

在一个方面，本发明的缀合物包括这样的种类，其中聚合物共价连接至亲本抗体上的特定位点，即聚合物连接靶向亲本抗体或抗体片段中的特定区域或特定氨基酸残基。聚合物的位点特异性缀合最常见地是通过与亲本抗体或抗体片段中的半胱氨酸残基连接来实现。在这样的实施方案中，偶联化学可以例如利用不在亲本抗体的二硫桥中的半胱氨酸残基的游离巯基。聚合物可以用能够与亲本抗体上的游离巯基或硫醇基团特异性反应的任何官能团(如马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸、对甲苯磺酸、氮杂环丙烷、exirane和5-吡啶基官能团)活化。可以使用任何适用于所选的偶联***的化学的方案将聚合物偶联至亲本抗体，如美国专利号4,179,337；7,122,636以及Jevsevar等(2010)Biotech.J.5：113-128中所述的方案和***。

在一个实施方案中，天然存在于亲本抗体中的一个或多个半胱氨酸残基被用作用于聚合物缀合的连接位点。在另一个实施方案中，将一个或多个半胱氨酸残基工程改造到亲本抗体中的所选的位点中以用于为聚合物提供特定的连接位点。

在一个方面，本发明包括抗体片段-聚合物缀合物，其中所述抗体片段是Fab，并且所述聚合物连接至通常将形成连接轻链和重链的链间二硫键的Fab片段的轻链或重链中的一个或多个半胱氨酸残基。

在另一个方面，本发明包括抗体片段-聚合物缀合物，其中所述抗体片段是Fab’，并且聚合物连接靶向Fab’片段的铰链区。在一个实施方案中，天然存在于抗体片段的铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基被用于连接聚合物。在另一个实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基被工程改造到Fab’片段的铰链区中以用于为聚合物提供特定的连接位点。在一个实施方案中，通过在C’端添加一个半胱氨酸来修饰本发明的抗-因子D抗体变体Fab片段以用于为聚合物缀合提供一个连接位点。在另一个实施方案中，通过在C’端添加四个另外的残基Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：21)来修饰本发明的抗-因子D抗体变体Fab片段以用于为聚合物缀合提供两个连接位点。

一种常用的抗体缀合是PEG化，其中一个或多个聚乙二醇(PEG)聚合物被共价连接至抗体的恒定区。参见美国专利号4,179,337；7,122,636。已知不同大小(例如，约500D至约300,000D)和形状(例如，直链或支链的)PEG聚合物在本领域中被广泛使用。可用于本发明的聚合物可以商业获得(例如，自Nippon Oil and Fats；Nektar Therapeutics；CreativePEGWorks)或使用常规化学方法制备自可商购的原料。PEG化改变抗体药物的物理和化学性质，并且可以导致改善的药物动力学表现如提高的稳定性、降低的免疫原性、延长的循环寿命以及增加的停留时间。

亲和力和生物学活性

可以在体外或体内筛选具有在本文中被鉴定为对于抗-因子D抗体来说理想的特性的抗体的理想性质如因子D-结合亲和力和因子D-抑制活性。

a.亲和力

在一个方面，本发明提供抗-因子D抗体变体，所述抗-因子D抗体变体与其所来源于的亲本抗-因子D抗体竞争。还提供结合与亲本抗-因子D抗体相同的表位的抗-因子D抗体变体。

为了确定抗-因子D抗体变体是否结合人因子D上的参比抗-因子D抗体所结合的相同表位，可以进行交叉封闭测定(Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988))。备选地，可以进行表位定位(mapping)以确定抗-因子D抗体是否结合目标表位(Champe等.(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394。抗体对例如人因子D的亲和力可以使用标准方法确定，所述方法包括实施例中更为详细描述的表面等离子共振(SPR)测定。

在一个方面，本发明的抗-因子D抗体变体的因子D结合亲和力与其所来源于的亲本抗-因子D抗体的因子D结合亲和力相当。在一些方面，本发明的抗-因子D抗体变体的因子D结合亲和力在亲本抗-因子D抗体的因子D结合亲和力的10倍、7倍、5倍、2倍或1倍内。

在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是20nM(20x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是10nM(10x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是1.0nM(1.0x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是0.5nM(0.5x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是1.0pM(1.0x10^-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是0.5pM(0.5x10^-12M)或更好。

在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是10.0nM(10.0x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是5.0nM(5.0x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是1.0nM(1.0x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是0.5nM(0.5x10^-9M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是5.0pM(5.0x10^-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是2.0pM(2.0x10^-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是1.0pM(1.0x10^-12M)或更好。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是0.5pM(0.5x10^-12M)或更好。

在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为0.5mM(0.5x10^-6M)至0.5pM(0.5x10^-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为15nM(15x10^-9M)至0.1nM(0.1x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为5.5nM(5.5x10^-9M)至1nM(1x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)为0.5pM(0.5x10^-12M)至50pM(5x10^-11M)。

在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为0.5mM(0.5x10^-6M)至0.5pM(0.5x10^-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体或其抗体变体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为10nM(10x10^-9M)至0.05nM(0.05x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为5.5nM(5.5x10^-9M)至1nM(1x10^{- 9}M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)为0.5pM(0.5x10^-12M)至50pM(5x10^-11M)。

在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约1.4pM(1.4x10^-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约1.1pM(1.1x10^-12M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约0.19nM(0.19x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约0.08nM(0.08x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约12.3nM(12.3x10^-9M)。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约9.0nM(9.0x10^-9M)。

在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约1.4pM(1.4x10^-12M)+/-0.5。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约1.1pM(1.1x10^-12M)+/-0.6。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约0.19nM(0.19x10^-9M)+/-.01。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约0.08nM(0.08x10^-9M)+/-0.01。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中单价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约12.3nM(12.3x10^-9M)+/-2。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中二价形式的抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)是约9.0nM(9.0x10^-9M)+/-1。

在另一个实施方案中，单价形式的抗-因子D抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)可以为约1.4pM(1.4x10^-12M)+/-2。在另一个实施方案中，二价形式的抗-因子D抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)可以为约1.1pM(1.1x10^-12M)+/-2。在另一个实施方案中，单价形式的抗-因子D抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)是约0.19nM(0.19x10^-9M)+/-2。在另一个实施方案中，二价形式的抗-因子D抗体或其抗体变体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)可以为约0.08nM(0.08x10^-9M)+/-2。在另一个实施方案中，单价形式的抗-因子D抗体对因子D的亲和力(例如，作为Fab片段的抗体对因子D的亲和力)可以为约12.3nM(12.3x10^-9M)+/-2。在另一个实施方案中，二价形式的抗-因子D抗体对因子D的亲和力(例如，作为IgG的抗体对因子D的亲和力)可以为约9.0nM(9.0x10^-9M)+/-2。

如本领域中已知的，配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测定中的任一种来确定，并且可以表示为多种数量值。因此，在一个实施方案中，结合亲和力以K_D值表示并且反映固有结合亲和力(例如，在亲合力作用最小的情况下)。通常并且优选地，在体外(在无细胞情况下或在细胞相关情况下)测量结合亲和力。如本文中更为详细地描述的，结合亲和力的倍数差异可以被量化为人源化抗体(例如，Fab形式的)的单价结合亲和力值与参比/比较抗体(例如，Fab形式的)(例如，具有供体高变区序列的鼠抗体)的单价结合亲和力值之比，其中在相似的测定条件下测定结合亲和力值。因此，在一个实施方案中，结合亲和力的倍数差异被确定为Fab形式的人源化抗体与所述参比/比较Fab抗体的K_D值之比。例如，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(A)的亲和力比参比抗体(M)的亲和力“低3倍”，那么如果A的K_D值是3x，则M的K_D值将是1x，并且A的K_D与M的K_D之比将是3∶1。相反，在一个实施方案中，如果本发明的抗体(C)的亲和力比参比抗体(R)的亲和力“高3倍”，那么如果C的K_D值是1x，则R的K_D值将是3x，并且C的K_D与R的K_D之比将是1∶3。包括本文中所述的那些在内的本领域中已知的多种测定中的任一种可以用于获得结合亲和力量度，所述测定包括例如Biacore、放射性免疫测定(RIA)和ELISA。

此外，本发明的抗体的K_D值可以变化，这取决于使用的具体测定的条件。例如，在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中将Fab或抗体固定并且测量配体(即因子D)的结合，或备选地，将Fab或抗体的配体(即因子D)固定并且测量Fab或抗体的结合。在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中再生条件可以包含(1)10mM甘氨酸或4M MgCl₂，pH 1.5，以及(2)pH 1.0至pH 7.5之间的pH，包括pH1.5、pH 5.0、pH 6.0和pH 7.2。在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中结合条件可以包含(1)PBS或HEPES-缓冲盐水和(2)Tween-20，即0.1％Tween-20。在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中配体(即因子D)的来源可以来自可商购的来源。在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中(1)将Fab或抗体固定并且测量配体(即因子D)的结合，(2)再生条件包含4M MgCl₂，pH 7.2，并且(3)结合条件包含HEPES-缓冲盐水，pH 7.2，含0.1％Tween-20。在一个实施方案中，结合亲和力量度可以在这样的测定中获得，其中(1)将配体(即因子D)固定并测量Fab或抗体的结合，(2)再生条件包含10mM甘氨酸，pH 1.5，并且(3)结合条件包含PBS缓冲剂。

b.生物学活性

为确定抗-因子D抗体或其变体或片段(例如抗原结合片段)是否能够结合因子D并且发挥生物学作用，例如，抑制备选途径溶血，可以使用利用兔RBC进行的溶血抑制测定，包括实施例2中所述的那些。此种溶血抑制可以使用标准测定确定(Kostavasili等(1997)Jof Immunology 158：1763-72；Wiesmann等(2006)Nature 444：159-60)。此种测定中补体的激活可以利用血清或血浆启动。血清或血浆中因子D的合适浓度(Pascual等.(1998)KidneyInternational 34：529-536；Complement Facts Book，Bernard J.Morley和MarkJ.Walport，编辑，Academic Press(2000)；Barnum等.(1984)J.Immunol.Methods，67：303-309)可以根据本领域中已知的方法常规确定，所述方法包括在文献如Pascual等.(1998)Kidney International 34：529-536和Barnum等.(1984)J.Immunol.Methods 67：303-309中描述的那些。本发明总体涉及能够抑制与因子D相关的生物学活性的抗体。例如，在18μg/ml的浓度(相当于血液中人因子D摩尔浓度的约1.5倍；抗-因子D抗体与因子D的摩尔比为约1.5∶1)，可以观察到抗体对备选补体活性的明显抑制(见，例如，美国专利号6,956,107)。

在一个实施方案中，本发明包括抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值小于30nM。在一个实施方案中，本发明包括抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值小于15nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值小于10nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值小于5nM。

在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为30nM至2nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为25nM至7nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为20nM至12nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为30nM至15nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为12nM至8nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为7nM至2nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为6nM至3nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为8nM至5nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为5nM至2nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为10nM至5nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC5₅₀值为8nM至2nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为7nM至3nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为6nM至4nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约4.7nM±0.6nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约6.4nM±0.6nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约3.5nM±0.5nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约4.4nM±1.5nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约10.2nM±0.8nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值为约23.9nM±5.0nM。

在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值小于80nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值小于50nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值小于40nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值小于20nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₅₀值小于15nM。

在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为80nM至10nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为75nM至15nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为70nM至20nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为65nM至25nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为60nM至30nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为55nM至35nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为50nM至40nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为80nM至70nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为55nM至25nM。在一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为16nM至12nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为约14.0nM±1.0nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为约38.0nM±11.0nM。在另一个实施方案中，本发明提供抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血，其中IC₉₀值为约72.6nM±4.8nM。

在一个实施方案中，本发明涉及抗-因子D抗体，其中在抗体与因子D的摩尔比为约0.05∶1(0.05)至约10∶1(10)，或约0.09∶1(0.09)至约8∶1(8)，或约0.1∶1(0.1)至约6∶1(6)，或约0.15∶1(0.15)至约5∶1(5)，或约0.19∶1(0.19)至约4∶1(4)，或约0.2∶1(0.2)至约3∶1(3)，或约0.3∶1(0.3)至约2∶1(2)，或约0.4∶1(0.4)至约1∶1(1)，或约0.5∶1(0.5)至约1∶2(0.5)，或约0.6∶1(0.6)至约1∶3(0.33)，或约0.7∶1(0.7)至约1∶4(0.25)，或约0.8∶1(0.8)至约1∶5(0.2)或约0.9∶1(0.9)至约1∶6(0.17)的情况下，所述抗体的Fab片段抑制备选途径溶血。

在一个实施方案中，本发明包括人源化抗-因子D抗体的片段(例如抗原结合片段)。本发明的抗体片段可以例如是Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、(scFv)₂、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微抗体、双抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗-因子D抗体片段(例如抗原结合片段)，其能够穿透基本上全部视网膜。在另一个实施方案中，本发明提供人源化抗-因子D抗体片段(例如抗原结合片段)，其能够穿透视网膜的整个厚度。

在一个实施方案中，本发明包括抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段的半衰期为经由单次玻璃体内注射向哺乳动物(例如人)眼部施用后至少3、5、7、10或12天。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗-因子D抗体，其中所述抗体的Fab片段抑制备选途径(AP)补体激活达经由单次玻璃体内注射向哺乳动物(例如人)眼部施用后至少40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或115天。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗-因子D抗体，其中在视网膜组织中保持抑制备选途径(AP)补体激活的所述抗体的Fab片段的浓度达经由单次玻璃体内注射向哺乳动物(例如人)眼部施用后至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85天。在另一个实施方案中，本发明包括人源化抗-因子D抗体，其中在玻璃体液中保持抑制备选途径(AP)补体激活的所述抗体的Fab片段的浓度达经由单次玻璃体内注射向哺乳动物(例如人)眼部施用后至少80、85、90、95、100、105、110或115天。

因子D拮抗剂可以单独施用也可以与至少第二治疗化合物组合施用。因子D拮抗剂和任何第二治疗化合物的施用可以同时进行，例如，作为单个组合物或者作为两种以上不同的组合物，使用相同或不同的施用途径。备选地，或另外，所述施用可以以任何顺序相继进行。在某些实施方案中，在两种以上组合物的施用之间可以存在数分钟至数日至数周至数月的间隔。例如，可以首先施用因子D拮抗剂，之后施用第二治疗化合物。然而，同样预期第二治疗化合物与因子D拮抗剂同时施用或在因子D拮抗剂之前施用。在一个实例中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。在另一个实例中，抗-因子D抗体是本文所述的抗-因子D抗体变体。在一个实例中，第二治疗化合物是HTRA1拮抗剂。在另一个实例中，HTRA1拮抗剂是抗-HTRA1抗体。

在一个实施方案中，用于患有补体介导的病症的人受试者中的补体介导的病症的本发明的疗法包括向所述受试者施用有效量的治疗化合物，如因子D拮抗剂，并且其还包括向所述受试者施用有效量的第二治疗化合物，所述第二治疗化合物是HTRA1拮抗剂。在一个实例中，因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。在另一个实例中，抗-因子D抗体是本文所述的抗-因子D抗体变体。在一个实例中，HTRA拮抗剂是抗-HTRA1抗体。在一个实例中，所述补体介导的病症是补体相关性眼部病症。在一个实例中，所述眼部病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD，糖尿病视网膜病(DR)，眼内炎和葡萄膜炎。在一个实例中，所述补体相关性眼部病症是中期干性AMD。在一个实例中，所述补体相关性眼部病症是地图样萎缩。在一个实例中，所述补体相关性眼部病症是湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))。

本文中的组合施用包括利用单独的制剂或单个药物制剂的同时施用，以及以任何顺序的连续施用，其中两种(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性通常需要一段时间。

药物制剂

可以通过将具有所需纯度的多肽与通常在本领域中使用的任选的“药用”载体、赋形剂或稳定剂(所有这些都被称为″赋形剂″)混合来制备抗体或其抗体变体的治疗制剂以作为冻干制剂或水溶液存储。例如，缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去垢剂、抗氧化剂和其他混合添加剂。(见Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，16版，A.Osol编辑(1980))。这些添加剂在所用的剂量和浓度对于受体必须是无毒性的。

缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们优选地以范围为大约2mM至大约50mM的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)以及乙酸缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以提及的有磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐诸如Tris。

可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且其可以以范围为0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、六甲氯铵、烷基对羟基苯甲酸酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

可以添加等渗剂(有时也被称为“稳定剂”)以保证本发明的液体组合物的等渗压性，并且其包括多元糖醇，优选地包括三元或更高元糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。

稳定剂涉及宽的赋形剂种类，其在功能上覆盖的范围可以是从填充剂到添加剂，所述添加剂是治疗剂溶解或者有助于防止变性或粘附到容器壁上。典型的稳定剂可以是多元糖醇(以上例举的)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinositol)，半乳糖醇、甘油等，包括环醇诸如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫甘油、d硫甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10残基)；蛋白质诸如人血清清蛋白、牛血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖诸如棉子糖；多糖诸如葡聚糖。稳定剂可以以范围为0.1至10,000重量/重量份活性蛋白。

可以添加非离子表面活性剂或去垢剂(也被称为“湿润剂”)以促进治疗剂的稳定以及使治疗剂免于搅拌导致的聚集，其也允许制剂暴露于受压的剪切表面而不导致蛋白的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨糖醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、Pluronic.RTM.多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单酯(Tween.RTM.-20、Tween.RTM.-80等)。非离子表面活性剂可以以范围为大约0.05mg/ml至大约1.0mg/ml，优选地大约0.07mg/ml至大约0.2mg/ml存在。

另外的混合赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)以及助溶剂。如果为被治疗的适应证所需，本文中的制剂也可以包含超过一种活性化合物，优选地包含具有彼此不产生不利作用的互补活性的那些。例如，可能需要进一步提供免疫抑制剂。这些分子适合以对目的用途有效的量组合存在。也可以将活性成分夹在制备的微胶囊中，例如，在胶质药物递送***(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在***液中，分别通过凝聚技术或通过界面聚合，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这种技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，16th edition，A.Osal，Ed.(1980)中。

用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以例如通过经由无菌滤膜过滤容易地实现。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括包含抗体或抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质是以成型物品的形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(可注射微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，而某些水凝胶在更短的时间周期内释放蛋白。当被包起来的抗体留在体内很长时间时，它们可能由于在37℃暴露于湿气而变性或聚集，从而导致生物活性丧失以及可能的免疫原性的改变。可以根据所涉及的机制设计用于稳定化的合理机制。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫互换的分子间S--S键形成，可以通过以下方法实现稳定化：修饰巯基残基、从酸性溶液中冷冻干燥、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特异性的聚合物基质组合物。

用于预防或治疗眼睛疾病或病症的本发明的化合物通常通过以下方式给药：眼部、眼内和/或玻璃体内注射，和/或巩膜旁注射，和/或筋膜下注射，和/或脉络膜上注射和/或以滴眼液和/或膏剂的形式局部给药。本发明的这些化合物可以通过多种方法递送，例如作为装置和/或贮藏物经玻璃体内递送，其允许化合物缓慢释放到玻璃体内，包括在参考文献诸如Intraocular Drug Delivery(眼内药物递送)，Jaffe，Jaffe，Ashton和Pearson编辑，Taylor&Francis(2006年3月)中所述的那些。在一个实例中，装置可以以微型泵和/或基质和/或被动扩散***和/或被包起来的细胞的形式，其在延长的时间周期内释放化合物(Intraocular Drug Delivery(眼内药物递送)，Jaffe，Jaffe，Ashton和Pearson编辑，Taylor&Francis(2006年3月))。也可以使用其他给药方法，其包括但不限于局部给药、肠胃外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内给药、鼻内给药和病变处给药。肠胃外注入包括肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、腹膜内给药或皮下给药。

可以通过本领域中已知的方法和本领域中已知的成分来制备眼部、眼内或玻璃体内给药的制剂。对有效治疗的主要需要是合适的穿透眼睛。与可以局部递送药物的眼前部疾病不同，视网膜疾病需要更具有位点特异性的方法。滴眼液和膏剂很少穿透眼睛的后部，并且血眼屏障妨碍被全身给药的药物穿透到眼组织中。因此，通常选择的用于药物递送以治疗视网膜疾病(诸如AMD和CNV)的方法是直接的玻璃体内注射。通常以一定的间隔重复玻璃体内注射，所述间隔取决于患者状态以及被递送药物的性质和半衰期。对于眼内(例如玻璃体内)穿透，通常优选的是具有较小尺寸的分子。

可以通过通常用于评估眼内疾病的不同终点来测量对补体相关的眼睛病症诸如AMD或CNV的治疗效力。例如，可以评估视力衰退。可以通过但不限于例如以下方法来评估视力衰退：通过到所需时间点的最佳校正视敏度(BCVA)距基线的平均改变来测量(例如，其中BCVA是基于糖尿病视网膜病变早期治疗研究(ETDRS)视力表并且在4米的测试距离进行估定)，测量相比于基线在所需的时间点在视敏度方面失去少于15个字母的受试者的比例，测量相比于基线在所需的时间点在视敏度方面得到多于或等于15个字母的受试者的比例，测量在所需的时间点视敏度Snellen等效值为20/2000以下的受试者的比例，测量NEI视功能问卷，测量在所需的时间点的CNV的尺寸和CNV的渗漏量，例如通过荧光血管造影术等。进行视觉评估，例如，其包括但不限于例如进行眼部检查，测量眼内压，评估视敏度，测量裂缝灯压力，评估眼内炎症等。

将有效治疗特定疾病或病症的抗体或其抗体变体的量将取决于疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。当可能时，理想的是确定剂量-反应曲线并且首先在体外确定本发明的药物组合物，然后在人中测试之前在有用的动物模型***中确定本发明的药物组合物。

在一些实施方案中，制剂中抗体的量约为以下中任一：大于50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、375mg/mL、400mg/mL、425mg/mL、450mg/mL、475mg/mL和500mg/ml。制剂中抗体的量可以约为以下中任一：约50mg/mL至500mg/mL、50mg/mL至300mg/mL、100mg/mL至500mg/mL、100mg/mL至300mg/mL、200mg/mL至500mg/mL、200mg/mL至400mg/mL或250mg/mL至375mg/ml。

在一个实施方案中，通过皮下注射来给药治疗性多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的水溶液。在另一个实施方案中，通过玻璃体内注射来给药治疗性多肽、抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原-结合片段)的水溶液。每剂可以是范围为大约0.5μg至大约50μg/千克体重，或者更优选地，大约3μg至大约30μg/千克体重。

皮下给药的用药时间表可以从每月一次到每天一次变化，其取决于众多临床因素，包括疾病类型、疾病的严重度，以及受试者对治疗剂的敏感性。

制造品和试剂盒

本发明的另一个实施方案是制造品，所述制造品包含可用于治疗、预防和/或诊断本发明的抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)所靶向的病症的物质。例如，本发明涉及包含可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症的物质的制造品。所述制造品包含容器和在所述容器上或与所述容器相结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小药瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料制成。所述容器盛有可有效用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症的组合物并且可以具有无菌进入端口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针头刺破的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗-因子D抗体。所述标签或包装插页指示所述组合物可用于治疗、预防和/或诊断特定病症。

包装插页是指通常包含在治疗产品的商品包装中的使用说明，其含有关于适应证、用法、剂量、给药、禁忌证和/或有关此种治疗产品的使用的警告的信息。在一个实施方案中，所述标签或包装插页指示所述组合物用于治疗补体相关病症，如例如之前列出的任何病症，包括眼部病症例如年龄相关性黄斑变性(AMD)。所述标签或包装插页还将包含将抗体组合物向患者给药的使用说明。

此外，所述制造品还可以包含第二容器，所述第二容器包含药用缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业和用户角度来看有用的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、填充剂、针和注射器。

在另一个实施方案中，还提供试剂盒，所述试剂盒可用于不同用途，例如，用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症，用于补体相关溶血测定，用于自细胞纯化或免疫沉淀因子D多肽。针对因子D多肽的分离和纯化，所述试剂盒可以包含与小珠(例如，琼脂糖小珠)连接的抗-因子D抗体。可以提供这样的试剂盒，所述试剂盒包含用于在体外(例如在ELISA或蛋白质印迹法中)检测和量化因子D多肽的抗体。与制造品一样，所述试剂盒包含容器和在所述容器上或与所述容器相结合的标签或包装插页。所述容器盛有包含至少一种本发明的抗-因子抗体的组合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。所述标签或包装插页可以提供对组合物的描述以及用于体外或检测用途的使用说明。所述标签或包装插页可以提供用于向受试者给药(例如抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)的使用说明。

治疗用途

本发明的抗体可以用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，所述抗体被施用于非人哺乳动物以例如用于获得临床前数据。示例的治疗的非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿动物和进行临床前研究的其他哺乳动物。所述哺乳动物可以是用于要用所述抗体治疗的疾病的建立的动物模型，或可以用于研究目的抗体的毒性。在这些实施方案中的每个中，可以在所述哺乳动物上进行剂量扩大研究。

所述抗体通过任何合适的手段给药，包括肠胃外给药、皮下给药、腹膜内给药、肺内给药和鼻内给药，并且如果需要用于局部免疫抑制治疗，则包括病变内给药。肠胃外注入包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。此外，所述抗体合适地通过脉冲注入给药，尤其是利用逐渐减小的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的剂量。优选地，所述剂量通过注射给予，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短暂的还是长期的。

为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于所治疗的疾病的类型，疾病的严重度和病程，抗体的施用是出于预防目的还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史以及对抗体的反应和主治医生的判断。

取决于疾病的类型和严重度，约0.1mg/kg至150mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的抗体是向患者给药的初始候选剂量，不论是例如通过一次或多次单独的给药还是通过连续注入。典型的日剂量可以为约1mg/kg至100mg/kg以上，这取决于以上提及的因素。对于数天或更长时间的重复给药，根据条件，持续治疗直至发生所需的疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可以是有用的。该疗法的过程可以容易地通过常规技术和测定监测。示例的用药方案公开在WO 94/04188中。

可以以与良好医学实践相一致的方式来配制、给药和施用所述抗体组合物。在此情况下要考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的病因、药剂的递送位点、给药方法、给药的时间安排及医学从业者已知的其他因素。要施用的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的″治疗有效量″将受制于这些考量，并且是预防、改善或治疗疾病或病症所需的最小量。所述抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)不需要但是可以任选地与目前用于预防或治疗目的病症的一种或多种药剂配制在一起。所述其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或其抗体变体或其片段(例如抗原结合片段)的量、病症或治疗的类型以及以上讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量并且以如前文所用的给药途径或迄今为止采用的剂量的约1至99％使用。

识别因子D作为其靶标的本发明的抗体可以用于治疗补体介导的病症。这些病症与过度或不受控的补体激活相关。其包括：心肺转流术期间的补体激活；由急性心肌梗塞、动脉瘤、卒中、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克和肠缺血后的缺血-再灌注所致的补体激活。这些病症还可以包括作为炎性病症的疾病或病症，如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞性贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是由不良药物反应、药物过敏、IL-2引起的血管渗漏综合征或放射摄影造影介质过敏所致。其还包括自体免疫疾病如***性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病和多发性硬化。补体激活还与移植排斥相关联。近来，补体激活和眼病之间显示强的相关性，所述眼病如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病和其他缺血相关性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉闭塞(CRVO)、角膜新血管形成和视网膜新血管形成。

实施例

以说明的方式而非限制的方式提供以下实施例。实施例中提及的市售试剂根据生产商的说明使用，除非另有指示。以下实施例以及整个说明书中以ATCC登录号识别的那些细胞的来源是美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)。

实施例1：产生抗-因子D抗体变体

Lampalizumab，其是一种通过结合至因子D上的外部位点而强效地抑制因子D和备选补体途径的人源化抗-因子D Fab片段，其目前处于临床开发中以用于治疗地图样萎缩(GA)(干性AMD的一种晚期形式)。Lampalizumab(FCFD4515S；下文中“aFD”)是一种由214个残基的轻链(SEQ ID NO：1)和223个残基的重链(SEQ ID NO：2)组成的抗体Fab片段。

虽然在GA中的II期人临床试验的结果指示，在每月玻璃体内注射aFD的情况下获得了治疗效果，但是存在使用更高的药物剂量以实现甚至更好的效力的动机。同时，较低的用药频率将给患者提供提高的便利性，具有降低感染率和增加临床效力的潜在益处，并且可以有助于治疗患有较早期形式的干性AMD的患者。

进行努力以进一步改善野生型aFD(WT)的物理和化学稳定性，尤其是在低pH条件下和/或在高浓度在中性pH下的稳定性。轻链上的天冬氨酸残基Asp-30和重链上的天冬氨酸残基Asp-62(图1A)被鉴定为倾向于异构化。Asp异构化涉及脱水形成环状的亚酰胺中间体(Asu)，其通常可以在pH＜8下长期存在并且在离子交换色谱法(IEC)时作为基础峰被检测到。环状中间体的形成在较低的pH下被加速。环状中间体水解以形成Asp或Iso-Asp，产生与起始材料相同的电荷状态并因此是无法通过IEC检测的，以上过程在较高的pH下更快。Asp-62(根据Kabat编号的Asp-61)的异构化似乎不影响潜能因为在Fab：fD复合物的晶体结构中其不与因子D接触。Katschke等(2012)J.Biol.Chem.287：12886。Asp-30与轻链残基Asp-32和Asp-92一起与因子D上的碱性残基进行静电接触。Asp-30的异构化相当快速并且推测其导致观察到的抗体潜能的损失。Asp残基32和92的异构化也可能影响fD结合但是已知的是速率非常慢。位置30处的环状亚酰胺的形成及其随后水解为异天冬氨酸可能通过扰乱静电相互作用而不利地影响抗原结合。分离的碱性部分上的抗原结合测量表明环状中间体是有完全活性的，与作为结合损失的原因的iso-asp形成一致。

重链上的Asn-103(根据Kabat编号的Asn-101)易于脱酰胺，该反应在中性pH下比在稍酸性pH(6-7)下以更高的速率进行。脱酰胺可以根据IEC时酸性峰的出现来进行检测。Asn脱酰胺，与Asp异构化一样，经由环状Asu中间体进行。然而，因为由Asn形成Asu仅在较高的pH发生(其中Asu被水解以形成Asp或异-Asp)，所以通常仅检测到酸性峰。Asn-103的侧链与因子D残基Arg-172形成氢键。该位点处的脱酰胺或环状亚酰胺中间体Asu的形成对抗原结合的影响是未知的。

aFD WT的pI(7.1)比典型的人源化Fab(pI 8-9)低。CDR-L1的组成(图1A)导致VL结构域上的负电荷簇。这些特征可能影响分子的溶解性，尤其是在低pH和低离子强度。此外，在37℃，aFD WT的高浓度制剂即使在中性pH和生理离子强度也可能倾向于以更快的速率形成非共价二聚体。

制备aFD WT的若干变体以用于提高稳定性。通过位点定向诱变使用(Agilent)诱变试剂盒，遵循随试剂盒提供的方案，引入点突变。合成载有所需的密码子改变的寡核苷酸引物。通过DNA测序鉴定和确定具有设计的改变的质粒。对于小规模的表达和纯化，将DNA转化到大肠杆菌菌株64B4中。将单个克隆挑取到5mL含50μg/mL羧苄青霉素(media prep code A3232)的LB培养基(media prep code A2008)中并在14mL培养管中在以200RPM进行振荡的情况下在Innova培养箱中在37℃过夜培养。将这些培养物用于接种在1L带盖的摇瓶(baffled shake flask)中的250mL的完全豆粕(soy crap)培养基(media prep code A4564)，50μg/mL羧苄青霉素中。将培养物在30℃在以200RPM进行振荡的情况下培养过夜，然后通过离心收集。将细胞沉淀用PopCulture介质(Invitrogen)溶解，并且在Gravitrap Protein G柱(GE Healthcare)上纯化Fab，遵循生产商提供的方案。对于较大规模的Fab制备，将得自10L转化细胞发酵的细胞糊悬浮在提取缓冲液中并且使用微型流化仪将其匀浆化。通过免疫亲和色谱在Protein G-Sepharose或κ-select上捕获Fab并且用低pH缓冲液洗脱。将低pH洗脱物调至pH 5并且进一步通过阳离子交换色谱法在S-Sepharose柱上进行纯化。纯化的蛋白质的身份通过质谱确认并且将汇集的级分浓缩至约10mg/mL，并且经由透析交换到PBS缓冲剂(pH 7.3)(本文中也被称为“PBS”；8mM磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，2mM磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，140mM NaCl，2.7mM KCl)中。

实施例2：抗-因子D抗体变体的生物活性

测试有希望的单个及组合突变体的因子D(fD)结合亲和力及抑制因子D活性的能力。

a.通过表面等离子共振(SPR)测量因子D结合亲和力

因子D结合固定的aFD WT及其变体的动力学和结合常数K_D通过在 T200仪器上进行的表面等离子共振(SPR)测量来确定。使用抗-huFab捕获试剂盒(GEhealthcare，货号28-9583-25)，遵循生产商描述的方案，将抗体Fab片段固定在Series SCM5传感器芯片上。自针对浓度以2倍增量从0.39nM变化至25nM的人因子D溶液的60μL等分试样的注射记录的感应图谱(sensorgram)计算结合的动力学。流速为30μL/min，运行缓冲液为HBS-P+，分析温度为25℃，采用实时参比室减除，并且跟踪因子D注射后的解离达10分钟。在减去对于注射运行缓冲液所观察到的感应图谱后，根据1∶1模型使用BiaEval软件v4.1(GE Healthcare)来分析数据从而提取动力学和亲和力常数。

表1.突变在对因子D的亲和力方面的影响

基于在aFD WT的轻链可变结构域(VL；SEQ ID NO：3)和重链可变结构域(VH；SEQID NO：4)中的位置来对突变体进行命名和编号。野生型残基的单字母代号之后是序列位置，之后是置换的氨基酸的单字母代号。通过冒号将相同结构域上的多个变化分开。

如表1中所示，aFD WT对fD具有高的亲和力，其为可通过SPR技术测定的极限(～10pM KD)。CDR-L1中的天冬氨酸残基28、30和31可以单独地分别用Ser、Glu和Ser置换，而不明显影响对fD的亲和力(表1)。相反，用Ser替代CDR-L1 Asp32导致fD-结合的明显损失，不论是单独地测试(AFD.v4)还是与D28S和D31S突变体(AFD.v5)组合地测试。确定将VL-D30E、D31S和VH-D62E组合的三重突变体(“TM”(AFD.v6))以及向TM(AFD.v6)添加VL-D92E的四重突变体(TM.D92E(AFD.v7))的fD亲和力与野生型分子相当。VH-D62E是在进行异构化而不明显影响fD-结合的位点处的置换；VL-Asp92是具有缓慢异构化速率的抗原接触残基。包含VL-D28S、D30E、D31S和VH-D62E的四重突变体“SIESD”(AFD.v8)显示对fD的亲和力的小的(～2倍)损失。在SIESD(AFD.v8)的情况下，VL-D92E置换导致对fD的亲和力的进一步损失(见AFD.v10(表1中的SIESD.D92E))。

针对利用其它残基进行的置换对脱酰胺的潜在位点进行测试。在共晶结构中，VL-N34和VH-N52都与fD接触，但是这些位点在中性pH条件下都不显示显著的脱酰胺速率。这些位点处的Ser置换导致亲和力的损失(表1；AFD.v9和AFD.v11)。VH残基Asn-103不接触fD并且在PBS中具有可测量的脱酰胺速率。在SIESD(AFD.v8)的情况中，将Asn-103置换成Asp或Ser导致对fD的亲和力的小的可接受的损失(见AFD.v12(SIESD.N103D)和AFD.v14(SIESD.N103S))(表1)。用Gln置换Asn-103导致结合亲和力的较大下降(见AFD.v13(SIESD.N103Q)(表1)。与SIESD(AFD.v8)类似，向五重突变体SIESD.N103S(AFD.v14)添加VL-D92E的SIESD.N103S.D92E(AFD.v15)进一步导致对fD亲和力的4倍下降。

b.因子D抑制测定

使用备选途径(AP)溶血测定测试aFD WT和变体抑制因子D引起的补体激活的能力。使用兔红血球(Er)的AP溶血测定之前已被描述。Pangburn(1998)，Methods.Enzymol.162：639；Katschke等.(2009)J.Biol.Chem.284：10473。将Er(ColoradoSerum)用在巴比妥缓冲液(GVB)中的0.5％牛皮明胶洗涤三次并重悬。以2X浓度制备aFD的稀释液并将其添加到96孔聚丙烯板中。将Er悬浮液与GVB/0.1M EGTA/0.1M MgCl₂混合并调节至平板。通过添加C1q耗尽的人血清来启动补体激活以避免任何通过经典途径的补体激活(CompTech；1∶3稀释在GVB中)。室温孵育30分钟后，通过添加在GVB中的10mM EDTA终止反应。将所述板离心并将上清液转移。在412nm读取上清液的吸光度。引起半最大抑制的aFD浓度(IC50)通过非线性回归分析确定。

表2.aFD变体的抑制潜力

*RSE＝±30％

如表2中所示，变体SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)和TM.D92E(AFD.v7)具有抑制与aFD WT相当的fD依赖性补体激活活性的潜力，IC50测量中的标准差为±30％。

c.在延长的时间内的结合能力

还使用SPR来测量在限定的条件下aFD变体与fD的随时间的总的结合。这些测量中的标准差为±10％。图2A显示在pH 5.5，对于aFD WT和aFD变体D30E(AFD.v2)和TM(AFD.v6)，在一个月内，结合的损失约为40％，而对于SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)，即使在延长的时间内(70天)，结合的损失也较小，为约15％。作为比较，抗-VEGF抗体Fab片段(aVEGF)在70天内未显示结合的损失。对于aFD WT和aVEGF，向pH 7.4条件添加盐似乎加快结合损失的速率(数据未显示)。如图2B中所示，在存在PBS的情况下(Fab蛋白浓度为100mg/ml)，D30E(AFD.v2)和TM(AFD.v6)具有相当的结合损失速率，其慢于对于aFD WT所观察到的。在37℃10周后的结合损失为约30％(对于aFD WT)和20％(对于抗-因子D变体D30E(AFD.v2)和TM(AFD.v6))。对于SIESD.N103S，在37℃10周后的结合损失仅为10％(AFD.14；图2B)，不大于实验误差，并且与在相同条件下对于aVEGF所观察到的相当。对SIESD(AFD.v8)，重复在PBS实验中在100mg/mL Fab浓度的热应激以收集达70天的数据。如图2C中所示，对于SIESD(AFD.v8)，70天时的结合损失小于10％。

实施例3.具有提高的稳定性的抗-因子D抗体变体

基于以上亲和力测定，选择若干单个或组合抗-因子D抗体变体用于进一步的稳定性分析。

a.溶解性

首先测试样品在低离子强度和pH 6的溶解性。首先通过使用Amicon CentriprepYM-10离心过滤单元浓缩至～100mg/mL而在20mM His-HCl pH 5缓冲液中制备样品。在肉眼观察时，这些溶液在pH 5和低离子强度未显示混浊。将样品以14,000xg离心10min以使任何不溶性物质沉淀。没有观察到沉淀，并且通过UV吸光度测量确定溶液的蛋白浓度。将样品(～1mL)置于10K MWCO的Slide-A-Lyzer盒(Pierce)中并在4℃对1L的20mM His缓冲液，pH6进行透析过夜，之后肉眼观察浊度。拍摄溶液的照片并提供在图6中。在pH 6和低离子强度条件(～100mg/ml，在20mM His-HCl，pH 6中)，aFD WT和D30E(AFD.v2)溶液明显是混浊的，TM(AFD.v6)溶液没那么混浊，而SIESD(AFD.v8)的溶液是清的(图6)。在如以上那样离心后，对于aFD WT和AFD.v2，肉眼观察到大的沉淀，对于TM(AFD.v6)，肉眼观察到大的沉淀，而对于SIESD(AFD.v8)，肉眼没有观察到沉淀，通过UV吸光度测量确定上清液的蛋白浓度(表3)。aFD WT和D30E(AFD.v2)显示小于50mg/ml的溶解性，TM(AFD.v6)显示接近100mg/mL的溶解性而SIESD(AFD.v8)在这些条件下可全溶。对于SIESD(AFD.v8)，在pH 6透析后，蛋白浓度相对于pH 5起始浓度的小幅减小反映了透析后的稀释作用而不是AFD.v8的沉淀，因为在离心后未观察到沉淀。

表3.AFD变体的溶解性(～100mg/ml，在20mM His-HCl，pH 6中)

在无盐溶解性测试中测试另外的变体AFD.v3、AFD.v12、AFD.v13和AFD.v14。在4℃透析到pH 6缓冲液中并在37℃孵育过夜后，除了aFD WT以往的所有蛋白质溶液都是清的(图7)。37℃孵育和离心后对蛋白浓度的测量(表4)显示，所有变体的可溶性都比aFD WT更好。在随后对PBS(pH 7.3)，一种含有盐(NaCl)的缓冲液透析时，aFD WT的混浊溶液(图7，顶行)变清，这暗示在添加盐和/或升高pH的情况下，沉淀是可逆的(图7，底行)。关于AFD.v3的溶解性数据指示，单个氨基酸变化D31S(除去1个带负电荷的残基)可以导致增加的溶解性。AFD.v8、AFD.v12、AFD.v13和AFD.v14中进一步的氨基酸变化也导致增加的溶解性。

表4.AFD变体在pH 6、无盐情况下的溶解性

还测试了aFD WT、SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)在生理pH(pH 7.3)和离子强度的条件下的溶解性。对于在生理pH和离子强度下的溶解性测试，将样品对PBS过夜透析，然后使用Amicon Centriprep YM-10离心过滤单元浓缩至227-372mg/mL。在4℃过夜孵育后，肉眼观察样品的浊度，将一部分浓缩以除去沉淀的蛋白质并通过UV吸光度测量确定蛋白浓度，并在表5中进行报告。在离心之前，aFD WT样品是混浊的，而SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)的溶液是清的(图8中显示的aFD WT、AFD.v8和AFD.v14)。对于照片(图8)中的溶液，AFD.v14的浓度为344mg/mL，然后其被进一步浓缩至372mg/ml。对于图8中的溶液，AFD.v8的浓度为269mg/ml。对于图8中的溶液，aFD WT的浓度为227mg/ml。在离心后，在aFD WT溶液的情况下观察到沉淀，但是对于SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)的溶液则没有观察到沉淀。蛋白浓度数据(表5)指示，在PBS中，aFD WT仅能够被浓缩至227mg/mL，之后则观察到沉淀，而SIESD(AFD.v8)(≥269mg/mL)和SIESD.N103S(AFD.v14)(≥372mg/mL)的溶解性极限更高。因为SIESD(AFD.v8)在269mg/mL没有观察到沉淀，并且没有进行进一步浓缩溶液的尝试，所以这是该变体在PBS中的溶解性的下限。类似地，SIESD.N103S(AFD.v14)在PBS中的溶解性的下限是372mg/ml。在PBS中的SIESD(AFD.v8)的269mg/mL溶液在2-8℃孵育4周后保持清澈。类似地，在PBS中的SIESD.N103S(AFD.v14)的372mg/mL溶液在2-8℃孵育3周后浊度没有任何明显增加。在该浓度，在使用分子排阻色谱法(SEC)测量时，聚集体％的变化很小(图9)，在2-8℃在3周内，从0.9％增加至2.1％(3周孵育前的SEC数据(0.9％聚集体)显示在图9中；3周孵育后的SEC数据是未显示的数据)。

表5.AFD变体的溶解性(在PBS(pH 7.3)中)

*pI值通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)确定

还比较了变体SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)在可以代表用于经由玻璃体内注射施用的药物的制剂的具有pH 5.5(20mM HCl pH5.5)和不同NaCl浓度的缓冲液中的溶解性。制备蛋白浓度为约100mg/mL的溶液并且将其对测试缓冲液透析。然后使用Amicon Centriprep YM-10离心过滤单元将这些溶液浓缩。表6中列出了使溶液在环境温度保持在视觉上清澈的获得的浓度。SIESD(AFD.v8)在pH 5.5和低NaCl浓度具有达到314mg/mL的高溶解性。在添加100mM NaCl的情况下，SIESD.N103S(AFD.v14)的达到278mg/mL的高浓度也是可实现的。

表6.AFD变体在pH 5.5(20mM His-HCl pH 5.5)和不同NaCl浓度的溶解性

NT＝未测

虽然与aFD WT相比，SIESD.N103S(AFD.v14)具有两个(2)带较少负电的残基，但电荷的这些变化并未导致pI的明显变化(表5)，如通过成像毛细管等电聚焦测量的(iCIEF)(Salas-Solano等，J.Sep Sci，35(22)：3124(2012))。预期蛋白质在接近pI的pH具有最小的溶解性(Green，A.A.，J.Biol.Chem.，93：517-542(1931))。对于SIESD.N103S(AFD.v14)，在PBS(pH 7.3)中的增加的溶解性与pI的改变不相关。更确切地，LC-CDR-L1中Asp到Ser的氨基酸变化(VL-D28S和D31S)表现为改变分子表面的电荷分布。

b.异构化和脱酰胺

为了模拟变体对在长效递送***中可能发现的多种条件的暴露，在37℃在变化的pH和盐条件下对抗体进行应激达数周。具体地，在以下五种不同的制剂中对抗体进行评估：

制剂1：10mg/mL，10mM磷酸缓冲液，pH 2.5，

制剂2：10mg/mL，10mM组氨酸HCl，pH 5.5，

制剂3：10mg/mL，10mM磷酸缓冲液，pH 7.4(“低盐”)，

制剂4：10mg/mL，pH 7.4PBS(“高盐”；10mM磷酸，137mM NaCl)

制剂5：100mg/mL，pH 7.4PBS

所有溶液都具有0.02％PS20，在37℃孵育并且每2周取样一次。评估低盐条件(pH2.5、5.5和7.4)液体制剂中化学分解的作用。将PBS用作人玻璃体pH和离子强度的模拟物。此外，将10mM phosphate，pH 7.4与PBS条件相比将揭示对化学和物理稳定性的离子强度作用。在孵育期间有规律地对PBS样品进行缓冲液交换以模仿玻璃体的交换。在所有5种条件下评估野生型aFD(“WT”或“aFD WT”)和aVEGF。在除4号以外的所有制剂中测试D30E(AFD.v2)和TM(AFD.v6)变体。在制剂2和5中测试SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)。

被量化的化学分解是脱酰胺和异构化的脱水步骤，脱酰胺被表征为形成酸性峰，而异构化的脱水步骤被表征为形成长时间存在的long-lived琥珀酰亚胺(Asu)中间体，其作为碱性峰被检测到。使用阳离子交换色谱法(Dionex ProPac SAX-10 columns)(IEC)来量化脱酰胺的Asn物质和脱水的Asp物质在不同制剂中的抗体样品内的出现。

对于所有测试的条件，在受试抗体中，aFD WT显示主峰损失和碱性峰增加的最大速率。这在pH 5.5最明显，aVEGF、D30E(AFD.v2)、TM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)都显示比aFD WT明显低的主峰损失速率，见图3A。SIESD.N103S(AFD.v14)显示最慢的主峰损失速率，所述速率在pH 5.5与aVEGF相似(图3A)并且在PBS中甚至比aVEGF更慢(图3B)。如图4B中所示(100mg/ml的Fab，在PBS(pH 7.3)中)，D30E(AFD.v2)显示的碱性峰形成的速率为aFD WT的约一半，而TM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.14)显示可忽略的碱性峰形成。相反，如图4B中所示(100mg/ml的Fab，在PBS(pH 7.3)中)，对于PBS条件，aFD WT和D30E(AFD.v2)的酸性峰产生的速率是相当的并且比对于TM(AFD.v6)和SIESD(AFD.v8)所确定的慢约2倍。PBS中SIESD.N103S(AFD.v14)的酸性峰形成基本上可忽略。

c.聚集

利用尺寸排阻色谱法(SEC)来量化受试抗体的聚集体和单体的形成。使用的柱子是TSK-GEL Super SW2000(Tosoh Biosci.)。基于生产商的说明来使用材料和条件(www.tskgel.com)。

在PBS中配制的100mg/ml的Fab的受试抗体的基于SEC数据的在37℃随时间的单体％显示在图5中。AFD WT显示单体峰级分每月下降3-4％。与aFD WT相比负电荷无变化的AFD.v2(D30E)显示相似的单体损失速率。AFD.v6、AFD.v8和AFD.v14显示下降的单体损失速率。第零天时单体含量的差异反映纯化的制剂在均一性方面的微小变化。在pH 5.5和7.4(无盐)在10mg/ml蛋白浓度，D30E(AFD.v2)和TM(AFD.v6)的聚集速率是可比的。在pH 7.4添加盐不影响aFD变体的聚集速率但是其使aVEGF的聚集速率加倍。聚集依赖于蛋白浓度，因为在PBS中将浓度从10mg/mL增加至100mg/mL使得所有受试样品的聚集速率增加(表7)。在10mg/mL浓度在10mM磷酸缓冲液pH 7.4且无NaCl中，以及在10mg/mL浓度在PBS中的聚集是最小的(表7)。在37℃，在100mg/mL浓度在PBS中的aFD WT和D30E(AFD.v2)的单体损失(在40天内分别为5.8％和7.3％)远大于在100mg/mL在PBS中的aVEGF、TM(AFD.v6)、SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)的单体损失(40天内分别为1.8％、1.5％、0.7％和1.5％)。这些数据暗示AFD.v6、AFD.v8和AFD.v14具有比aFD WT和AFD.v2更少的聚集并且可以更适合作为治疗剂因为其可以较少地倾向于体内免疫原性。

表7.在40天通过SEC确定的盐和蛋白浓度对aFD变体和aVEGF的聚集的作用

为检测作为pH的函数形成的碎片，进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)，使用Beckman PA800 System，利用无涂层的内径为50μm的熔融二氧化硅毛细管(PolymicroTechnologies，Inc)。通过Beckman Coulter NXp Liquid Handling Robot利用相当于Q12695的自动化来制备样品。以5kV的电压用15秒将样品注射到毛细管中，然后以15kV的电压固定30分钟。所有样品都在环境温度下运行。所有受试抗体的电泳图都与aFD WT的电泳图类似。仅在pH 2.5观察到明显的碎片。在任何条件下都没有观察到更高分子量的物质，指示形成的任何聚集体都是可用SDS分解的并且不是共价相连的。

以上稳定性结果显示抗-因子D的三重(TM(AFD.v6))和四重(SIESD(AFD.v8))突变体变体的化学稳定性与aFD WT或D30E(AFD.v2)相比明显提高。在该系列中，SIESD.N103S(AFD.14)在pH 5.5和在PBS中具有最高的化学稳定性，类似于aVEGF的稳定性。异构化和脱酰胺位点都被去除并且在中性pH的溶解性提高，同时保持了fD结合亲和力。基于以上发现，本文中描述的所选的抗-因子D变体，尤其是SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)变体，适用于高浓度制剂和经由例如端口递送***(PDS)设备的长效递送两者。例如，在生理条件的pH(～7.3)和离子强度(～150mM NaCl)下，利用耐久性的、可再填充的设备如端口递送***的长效递送可能需要高浓度制剂和低的聚集倾向。

HVR序列列表(变体中的置换被下划线)

实施例4.抗-因子D抗体变体被进一步修饰以用于聚合物缀合

以上实施例中所述的aFD WT和变体是Fab片段。虽然其轻链和重链的可变结构域(VL和VH)序列不同，如图1B中所示，但其恒定结构域CL和CH1保持相同。特别地，如图1A(SEQID NO：2)、图1C(SEQ ID NO：27)和图1D(SEQ ID NO：29)中所示，重链的CH1结构域终止于苏氨酸残基。为了制备用于聚合物缀合如PEG化的aFD变体，通过添加自Fab’对应物的铰链区起的第一个半胱氨酸残基将Fab片段的重链进一步修饰(例如，对于AFD.v8为Cys-修饰的HC(SEQ ID NO：30)，对于AFD.v14为Cys-修饰的HC(SEQ ID NO：32))，使得添加的半胱氨酸充当PEG聚合物的连接位点。所得的片段可以因此与一个PEG分子聚合。还通过添加自Fab’对应物的铰链区起的头四个残基，即Cys-Pro-Pro-Cys(SEQ ID NO：21)来修饰Fab片段的重链(例如对于AFD.v8为Cys-Pro-Pro-Cys-修饰的HC(SEQ ID NO：31)，对于AFD.v14为Cys-Pro-Pro-Cys-修饰的HC(SEQ ID NO：33))，使得添加的两个Cys都充当PEG的连接位点，导致修饰的aFD Fab片段能够连接两个PEG分子。

实施例5：AFD.v8/v14的兔pK

在兔中测试AFD.v8和AFD.v14的体内pK研究。由单剂量实验确定pK参数，因为在重复用药后或在通过持续递送制剂增加暴露时，人源化抗体在兔中有免疫原性。

对动物的照看依照Genentech机构动物护理和用途委员会(GenentechInstitutional Animal Care and Use Committee)指南。将天然新西兰白(NZW)兔(41只雄性动物；3.1kg至4.1kg并且在用药时为约4月龄)分配到各剂量组并且利用在CharlesRiver Laboratories的测试项目进行用药。

经由单次双侧玻璃体内注射将SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)或雷珠单抗(ranibizumab)施用至兔并且进行观察达27天。在治疗前一天，紧接着注射后，将局部抗生素(托普霉素眼膏)两次施用于双眼，并且在注射后一天施用两次，在第1天和第2天送去验尸的动物除外。在用药前，将散瞳剂液滴(1％托吡卡胺)施用于每只眼以进行充分扩瞳。在所述过程之前或期间用异氟醚/氧气使动物镇静。还在注射前将爱尔卡因(0.5％)施用于每只眼。用稀释在无菌水中的苯扎氯铵(ZephiranTM)冲洗结膜，U.S.P.至1∶10,000(v/v)。

在快要用药前在层流柜中充填注射器。通过单次30μL玻璃体内注射(0.3mg剂量)将Fab施用于所有动物的双眼。由委员会认证的兽医眼科医生利用消毒的带有30规格x1/2”针头的100μL Hamilton Luer Lock注射器来施用剂量。为了模拟临床用药，在下前方象限，即对于左眼和右眼，分别在5点钟和7点钟位置(当面向动物时)，给眼睛用药。在处理后立即通过裂隙灯活组织显微镜检查和/或间接的检眼镜检查对眼睛进行检查。

在通过静脉内注射戊巴比妥钠进行麻醉后，通过切割腋动脉或股动脉对所有动物进行放血。收集房水、玻璃体液和视网膜组织，在液氮中速冻并且存储在-80℃。通过在50mMTris-HCl pH 8.0，1M NaCl中的匀浆化提取视网膜中的抗体Fab。通过以下描述的GRIPELISA确定测试品的玻璃体和视网膜浓度。低于LLOQ的值不被用于药物动力学分析或用于绘图或概述。通过非室分析利用标称时间和剂量来确定药物动力学参数(PhoenixWinNonlin，Pharsight Corp，Mountain View，CA)。

在通用免疫球蛋白药物动力学(GRIP)ELISA中进行对SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)和雷珠单抗的分析，以下除外。将绵羊抗-人-IgG(The BindingSite；San Diego，CA)稀释至1000ng/mL，在0.5M碳酸盐/碳酸氢盐，pH 9.6中，并且在4℃过夜孵育期间涂覆在384孔ELISA平板(Nunc；Neptune，NJ)上。将平板用PBS加上0.05％Tween-20洗涤并且在与PBS加上0.5％牛血清白蛋白(BSA)一起孵育1至2小时期间进行封闭。此孵育及所有后续孵育都在室温在轻微搅动的情况下进行。通过在测定缓冲液(PBS，0.5％BSA，15ppm Proclin，0.05％Tween 20，0.25％CHAPS，5mM EDTA，0.35M NaCl，(pH 7.4))中40-0.625ng/mL连续稀释AFD.v8、AFD.v14或雷珠单抗来制备标准曲线。兔玻璃体或视网膜匀浆样品分别在测定缓冲液中进行最小1∶100或1∶50稀释。然后将稀释的标准物、对照及样品在清洗过的平板上孵育1-2小时。在洗涤步骤后，在利用在测定稀释液(PBS+0.5％BSA+0.05％Tween 20+10ppm Proclin)中的稀释至83.3ng/mL的缀合了HRP的绵羊抗-人IgG mAb(Bethyl Laboratories Inc；Montgomery，TX)的1.5小时孵育其间检测与平板结合的AFD.v8、AFD.v14或雷珠单抗。在最后洗涤后，添加四甲基联苯胺过氧化物酶底物(Moss，Inc.，Pasadena，MD)，显色10-15分钟，并且用1M磷酸终止反应。使用微板读数仪(MultiscanAscent，Thermo Fischer；Waltham，MA)在450nm对平板进行读数，以620nm作为参比。使用内部的基于Excel的软件，由相应的标准曲线的四参数拟合计算AFD.v8、AFD.v14或雷珠单抗的浓度。考虑到玻璃体或视网膜匀浆中的最小稀释，AFD.v8、AFD.v14或雷珠单抗在兔玻璃体或视网膜匀浆中的最小可量化浓度分别为62.5ng/mL或31.25ng/mL。

玻璃体内注射0.3mg SIESD(AFD.v8)、SIESD.N103S(AFD.v14)或比较剂量的雷珠单抗(抗-VEGF)观察到的时间依赖性浓度曲线显示在图10中。

使用非室模型的玻璃体数据分析指示SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)两者都具有与雷珠单抗非常相似的清除性质。在三眼室：玻璃体液、房水和视网膜中，三种蛋白质全部给出非常相似的暴露，如AUC参数反映的。计算的雷珠单抗的PK参数与之前在兔子中的研究的结果一致(Gaudrealt等，Retina，27：1260-6(2007))。SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)都显示不依赖于靶标的眼清除性质，这使得这些分子适合开发。

实施例6：AFD.v8/v14的粘度

因为低粘度对于玻璃体内给药是重要的，因此在不同蛋白浓度在pH5.5，低盐缓冲液中测量SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)的粘度。在25℃恒温的TA Instruments锥板式流变仪上，使用1000s^-1的剪切速率，进行粘度测量。

aFD WT、SIESD(AFD.v8)和SIESD.N103S(AFD.v14)给出类似的依赖于蛋白浓度的粘度曲线，其中即使在超过200mg/mL的浓度，粘度对于玻璃体内注射来说也是可接受的(＜30cP)(图11)。

本领域技术人员仅使用常规实验就可以认可或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效物。以下权利要求意欲包括所述等效物。

虽然为了清楚的理解已经通过图表和实施例对上述发明进行了详细描述，但说明书和实施例不应当被视为限制本发明的范围。本文提到的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚地结合。

上述说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明的范围不受保藏的构建体的限制，因为保藏的实施方案意在作为本发明的某些方面的简单说明，并且功能相当的任何构建体都在本发明的范围内。实际上，在上述描述的基础上，除了本文中显示和描述的那些以外的本发明的各种改进对本领域技术人员来说将是显然的，并且其落在所附权利要求的范围内。

Claims (58)

1.具有提高的稳定性的抗-因子D抗体变体，其包含在参比抗-因子D抗体的高变区(HVR)内的至少一个靶天冬氨酸(D或Asp)残基的置换，其中所述靶Asp残基被鉴定为倾向于异构化并且所述置换是Asp至谷氨酸(E或Glu)，并且其中当与所述参比抗-因子D抗体相比时，所述抗-因子D抗体变体显示提高的稳定性而不显著丧失因子D结合亲和力。

2.根据权利要求1所述的抗体变体，其中所述Asp残基在Asp-Xaa基序内，其中Xaa是Asp、Gly、His、Ser或Thr。

3.根据权利要求2所述的抗体变体，其中所述靶Asp残基是Asp-Asp基序中的第一个Asp。

4.根据权利要求1所述的抗体变体，其中所述变体还包含丝氨酸(S或Ser)对参比抗-因子D抗体的HVR内的另外的至少一个Asp残基的置换，其中所得的变体与所述参比抗-因子D抗体相比时具有更低的负电荷和显示提高的溶解性。

5.根据权利要求1所述的抗体变体，其中所述变体还包含一个或多个对参比抗-因子D抗体的HVR内的有脱酰胺倾向的天冬酰胺(N或Asn)残基的Ser置换。

6.根据权利要求1所述的抗体变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：3的轻链可变结构域序列。

7.根据权利要求6所述的抗体变体，其还包含SEQ ID NO：4的重链可变结构域序列。

8.根据权利要求7所述的抗体变体，其中所述参比抗-因子D抗体包含SEQ ID NO：1的轻链序列和SEQ ID NO：2的重链序列。

9.根据权利要求8所述的抗体变体，其中所述变体包含SEQ ID NO：11的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列。

10.根据权利要求9所述的抗体变体，其还包含SEQ ID NO：13的轻链HVR3(HVR-L3)序列。

11.根据权利要求8所述的抗体变体，其中所述变体包含SEQ ID NO：14的轻链HVR1(HVR-L1)序列和SEQ ID NO：12的重链HVR2(HVR-H2)序列。

12.根据权利要求11所述的抗体变体，其还包含SEQ ID NO：15的重链HVR3(HVR-H3)序列。

13.抗-因子D抗体变体，其包含在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个位置的置换，其中所述参比抗-因子D抗体包含以下：包含序列ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO：5)的轻链HVR-1，包含序列GGNTLRP(SEQ ID NO：6)的轻链HVR-2，包含序列LQSDSLPYT(SEQ ID NO：7)的轻链HVR-3，包含序列GYTFTNYGMN(SEQ ID NO：8)的重链HVR-1，包含序列WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO：9)的重链HVR-2，和包含序列EGGVNN(SEQ ID NO：10)的重链HVR-3，并且其中所述置换是以下的一个或多个：(a)在SEQ ID NO：5的位置5处的氨基酸是S(SEQ ID NO：22中公开的a、b和c)；(b)在SEQ ID NO：5的位置7处的氨基酸是E；(c)在SEQID NO：5的位置8处的氨基酸是S；(d)在SEQ ID NO：9的位置13处的氨基酸是E(SEQ ID NO：23)；(e)在SEQ ID NO：7的位置4处的氨基酸是E(SEQ ID NO：24)；或(f)在SEQ ID NO：10的位置5处的氨基酸是S(SEQ ID NO：25)。

14.根据权利要求13所述的抗体变体，其中所述抗体变体包含在其中的置换(b)-(d)。

15.根据权利要求13所述的抗体变体，其中所述抗体变体包含在其中的置换(b)-(e)。

16.根据权利要求13所述的抗体变体，其中所述抗体变体包含在其中的置换(a)-(d)。

17.根据权利要求13所述的抗体变体，其中所述抗体变体包含在其中的置换(a)-(d)和(f)。

18.抗-因子D抗体，其包含SEQ ID NO：16、18或19的轻链可变结构域氨基酸序列。

19.抗-因子D抗体，其包含SEQ ID NO：17或20的重链可变结构域氨基酸序列。

20.根据权利要求18所述的抗-因子D抗体，其还包含SEQ ID NO：17或20的重链可变结构域氨基酸序列。

21.根据权利要求20所述的抗-因子D抗体，其中所述轻链可变结构域氨基酸序列是根据SEQ ID NO：19并且所述重链可变结构域氨基酸序列是根据SEQ ID NO：17。

22.根据权利要求20所述的抗-因子D抗体，其中所述轻链可变结构域氨基酸序列是根据SEQ ID NO：19并且所述重链可变结构域氨基酸序列是根据SEQ ID NO：20。

23.抗-因子D抗体，其具有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含具有SEQ ID NO：11或14的序列的HVR-L1，具有SEQ ID NO：6的序列的HVR-L2，和具有SEQ ID NO：7或13的序列的HVR-L3；所述可变重链包含具有SEQ ID NO：8的序列的HVR-H1，具有SEQ ID NO：9或12的序列的HVR-H2，和具有SEQ ID NO：10或15的序列的HVR-H3。

24.根据权利要求23所述的抗-因子D抗体，其具有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含具有SEQ ID NO：14的序列的HVR-L1，具有SEQ ID NO：6的序列的HVR-L2，和具有SEQIDNO：7的序列的HVR-L3；所述可变重链包含具有SEQ ID NO：8的序列的HVR-H1，具有SEQ IDNO：12的序列的HVR-H2，和具有SEQ ID NO：10的序列的HVR-H3。

25.根据权利要求23所述的抗-因子D抗体，其具有可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含具有SEQ ID NO：14的序列的SEQ ID NO：HVR-L1的HVR-L1序列，具有SEQ ID NO：6的序列的HVR-L2，和具有SEQ ID NO：7的序列的HVR-L3；所述可变重链包含具有SEQ ID NO：8的序列的HVR-H1，具有SEQ ID NO：12的序列的HVR-H2，和具有SEQ ID NO：15的序列的HVR-H3。

26.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

27.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列。

28.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

29.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列。

30.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。

31.抗-因子D抗体，其具有轻链和重链，所述轻链具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列，所述重链具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

32.不具有可检测的Asp异构化的抗-因子D抗体变体，其通过包括以下的方法制备：(a)鉴定在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个倾向于Asp异构化的Asp残基；(b)用Glu置换步骤(a)中鉴定的Asp残基；(c)针对Asp异构化筛选所得的候选变体；和(d)选择不具有可检测的Asp异构化的那些变体。

33.根据权利要求32所述的抗体变体，其中所述方法还包含(e)鉴定在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个倾向于脱酰胺的Asn残基；(f)用Ser置换步骤(e)中鉴定的Asn残基；(g)针对脱酰胺筛选所得的候选变体；和(h)选择具有减少的或消除的脱酰胺的那些变体。

34.根据权利要求32所述的抗体变体，其中所述方法还包含(e)选择在参比抗-因子D抗体的HVR内的一个或多个带负电的氨基酸残基D或E；(f)用Ser置换步骤(e)中选择的残基；(g)针对溶解性筛选所得的候选变体；和(h)选择与所述参比抗-因子D抗体相比具有提高的溶解性的那些变体。

35.根据权利要求32所述的抗体变体，其中所述方法还包含在所述参比抗体的HVR内的另外的置换，由此所得的变体在保持结合亲和力的同时具有提高的稳定性。

36.药物制剂，其包含根据权利要求1-35中任一项所述的抗体或抗体变体。

37.根据权利要求36所述的药物制剂，其中所述抗体变体的浓度为至少100mg/ml。

38.根据权利要求36所述的药物制剂，其中所述抗体变体的浓度为至少200mg/ml。

39.根据权利要求36所述的药物制剂，其中所述抗体变体的浓度为至少300mg/ml。

40.根据权利要求36所述的药物制剂，其中所述抗体变体的浓度为至少500mg/ml。

41.用于眼部递送的长效递送设备，其包含权利要求36的药物制剂和用于将所述制剂以在玻璃体内的方式递送至患者的装置，由此所述制剂在延长的时间期间在位点保持有效。

42.权利要求36的制剂或权利要求41的设备用于制备药物的用途，所述药物用于治疗补体相关病症。

43.根据权利要求42所述的用途，其中所述补体相关病症是眼病。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述眼病选自由以下各项组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉闭塞(CRVO)、角膜新血管形成和视网膜新血管形成。

45.根据权利要求44所述的用途，其中所述眼病是中期干性形式AMD或地图样萎缩(GA)。

46.组合物，其包含因子D拮抗剂和HTRA1拮抗剂。

47.权利要求46的组合物，其中所述因子D拮抗剂是抗-因子D抗体。

48.权利要求46或47的组合物，其中所述HTRA1拮抗剂是抗-HTRA1抗体。

49.权利要求46-48中任一项的组合物，其中所述抗-因子D抗体是权利要求1-31中任一项的抗-因子D抗体。

50.包含因子D拮抗剂和HTRA1拮抗剂的组合物用于治疗补体相关病症的用途。

51.根据权利要求44所述的用途，其中所述补体相关病症是眼病。

52.治疗人受试者中补体相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的第一治疗化合物和有效量的第二治疗化合物。

53.权利要求46的方法，其中所述第一和第二治疗化合物被同时施用。

54.权利要求52的方法，其中所述第一和第二治疗化合物被作为单个组合物施用。

55.权利要求52的方法，其中所述第一和第二治疗化合物作为不同的组合物被施用。

56.权利要求52的方法，其中所述第一和第二化合物被相继施用。

57.权利要求52的方法，其中所述第一治疗化合物是因子D拮抗剂。

58.权利要求52或57的方法，其中所述第二治疗化合物是HTRA1拮抗剂。