CN104995303A - 利用结合乙酰透明质酸的肽标签的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地涉及利用与乙酰透明质酸(HA)结合的肽标签的组合物和方法。HA标签可以与分子如蛋白质或核酸连接，其中施用至眼时，所述HA标签导致该蛋白质或核酸的眼半衰期和/或平均停留时间增加和或其眼清除降低。本发明还涵盖通过施用与HA肽标签连接的蛋白质或核酸治疗眼病(包括视网膜血管病)的方法。

Description

利用结合乙酰透明质酸的肽标签的组合物和方法
发明背景
视网膜疾病，包括新生血管性(wet)AMD、糖尿病性视网膜病变和视网膜静脉闭塞，具有导致视力减退的生血管组分。临床试验已经显示，可以采用每月一次玻璃体内注射抗VEGF疗法如雷珠单抗(ranibizumab)或贝伐单抗或每两月一次用阿柏西普(aflibercept)治疗，有效地治疗这些疾病。尽管这些疗法有效，但每月一次或每两月一次治疗是患者和医师的显著的健康护理负担(Oishi等人,(2011)Eur J Ophthalmol.Nov-Dec；21(6):777-82)。因此需要这样的眼治疗，所述眼治疗可以频率较低地递送，但仍然提供与每月一次或每两月一次用这些活性剂治疗相同的治疗益处。
眼是具有几个不同区室的复杂组织，所述区室包括角膜、眼房水、晶状体、玻璃体液、视网膜、视网膜色素上皮和脉络膜。这些区室的组成不定，但是通常在文献中描述它们由细胞组成，并且包括胞外大分子如透明质酸。本发明描述了结合玻璃体中透明质酸的肽标签，所述肽标签使得与它们连接的分子有可能具有较长的眼半衰期、较长的眼停留时间和在眼病中较长的作用持续时间。
本发明提供可以与治疗性分子连接以减少从眼清除该治疗性分子，因而增加其眼半衰期的肽标签。例如，本文中描述了加肽标签的分子，所述分子相对未加标签的分子在眼中的效力持续时间增加，这将在临床上导致更低频率的眼内注射和患者治疗改善。
发明简述
本发明涉及如本文所述的结合眼中乙酰透明质酸(HA)的肽标签。在某些方面本发明涉及如本文所述的以小于或等于9.0μM的KD结合眼中乙酰透明质酸(HA)的肽标签。例如、肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。本发明还涉及一种分离的肽标签，所述肽标签结合或能够结合包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的HA。
本发明还涉及一种加肽标签的分子，所述分子包含一个或多个与蛋白质或核酸连接的肽标签，其中所述肽标签包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。在肽标签与蛋白质连接的情况下，该标签可以与这种蛋白质的氨基酸连接。在肽标签与核酸连接的情况下，该标签可以与这种核酸的核苷酸连接。在某些方面，它构思肽标签与蛋白质分子的N末端和/或C末端连接或在核酸的5’和/或3’末端连接。此外，肽标签可以与蛋白质或核酸直接连接，或肽标签可以经接头与蛋白质或核酸间接连接。构思了本文所述的加肽标签的分子可以用作药物。
在本发明的某些方面，加肽标签的分子包含与蛋白质连接的肽标签，所述蛋白质例如是抗体或抗原结合片段、治疗性蛋白、蛋白质受体或设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)。在本发明的某些方面，加肽标签的分子包含与适配体连接的肽标签。构思了加肽标签的分子结合VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、TNFα、FGFR2和/或PDGF-BB。
本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合VEGF并且包含分别为SEQ IDNO:1、2和3的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:11、12和13的轻链CDR1、2和3序列。本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合C5并且包含分别为SEQ ID NO:37、38和39的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:46、47和48的轻链CDR1、2和3序列。本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合因子P并且包含分别为SEQ ID NO:53、54、55的重链CDR1、2、和39序列，以及分别为SEQ ID NO:65、66和67的轻链CDR1、2和3序列。本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合EPO并且包含分别为SEQ ID NO:75、76和77的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的轻链CDR1、2和3序列。本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合TNFα并且包含分别为SEQ ID NO:108、109和110的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:117、118和119的轻链CDR1、2和3序列。本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段结合IL-1β并且包含分别为SEQ ID NO:189、190和191的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:198、199和200的轻链CDR1、2和3序列。
本发明还涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段还包含可变重链结构域和可变轻链结构域，所述可变重链结构域和可变轻链结构域分别具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17的序列；分别具有SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:49的序列；分别具有SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:71的序列；分别具有SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:92的序列；分别具有SEQ ID NO:111和SEQ IDNO:120的序列；或分别具有SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:201的序列。在某些方面，本发明涉及一种包含分离的抗体或抗原结合片段的加肽标签的分子，所述分离的抗体或抗原结合片段具有分别为SEQ ID NO:9和SEQID NO:19的重链序列和轻链序列；具有分别为SEQ ID NO:42和SEQ IDNO:51的重链序列和轻链序列；具有分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:73的重链序列和轻链序列；具有分别为SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:85的重链序列和轻链序列；具有分别为SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:122的重链序列和轻链序列；具有分别为SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:202的重链序列和轻链序列。更具体地，加肽标签的分子包含分别为SEQ IDNO:21和19；SEQ ID NO:23和19；SEQ ID NO:25和19；SEQ ID NO:27和19；SEQ ID NO:29和19；SEQ ID NO:44和51；SEQ ID NO:63和73；SEQ ID NO:85和95；SEQ ID NO:115和122或SEQ ID NO:196和202的加标签重链序列和轻链序列。
本发明还涉及如表1、2、8、8b、9或9b中所述的肽标签或加肽标签的分子。更具体地，在某些方面，加肽标签的分子是NVS1、NVS2、NVS3、NVS36、NVS37、NVS70T、NVS71T、NVS72T、NVS73T、NVS74T、NVS75T、NVS76T、NVS77T、NVS78T、NVS80T、NVS81T、NVS82T、NVS83T、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h或NVS1j。
本发明还涉及包含肽标签的组合物，所述肽标签例如是具有SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列的肽标签。本发明还涉及如本文所述的加肽标签的分子，尤其包含下述肽标签的加肽标签的分子，所述肽标签具有SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。在某些方面，本文所述的组合物还包含可药用赋形剂、稀释剂或载体。还构思可以配制用于眼递送(例如，眼内)的组合物。在某些方面，用于眼递送的组合物可以包含以小于或等于9.0μM KD结合HA的肽标签。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。在某些方面，组合物包含12mg或更少的加肽标签的分子。在又一个方面，将组合物配制以每剂量递送12mg/眼或更少的加肽标签的分子。在某些方面，本文所述的组合物包含6mg/50μl或更少的加肽标签的分子。在本发明的某些方面，构思了组合物包含12mg或更少的肽标签。
本发明的另一个方面提供一种编码肽标签的核酸分子，所述肽标签包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。更具体地，核酸分子可以编码肽标签HA10.1、HA10.2，HA11或HA11.1。本发明的其他方面提供一种编码如表1、2、8、8b、9或9b所述的加肽标签分子的核酸分子。在某些方面，核酸分子可以编码NVS1、NVS2、NVS3、NVS36、NVS37、NVS70T、NVS71T、NVS72T、NVS73T、NVS74T、NVS75T、NVS76T、NVS77T、NVS78T、NVS80T、NVS81T、NVS82T、NVS83T、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h或NVS1j。在某些具体方面，该核酸包含序列SEQ ID NO:10、20、22、24、26、28和/或30。
本发明涉及包含本文所述核酸的表达载体。更具体地，例如，表达载体可以包含如表1和2中所述的核酸。在某些方面，本发明还提供包含一种或多种如本文所述的表达载体的宿主细胞，其中宿主细胞可以用于产生具有SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列的肽标签。可选地，包含一种或多种如本文所述的表达载体的宿主细胞可以用于产生如表1、2、8、8b、9或9b中所述的加肽标签的分子。在某些方面构思宿主细胞是哺乳动物细胞。
构思了本文所述的宿主细胞可用于产生本发明的肽标签和加肽标签分子。因此，本发明还涉及一种用于产生如本文所述的肽标签和/或加肽标签分子的方法，例如如表1、2、8、8b、9或9b中所述的肽标签或加肽标签的分子。构思了该方法还包括步骤：在产生肽标签或加肽标签分子的适宜条件下培养宿主细胞，并进一步分离肽标签或加肽标签的分子。
本发明仍然还涉及包含本文所述的肽标签或加肽标签分子的组合物。还构思肽标签、加肽标签的分子和/或组合物可以用于治疗，更具体地用于眼治疗。此外，肽标签、加肽标签的分子和/或组合物可以用于治疗个体中与视网膜血管病相关的病况或病症。在某些方面，视网膜血管病可以是新生血管性年龄相关黄斑变性(wet AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。可选地，肽标签、加肽标签的分子和/或组合物可以用于治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症。在某些方面，与黄斑水肿相关的病况或病症是糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关黄斑变性、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
在本发明的某些具体方面，包含加肽标签分子的组合物包含可以用于治疗个体中VEGF介导的病症，其中所述的加肽标签分子包含抗VEGF抗体或其抗原结合片段。在某些方面，VEGF介导的病症可以是年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。在某些具体方面，可用于治疗VEGF介导的病症的组合物包含抗VEGF抗体或抗原结合片段，所述抗VEGF抗体或抗原结合片段包含分别为SEQ IDNO:1、2和3的重链CDR1、2、和3序列，以及分别为SEQ ID NO:11、12和13的轻链CDR1、2、和3序列。
本发明还涉及一种治疗个体中与视网膜血管病相关的病况或病症的方法，其中该方法包括向个体施用包含本文所述的肽标签和/或加肽标签分子的组合物。在某些具体方面，该方法包括施用包含肽标签或加肽标签分子的组合物，其中肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在某些具体方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在某些具体方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在某些具体方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。
在某些方面，与视网膜血管病相关的病况或病症是新生血管性年龄相关黄斑变性(wet AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
本发明还涉及一种治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症的方法，其中该方法包括向个体施用包含如本文所述的肽标签和/或加肽标签分子的组合物。在某些具体方面，该方法包括施用包含肽标签或加肽标签分子的组合物，其中肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。在某些方面，与黄斑水肿相关的病况或病症是糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关黄斑变性、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
本发明还涉及一种治疗个体中VEGF介导的病症的方法，其中该方法包括步骤：向个体施用包含与抗VEGF抗体或其抗原结合片段连接的肽标签的组合物，其中所述肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。在某些方面，该方法涉及治疗个体眼中VEGF介导的病症。本发明仍然还涉及一种治疗个体中VEGF介导的病症的方法，其中该方法包括步骤：向个体施用包含与抗VEGF抗体或其抗原结合片段连接的肽标签的组合物，其中所述肽标签包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。构思了抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含分别为重链SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、2、和3序列，以及分别为SEQ ID NO:12、13和14的轻链CDR1、2、和3序列。在某些具体方面，VEGF介导的病症是年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。
本发明还涉及一种增加分子在眼中的半衰期、平均停留时间或终浓度或减少分子从眼清除的方法，所述方法包括步骤：向个体的眼施用包含加肽标签的分子的组合物，其中肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的Kd结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。
本发明还涉及增加分子的眼半衰期的方法，所述方法包括步骤：将该分子连接至以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签。在某些方面，本发明涉及增加分子的眼平均停留时间的方法，所述方法包括步骤：将该分子连接至以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签。在某些方面，本发明涉及增加分子的眼终浓度的方法，所述方法包括步骤：将该分子连接至以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签。在某些方面，本发明涉及减少分子的眼清除率的方法，所述方法包括步骤：将该分子连接至以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签。在前述每种方法中，肽标签以小于或等于9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于9.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36的序列。
本发明还涉及一种产生用于眼递送的组合物的方法，所述方法包括步骤：将以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签连接至结合眼中靶的分子。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。本发明仍然进一步涉及一种产生加肽标签分子的方法，包括将SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列与分子例如蛋白质或核酸连接。在某些方面构思了肽标签与分子的连接产生加肽标签的分子，其中当施用至眼时，与不带标签的分子相比，所述加肽标签的分子具有减少的眼清除率、增加的眼平均停留时间和/或增加的眼终浓度。
定义
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
本文所用的术语“抗体”意指完整抗体。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由CL一个结构域组成。VH和VL区可进一步细分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其中散布更保守的称为构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq))的结合。
本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合给定抗原(例如血管内皮细胞生长因子:VEGF)的能力。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的抗原结合片段之内的结合片段的实例包括，但不限于：Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段(scFv)；由VH结构域或VL结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等,(1989)Nature341:544-546)；及分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可用重组方法，通过人工肽接头将它们连接，该人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等,1988 Science 242:423-426；和Huston等,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这类单链抗体可以包括抗体的一个或多个抗原结合片段。用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并筛选该片段，以与完整抗体相同的方式使用该片段。
抗原结合片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植入基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。
抗原结合片段可掺入到包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，该串联Fv区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸时由遗传密码编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ–羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即结合氢的α-碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化合物。
术语“补体C5蛋白”或“C5”互换使用，并且指不同物种中的补体组分5蛋白。例如，人C5具有如SEQ ID NO:99中所述的序列(参见表2)。人C5是本领域已知的并且可以从Quidel获得的(目录号A403)。
术语“视网膜疾病相关病况或病症”指任何数量的其中视网膜变性或变得功能异常的病况或疾病。这包括糖尿病性视网膜病变(DR)、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)、非增生性糖尿病性视网膜病变(NPDR)、新生血管性年龄相关性黄斑变性(wetAMD，新生血管性AMD)、视网膜静脉闭塞(RVO)、多病灶性脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。可以通过VEGF抑制来治疗的视网膜血管病的解剖特征包括黄斑水肿、静脉扩张、血管迂曲、荧光素血管造影术测量的血管渗漏、视网膜出血、及微血管异常(例如微动脉瘤、棉絮斑、IRMA)、毛细血管脱落、白细胞黏附、视网膜局部缺血、视盘新血管形成、后极新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜内出血、玻璃体出血、黄斑瘢痕、视网膜下纤维化和视网膜纤维化。
术语“与视网膜血管病相关的病况或病症”指其中存在视网膜膜异常血管化(例如，增加或减少)的病况。与视网膜血管病相关的病况或病症包括新生血管性年龄相关黄斑变性(wet AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
术语“糖尿病性视网膜病变相关病况或病症”指任何数量的其中视网膜由于糖尿病(1型或2型)对视网膜血管***、视网膜代谢、视网膜色素上皮、血液视网膜屏障、或高级糖化终产物(AGE)的眼水平、醛糖还原酶活性、糖基化血红蛋白和蛋白激酶C的影响而变性或变得功能异常的病况。糖尿病性视网膜病患者中的视力丧失可以是视网膜局部缺血、黄斑水肿、血管渗漏、玻璃体出血的结果，或是提高的葡萄糖水平对视网膜神经元的直接影响。可以通过VEGF抑制来治疗的糖尿病性视网膜病的解剖特征包括微动脉瘤、棉絮斑、静脉扩张、黄斑水肿、视网膜内微血管异常(IRMA)、视网膜内出血、血管增生、视盘新血管形成、发红和视网膜局部缺血。“糖尿病性黄斑水肿”发生在患有糖尿病性视网膜病的个体中，且可以发生在该疾病的任意阶段。
术语“黄斑水肿相关病况或病症”指任何数量的其中黄斑由于视网膜血管渗液、“黄斑水肿”而发生肿胀或增厚的病况或病症。黄斑水肿发生在视网膜血管病中，且通常是视网膜血管病的并发症。具体的黄斑水肿相关病况或病症包括糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病、非增生性糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性、视网膜静脉阻塞、多灶性脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病。可以通过眼底检查、光学相干断层扫描和改善的视力来测定VEGF的抑制对黄斑水肿的治疗。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的各取代、缺失或添加，其导致用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领域所熟知。此类保守修饰变体附加至而不排斥本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有彼此为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”或“保守修饰”用于指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用，术语“DARPin”(设计型锚蛋白重复序列蛋白的首字母缩略词)指一般显示高度特异性和高亲和力靶蛋白结合作用的抗体模拟蛋白。它们一般经基因工程化并衍生自天然锚蛋白类并且由这些蛋白质的至少三个、通常四个或五个重复基序组成。对于四重复或五重复DARPin，它们的分子质量分别是约14或18kDa(千道尔顿)。DARPin的例子可以在例如美国专利7,417,130中找到。
术语“剂量”指一次性(单位剂量)或在一个限定时间区间范围内以两次或更多次施用向个体施用的肽标签、加肽标签的分子、蛋白质或核酸的量。例如，剂量可以指历经三周或一个、两个、三个或更多个月(例如，通过单次施用或通过两次或更次施用)向个体施用的蛋白质(例如，加肽标签的分子，例如，包含抗VEGF抗原结合片段和结合HA的肽标签的加肽标签蛋白质)的量。各次给药之间的时间间隔可以任何所需的时间量并且称作“给药间隔时间”。术语“药学有效的”在指剂量时意指足够提供所需效果的蛋白质(例如，抗体或抗原结合片段)、肽标签或其他药物活性物质的量。“有效的”量将在个体之间不同，这取决于个体的年龄和总体状况、具体药物或药物活性物质等。因此，不总是可能规定适用于全部患者的确切“有效量”。然而，任何单个情况下的适宜“有效”剂量可以由本领域普通技术人员使用例行试验确定。
术语“Epo蛋白”或“Epo抗原”或“EPO”或“Epo”互换使用并且指不同物种中的***蛋白。例如，人EPO具有如表2b中所述的序列：SEQ ID NO:98。人、食蟹猴、小鼠、大鼠和兔Epo的蛋白质序列是可公开获得的。人EPO也可以高糖基化的。
术语“Epo受体”或“EPOR”互换使用并且指***受体蛋白，并且指不同物种中的***受体蛋白。EPOR已经由Winkelmann J.C.,Penny L.A.,Deaven L.L.,Forget B.G.,Jenkins R.B.Blood 76:24-30(1990)描述。
术语“因子D蛋白”或“因子D抗原”或“因子D”互换使用，并且指不同物种中的因子D蛋白。人因子D的序列已经由Johnson等人描述(FEBSLett.1984 Jan 30；166(2):347-51)。针对因子D的抗体是本领域已知的并且在US8273352中描述。
术语“因子P蛋白”或“因子P抗原”或“因子P”互换使用并且指不同物种中的因子P蛋白。例如，人因子P具有如表2b中所述的序列：SEQ IDNO:100。人因子P可以从Complement Tech,Tyler,TX获得。可以从食蟹猴血清纯化食蟹猴因子P(方案改编自Nakano等人,(1986)J ImmunolMethods 90:77-83)。因子P是在本领域也称作“备解素(Properdin)”。
术语“FGFR2”指不同物种中的成纤维细胞生长因子受体2。FGFR2已经由Dionne C.A.,Crumley G.R.,Bellot F.,Kaplow J.M.,Searfoss G.,RutaM.,Burgess W.H.,Jaye M.,Schlessinger J.EMBO J.9:2685-2692(1990)描述。
术语“乙酰透明质酸”或“透明质酸”或“HA”指一种含有重复二糖单元N-乙酰氨基葡萄糖和葡糖醛酸的庞大多聚糖胺，其出现在胞外基质中和细胞表面上。乙酰透明质酸进一步在J.Necas,L.Bartosikova,P.Brauner,J.Kolar,Veterinarni Medicina,53,2008(8):397–411中描述。
术语“透明质酸粘素(hyaladherin)”或“乙酰透明质酸结合蛋白”或“HA结合蛋白”指结合乙酰透明质酸的蛋白质或蛋白家族。HA结合蛋白的例子是本领域已知的(Day等人,2002J Bio.Chem 277:7,4585和Yang等人,1994,EMBO J 13:2,286-296)(例如：Link、CD44、RHAMM、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、细菌HA合酶、胶原蛋白VI和TSG-6)。许多HA结合蛋白和肽片段含有参与HA结合的约100个氨基酸长度的共同结构域；该结构域称作“LINK结构域”(Yang等人,1994,EMBO J 13:2,286-296和Mahoney等人,2001,J Bio.Chem 276:25,22764-22771)。例如，TSG-6(一种HA结合蛋白)的LINK结构域(LINK Domain)包含人TSG-6序列(SEQ IDNO:30)的氨基酸残基36-128。
本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有其中构架区和CDR区二者都源自人来源的序列的可变区的抗体。此外，如果该抗体包含恒定区，则该恒定区也源自这类序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，其具有如下可变区，其中构架区和CDR区都源自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包括从具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞；该B细胞与永生化细胞融合。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性，同时在人类中免疫原性较低的抗体。这例如可通过保留非人CDR区并用它们的人类对应物替换抗体的其余部分(即恒定区，以及可变区的构架部分)来达到。见例如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人改造技术的其他实例包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
在两条或更多核酸或多肽序列的背景中，术语“同一的”或百分比“同一性”指相同的两条或更多序列或子序列。在为了比较窗内或指定区域内的最大对应而用以下序列比较算法之一或通过手工比对和视觉检查测量来比较和比对时，如果两条序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在特定区域内，或在不指定时，在全长序列内60％同一性，可选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，那么两条序列“基本相同”。可选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域，或更优选地在长度为100至500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多氨基酸)的区域。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定备选参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
本文所用的“比较窗口”包括参考选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的任一数目的相邻位置的区段，其中可在两条序列进行最佳比对后将序列与相同数目相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如可通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的搜索相似性法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、或通过手工比对和视觉检查(参见例如Brent等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou ed.,2003))来进行序列最佳比对用于比较。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for BiotechnologyInformation公开获得。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，该短字匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等,上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的更长HSP。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列，用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分；总是大于0)和N(对错配残基的罚分；总是小于0)计算累积得分。对于氨基酸序列，用得分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最高达到值跌落X量、累积得分由于一个或更多负得分残基比对的累积而到达零或以下、或到达任一序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2、更优选低于约0.01、最优选低于约0.001，那么认为核酸与参考序列相似。
也可使用已经整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法，使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、14、12、10、8、6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
除了上文指出的百分比序列同一性外，两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文所述。因此，例如，在两条肽仅因保守取代而不同时，多肽通常与第二条多肽基本相同。两条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可用相同的引物来扩增两条核酸序列。
术语“分离的抗体”指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体或其他蛋白质的抗体(例如特异性结合VEGF的分离的抗体基本不含特异性结合VEGF以外的抗原的抗体)。但是，特异性结合VEGF的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞物质和/或化学药品，例如分离自细胞上清的抗体。
术语“IL-1β”指白介素-1β蛋白，一种在人中由IL1B基因编码的细胞因子。例如，人IL-1β具有如表2b中所述的序列：SEQ ID NO:102。
术语“IL-10”或“IL10”互换使用并且指白介素-10蛋白，并指不同物种中的白介素-10蛋白。IL10已经由Vieira P.,de Waal-Malefyt R.,DangM.-N.,Johnson K.E.,Kastelein R.,Fiorentino D.F.,Devries J.E.,Roncarolo M.-G.,Mosmann T.R.,Moore K.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:1172-1176(1991)描述。
术语“IL-17A”指白介素17A，是一种155个氨基酸的蛋白质，它是一种二硫键连接的同型二聚分泌型糖蛋白，分子质量35kDa(Kolls JK,Lindén A 2004,Immunity 21:467–76)。
术语“同种型”指由重链恒定区基因提供的抗体种类(例如，IgM、IgE、IgG，如IgG1或IgG4)。同种型还包括这些种类之一的修饰形式，其中进行修饰来改变Fc功能，例如以增强或减低效应子功能或与Fc受体的结合。
术语“连接”或“连接”指将肽标签例如表1和2中所列的结合HA的肽标签接合至分子例如蛋白质或核酸。肽标签与至蛋白质或核酸分子的接合可以例如在分子的氨基端或羧端进行。肽标签也可以与分子的氨基端和羧基端接合。肽标签也可以分别与蛋白质或核酸分子的一个或多个氨基酸或核酸连接。此外，“连接”还可以指两个或更多个肽标签彼此结合和/或两个或更多个肽标签与分子上的不同位点结合。可以通过本领域已知的几种方法完成肽标签与分子的连接，所述方法包括但不限于，将肽标签和分子表达为融合蛋白、通过标签和/或分子之间的肽接头连接两个或更多个肽标签或通过翻译后将肽标签与分子彼此直接或经借助二硫键的接头等化学连接。
术语“肽接头”指起到将肽标签与分子共价接合作用的氨基酸序列。肽接头可以与肽标签和/或蛋白质的氨基端或羧基端之一或二者或核酸分子共价连接。肽接头也可以分别与蛋白质或核酸分子的序列内的氨基酸或核酸缀合。构思了肽接头可以例如长约2个至25个残基。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物对特定表位展示单结合特异性和亲和力。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性质，并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。这类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有指出，特定核酸序列也暗中涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，如下文详述，可通过产生这样的序列来完成简并密码子取代，其中用混和碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或更多所选(或全部)密码子的第三个位置(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
术语“清除率”指是每单位时间清除的物质(例如：基质、组织、血浆、或其他物质如药物或如加肽标签的分子)的体积(Shargel,L和Yu,ABC:Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,第4版(1999))。“眼清除”指从眼清除某物质如加肽标签的分子。
术语“有效连接”指两个和更多个多核苷酸(例如DNA)区段的功能关系。通常，它指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其他表达***中的转录，那么该启动子或增强子序列有效连接至编码序列。通常，有效连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻近，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节序列，如增强子不需要与编码序列(增强子增强其转录)在物理空间上邻近或位于其附近。
本文所用的术语“优化的”意指已用生产细胞或生物中优选的密码子改变核苷酸序列来编码氨基酸序列，该生产细胞或生物通常是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。改造优化的核苷酸序列，以完全或尽可能多地保留起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)最初编码的氨基酸序列。本文的优化序列已改造为具有哺乳动物细胞中优选的密码子。但是，本文也设想这些序列在真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
术语“PDGF-BB”指血小板衍生生长因子亚基B，这种蛋白质已经如Josephs S.F.,Ratner L.,Clarke M.F.,Westin E.H.,Reitz M.S.,Wong-StaalF.Science 225:636-639(1984)所描述。
术语“肽标签”或“蛋白质标签”互换地用来指结合各种眼区室中存在的分子的短蛋白质序列、肽片段或肽模拟物，所述眼区室包括：玻璃体、视网膜、RPE、脉络膜、眼房水、小梁网、角膜或睫状体。例如，由肽标签结合的眼分子可以包括结构性玻璃体蛋白、视网膜蛋白和RPE蛋白，包括胶原蛋白和层粘连蛋白：胞外蛋白质，包括弹性蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白；可溶性蛋白，包括白蛋白；跨膜蛋白包括整联蛋白；和含糖分子，包括透明质酸、糖胺聚糖和其他胞外蛋白聚糖。肽标签的具体例子例如包括结合HA的肽标签(即：结合HA的肽标签)。本发明的肽标签，包括结合HA的肽标签，与不连接于肽标签的相同分子(即：未加标签的分子)相比，可以增加加肽标签的分子(例如：蛋白质或核酸)的眼半衰期(T1/2或t1/2)、和/或增加眼平均停留时间、和/或降低眼清除率、和/或增加给药间隔时间。
可以通过本领域已知的几种方法连接肽标签以形成多聚体，所述方法包括但不限于，将蛋白质标签表达为融合蛋白、通过标签之间的肽接头连接两个或更多个蛋白质标签或通过翻译后将肽标签彼此直接或经借助二硫键的接头等化学连接。术语“加肽标签的分子”指与一个或多个本发明肽标签连接的分子。该分子可以是，但不限于蛋白质或核酸。术语“加标签的抗体”或“加肽标签的抗体”指与本发明的一个或多个蛋白质标签连接的抗体或其抗原结合片段。术语“加肽标签的抗原结合片段”指与本发明的一个或多个蛋白质标签连接的抗原结合片段。
如本文所用，术语“半衰期”指药物浓度降至一半所需要的时间(Rowland M和Towzer TN：Clinical Pharmacokinetics.Concepts andApplications.第3版(1995)以及Bonate PL和Howard DR(编著):Pharmacokinetics in Drug Development,第1卷(2004))。
如本文所用，术语“平均停留时间”或“MRT”是药物(例如：加肽标签的分子)停留在身体中(包括停留在特定器官或组织(例如，眼))中的平均时间。
如本文所用，术语“Ctrough”指整个给药间隔时间期间基质或组织中测量到的最低药物浓度，最经常紧邻重复剂量施用之前出现。
如本文所用，术语“蛋白质”指由在一条或多条线性链中排列的氨基酸组成并折叠成球状形式的任何有机化合物。聚合物链中的氨基酸由相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起。术语“蛋白质”还包括，而不限于肽、单链多肽或主要由两条或更多条氨基酸链组成的任何复杂分子。它还包括，而不限于糖蛋白或其他已知的翻译后修饰形式。它还包括天然蛋白的已知天然或人工化学修饰形式，例如而不限于，糖工程化、PEG化、hesylation等、非天然氨基酸的掺入和用于与另一个分子化学缀合的氨基酸修饰。
本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化用于表达人抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，及通过涉及将人免疫球蛋白基因、序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任意其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有如下可变区，其中构架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。但是，在某些实施方案中，可对这类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时进行体内体细胞诱变)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，该序列尽管源自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能并不天然存在于体内的人抗体种系库中。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)指已将重组表达载体引入其中的细胞。应理解，这类术语旨在不仅指具体的主题细胞，还指这种细胞的后代。由于某些修饰可以因突变或环境影响而存在于后代中，这种后代事实上可以与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围之内。
术语“个体”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)，如非人灵长类(例如食蟹猴)、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除了指出时，术语“患者”或“个体”在本文中可互换使用。本文所用的术语“cyno”或“食蟹猴”指食蟹猴(Macacafascicularis)。
术语“终浓度”指在实验或研究结束时测量的肽标签，加肽标签的分子等的浓度。“药物终浓度增加”指加肽标签的分子的终浓度增加至少25％。
如本文所用，术语“治疗”与视网膜血管病相关的任何病况或病症、与糖尿病性视网膜病变相关的病况或病症和/或与黄斑水肿相关的病况或病症在一个方面指缓解疾病或病症(即，延缓或停滞或减少疾病或其至少一个临床症状的形成)。在另一方面中，“治疗”指减轻或改善至少一种物理参数，包括患者不可识别的那些。还在另一方面中，“治疗”指在物理上(例如稳定不可识别的症状)、在生理学上(例如稳定物理参数)或在物理和生理学上调节疾病或病症。还在另一方面中，“治疗”指预防或推迟疾病或病症的起始或发展或进展。“预防”本身涉及本文所述的适应症，包括视网膜血管病相关病况或病症、糖尿病性视网膜病相关病况或病症、和/或黄斑水肿相关病况或病症，意指在处于下文所述视觉功能、视网膜解剖学、视网膜血管病参数、糖尿病性视网膜病参数和/或黄斑水肿病参数恶化风险的患者中防止或减慢所述恶化的任意动作。更具体而言，视网膜血管病相关病况或病症、糖尿病性视网膜病相关病况或病症和/或黄斑水肿相关病况或病症的“治疗”意指导致或考虑其导致视觉功能和/或视网膜解剖学的改善或保持的任意动作。用于评估疾病的治疗和/或预防的方法为本领域已知并在下文描述。
术语“TNFα”指肿瘤坏死因子α(也称作，恶液质素)，一种由许多细胞类型(包括响应于内毒素或其他刺激的单核细胞和巨噬细胞)产生的天然存在的哺乳动物细胞因子。TNFα是炎性反应、免疫反应和病理生理反应的主要介质(Grell，M.等人,(1995)Cell,83:793-802)。可溶性TNFα因前体跨膜蛋白裂解形成(Kriegler等人,(1988)Cell 53:45-53)，并且分泌性17kDa多肽装配成可溶解性同源三聚体复合物(Smith等人,(1987)，J.Biol.Chem.262：6951-6954；关于TNFα的综述，参见Butler等人,(1986),Nature 320:584；Old(1986),Science 230:630)。人TNFα的序列在表2b中描述并且具有SEQ ID NO:101序列。
术语“TSG-6”指肿瘤坏死因子诱导型基因6。TSG-6是HA结合蛋白家族成员并含有LINK结构域。(Lee等人,J Cell Bio(1992)116:2,545-57)。来自TSG-6的LINK结构域在本文中也称作“TSG-6LINK结构域”。
术语“载体”旨在指能够转运与它连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他DNA区段可以连接入其中的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中其他DNA区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明旨在包括这类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其执行等同的功能。
术语“VEGF”指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，以及相关的121个氨基酸、189个氨基酸和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung等人,Science 246:1306(1989),和Houck等人,Mol.Endocrin.5:1806(1991)所描述，以及那些生长因子的天然存在等位形式和加工形式。人VEGF的序列在表2b中描述并且具有SEQ ID NO:97序列。
术语“VEGF介导的病症”指需要VEGF参与的任何病症、症状或疾病状态发作、进展或持续。示例性VEGF介导的病症包括但不限于年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、斑痣性错构瘤病相关性异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。
如本文所用，术语“治疗性蛋白”指可用于治疗、防止或改善疾病、病况或病症的蛋白质。
如本文所用，术语“蛋白质受体”指作为细胞受体并结合配体的蛋白质。
附图简述
图1.显示兔玻璃体中雷珠单抗和NVS4的4点PK曲线。
图2.显示兔渗漏模型中hVEGF的剂量反应。
图3.显示用未加标签的抗体抑制荧光素渗漏的时程。
图4.显示兔渗漏模型中加标签抗体的效力和玻璃体终末浓度之间的关联。
图5.显示兔渗漏模型中胶原蛋白结合肽标签的效力持续时间。
图6.显示兔渗漏模型中NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37的效力持续时间。
图7.显示雷珠单抗、NVS1、NVS2和NVS3的2点PK曲线
图8.显示兔渗漏模型中加标签的抗体的效力持续时间延长。
图9.显示兔渗漏模型中加标签的抗体的效力持续时间延长。
图10.显示NVS1的2点和6点PK曲线。
图11.显示食蟹猴中的初步研究。
图12.显示从28天食蟹猴耐受性研究中测量的药物终末水平得出的的眼2点PK曲线。
图13.显示从59天食蟹猴耐受性研究中测量的药物终末水平得出的眼3点PK曲线。
图14.A、B和C显示相对人中的雷珠单抗，玻璃体中加肽标签的抗体浓度的模型预测。图14A和14B：剂量范围预测值。图14C效力持续时间。图14D显示一个模型，该模型基于初始剂量后随时间在眼中剩余的分子的百分数显示增加具有结合HA的肽标签的分子的半衰期的作用。图14E显示眼中所比较的加肽标签分子(例如：NVS2)以及雷珠单抗(0.5mg)、阿柏西普(2mg)和贝伐单抗(1.25mg)的IVT剂量的效力持续时间。图14F显示以如图14E中所显示的给药间隔时间给药1年后的预测血清总药物Cave(nM)。
图15.显示采用无NVS4抗VEGF蛋白的兔效力持续时间研究
图16.显示以VEGF攻击的高亲和力和低亲和力变体的兔效力
图17.显示借助PET成像时加肽标签的分子和未加标签的分子的生物分布
发明详述
本发明部分地基于发现这样的肽标签，所述肽标签增加蛋白质或核酸在眼中的半衰期和/或平均停留时间。在某些方面，本发明肽标签增加抗体和抗原结合片段、治疗性蛋白、蛋白质受体、DARPin和/或适配体在眼中的半衰期和/或平均停留时间。本发明还涉及发现特异性结合眼部蛋白(例如：HA和/或VEGF)并在眼中显示增加的半衰期和/或平均停留时间的长效抗体分子。本发明涉及与蛋白质标签连接的完整IgG形式抗体以及抗原结合片段，如Fab片段。
肽标签
许多因素可能影响蛋白质的体内半衰期。例如，肾过滤，肝脏中代谢、遭蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反应(例如，抗体的蛋白质中和作用和被巨噬细胞和树突细胞摄取)。多种策略可以用来延长抗体、抗原结合片段或抗体模拟物的血清半衰期。例如，通过连接聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和糖屏障(carbohydrate shield)；通过与结合血清蛋白如白蛋白、IgG、FcRn和转铁蛋白结合的蛋白质遗传融合；通过偶联(遗传或化学方式)至与血清蛋白结合的其他结合部分如纳米抗体、Fab、DARPin、高亲和性多聚体(avimer)、亲和体(affibody)和抗运载蛋白(Anticalin)；通过与白蛋白或白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白、抗体Fc区遗传融合；或通过掺入纳米载体、缓释制剂或医疗器械。
本发明提供特异性结合眼中乙酰透明质酸的肽标签。乙酰透明质酸以各种大小在身体的许多组织和器官中存在。例如，人眼和滑液含有最高浓度的乙酰透明质酸，浓度分别是0.14-0.338mg/ml和1.42-3.6mg/ml，而其他组织/流体含有低得多浓度的乙酰透明质酸，如血清，其中乙酰透明质酸浓度是0.00001-0.0001mg/ml(Laurent和Fraser,1986 Ciba Found Symp.1986；124:9-29)。非眼乙酰透明质酸主要由迅速降解并周转的低分子量聚合物组成。在人体中，乙酰透明质酸具有血液中半衰期2.5-5分钟(Fraser JR,Laurent TC,Pertoft H,Baxter E.Biochem J.1981 Nov 15；200(2):415-24)。与之相反，眼乙酰透明质酸主要由高分子量聚合物(>0.5X10^5道尔顿)组成并且具有数日或数周的较慢周转速率(Laurent和Fraser,Exp.Eye Res.1983；36,493-504)。由于乙酰透明质酸大小及其在眼中周转的这些差异，假设眼中的乙酰透明质酸充当与结合HA的肽标签连接的玻璃体内蛋白质和核酸的缓释支架。
本领域中已经描述推定性乙酰透明质酸结合蛋白(J.Necas,L.Bartosikova,P.Brauner,J.Kolar.Veterinarni Medicina,53,2008(8):397–411)，例如，肿瘤坏死因子诱导型基因6蛋白(TSG6)、乙酰透明质酸介导的能动受体(RHAMM)、CD44抗原、乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白4、神经蛋白聚糖核芯蛋白、Stabilin-2和人神经胶质透明质酸结合蛋白。但是，测试的大部分推定性乙酰透明质酸结合蛋白不结合HA，也不增加与推定性结合HA的蛋白连接的蛋白质或核酸的眼半衰期。本发明基于令人惊讶地发现这样的肽标签，所述肽标签在眼中结合HA并且适于延长蛋白质或核酸在眼中的半衰期、增加蛋白质或核酸在眼中的终浓度、减少蛋白质或核酸在眼中的眼清除作用，和/或增加蛋白质或核酸在眼中的平均停留时间。在本发明的某些方面，肽标签以小于或等于9.0μM、小于或等于8.5μM、小于或等于8.0μM、小于或等于7.5μM、小于或等于7.0μM、小于或等于6.5μM、小于或等于6.0μM、小于或等于5.5μM、小于或等于5.0μM、小于或等于4.5μM、小于或等于4.0μM、小于或等于3.5μM、小于或等于3.0μM、小于或等于2.5μM、小于或等于2.0μM、小于或等于1.5μM、小于或等于1.0μM、小于或等于0.5μM或小于或等于100nM的KD结合眼中的HA。在更具体的方面，例如，肽标签以小于或等于8.0μM、小于或等于7.2μM、小于或等于6.0μM、或小于或等于5.5μM的KD结合眼中的HA。在本发明的一些方面，结合HA的肽标签具有LINK结构域。在本发明的某些其他方面，LINK结构域是TSG-6LINK结构域。另外，本发明的其他方面基于发现还抵抗蛋白酶解切割和/或糖基化的肽标签修饰形式。更具体地，本发明可以包括一种肽标签，所述肽标签结合或能够结合包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的HA。构思了包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签结合或能够结合个体眼中的HA。构思了肽标签可以是表1中列出的任一个肽标签。更具体地，肽标签可以是HA10、HA10.1、HA10.2、HA11或HA11.1。
在某些方面，肽标签可以具有包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97或98个连续氨基酸的序列。在某些其他方面，构思了肽标签是包含SEQ ID NO：32、33、34、35或36的序列的肽标签的截短变体。可以从包含SEQ ID NO：32、33、34、35或36的序列的肽标签的N末端、C末端或两个末端切除氨基酸，以产生肽标签的截短变体HA10、HA10.1、HA10.2、HA11或HA11.1。进一步构思可以从SEQ ID NO：32、33、34、35或36的N末端至多和(但是不包括)N端首个半胱氨酸切割序列。进一步构思可以从SEQ ID NO：32、33、34、35或36的C末端至多和(但是不包括)C端首个半胱氨酸切割序列。进一步构思可以从SEQ IDNO：32、33、34、35或36的N末端和C末端至多(但是不包含)N末端首个半胱氨酸和(但是不包含)C端首个半胱氨酸切割序列。例如，相对于SEQID NO：32，本领域技术人员可以从从N末端移除至多22个氨基酸(粗体)和/或从C末端移除至多六个氨基酸(下划线)：
GVYHREARSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYC(SEQ ID NO：32)
本发明的肽标签可以与分子连接以延长该分子的眼半衰期，例如该分子可以是蛋白质或核酸。可以由本文所述的蛋白质标签修饰的蛋白质和核酸的具体例子包括但不限于抗体、抗原结合片段、治疗性蛋白、蛋白质受体、DARPin、和/或适配体、以及蛋白质和核酸多价组合。在某些方面、这些蛋白质和核酸结合眼中的靶蛋白，例如VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、Il-1β、IL-17A、TNFα、IL-10或FGFR2。不受任何具体理论约束的情况下，相对未加标签的分子，在连接至结合眼中靶蛋白的蛋白质或核酸时，本发明的肽标签减少加标签的分子(例如：蛋白质或核酸)在眼中的眼清除、增加平均停留时间、增加其半衰期(T1/2)和/或增加药物终浓度。
本发明还涉及令人惊讶的研究结果：与无标签的分子相比，将结合或能够结合眼中HA的肽标签与分子(例如：蛋白质或核酸)连接显著地改善加肽标签分子的生物物理特性。构思与无标签的分子相比，加肽标签分子的生物物理特性以统计显著的量(即：p<0.05)改善，所述生物物理特性包括但不限于相对于未加标签形式的分子，加肽标签的分子的改善的溶解度、改善的等电点(pI)和/或改善的对其靶的结合亲和力。在具体方面，本发明涉及一种增加分子的溶解度的方法，所述方法包括步骤：将该分子与结合眼中HA的肽标签连接。在具体方面，本发明涉及一种增加分子的pI的方法，所述方法包括步骤：将该分子与结合眼中HA的肽标签连接。在某些方面，与未加标签的分子相比，肽标签与分子连接增加pI至多3倍。在其他方面与未加标签的分子相比，加肽标签的分子的pI增加至多2.8、2.5、2.0、1.75、1.5、1.0或0.5倍。
在具体方面，本发明涉及一种增加分子对其靶的结合亲和力的方法，所述方法包括步骤：将该分子与结合眼中HA的肽标签连接。在某些具体方面，肽标签与分子连接改善分子对主要靶的结合亲和力135倍、130倍、120倍、110倍、100倍、90倍、80倍、75倍、50倍、40倍、30倍、20倍、15倍、10倍、7.5倍、5倍、4倍、2倍、1.75倍。构思了加肽标签的分子以小于或等于9.0μM、8.0μM、6.0μM或5.5μM的KD结合眼中的HA。进一步构思，与无标签的分子相比时，包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签以统计显著的量改善与该肽标签连接的分子的生物物理特性。仍然进一步构思了可以在本文所述的任何方法使用多个肽标签，以改善对眼中对HA的结合亲和力，更具体地，例如包含多于一个肽标签的加肽标签的分子以小于或等于1.0μM、0.9μM、0.8μM、0.7μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM或0.1μM的KD结合HA。
在本发明的某些方面，构思了单个肽标签与分子例如蛋白质或核酸分子连接。在本发明的其他方面，构思了两个、三个、四个或更多个肽标签可以与蛋白质或核酸连接。构思了肽标签连接至蛋白质的羧基端或氨基端。还构思肽标签可以连接至抗体或其抗原结合片段的重链或轻链，或可选地连接至两条链。构思了肽标签可以连接至核酸分子的5’和/或3’。多个标签可以串联和/或连接至多条蛋白质链(例如：连接至重链和轻链)。还构思蛋白质标签和/或蛋白质和/或核酸可以在翻译后彼此直接或借助二硫键、肽接头等化学连接。肽接头和蛋白质标签与蛋白质(例如：抗体和抗原结合片段)或核酸连接的方法是本领域已知的并在本文中描述。
加肽标签的分子
本发明的另一个方面包括加肽标签的分子。在本发明的某些方面，加肽标签的分子可以包含结合或能够结合HA的肽标签。在某些方面，加肽标签的分子包含以小于或等于9.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。在某些具体方面，肽标签可以包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列。还构思肽标签与作为蛋白质的分子或作为核酸的分子连接。本文中描述了可以与蛋白质标签连接的分子的例子。
蛋白质分子
本发明提供可以与本发明的肽标签连接的蛋白质。在本发明的某些方面，蛋白质可以是分离的抗体或其抗原结合片段(例如：Fab、scFv、FcTrap等)、作为治疗性蛋白的蛋白质(例如EPO、胰岛素、细胞因子等)、蛋白质受体(例如：EPO受体、FGFR2等)或DARPin。在本发明的某些方面，该蛋白质结合或能够结合VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、TNFα、IL-10或FGFR2。进一步构思，蛋白质结合在眼中发生。
本发明的一个方面包括结合VEGF的蛋白质。众多VEGF结合蛋白是本领域已知的并在本文中描述，参见例如表1、9和9b。在某些方面，抗VEGF结合蛋白可以具有NVS4、NVS80、NVS81、NVS82、NVS83、NVS84或NVS85的序列。在某些具体方面，例如，本发明还提供特异性结合VEGF的抗体和抗原结合片段。本发明的VEGF抗体和抗原结合片段包括但不限于在美国专利申请US 20120014958或WO 1998045331中分离并描述的抗体和片段，以及如本文(例如在表1和实施例中)所述的抗体和抗原结合片段。可以与本文所述的蛋白质标签连接并且在本文所述的方法中使用的其他抗VEGF抗体、VEGF拮抗剂和VEGF受体拮抗剂例如包括：雷珠单抗(Ferrara N,Damico L,Shams N,Lowman H,Kim R.Retina.2006Oct；26(8):859-70)、贝伐单抗(Ferrara N,Hillan KJ,Gerber HP,NovotnyW.Nat Rev Drug Discov.2004May；3(5):391-400)、阿柏西普(Stewart MW,Grippon S,Kirkpatrick P.Nat Rev Drug Discov.2012 Mar30；11(4):269-70)、KH902(Zhang M,Zhang J,Yan M,Li H,Yang C,Yu D.Mol Vis.2008 Jan 10；14:37-49)、MP0112(Campochiaro PA,Channa R,Berger BB,Heier JS,Brown DM,Fiedler U,Hepp J,Stumpp MT.Am JOphthalmol.2013 Apr；155(4):697-704)、培加尼布(Gragoudas ES,AdamisAP,Cunningham ET Jr,Feinsod M,Guyer DR.N Engl J Med.2004 Dec30；351(27):2805-16)、CT-322(Dineen SP,Sullivan LA,Beck AW,MillerAF,Carbon JG,Mamluk R,Wong H,Brekken RA.BMC Cancer.2008Nov 27；8:352.doi:10.1186/1471-2407-8-352)和如US 20120014958中所述的抗VEGF抗体和片段。
本发明的特定的方面提供特异性结合VEGF蛋白的抗体，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。本发明还提供特异性结合VEGF蛋白的抗体，其中抗体、抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链。本发明还提供特异性结合VEGF蛋白的抗体，其中抗体、抗原结合片段具有加肽标签的重链，所述重链包含SEQ ID NO:21、23、25、27或29的氨基酸序列。本发明还提供与VEGF蛋白特异性结合(例如，人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠VEGF)的抗体，其中抗体包含具有本文表1中所列出任一个VH CDR的氨基酸序列的VH CDR。特别地，本发明提供与VEGF蛋白特异性结合的抗体，其中抗体包含具有本文表1中所列任意个VH CDR的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个VH CDR(或可选地，由其组成)。
本发明提供与VEGF蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含具有SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域。本发明还提供特异性结合VEGF蛋白的抗体，其中抗体、抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。本发明还提供与VEGF蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含具有本文表1中所列出任一个VL CDR的氨基酸序列的VL CDR。特别地，本发明提供与VEGF蛋白特异性结合的抗体，所述抗体包含具有本文表1中所列任意个VL CDR的氨基酸序列的一个、两个、三个或更多个VL CDR(或可选地，由其组成)。
本发明的又一些方面提供可以与本文所述的肽标签连接的额外蛋白质。在某些方面，该蛋白质是结合因子P、因子D、Epo、C5、TNFα、Il-1β、Il-17a、和/或FGFR2的抗体或抗原结合片段。在某些方面，该蛋白质可以是治疗性蛋白如***、胰岛素、人生长因子、白介素-10、补体因子H、CD35、CD46、CD55、CD59、补体因子I、补体受体1相关(CRRY)、神经生长因子、血管抑制素、色素上皮衍生因子、内皮抑素、睫状神经营养因子、补体因子1抑制剂、补体因子样1、补体因子I等。在其他方面，该蛋白质可以是受体如EPOR。表2、8和8b中提供可以与肽标签连接的蛋白质的额外例子。更具体地，该蛋白质可以是NVS70、NVS71、NVS72、NVS73、NVS74、NVS75、NVS76、NVS77、NVS78或NVS90。
其他本发明的蛋白质包括已经被突变，仍与表1、2、8b或9b中所述的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸。在一些实施方案中，它包括突变氨基酸序列，其中在表1、2、8b或9b中描述的序列中不多于1、2、3、4或5个氨基酸已经被突变。
本发明还提供编码本文所述的蛋白质分子的核酸序列。这些核酸序列可以针对哺乳动物细胞中的表达而优化。
核酸分子
本发明提供可以与本发明的肽标签连接的核酸。在某些方面，与肽标签连接的核酸可以是mRNA或RNAi活性剂、核酶或反义寡核苷酸。更具体地，与肽标签连接的RNAi活性剂可以是siRNA、shRNA、微RNA(即miRNA)、抗微RNA寡核苷酸、适配体等。在某些具体方面，核酸分子可以是适配体。特别地，适配体可以结合PDGF-BB。更具体地，核酸可以是NVS79。
表1加肽标签的抗VEGF分子和组分序列的例子：包括未加标签的抗VEGF分子(NVS4)、接头和肽标签。
表2：额外的加肽标签的分子(例如：NVS70T、NVS71T，NVS72T和NVS75T)、未加标签的分子(例如：NVS70、NVS71、NVS72和NVS75)和组分序列的例子。
表2b：眼蛋白序列
肽接头
在本发明的某些方面，蛋白质标签可以通过接头与分子连接。更具体地，蛋白质标签可以通过长度和/或氨基酸组成优化的肽接头(例如(Glyn-Sern)n或(Sern-Glyn)n接头)与蛋白质或核酸连接。已知肽接头长度可以极大影响连接的蛋白质怎样折叠和相互作用。关于接头取向和大小的例子，参见，例如，Hollinger等人,1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，和PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715，所述文献通过引用方式并入本文。
肽接头序列可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75个或更多个氨基酸残基长度。肽接头序列可以由天然存在或非天然存在的氨基酸组成。在一些方面，接头是甘氨酸聚合物。在一些方面，氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成接头序列内部的氨基酸。在某些方面，接头区域包含数组甘氨酸重复序列(GlySerGly3)n，其中n是等于或大于1的正整数。更具体地，接头序列可以是GlySerGlyGlyGly(SEQ ID NO:31)。可选地，接头序列可以是GlySerGlyGly(SEQ ID NO:124)。在某些其他方面，接头区域取向包含数组甘氨酸重复序列(SerGly3)n，其中n是等于或大于1的正整数。
肽接头还可以包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。氨基酸残基Glu和Lys可以间插于Gly-Ser肽接头内部用于更好地溶解。在某些方面，肽接头可以包括(Gly3Ser)、(Gly2Ser)或(GlySer)的多个重复序列。在某些方面，肽接头可以包括(SerGly3)、(SerGly2)或(SerGly)的多个重复序列。在其他方面，肽接头可以包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)的组合和重复。在另外其他方面，可以将Ser替换为Ala，例如，(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另外其他方面，接头包含基序(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n是等于或大于1的正整数。在某些方面，肽接头还可以包括可切割接头。
肽接头可以是多种长度。特别地，肽接头具有约5个至约50个氨基酸长度；约10个至约40个氨基酸长度；约15个至约30个氨基酸长度；或约15个至约20个氨基酸长度。肽接头长度的变动可以保留或增强活性，导致活性研究中的优越效力。可以使用本领域已知的技术，向多肽和蛋白质序列引入肽接头。例如，可以使用PCR诱变。可以通过DNA序列分析证实修饰。质粒DNA可以用来转化宿主细胞以稳定生产所产生的多肽。
肽接头、肽标签和蛋白质(例如：抗体或抗原结合片段)或核酸或其组合，可以在相同载体中编码并在相同宿主细胞中表达及装配。可选地，肽接头、蛋白质标签和蛋白质或核酸各自可以独立生成并且随后彼此缀合。可以通过使用本领域已知的方法缀合构成组分制备肽接头、肽标签和蛋白质或核酸。可以使用分选酶介导的酶促缀合，实现位点特异性缀合(Mao H,Hart SA,Schink A,Pollok BA.J Am Chem Soc.2004 Mar10；126(9):2670-1)。多种偶联剂或交联剂可以用于共价缀合。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、和磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人,1985 Proc Natl Acad Sci USA82:8648)。其他方法包括在Paulus,1985 Behring Ins.No.78,118-132；Brennan等人,1985 Science 229:81-83)和Glennie等人,1987 J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些方法。偶联剂是SATA和磺基-SMCC，二者均从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)可获得。
半衰期延长的工程化和修饰的分子
产生加肽标签的分子
本发明提供可以与其他分子例如其他蛋白质或核酸重组融合(即：连接)或化学缀合(包括共价和非共价缀合)的肽标签。在某些方面一个，两个，三个，四个或更多个肽标签可以与蛋白质或核酸重组融合、连接或化学缀合。在某些方面，肽标签结合HA。在其他方面，肽标签结合HA并且包含LINK结构域。在其他方面，肽标签结合HA并且包含TSG-6 LINK结构域。更具体地，构思了肽标签可以是HA10(SEQ ID NO:32)、HA10.1(SEQID NO:33)、HA10.2(SEQ ID NO:34)、HA11(SEQ ID NO:35)或HA11.1(SEQ ID NO:36)。此外，蛋白质可以是本文所述的任何蛋白质、抗体或抗原结合片段，包括但不限于如上文和表1、2、2b、8b和9b中以及US 20120014958、WO 2012015608、WO 2012149246、US8273352、WO1998045331、US 2012100153和WO 2002016436所述的蛋白质、抗体和抗原结合片段。
在某些具体方面，本发明提供包含抗体或抗原结合片段和肽标签的加肽标签分子。特别地，本发明提供加肽标签的分子，所述分子包含本文所述抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、(Fab’)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和肽标签。用于将蛋白质、多肽或肽与抗体或抗原结合片段连接、融合或缀合的方法是本领域已知的并且可以使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术进行。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-5600和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341；Hermanson(2008)Bioconjugate Techniques(第2版)Elsevier,Inc。
可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)的技术产生其他融合蛋白。可利用DNA改组来改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段)和/或改变肽标签或蛋白质的活性(例如，亲和力较高和解离速率较低的肽标签和/或蛋白质)。一般参见美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等,1997,Curr.OpinionBiotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313；(Wittrup,2001)(Levin和Weiss,2006)。可在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸***或其他方法进行随机诱变来改变抗体或其片段，或编码的抗体或其片段。编码特异性结合眼中治疗性靶标(例如蛋白VEGF)的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或多种异源分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、结构域、片段等和/或结合HA的肽标签重组。
此外，可将抗体或抗原结合片段和/或肽标签融合到标记序列(如肽)以便于纯化。例如，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)中提供的标志物等，其中许多是市售的。如Gentz等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述，例如，六组氨酸为纯化融合蛋白提供了便利。可用于纯化的其他标签包括但不限于对应于衍生自流行性感冒乙酰透明质酸蛋白质的表位(Wilson等,1984,Cell 37:767)的乙酰透明质酸标签和“flag”标签。
在其他实施方案中，抗体或抗原结合片段和/或肽标签可以与诊断剂或检测剂缀合。此类抗体和/或肽标签可作为临床测试程序的一部分(如测定特定疗法的功效)，用于对疾病或病症的起始、发展、进展和/或严重性进行监测或预后。可通过将抗体与可检测物质偶联来实现这种诊断和检测，该可检测物质包括但不限于多种酶，如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，如但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，如但不限于鲁米诺；生物发光物质，如但不限于荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；放射性物质，如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In,)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；及使用多种正电子发射断层术的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。
抗体或抗原结合片段以及肽标签也可附着到固相支持物上，该固相支持物尤其用于靶抗原的免疫测定或纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定法(例如生长抑制)或Western印迹测定法证实肽标签或加肽标签的分子与其特定靶的结合。通过使用针对目的蛋白质-配体复合物特异的标记试剂(例如抗体)，这些测定法的每一种通常检测目的复合物的存在。
与肽标签连接的抗VEGF抗体和抗原结合片段
本发明也提供肽标签，所述肽标签与抗VEGF抗体或抗原结合片段连接，因而延长抗VEGF抗体或抗原结合片段的眼半衰期。
在某些方面，肽标签是与抗VEGF抗体连接的结合HA的肽标签。在一个方面，加肽标签的分子包含以小于或等于9.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于8.0μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于7.2μM的KD结合HA。在一个方面，肽标签以小于或等于5.5μM的KD结合HA。结合HA的肽标签可以是LINK结构域、TSG-6LINK结构域或具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的特定肽标签。在某些方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3的序列的重链CDR。在其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:11、12和13的序列的轻链CDR。更具体地，肽标签与结合VEGF的抗体体或抗原结合片段连接，所述抗体体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3的序列的重链CDR和分别具有SEQ ID NO:11、12和13的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:7的序列的可变重链。在另外其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或其抗原结合片段连接，所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:17的序列的可变轻链。在其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:7和17的序列的可变重链和可变轻链。在另外其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:9的序列的重链。在另外其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:19的序列的轻链。在其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:9和29的序列的重链和轻链。在其他方面，肽标签与结合VEGF的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:9和29的序列的重链和轻链。更具体地，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:21、23、25、27或29的序列。在其他具体方面中，与肽标签连接的结合VEGF的抗体或抗原结合片段，具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ IDNO:21和19的序列；分别具有SEQ ID NO:23和19的序列；分别具有SEQ ID NO:25和19的序列；分别具有SEQ ID NO:27和19的序列；分别具有SEQ ID NO:29和19的序列；分别具有SEQ ID NO:163和164的序列。在另外其他方面，与肽标签连接的结合VEGF的抗原结合片段是具有SEQ ID NO:166的序列的scFv。
在某些方面，结合VEGF的抗体体或抗原结合片段可以具有与轻链、重链连接的肽标签和/或在一条链或两条链上具有多个标签，其中所述抗体体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3的序列的重链CDR和分别具有SEQ ID NO:11、12和13的序列的轻链CDR。更具体地，加肽标签的结合VEGF的抗体或抗原结合片段可以具有重链和轻链，所述重链和轻链分别具有SEQ ID NO:173和174的序列；分别具有SEQ ID NO:175和176的序列；分别具有SEQ ID NO:177和178的序列；分别具有SEQ ID NO:179和180的序列；分别具有SEQ ID NO:181和182的序列。
构思了具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签可以连接至雷珠单抗(Ferrara等人,2006)、贝伐单抗(Ferrara等人,2004)、MP0112(Campochiaro等人，2013)、KH902(Zhang等人,2008)或阿柏西普(Stewart等人,2012)。
与肽标签连接的其他抗体或抗原结合片段
本发明也提供了包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签，所述肽标签待与结合C5、因子P、EPO、因子D、TNFα、或IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，因而延长抗体或抗原结合片段的眼半衰期。在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:37、38和39的序列的重链CDR。在其他方面，该肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:46、47和48的序列的轻链CDR。更具体地，该肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:37、38和39的序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:46、47和48的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:40的序列的可变重链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:49的序列的可变轻链CDR。在其他方面，肽标签与结合C5的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:40和49的序列的可变重链和可变轻链。在某些方面，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:44的序列。更具体地，与肽标签连接的结合C5的抗体或抗原结合片段具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:44和51的序列。
在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:75、76和77的序列的重链CDR。在其他方面，该肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:86、87和88的序列的轻链CDR。更具体地，该肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:75、76和77的序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:86、87和88的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:81的序列的可变重链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:92的序列的可变轻链CDR。在其他方面，肽标签与结合Epo的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:81和92的序列的可变重链和可变轻链。在某些方面，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:85的序列。更具体地，与肽标签连接的结合Epo的抗体或抗原结合片段具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:85和95的序列。
在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:53、54和55的序列的重链CDR。在其他方面，该肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:65、66和67的序列的轻链CDR。更具体地，该肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:53、54和55的序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:65、66和67的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:59的序列的可变重链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:71的序列的可变轻链CDR。在其他方面，肽标签与结合因子P的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:59和71的序列的可变重链和可变轻链。在某些方面，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:63的序列。更具体地，与肽标签连接的结合因子P的抗体或抗原结合片段具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:63和73的序列。
在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:108、109和110的序列的重链CDR。在其他方面，该肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:117、118和119的序列的轻链CDR。更具体地，该肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:108、109和110的序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:117、118和119的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:111的序列的可变重链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:120的序列的可变轻链CDR。在其他方面，肽标签与结合TNFα的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:111和120的序列的可变重链和可变轻链。在某些方面，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:113的序列。更具体地，与肽标签连接的结合TNFα的抗体或抗原结合片段具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ IDNO:115和122的序列。
在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段(例如：如Fab)连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:189、190和191的序列的重链CDR。在其他方面，该肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:198、199和200的序列的轻链CDR。更具体地，该肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:189、190和191的序列的重链CDR和具有SEQ ID NO:198、199和200的序列的轻链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:193的序列的可变重链CDR。在另外其他方面，肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:201的序列的可变轻链CDR。在其他方面，肽标签与结合IL-1β的抗体或抗原结合片段连接，所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:193和201的序列的可变重链和可变轻链。在某些方面，与肽标签连接的重链可以具有SEQ ID NO:194的序列。更具体地，与肽标签连接的结合IL-1β的抗体或抗原结合片段具有加肽标签的重链和轻链，所述加肽标签的重链和轻链分别具有SEQ IDNO:196和202的序列。
在某些方面，具有SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列的肽标签与如WO 2010/015608或WO 2012/149246中所述并且通过引用方式并入本文的结合C5、Epo或因子P的抗体或抗原结合片段连接。
同源蛋白质
本发明也提供与本文所述的序列同源的蛋白质和肽标签。更具体地，本发明提供包含与表1、2、8、8b、9和9b中所述的序列同源的氨基酸序列的蛋白质，并且蛋白质或肽标签与相应的眼部靶结合并且保留在表1、2、8、8b、9、9b和实施例中所述的那些蛋白质和肽标签的所需功能特性。
例如，本发明提供与本文所述的序列同源的抗VEGF抗体或抗原结合片段和肽标签。更具体地，本发明提供包含重链可变结构域和轻链可变结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含与SEQ IDNO:7的氨基酸序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；并且所述抗体与VEGF特异性结合。在本发明的某些方面，重链和轻链序列还包含如Kabat所定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别为SEQ ID NO:1、2、3、11、12和13。在本发明的某些其他方面，重链和轻链序列还包含如chothia所定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别为SEQ IDNO:4、5、6、14、15和16。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与表1和表2中所述的序列相同大于或等于80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以是相同的，除了不多于1、2、3、4或5个氨基酸位置中的氨基酸置换。可以通过以下方式获得具有与表1和表2中所述的那些抗体的VH区和VL区具备<100％同一性的VH区和VL区的抗体：诱变(例如，位点定向诱变或PCR介导诱变)在表1和表2中所述的核酸分子(例如，分别编码SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17的核酸分子)，随后使用本文中和US 20120014958中所述的功能测定法对编码的已改变的抗体检验保留的功能。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与表1和表2中所述的序列相同大于或等于80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可以通过以下方式获得具有与表1和表2中所述的重链和轻链(例如：SEQ ID NO:9、21、23、25、17或29任一者的重链和SEQ ID NO:19的轻链)具备高(即，80％或更高)同一性的重链和轻链的抗体：诱变(例如，位点定向诱变或PCR介导诱变)编码这类多肽的核酸分子，随后使用本文所述的功能测定法对编码的已改变的抗体检验保留的功能。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以与表1和表2中所述的序列相同大于或等于80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在其他实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区核苷酸序列可以与表1和表2中所述的序列相同大于或等于80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。构思了变异性可以存在于CDR或构架区中。
此外，本发明还提供了包含与表1中所述序列同源的氨基酸序列的肽标签，并且肽标签与HA结合并且保留本文所述的那些肽标签的所需功能特征。更具体地，肽标签的氨基酸序列可以与表1中所述序列相同大于或等于80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％并且保留本文所述的那些肽标签的所需功能特征。
如本文所用，考虑到需要为最佳比对这两个序列而导入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性等于相同位置数/位置总数x 100)。可以使用如下文非限制性实施例中所述的数学算法，完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。
额外地或可选地，可以进一步使用本发明的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，以例如鉴定相关序列。例如，可以使用Altschul等人,1990 J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(2.0版)执行此类检索。
具有保守修饰的蛋白质
本发明的范围内还包括具有保守修饰的分离的肽标签和加肽标签的分子。更具体地，本发明涉及相对于表1的肽标签和加肽标签的分子具有保守修饰的肽标签和加肽标签的分子。本发明的范围内还包括具有保守修饰的分离的抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，本发明加肽标签的抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列的一个或多个序列具有基于本文所述的抗体或其保守修饰物的指定氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的抗体的所需功能特性。例如，本发明提供与结合VEGF的分离的抗体或其抗原结合片段连接的肽标签，所述抗体或其抗原结合片段由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2、和CDR3序列的轻链可变区组成，其中重链可变区CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO:1及其保守修饰物；重链可变区CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO:2及其保守修饰物；重链可变区CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO:3及其保守修饰物；轻链可变区CDR1氨基酸序列是SEQ ID NO:11及其保守修饰物；轻链可变区CDR2氨基酸序列是SEQ ID NO:12及其保守修饰物；轻链可变区CDR3氨基酸序列是SEQ ID NO:13及其保守修饰物；并且抗体或其抗原结合片段与VEGF特异性结合。
在其他实施方案中，本发明的抗体针对哺乳动物细胞中的表达而优化并且具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列的一个或多个序列具有基于本文所述的抗体或其保守修饰物的指定氨基酸序列，并且其中抗体保留本发明结合VEGF的抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种为哺乳动物细胞中表达而优化的分离的抗体，所述分离的抗体包含例如可变重链和可变轻链，其中可变重链包含SEQ ID NO:7及其保守修饰物的氨基酸序列；并且可变轻链包含SEQ ID NO:17及其保守修饰物的氨基酸序列；并且抗体与VEGF特异性结合。本发明还提供一种与肽标签连接并且为哺乳动物细胞中表达而优化的分离的抗体，所述分离的抗体包含例如可变重链和可变轻链以及肽标签，其中可变重链包含SEQ ID NO:7及其保守修饰物的氨基酸序列；并且可变轻链包含SEQ ID NO:17及其保守修饰物的氨基酸序列；并且肽标签包含选自SEQ ID NO:32、33、34、35和36的氨基酸序列，并且抗体与VEGF特异性结合以及肽标签与HA特异性结合。本发明提供一种为哺乳动物细胞中表达而优化的分离的抗体，由重链和轻链及肽接头及肽标签组成，其中重链包含SEQ ID NO:9及其保守修饰物的氨基酸序列；并且轻链包含SEQ ID NO:19及其保守修饰物的氨基酸序列；并且肽标签包含选自SEQ ID NO:32、33、34、35和36的氨基酸序列；并且抗体与VEGF特异性结合以及肽标签与HA特异性结合。更具体地，本发明提供与肽标签连接的分离的抗体或其抗原结合片段，其中连接的抗体或片段为哺乳动物细胞中的表达而优化，由重链和轻链组成，所述重链具有选自SEQ ID NO:21、23、25、27和29及其保守修饰物的氨基酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列；并且分离的抗体与VEGF特异性结合以及肽标签与HA特异性结合。
产生本发明抗体及标签的方法
编码抗体及肽标签的核酸
本发明提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码本文所述的肽标签和/或加肽标签的分子。在某些方面，本发明提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码加肽标签的蛋白质，例如，表1、2、2b、8b和9b所述的加肽标签的蛋白质。更具体地，本发明提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36、NVS37、NVS70、NVS70T、NVS71、NVS71T、NVS72、NVS72T、NVS72、NVS73T、NVS74、NVS74T、NVS75、NVS75T、NVS76、NVS76T、NVS77、NVS77T、NVS78、NVS78T、NVS79、NVS79T、NVS80、NVS80T、NVS81、NVS81T、NVS82、NVS82T、NVS83、NVS83T、NVS84、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h或NVS1j。本发明中还提供编码至少一种肽标签的核酸分子，所述肽标签具有SEQ ID NO:32、33、34、35和/或36的肽序列。更具体地，例如，编码肽标签的核苷酸序列可以包括SEQID NO:102、103、104、105和/或106的核苷酸序列。
本发明提供基本上纯化的核酸分子，所述核酸分子编码本文所述的蛋白质，例如，上文描述的包含抗VEGF、抗EPO、抗C5、抗因子P、抗TNFα或抗IL-1β抗体或抗原结合片段、肽标签和/或加肽标签的分子的蛋白质。更具体地，本发明的一些核酸包含编码SEQ ID NO:7中所示的重链可变区的核苷酸序列，和/或编码SEQ ID NO:17中所示的轻链可变区的核苷酸序列。在某些具体实施方案中，核酸分子是表1或表2中鉴定的那些。本发明的一些其他核酸分子包含与表1或表2中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本上相同(例如，至少65％、80％、95％或99％)的核苷酸序列。从适宜的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示靶抗原结合能力，例如，抗VEGF、抗EPO、抗C5、抗因子P、抗TNFα或抗IL-1β抗原结合能力。
本发明还提供这样的多核苷酸，该多核苷酸编码来自上文所示的抗体的重链或轻链的至少一个CDR区且通常为全部三个CDR区。一些其他多核苷酸编码上文所示的抗体的重链和/或轻链的全部或基本上全部可变区序列。由于密码子的简并性，多种核酸序列可以编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
本发明的核酸分子可以同时编码抗体的可变区和恒定区。本发明的一些核酸序列包含编码修饰的重链序列的核苷酸，所述修饰的重链序列与原始重链序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)(例如：与NVS4的重链基本上相同)。一些其他核酸序列包含编码修饰的轻链序列的核苷酸，所述修饰的轻链序列与原始轻链序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)(例如：与NVS4的轻链基本上相同)。
可通过从头固相DNA合成或通过编码VEGF抗体或其结合片段的现有序列(例如下文实施例中所述的序列)的PCR诱变来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法实现核酸的直接化学合成，如Narang等,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等,Tetra.Lett.,22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固相支持物法。可按例如PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications,Innis等(编辑),Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等,Nucleic Acids Res.19:967,1991；和Eckert等,PCRMethods and Applications 1:17,1991中所述进行通过PCR向多核苷酸序列中引入突变。
本发明中还提供用于产生上文描述的肽标签、蛋白质、抗体或抗原结合片段或加肽标签的分子(例如本文所述的加肽标签的抗体或抗原结合片段)的表达载体和宿主细胞。更具体地，本发明提供包含核酸的表达载体，所述核酸编码具有SEQ ID NO:32、33、34、35和/或36的序列的肽标签，或可选地，包含核酸的表达载体，所述核酸编码如本文所述的加肽标签的分子。在某些方面，表达载体包含核酸，所述核酸编码在表1、2、8或9中描述的任一种加肽标签的分子，例如NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36、NVS37、NVS70、NVS70T、NVS71、NVS71T、NVS72、NVS72T、NVS72、NVS73T、NVS74、NVS74T、NVS75、NVS75T、NVS76、NVS76T、NVS77、NVS77T、NVS78、NVS78T、NVS79、NVS79T、NVS80、NVS80T、NVS81、NVS81T、NVS82、NVS82T、NVS83、NVS83T、NVS84、NVS84T、NVS1b、NVS1c、NVS1d、NVS1e、NVS1f、NVS1g、NVS1h或NVS1j。
可用多种表达载体来表达编码肽标签、蛋白质、抗体链或抗原结合片段或加肽标签的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体和非病毒表达载体都可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和***包括质粒、游离型载体(通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人工染色体(参见例如，Harrington等,Nat Genet 15:345,1997)。例如，用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达肽标签或VEGF多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体及本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、***瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参见，Brent等,supra；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；和Rosenfeld等,Cell 68:143,1992。
用于产生病毒载体的方法是本领域熟知的并且将允许技术人员产生本发明的病毒载体(参见，例如，美国专利号7,465,583)。
表达载体的选择依赖于将在其中表达该载体的预期宿主细胞。通常，该表达载体含有有效连接编码抗体链或片段、肽标签或加肽标签抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些实施方案中，用诱导型启动子来防止***序列除了在诱导条件下之外的表达。诱导型启动子包括，例如***糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可在非诱导条件下扩大转化生物的培养，而不偏向编码序列的群体，该编码序列的表达产物能更好地由宿主细胞耐受。除启动子外，还可要求或希望将其他调节元件用于抗体链或片段、肽标签或加肽标签抗体链或片段的有效表达。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外，可通过包括适合于所使用的细胞***的增强子来增强表达的效率(参见例如，Scharf等,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；和Bittner等,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体也可提供分泌信号序列，其被定位为与所***的肽标签、抗体或加肽标签的抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更经常地，在包括进入载体之前，将该***的序列与信号序列连接。待用于接受编码抗体轻链和重链可变结构域或加肽标签抗体结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白，由此导致完整抗体或抗原结合片段的产生。通常，此类恒定区是人的恒定区。
用于包含并表达肽标签、抗体链或加肽标签的分子(例如：加肽标签的抗体或抗原结合片段)的的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明的多核苷酸的一种原核宿主。适于使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常含有与该宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任意数目的多种众所周知的启动子，如乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***，或来自λ噬菌体的启动子***。该启动子通常可选地与操纵子序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于起始并完成转录和翻译。其他微生物，如酵母，也可以用来表达本发明的抗体或加肽标签的分子(例如：加肽标签的抗体或抗原结合片段)或肽标签。也可将昆虫细胞与杆状病毒载体组合使用。
在一些优选实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的本文所述的肽标签、加肽标签的分子和/或未加标签的分子(例如加肽标签的抗体或抗原结合片段)。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或包含外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如下文示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任意正常死亡的或正常或非正常永生的动物细胞或人细胞。例如，已经发展了能够分泌完整免疫球蛋白的大量适宜的宿主细胞系是本领域技术人员已知的，并且包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞和杂交瘤。一般在例如Winnacker,FROM GENESTO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论了哺乳动物组织细胞培养物在表达多肽中的用途。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如，Queen等,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。适宜的启动子可以是组成型的、细胞类型特异型的、阶段特异型的、和/或可调整的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、***诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook,等，上文)。其他方法包括，例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物射弹方法、病毒颗粒、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell 88:223,1997)、DNA的活性剂增强摄取和离体转导。对于重组蛋白质的长期、高产率产生，通常将希望稳定表达。例如，可用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体来制备稳定表达肽标签、抗体链或抗原结合片段，或加肽标签的抗体链或抗原结合片段的细胞系。引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达所引入的序列的细胞在选择性培养基中生长。可以用适于该细胞类型的组织培养技术增殖具有抗性的稳定转染的细胞。本发明还提供用于产生本文所述的肽标签和/或加肽标签的分子的方法，其中在产生一个或多个肽标签和/或加肽标签的分子的适宜条件下培养能够产生如本文所述的肽标签或加肽标签的分子的宿主细胞。该方法还可以包括分离本发明的肽标签和/或加肽标签的分子。
含有编码本发明肽标签、蛋白质和/或抗体或抗原结合片段肽标签的核酸序列的表达载体可以用于递送基因至眼。在本发明的某些方面，表达载体编码与一个或多个本发明的肽标签连接的抗体并且适于递送至眼。在本发明的其他方面，抗体或抗原结合片段和肽标签在适于递送至眼的一种或多种表达载体中编码。用于递送基因产物至眼的方法是本领域已知的(参见，例如，US 05/0220768)。
单克隆抗体的产生
可通过多种技术来产生单克隆抗体(mAb)，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,1975 Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。可利用产生单克隆抗体的许多技术，例如，B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。例如，在本文实施例中并在WO 20120014958中描述了产生本发明抗VEGF抗体或抗原结合片段的方法。
用于制备杂交瘤的动物***是鼠、大鼠和兔***。小鼠中杂交瘤的产生是完善的方法。分离经免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可在按上文所述制备的鼠单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合抗体或人源化抗体。可用标准分子生物学技术从目的鼠杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并进行改造以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(参见例如，Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可用本领域已知的方法将鼠CDR区***人构架中。参见例如，Winter的美国专利号5225539和Queen等的美国专利号5530101、5585089、5693762和6180370。
在某实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可用携带人免疫***的部分而非小鼠***的转基因或转染色体小鼠产生抗VEGF的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在此处统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及失活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如，Lonberg,等,1994Nature 368(6474):856-859)。因此，该小鼠显示降低表达的小鼠IgM或κ，并且响应免疫时，所引入的人重链和轻链转基因经历种类转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等,1994上文；综述于Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13:65-93；及Harding,F.和Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546中)。HuMAb小鼠的制备和用途以及该小鼠所携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等,1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等,1993 InternationalImmunology 5:647-656；Tuaillon等,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724；Choi等,1993Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等,1993EMBO J.12:821-830；Tuaillon等,1994J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等,1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等,1996 Nature Biotechnology 14:845-851中，所有参考文献的内容在此以其整体明确引入作为参考。进一步参见均为Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等的美国专利号5,545,807；均为Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；及Korman等的PCT公开号WO 01/14424。
在另一实施方案中，可用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生本发明的人抗体。Ishida等的PCT公开WO 02/43478中详细描述了本文称为“KM小鼠”的此类小鼠。
另外，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物***在本领域中可得，并可用于制备本发明的抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的备选转基因***。例如Kucherlapati等的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963中描述了此类小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物***在本领域中可得，并可用于制备本发明的VEGF抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体二者的小鼠；Tomizuka等,2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中描述了此类小鼠。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛在本领域中已有描述(Kuroiwa等,2002 NatureBiotechnology 20:889-894)，并可用于制备本发明的VEGF抗体。
也可用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示法制备本发明的人单克隆抗体。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示法。参见例如：Ladner等的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；及Griffiths等的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。
也可用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，在该SCID小鼠中，已经重构了人免疫细胞，使得可在免疫后产生人抗体应答。例如Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。
改造改变的蛋白质和肽标签的方法
如上文讨论，本文中显示的肽标签、蛋白质、抗体和抗原结合片段可以用来通过修饰描述的氨基酸序列，产生新的肽标签、蛋白质、抗体和抗原结合片段。因此，在本发明的另一个方面，本发明加肽标签的抗体的结构特征用来产生结构上相关的加肽标签的抗体，所述抗体保留本发明加肽标签的抗体的至少一种功能特性，例如，与人VEGF结合并且还抑制VEGF的一个或多个功能特征(例如，抑制VEGF与VEGF受体结合)。
例如，本发明的抗体的一个或多个CDR区或其突变物可与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生上文讨论的本发明的其他重组改造的抗体。其他类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际制备(即表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，将序列中包含的信息用作起始材料来产生衍生自初始序列的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列并将其表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种用于制备加肽标签的抗VEGF抗体或抗原结合片段的方法，所述加肽标签的抗VEGF抗体或抗原结合片段由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成，所述重链可变区抗体序列具有SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:2的CDR2序列和/或SEQ ID NO:3的CDR3序列；所述轻链可变区抗体序列具有SEQ ID NO:11的CDR1序列、SEQ ID NO:12的CDR2序列和/或SEQ IDNO:13的CDR3序列；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内部的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并且将改变的抗体序列作为蛋白质表达。
也可通过筛选抗体文库来制备该改变的抗体序列，该抗体文库具有如US20050255552中描述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇以及CDR1和CDR2序列上的多样性。可按照适合于从抗体文库中筛选抗体的任意筛选技术(如噬菌体展示技术)进行筛选。
标准分子生物学技术可以用来制备并表达改变的肽标签或加肽标签的分子序列。由改变的序列编码的肽标签或加肽标签的分子是这样的肽标签或加肽标签的分子，它们保留肽标签或加肽标签的分子(例如本文所述的蛋白质或加肽标签的抗体，如NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36或NVS37)的一个、一些或全部功能特性。
在改造本发明抗体或肽标签的方法的某些实施方案中，可以随机地或选择性地引入突变，连同全部或部分的VEGF抗体编码序列或肽标签，并且可以对所得到的修饰的VEGF抗体或肽标签筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能特性。已经在本领域描述了突变方法。例如，PCT公开WO02/092780简短描述了用于使用饱和诱变法、合成连接装配法或其组合产生并筛选抗体突变物的方法。可选地，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法优化抗体物理化学特性的方法。
在本发明的某些实施方案中，抗体和肽标签可以改造以移除脱酰胺化位点。已知的脱酰胺化在肽或蛋白质中造成结构性和功能性改变。脱酰胺化可以导致降低的生物活性，以及蛋白质药物药代动力学和抗原性的改变。(Anal Chem.2005 Mar 1；77(5):1432-9)。在本发明的某些其他方面，抗体和肽标签可以被改造以添加或移除蛋白酶切割位点。表4和实施例中描述肽标签修饰的例子。
可以使用本领域可获得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中所述的那些评估改变的抗体的功能特性。
其他抗体形式
驼类抗体
从骆驼和单峰驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelusdromaderius))家族的成员，包括新世界成员如美洲驼物种(驼羊(Lamapaccos)、大羊驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna))中获得的抗体蛋白质已经在关于大小、结构复杂性和对人个体的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于来自其他动物的抗体的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO 94/04678)。
可通过遗传改造获得鉴定为VHH的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域，以产生对靶具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的抗体衍生蛋白质，称为“骆驼纳米抗体”。参见1998年6月2日授权的美国专利号5,759,808；还参见Stijlemans,B.等,2004 J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等,2003 Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等2002 Int JCancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等1998 EMBO J 17:3512-3520。例如从Ablynx,Ghent,比利时可购得骆驼抗体和抗原结合片段的改造文库。如同非人来源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列来获得与人序列更像的序列，即纳米抗体可以进行“人源化”。
骆驼纳米抗体具有人IgG分子的分子量的大概十分之一的分子量，并且该蛋白质物理直径仅几纳米。小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体结合对更大的抗体蛋白质而言在功能上不可见的抗原部位，即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的检测试剂，并可能用作治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制与靶蛋白质的沟或窄缝中的特性异部位的结合，并因而可具有这样的能力，其比经典抗体更像经典的低分子量药物的功能。
低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且抗原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环***转移到组织。纳米抗体可进一步便于药物运输跨过血脑屏障。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。另外，这些分子可在原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)中充分表达，并用噬菌体表达为融合蛋白，且是有功能的。
因此，本发明的一个特征是一种例如对VEGF具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体天然地在骆驼动物中产生，即，在使用本文对其他抗体所述的技术用VEGF或其肽片段免疫之后由骆驼产生。可选地，使用淘洗法以适宜的靶从展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白的噬菌体文库，将骆驼纳米抗体改造(即，例如通过选择过程)。还可以通过基因工程定制改造的纳米抗体。骆驼纳米抗体可以与如本文所述的肽标签连接以相对未加标签的骆驼纳米抗体，延长平均停留时间、提高药物终浓度和/或增加给药间隔时间。在一个具体方面，通过将本发明的人抗体重链或轻链的CDR序列移植入纳米抗体或单结构域抗体构架序列，获得骆驼抗体或纳米抗体，如PCT/EP 93/02214中所述。
双特异性分子和多价抗体
在另一个方面，本发明特征在于包含本发明肽标签的双特异性或多特异性分子。更具体地，构思了本发明特征在于包含肽标签和多于一种蛋白质和/或核酸分子的双特异性或多特异性分子。例如，多特异性分子可以包含本发明的肽标签、抗体或其抗原结合片段和核酸分子。
本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生为或连接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体))，以产生结合至少两个不同结合部位或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体可实际上衍生为或连接至超过一种其他功能分子，以产生结合多于两个不同结合部位和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在为本文所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，如另一抗体、抗原结合片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本发明包括含有至少一种对VEGF的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。例如，该第二靶表位是VEGF的不同于该第一靶表位的另一表位。可选地，第二靶表位是另一种眼分子的表位。可选地，第二靶表位是HA的表位。
此外，对于其中双特异性分子是多特异性分子的发明，除第一和第二靶表位外，该分子可进一步包括第三结合特异性。可选地，第二靶表位是另一种眼分子的表位。
在一个实施方案中，双特异性分子包含至少一种抗体或其抗原结合片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。该抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任意最小片段，如Ladner等的美国专利号4,946,778中所述的Fv或单链构建体。
双抗体是二价、双特异性分子，其中VH和VL结构域表达在单条多肽链上，通过太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头连接。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合部位(参见例如Holliger等,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等,1994 Structure 2:1121-1123)。双抗体可以通过在同一细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链来产生。它们中的大多数可以在细菌中以可溶形式表达。通过用约15个氨基酸残基的接头连接两条形成双抗体的多肽链来产生单链双抗体(scDb)(参见Holliger和Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4):128-30；Wu等,1996Immunotechnology,2(1):21-36)。scDb可以在细菌中以可溶、活性单体形式表达(参见Holliger和Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34):128-30；Wu等,1996Immunotechnology,2(1):21-36；Pluckthun和Pack,1997 Immunotechnology,3(2):83-105；Ridgway等,1996 ProteinEng.,9(7):617-21)。双抗体可以与Fc融合产生“双-双抗体”(参见Lu等,2004 J.Biol.Chem.,279(4):2856-65)。
其他可以用于本发明的双特异性分子的抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可使用本领域已知的方法，通过缀合组成结合特异性来制备双特异性分子。例如，可分开产生双特异性分子的每一结合特异性，然后相互缀合。在该结合特异性是蛋白质或肽时，可用多种偶联剂或交联剂来进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等,1984 J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等,1985 Science 229:81-83)；及Glennie等,1987 J.Immunol.139:2367-2375)中所述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
在该结合特异性是抗体时，它们可通过两条重链的C端铰链区的巯基成键而缀合。在具体实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，例如1个。
备选地，两种结合特异性可在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达和装配。在双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2、配体x Fab、肽标签x mAb、肽标签x Fab融合蛋白时，该方法尤其有用。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。例如在美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述了用于制备双特异性分子的方法。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或Western印迹测定来验证双特异性或多价分子与其特异性靶标的结合。这些测定法中的每一种一般通过利用对目的复合物特异的标记试剂(例如抗体)来检测特别重要的蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一个方面，本发明提供包含与VEGF结合的本发明抗体的至少两个相同或不同抗原结合部分的多价分子。在又一个方面，本发明提供包含与HA结合的本发明肽标签的至少两个相同或不同抗原结合部分的多价化合物。该抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接在一起。备选地，已针对多特异性分子描述了连接方法。例如通过将本发明的抗体的抗体与结合本发明抗体的恒定区(例如Fc或铰链区)的抗体交联来获得四价化合物。
例如在Borean的专利EP 1 012 280B1中描述了三聚化结构域。例如在PCT/EP97/05897中描述了五聚化模块。
预防性用途和治疗性用途
许多眼病，尤其例如视网膜血管病，用需要每周一次、每二周一次或每月一次玻璃体内注射的疗法治疗。治疗的方法和频率为医生和患者带来明显的健康护理负担。此外患者还存在与频繁玻璃体内注射相关的显著风险，原因是因玻璃体内注射所致的眼内炎和眼内压风险。在某些情况下，如青光眼，这些疗法施用有难度并且临床上并未例行使用。因此，施用每季度一次或更低频率给药的疗法的能力将提供最佳的视力结果改善，同时减少与频繁玻璃体内注射相关的治疗负担和风险。
视网膜疾病，包括新生血管性(wet)AMD、糖尿病性视网膜病变和视网膜静脉闭塞，具有导致视力减退的生血管组分。临床试验已经显示，可以采用每月一次玻璃体内注射眼用生物制品疗法例如抗VEGF疗法如雷珠单抗或贝伐单抗或每两月一次用阿柏西普治疗，有效地治疗这些疾病。尽管这些疗法有效，但每月一次或每两月一次治疗是患者和医师的明显健康护理负担(Oishi等人,(2011)。因此经常需要这样的眼疗法，所述眼疗法可以频率较低地递送，但仍然提供与每月一次或每两月一次治疗相同的治疗益处。抗VEGF疗法总体上安全并由大部分患者良好耐受，但是存在因玻璃体内手术所致的轻微眼内炎风险(Day等人,2011)。最近的临床数据显示，可能存在采用贝伐单抗时非眼不良事件增加的趋势，贝伐单抗是与雷珠单抗(一种抗原结合片段(例如，Fab))相比而言的全长IgG。与雷珠单抗相比，贝伐单抗的全身性不良事件的主要差异和潜在原因是较高的贝伐单抗全身暴露，这伴随对循环中的VEGF的抑制作用更高(Comparison ofAge-related Macular Degeneration Treatments Trials(CATT)ResearchGroup,Martin DF,Maguire MG,Fine SL,Ying GS,Jaffe GJ,GrunwaldJE,Toth C,Redford M,Ferris FL 3rd.Ophthalmology.2012Jul；119(7):1388-98)。因此，可以更低频率施用的抗VEGF疗法将具有因玻璃体内手术次数降低和VEGF的较低全身性抑制作用所致的安全益处。
在关键性MARINA试验(Rosenfeld等人,2006)中，每月一次注射雷珠单抗导致最佳校正视敏度(BCVA)改善10-15个字母，而未接受治疗的患者丧失平均约10个字母视力。wet AMD患者中的后续研究评估了不同给药模式以观察视力改善是否可以在更少的情况下维持(PIER、PRONTO、EXCITE、SUSTAIN、HORIZON、CATT)。这些试验已经显示与频繁较低的给药方案相比，每月一次给药导致优越视力结局(Patel等人,2011)。需要具有作用持续时间更长的抗VEGF疗法，这些抗VEGF疗法将导致患者需要比每月一次或每两月一次更低频率的注射，同时仍然维持采用每月一次或每两月一次给药方案实现的效力。
除VEGF之外，其他促血管生成介质、炎性介质或生长因子介质参与视网膜疾病例如、新生血管性(wet)AMD、糖尿病性视网膜病变和视网膜静脉闭塞。促血管生成介质、炎性介质或生长因子介质的例子包括但不限于PDGF(Boyer,2013)、血管生成素(Oliner等人,2012)、S1P(Kaiser,2013)、整联蛋白αvβ3、αvβ5、α5β1(Kaiser等人,2013；Patel、2009a；Patel,2009b)、β细胞素(betacellulin)(Anand-Apte等人,2010)、apelin/APJ(Hara等人,2013)、***(Watanabe等人,2005；Aiello,2005)、补体因子D、TNFα和通过遗传关联研究与AMD风险关联的蛋白质如补体途径蛋白质，包括C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a、和C3a、和HtrA1、ARMS2、TIMP3、HLA、IL8、CX3CR1、TLR3、TLR4、CETP、LIPC、COL10A1、和TNFRSF10A(Nussenblatt等人,2013)。随着开发有效靶向这些分子和途径的疗法，将需要提供视力结局改善，与此同时减少与频繁玻璃体内注射相关的治疗负担和风险。另一个视网膜疾病是Dry AMD，最常见形式的AMD，其特征在于存在玻璃疣，作为视网膜上黄色点观察到的残片沉积物。Dry AMD可以进展成更严重的形式，如新血管形成(wet)AMD或地图样萎缩(geographic atrophy)。Dry AMD和地图样萎缩是慢性疾病并且因此疗法将可能不得不施用许多年。因此，需要改善视力结局，同时减少与频繁玻璃体内注射相关的治疗负担和风险。包括但不限于青光眼、干眼病或葡萄膜炎的其他眼病也可以是用玻璃体内递送的疗法可处理的。
本发明提供可以与治疗性分子连接以减慢从眼清除该治疗性分子，因而增加其眼半衰期的肽标签。本发明涉及相对未加标签的分子，效力持续时间增加的肽标签和加肽标签的分子，这将在临床上导致频率更低的眼内注射和改善的患者治疗。
本文所述的加肽标签的分子可以用作药物。特别地，本发明的加肽标签的分子可以用于治疗在个体中与视网膜血管病相关的病况或病症。例如，如本文所述的结合VEGF的加肽标签的抗体或抗原结合片段可以在治疗有用的浓度，通过向有需求的个体施用有效量的本发明加标签的抗体或抗原结合片段，用于治疗与VEGF水平和/或活性增加相关的眼病或病症。
本发明提供一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗与视网膜血管病相关的病况或病症的方法。本发明提供一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗与糖尿病性视网膜病变(DR)相关的病况或病症的方法。本发明提供一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗与黄斑水肿相关的病况或病症的方法。本发明也提供一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)的方法。本发明还提供一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗增生性糖尿病性视网膜病变(PDR)的方法。仍然进一步，本发明提供通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗年龄相关的黄斑水肿(AMD)、视网膜静脉闭塞(RVO)、血管性水肿、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成和/或早产儿视网膜病变的方法。仍然进一步，本发明涉及一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗VEGF介导的病症的方法。构思了加肽标签的分子包含以小于或等于9.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。构思了加肽标签的分子是如本文所述的加肽标签的抗体或抗原结合片段。在一个方面，加肽标签的分子包含以小于或等于8.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。在一个方面，加肽标签的分子包含以小于或等于7.2μM的KD结合眼中HA的肽标签。在一个方面，加肽标签的分子包含以小于或等于6.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。在一个方面，加肽标签的分子包含以小于或等于5.5μM的KD结合眼中HA的肽标签。在某些具体方面，肽标签可以包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列。在又一个方面，前述方法还包括，在施用步骤之前，诊断患有这种病况或病症的个体的步骤。
在一个方面，本发明涉及一种通过向有需求的个体施用有效量的本发明加肽标签的分子，治疗个体中对抗VEGF治疗抵抗的VEGF介导病症的方法。构思了加肽标签的分子包含以小于或等于9.0μM的KD结合眼中HA的肽标签。例如，肽标签可以以小于或等于8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。在某些具体方面，肽标签可以包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列。如本文使用，“对抗VEGF治疗抵抗的”指不能用已知的抗VEGF疗法如雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普或培加尼布治疗实现令人满意的生理反应。这类患者在3次玻璃体内注射雷珠单抗、贝伐单抗或阿柏西普(或3次玻璃体内注射前述任一疗法组合)后，具有小于20％的异常中央视网膜厚度(黄斑中心1mm2区域)下降。在一个实施方案中，尽管接受雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普或培加尼布疗法，对抗VEGF疗法抵抗的患者仍出现持续视力恶化。在另一个实施方案中，尽管接受雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普或培加尼布疗法，对抗VEGF疗法抵抗的患者仍出现视网膜增厚。在一些实施方案中，尽管接受雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普或培加尼布疗法，对抗VEGF疗法抵抗的患者仍显示可忽略解剖改善。
本发明加肽标签的分子(例如：加肽标签的抗体或抗原结合片段)可以尤其用来防止与视网膜血管病相关的病况或病症(例如，DR、DME、NPDR、PDR、年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉闭塞(RVO)、血管性水肿、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成和/或早产儿视网膜病变)进展、用来治疗或预防与视网膜血管病相关的黄斑水肿、用来与采用现行抗VEGF药物(例如，雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普)所需要的注射频率相比、降低玻璃体内注射频率、并用来改善因视网膜血管病进展所致的视力损失。本发明的加肽标签分子(例如：加肽标签的抗体或抗原结合片段)也可以例如与其他抗VEGF疗法、其他抗PDGF疗法、其他抗补体疗法或其他抗EPO疗法或其他抗炎性疗法组合用于治疗视网膜血管病患者。
视网膜血管病、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变和VEGF介导的病症和与视网膜血管病相关的其他病况或病症的治疗和/或预防可由眼科学家或健康护理专业人员用视觉功能和/或视网膜解剖学的临床相关测量来测定。视网膜血管病相关病况或病症的治疗意指导致或考虑其导致视觉功能和/或视网膜解剖学的改善或保护的任意行动(例如施用本文所述加肽标签的抗VEGF抗体)。此外，在它涉及视网膜血管病相关病况或病症时，预防意指在处于视觉功能、视网膜解剖学和/或本文定义的视网膜血管病参数恶化风险的患者中防止或减慢该恶化的任意行动(例如施用本文所述加肽标签的抗VEGF抗体)。
视觉功能可以包括例如视力、低照度视力、视野、中央视野、周边视力、对比敏感度、暗适应、光应力恢复、辨色力、阅读速度、辅助装置依赖性(例如大字体、放大装置、望远镜)、面部识别、驾驶机动车熟练程度、进行日常生活中的一项或多项活动的能力、和/或患者报告的视觉功能相关满意度。
视觉功能的示例性测量包括Snellen视力、ETDRS视力、低照度视力、Amsler方格表、Goldmann视野、Humphrey视野、微视野检查(microperimetry)、Pelli-Robson图表、SKILL卡片、Ishihara色板、Farnsworth D15或D100色彩测试、标准视网膜电描记术、多焦视网膜电描记术、经验证的阅读速度测试、面部识别、驾驶模拟和患者报告的满意度。因此，血管病和/或黄斑水肿的治疗可以说是通过获得或未丧失ETDRS量表上的2或更多行(或10字母)的视力。此外，血管病和/或黄斑水肿的治疗可以说是在个体显示阅读速度(字/分钟)提高至少10％或未降低10％时发生。此外，血管病和/或黄斑水肿的治疗可以说是在个体显示Ishihara测试上正确鉴别的板或Farnsworth测试上正确排序的盘的比例提高20％或未降低20％时发生。另外，视网膜血管病和/或黄斑水肿的治疗可以说是在个体达到预先指定的暗适应程度的时间具有例如至少10％的减少或未增加10％或更多时发生。此外，视网膜血管病和/或黄斑水肿的治疗可以说是在个体显示表示为由合格健康护理专业人员(即眼科学家)测定的视角的视力盲点的总面积例如减少至少10％或未增加10％或更多时发生。
可以治疗或预防的视网膜解剖学的不希望的方面包括例如微动脉瘤、黄斑水肿、棉絮斑、视网膜内微血管异常(IRMA)、毛细血管脱落、白细胞黏附、视网膜局部缺血、视盘新血管形成、后极新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜内出血、玻璃体出血、黄斑瘢痕、视网膜下纤维化、和视网膜纤维化、静脉扩张、血管迂曲、血管渗漏。因此，例如黄斑水肿的治疗可以通过光学相干断层扫描测量的中央视网膜子域厚度减少20％或更多来测定。
评估视网膜解剖学的示例性手段包括眼底镜检查、眼底照相术、荧光素血管造影、靛青绿血管造影、光学相干断层扫描(OCT)、谱域光学相干断层扫描、扫描激光检眼镜检查、共焦显微术、自适应光学、眼底自发荧光、活组织检查、尸体剖检和免疫组织化学。因此，在通过荧光素血管造影测定的渗漏面积减少10％时，可以说在个体中治疗了血管病和/或黄斑水肿。
待用本发明的治疗剂治疗的个体也可以以已知的治疗糖尿病相关病况的方法施用其他治疗剂，如所有形式的胰岛素和抗高血压药物。
眼病(如年龄相关黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)、血管性水肿、多灶性脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成和/或早产儿视网膜病)的治疗和/或预防可以由眼科学家或健康护理专业人员通过任意上述测量用视觉功能和/或视网膜解剖学的临床相关测量来测定。虽然本文所述的测量不适用于本文的各种和每种眼病，但本领域技术人员将识别出可以用来治疗给定眼病的视觉功能和/或视网膜解剖学的临床相关测量。
在将本发明的治疗剂与另一种药物一起施用时，二者可以以任一顺序顺次施用或同时施用。在一些方面，对还接受第二药物(例如Lucentis)治疗的个体施用本发明的加标签的抗体或抗原结合片段。在其他方面，结合手术治疗施用该结合分子。
适合与本发明的加标签的抗体或抗原结合片段组合治疗的药物包括本领域已知的能够调节VEGF、VEGF受体的活性的药物，其他受体酪氨酸激酶抑制剂，或调节HIF-1介导途径的其他实体。已报道其他药物抑制这些途径，包括雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevicizumab)、培加尼布(pegaptanib)、阿柏西普(aflibercept)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafinib)、舒尼替尼(sunitinib)和雷帕霉素。与抗炎剂如糖皮质激素、NSAIDS和TNF-α抑制剂的组合治疗在视网膜血管病和黄斑变性，例如糖尿病性视网膜病和DME的治疗中可以是有益的。
联合治疗方案可以是附加性的，或者它可以产生协同结果(例如，对于两种药物的组合使用，视网膜病严重度比预期降低的更多)。在一些实施方案中，本发明提供用本发明的加标签的抗体或抗原结合片段和抗血管发生剂(如第二抗-VEGF剂)预防和/或治疗上述视网膜血管病和黄斑变性(具体而言AMD糖尿病性视网膜病，包括DME和/或PDP)的联合治疗。在某些其他实施方案中，本发明提供一种用本发明的加肽标签的抗体或加肽标签的抗原结合片段和抑制其他眼部靶如VEGF、PDGF、EPO、补体途径组分(例如：C5、因子D、因子P、C3)、SDF1、Apelin、β细胞素或抗炎药(例如：类固醇)预防和/或治疗如上文所述的视网膜血管病和黄斑水肿、尤其新生血管性AMD和糖尿病性视网膜病变(包括DME和/或PDR)联合疗法。
在一个方面，本发明涉及一种延长玻璃体内施用的治疗剂(therapeutic)的效力持续时间的方法。可以通过增加该治疗剂的眼半衰期、减少眼清除作用或增加眼平均停留时间实现延长效力持续时间(例如，增加给药间隔时间)。可以通过将治疗剂(例如，蛋白质或核酸)与结合HA的肽标签连接，增加半衰期或平均停留时间(并减少清除)。因此，在一个方面，本发明涉及一种增加分子在眼中的半衰期、平均停留时间和/或减少其清除的方法。特别地，本发明涉及一种通过将蛋白质或核酸连接至本文所述的肽标签，增加该蛋白质或核酸在眼中的半衰期和/或平均停留时间或减少其清除的方法。
给药间隔时间的增加因分子的半衰期增加、平均停留时间增加、终浓度增加和/或分子从眼中清除减少引起。本发明也提供用于增加分子在眼中的半衰期的方法，所述方法包括步骤：向个体的眼施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于8.0μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于7.2μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于5.5μM的KD结合HA的肽标签连接。本发明提供用于增加分子在眼中的平均停留时间、增加其在眼中的终浓度和/或减少其从/在眼中清除的方法，所述方法包括步骤：向个体的眼施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于9.0μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于8.0μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于7.2μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些具体方面，该方法包括施用包含下述分子的组合物，所述分子与以小于或等于5.5μM的KD结合HA的肽标签连接。在某些方面，肽标签包含SEQ ID NO:32、33、34、36或37的序列。构思了该组合物包含肽标签，所述肽标签以小于或等于9.0μM、8.0μM、7.2μM或5.5μM结合HA的KD与蛋白质或核酸(例如，抗体或抗原结合片段，更具体地，例如抗VEGF抗体或抗原结合片段)连接。
如本文所述的半衰期指药物浓度降至一半所需要的时间(Rowland M和Towzer TN：Clinical Pharmacokinetics.Concepts andApplications.第3版(1995)以及Bonate PL和Howard DR(编著):Pharmacokinetics in Drug Development,第1卷(2004))。细节也可以在Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook forPharmacists并在Peters等人,Pharmacokinetic analysis:A PracticalApproach(1996)中找到。还参考Marcel Dekker出版的“Pharmacokinetics",M Gibaldi&D Perron,published,第2修订版(1982)”，该文献描述了药代动力学参数如α半衰期和β半衰期和曲线下面积(AUC)。任选的，本文中引用的全部药代动力学参数和值均应解读为在人类中的值。任选的，本文中引用的全部药代动力学参数和值均应解读为在小鼠或大鼠或食蟹猴中的值。
在一个方面，构思因与HA结合增加半衰期至少25％(例如从5天增至6.25天)。在另一个方面，构思增加半衰期至少50％(例如从5天增至7.5天)。在另一个方面，构思增加半衰期至少75％(例如从5天增至8.75天)。在另一个方面，构思增加半衰期至少100％(例如从5天增至10天)。在另一个方面，构思增加半衰期大于100％(例如，150％、200％)。在一个方面，如本文所述将肽标签与分子连接可以相对无标签的分子的眼半衰期，增加眼半衰期至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍以及至少4倍或更多倍。可以通过以下方式确定与未加标签的分子相比，加结合HA的肽标签的分子的眼半衰期的相对增加：通过玻璃体内注射施用该分子和在各个时间点使用本领域已知的分析方法(例如ELISA、质谱法、Western印迹法、放射免疫测定法或荧光标记法)测量剩余浓度。从玻璃体清除玻璃体内施用的生物分子已经显示符合一级指数衰减函数(等式1)(Krohne等人,2008；Krohne等人,2012；Bakri等人,2007b；Bakri等人,2007a；Gaudreault等人,2007；Gaudreault等人,2005)。
Ct＝Ct＝0*e-kt(1)
                   (1)
速率常数k是：
Ct是玻璃体内施用后时间t处的浓度。
Ct＝0是玻璃体内施用后时间0处的浓度。
T1/2是玻璃体内施用后的眼半衰期。
可以使用等式(1)和(2)对增加玻璃体内半衰期的作用建模。
用于加肽标签的分子的药代动力学分析和确定其平均停留时间和/或半衰期的方法将是本领域技术人员熟悉的。此外，与加肽标签分子的药代动力学分析和确定其平均停留时间的方法的细节可以在Shargel,L和Yu,ABC:Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics,第4版(1999),Rowland M和Towzer TN:Clinical Pharmacokinetics.Concepts andApplications.第3版(1995)以及Bonate PL和Howard DR((编著))：Pharmacokinetics in Drug Development,第1卷(2004)中找到，所述文献描述药代动力学参数如平均停留时间。可以从药物(例如：治疗性蛋白、加肽标签的蛋白质、肽标签等)的基质或组织(例如：血清)浓度对时间的曲线确定平均停留时间和AUC。可以使用Phoenix WinNonlin软件，例如6.1版(从美国Pharsight Corp.,Cary,NC可获得)，例如分析这类数据和/或对其建模。平均停留时间是药物停留在身体内的平均时间并涵盖吸收、分布和消除过程。MRT表示当63.2％的剂量已经消除时的时间。
在一个方面，本发明涉及一种如本文所述的通过将分子(如蛋白质或核酸)与肽标签连接，增加该分子平均停留时间的方法。在一个方面，如本文所述的肽标签与分子连接可以增加该分子在眼中的平均停留时间10％或更大。在又一个方面，如本文所述的肽标签与分子连接可以增加该分子在眼中的平均停留时间20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。
在又一个方面，本发明涉及一种如本文所述的通过将分子(如蛋白质或核酸)与肽标签连接，减少该分子的眼清除作用的方法。在一个方面，如本文所述的肽标签与分子连接可以减少该分子在眼中的眼清除作用10％或更多。在又一个方面，人为如本文所述的肽标签与分子连接可以减少该分子在眼中的眼清除作用20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％或更多。
药物组合物
递送肽标签和加肽标签的分子
本发明提供组合物，所述组合物包含本发明的肽标签，例如以小于或等于9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合眼中HA的肽标签。在某些具体方面，肽标签可以包含SEQ ID NO:32、33、34、35或36的序列，与可药用赋形剂、稀释剂或载体一起或分别配制。本发明也提供组合物，所述组合物包含与可药用赋形剂、稀释剂或载体一起或分别配制的加肽标签分子(例如：与蛋白质或核酸连接的肽标签)。在某些方面，加肽标签的分子包含如上文所述的结合眼中HA的肽标签。本发明也提供组合物，所述组合物包含与可药用赋形剂、稀释剂或载体一起或分别配制的加肽标签的抗体或加肽标签的抗原结合片段，和/或肽标签。在某些方面，本发明提供组合物，所述组合物包含与可药用赋形剂，稀释剂或载体配制在一起的与肽标签连接的VEGF抗体或其抗原结合片段。在更具体的方面，本发明提供包含加肽标签的分子的组合物：NVS1、NVS2、NVS3、NVS36或NVS37。在仍然更具体的方面，本发明提供组合物，所述组合物包含在表1、2、8，8b、9或9b任一个表中的加肽标签的分子。本文所述的组合物可以与可药用赋形剂、稀释剂或载体配制在一起。该组合物可以额外地含有适于治疗或预防例如与视网膜血管病相关的病况或病症的一种或多种其他治疗剂。可药用载体增强或稳定组合物，或可以用来促进组合物的制备。可药用载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌药和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂等。
本发明的药物组合物可以是通过本领域已知的多种方法施用。施用途径和/或模式根据所需的结果变动。优选的组合物应当适合向眼施用，更具体地，组合物可以适于玻璃体内施用。可药用赋形剂、稀释剂或载体应当适合向眼施用(例如，通过注射、结膜下或局部施用)，更具体地，适用于玻璃体内施用。取决于施用途径，可以将活性化合物(即，抗体，双特异性和多特异性分子)包覆在保护该化合物免遭可能使这种化合物失活的酸和其他天然条件作用的材料中。本发明也提供了产生用于眼递送的组合物的方法，其中所述方法包括步骤：将以小于或等于9.0μM、8.5μM、8.0μM、7.5μM、7.0μM、6.5μM、6.0μM、5.5μM、5.0μM、4.5μM、4.0μM、3.5μM、3.0μM、2.5μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合眼中HA的肽标签与结合或能够结合眼中靶(例如：VEGF、因子P、因子D、EPO、TNFα、C5、IL-1β等)的分子(例如：蛋白质或核酸)连接。
组合物应为无菌和流体。例如，可通过使用诸如卵磷脂的包被、在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小及通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝或明胶)来产生可注射组合物的长期吸收。
本发明的药物组合物可按照本领域熟知和常规实施的方法制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack PublishingCo.,第20版,2000；及Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中利用分子的治疗有效剂量或有效剂量。通过本领域技术人员已知的常规方法将加肽标签的分子配制为可药用剂型。调整剂量方案以提供最优的期望应答(例如治疗应答)。例如，可以施用单次快速浓注、可以随时间推移施用若干分份剂量或者按治疗情况的紧急需要所指示按比例降低或提高剂量。以剂量单位形式配制胃肠外组合物对施用的容易性和剂量的均一性尤其有利。本文所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的个体的单个剂量的物理上分开的单位；每个单位包含计算为与所需药物载体联合产生期望的疗效的预定活性化合物量。
可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得活性成份的量，该量就具体患者、组合物和施用方式而言对达到所希望的治疗应答有效，而对患者无毒性。所选剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括本发明所利用的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所利用的具体化合物的***速率、治疗的持续时间、与所利用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康和过往病史等因素。可以选择和/或调节剂量水平以实现治疗反应，如使用本文所述的一种或多种眼/视觉评定法所测定。
医师或兽医可以在低于达到希望的疗效所需的水平的水平开始本发明的加肽标签的分子用于药物组合物中的剂量，并逐渐增加剂量，直至达到希望的作用。通常，本发明的组合物治疗本文所述视网膜血管病的有效剂量取决于许多不同因素而变，包括施用手段、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物、及处理是预防性的还是治疗性的。需滴定治疗剂量来优化安全性和有效性。加肽标签的分子的玻璃体内施用的剂量可以是每次注射0.1mg/眼至6mg/眼。单次给药/眼可以按2次注射/眼实施。例如，12mg/眼的单次给药可以按2次注射每次6mg递送，产生总剂量12mg。在某些具体方面，剂量可以是12mg/眼、11mg/眼、10mg/眼、9mg/眼、8mg/眼、7mg/眼、6mg/眼、5mg/眼、4.5mg/眼、4mg/眼、3.5mg/眼、3mg/眼、2.5mg/眼、2mg/眼、1.5mg/眼、1mg/眼、0.9mg/眼、0.8mg/眼、0.7mg/眼、0.6mg/眼、0.5mg/眼、0.4mg/眼、0.3mg/眼、0.2mg/眼或0.1mg/眼或更低。每种剂量可以按每只眼一次或多次注射实施。每次注射的体积可以在10微升和50微升之间，同时每剂量的体积可以在10微升和100微升之间。例如，剂量包括每只眼每次注射0.1mg/50μl、0.2mg/50μl、0.3mg/50μl、0.4mg/50μl、0.5mg/50μl、0.6mg/50μl、0.7mg/50μl、0.8mg/50μl、0.9mg/50μl、1.0mg/50μl、1.1mg/50μl、1.2mg/50μl、1.3mg/50μl、1.4mg/50μl、1.5mg/50μl、1.6mg/50μl、1.7mg/50μl、1.8mg/50μl、1.9mg/50μl、2.0mg/50μl、2.1mg/50μl、2.2mg/50μl、2.3mg/50μl、2.4mg/50μl、2.5mg/50μl、2.6mg/50μl、2.7mg/50μl、2.8mg/50μl、2.9mg/50μl、3.0mg/50μl、3.1mg/50μl、3.2mg/50μl、3.3mg/50μl、3.4mg/50μl、3.5mg/50μl、3.6mg/50μl、3.7mg/50μl、3.8mg/50μl、3.9mg/50μl、4.0mg/50μl、4.1mg/50μl、4.2mg/50μl、4.3mg/50μl、4.4mg/50μl、4.5mg/50μl、4.6mg/50μl、4.7mg/50μl、4.8mg/50μl、4.9mg/50μl、5.0mg/50μl、5.1mg/50μl、5.2mg/50μl、5.3mg/50μl、5.4mg/50μl、5.5mg/50μl、5.6mg/50μl、5.7mg/50μl、5.8mg/50μl、5.9mg/50μl、或6.0mg/50μl。一个示例性治疗方案能够进行每两周一次或每月一次或每两月一次或每3至6个月一次或根据需要(PRN)IVT施用。加肽标签的分子允许给药间隔时间增加，这改善现行疗法的治疗方案并在下文更详细地描述。
考虑FDA批准适合随Lucentis一起使用的剂量和方案。US20120014958中描述了适合随抗VEGF抗体或抗原结合片段一起使用的其他剂量和方案。
肽标签或加肽标签分子的组合物可以在多种场合施用。单个剂量之间的时间间隔可以是每周一次、每月一次或每年一次。例如基于视敏度或黄斑水肿，时间间隔也可以是不规则的，如患者中再治疗需要所示。此外，替代性给药间隔时间可以由医师确定并且每月施用一次或根据达成效果的需要。效力基于损害增长、抗VEGF拯救率、如光学相干断层摄影术(OCT)所确定的视网膜厚度和视敏度。剂量和频率可以根据加肽标签的分子在患者中的半衰期和治疗靶(例如，VEGF、C5、EPO、因子P等)的水平变动。延长IVT施用的治疗性分子效力持续时间可以通过增加眼T1/2和/或增加其眼平均停留时间和/或减少清除作用来实现。可以例如通过以下方式延长效力持续时间：将结合HA的肽标签与分子连接以减慢其从玻璃体、视网膜和/或RPE/脉络膜清除，导致加肽标签的分子的眼半衰期增加。可以通过以下方式确定与未加标签的分子相比，加结合HA的肽标签的分子的眼半衰期的相对增加：通过玻璃体内注射施用该分子和在各个时间点使用本领域已知的分析方法(例如ELISA、质谱法、蛋白质印迹法、放射免疫测定法或荧光标记法)测量剩余浓度。也可以测量血液浓度并将它们用来如所述那样计算从眼中的清除速率(Xu L等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.,54(3):1616-24(2013))。
从总体上看，与本发明的肽标签连接的分子(例如，抗体或片段)显示比未加标签的分子更长的眼半衰期。例如，与结合眼中HA的肽标签连接的分子可以具有与未加标签的分子相比25％(例如5至6.25日)的半衰期增加、与未加标签的分子相比50％(例如5至7.5日)的半衰期增加，与未加标签的分子相比75％(例如5至8.75日)的半衰期增加，或与未加标签的分子相比100％(例如5至10日)的半衰期增加。在某些方面，预期与未加标签的分子相比，加肽标签的分子的半衰期可以增加超过100％(例如：从5日增至15日、20日或30日；从1周增至3周、4周或更长等)。
施用的剂量和频率可以根据治疗是否为预防性或治疗性而变动，并且直接受所给药的分子的半衰期影响。本文所述的肽标签或加肽标签分子的施用导致有临床意义的剂量和给药频率改善。例如，与未加标签的分子相比，肽标签或加肽标签的分子可以按较低频率给药。实现有临床意义的剂量和给药频率改善可以根据组合物初始起始剂量变动。例如，对于每日一次、每周一次、每二周一次、每月一次或每两个月一次给药的分子，可以用加肽标签的分子实现的有临床意义的给药频率改善将例如是给药间隔时间增加至少25％、30％、50％、75％或100％。在某些方面，例如有临床意义的给药频率改善因给药频率分别从每日一次减少到每隔1日一次、从每周一次减少到每两周一次或从每月一次减少到每六周一次或每两个月一次，或分别更长而发生。
更具体地，本发明的肽标签可以用来改善当前眼用疗法的给药间隔时间。在某些方面，肽标签可以用于增加分子的给药间隔时间至少25％。例如，给药间隔时间可以增加30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％或更多。可以通过将分子连接至以小于或等于7.5μM、小于或等于7.0μM、小于或等于6.5μM、小于或等于6.0μM、小于或等于5.5μM、小于或等于5.0μM、小于或等于4.5μM、小于或等于4.0μM、小于或等于3.5μM、小于或等于3.0μM、小于或等于2.5μM、小于或等于2.0μM、小于或等于1.5μM、小于或等于1.0μM、小于或等于0.5μM、或小于或等于100nM的KD结合眼中HA的肽标签，增加该分子的眼给药间隔时间。例如，抗VEGF Fab(雷珠单抗)和抗VEGF IgG(贝伐单抗)是目前每月一次给药以对Wet AMD和DME患者实现最大视力益处。连接结合HA的肽标签至雷珠单抗或贝伐单抗将预计减少给药频率至每两个月或每季度一次给药(即：至少给药间隔时间增加50％)。类似地，目前规定抗VEGF适配体(培加尼布)在Wet AMD患者中每六周一次给药。连接培加尼布至结合HA的肽标签预计增加给药间隔时间至2月或更长(即：给药间隔时间增加至少30％)。对于需要按每两个月或更长时间的频率给药的其他分子，有临床意义的改善将增加给药间隔时间达额外一个月或更长时间(即给药间隔时间增加至少50％)。例如，目前规定抗VEGF Fc trap(阿柏西普)在Wet AMD患者中每两个月一次给药，连接阿柏西普至结合HA的肽标签预计能够进行每三个月或更长时间给药，导致给药间隔时间至少增加50％。
在某些具体方面，将组合物配制以递送每剂量12mg、11mg、10mg、9mg、8mg、7mg、6mg、5mg、4.5mg、4mg、3.5mg、3mg、2.5mg、2mg、1.5mg、1mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg或0.1mg加肽标签的分子。在某些具体方面，将组合物配制以每次注射递送6mg、5mg、4.5mg、4mg、3.5mg、3mg、2.5mg、2mg、1.5mg、1mg、0.9mg、0.8mg、0.7mg、0.6mg、0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg、0.1mg或0.05mg加肽标签的分子。在一个特定方面，将组合物配制以每剂量递送12mg加肽标签的分子和/或每次注射递送6mg加肽标签的分子。在预防性应用中，相对低的剂量以相对地不频繁的时间间隔在长的时间范围内施用。一些患者继续接受治疗持续其余生。在治疗性应用中，有时需要在相对短的时间间隔上相对高的剂量直至疾病的进展减低或终止，并且优选地直至患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后，患者可以按预防性方案施用。
实施例
本文的实施例描述结合乙酰透明质酸(HA)的肽标签，所述肽标签延长分子在眼中的半衰期，例如，分子可以是蛋白质或核酸。两个动物模型用来评估用HA结合肽标签连接的蛋白质和裸露未修饰(即：未加标签的)的蛋白质或核酸之间的效力持续时间差异：VEGF诱导的兔渗漏模型(视网膜水肿模型)，和激光诱导的食蟹猴脉络膜新血管形成(激光CNV)模型(新生血管性(wet)AMD模型)。
实施例1：VEGF Fab(NVS4)和加肽标签VEGF Fab(NVS1)的产生
抗VEGF scFv转换成抗VEGF Fab(NVS4)
产生抗VEGF Fab(NVS4)的起点是抗VEGF scFv(1008scFV)。1008scFV先前在US 20120014958中公开并且被确定为578 minimaxT84N_V89L或蛋白质编号1008。
为了将1008scFv转化成其Fab形式(NVS4)，将1008scFv的氨基酸序列与公开的人IgG构架序列比对并确定与κ构架具有高度同源性。因此，通过以下方式将1008scFv转化成NVS4：添加1)人免疫球蛋白κ链恒定区序列
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK
VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：125)，
至1008scFv轻链的C末端并ii)添加重链(CH1结构域)序列的人免疫球蛋白第一恒定Ig结构域
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP
VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO：126)
至1008scFv重链的C末端。
此外，选择的同种异型与重链的G1m(f)3和κ轻链的Km3相关，因为这些同种异型用于我们的抗体疗法。
加标签的和未加标签的重组抗体和蛋白质通过在HEK293细胞中瞬时转染哺乳动物表达载体来表达并使用标准亲和树脂例如KappaSelect(目录号17-5458-01，GE Healthcare Biosciences)纯化。
实施例2：未修饰的VEGF抗体(NVS4)与雷珠单抗的基准分析
兔常规眼PK测定
使用如下文描述和图1中显示的传统方法，比较NVS4和雷珠单抗(CAS#：347396-82-1)在兔玻璃体中的眼PK曲线。
将150μg/眼雷珠单抗或NVS4以玻璃体内方式注射至兔眼中(N＝6只眼/抗体)。在注射后1小时和7、14、21和28日处死兔并摘出眼。将摘出的眼剖分并且将玻璃体与其他组织分离并使用TissueLyzer进一步机械匀浆。通过ELISA测量玻璃体中的抗体水平。Maxisorp 384孔平板(Nunc 464718)用碳酸盐缓冲液(28382)中的山羊抗人IgG(H+L)(Thermo31119)在4℃包被过夜。在各次温育之间，使用洗板器，将平板用TBST(THERMO28360)洗涤3次。次日，将平板在室温用用TBS中的封闭缓冲液(5％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％Triton X-100(P234729)封闭2小时(或在4℃封闭过夜)。将样品稀释于稀释剂(TBS中的2％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％Triton X-100(P234729))中。将样品在平板上在室温伴以温和振摇下温育1小时。检测抗体是与HRP缀合的山羊抗人IgG[F(ab')2])(ThermoFisher 31414)。将检测抗体在室温伴以温和振摇下添加至平板持续30分钟。添加Ultra TMBed持续15分钟(Thermo34028)。反应用2N硫酸猝灭(Ricca8310-32)。在(450–570nm)上读取样品的吸光度。为了反算来自眼组织的Fab回收水平，使用纯化的标准物。对于该标准物，2倍稀释时，使用的最大浓度是200ng/mL。不同对的抗体可以用于从兔组织回收Fab。
NVS4和雷珠单抗展示等同的眼PK曲线，如图1中所显示。雷珠单抗和NVS4的半衰期值分别是2.5日和2.7日，显示两种不相关的抗VEGFFab的PK等价性，因此加肽标签的抗VEGF Fab可以是与雷珠单抗或NVS4比较。
兔VEGF攻击模型
在VEGF诱导的兔渗漏模型中，将人VEGF(hVEGF)通过玻璃体内(IVT)注射施用至兔眼。人VEGF诱导剂量依赖性血管变化，包括血管直径、曲度(tortuosity)和通透性增加。可以使用与定量图像处理或荧光素渗漏评定法(下文描述的方法)组合的荧光素血管造影术，评估血管通透性。
兔中的玻璃体内(IVT)注射
兔眼以局部用1％环喷托酯和2.5％或10％去氧肾上腺素扩瞳并且角膜以局部用0.5％丙对卡因麻醉。兔随后用肌内注射***/赛拉嗪混合物(17.5–35mg/kg和2.5–5mg/kg)麻醉。在手术显微镜的直接可视化下，将50μL治疗药注入玻璃体。将30号针头距角膜缘大约2mm颞上***玻璃体的中央。对兔眼检查因注射所致的并发症(例如，出血、视网膜脱离或晶状体损伤)并且随后在对侧眼上重复该手术。对于全部研究，将抗生素油膏剂施加至双眼(在研究子集中，抗生素油膏剂额外地含有***)。将400ng重组hVEGF注入体重大约1.6-2kg的荷兰黑带兔的玻璃体。将人VEGF(Peprotech；目录号AF100-20，批号0508AF10)稀释于0.9％无菌盐水中。在玻璃体内VEGF攻击注射后48小时，如下文描述，对兔视网膜血管***成像。
图像采集
通过在静脉内施用荧光染料后采集视网膜血管图像，对人VEGF诱导的视网膜血管变化定量。在全部效力研究中，利用输送荧光素后所获得的图像以确定血管通透性。产生定量荧光素渗漏的研究还需要对经选择以标记血管的荧光染料(荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的葡聚糖)成像。注射VEGF后48小时获得眼图像。图像是至多40幅寄存(registered)扫描激光检眼镜(SLO)图像的平均值，所述图像用30度透镜对毗邻视神经的鼻髓放线获得。来自6模式(Heidelberg Engineering)的荧光素通道用于全部图像采集。在成像之前，兔局部接受1-2滴1％环喷托酯和1-2滴去氧肾上腺素(2.5％或10％)用于扩瞳。还施加0.5％丙对卡因作为局麻药。兔随后如先前所述麻醉。在图像采集之前大约5分钟，将血管以静脉内注射1mL FITC缀合2000kD葡聚糖溶液至耳缘静脉中进行标记。基于产生高品质图像必需的荧光信号，为每个批次经验地选择所用的FITC-葡聚糖浓度(35–70mg/mL)。随后获得标记的视网膜血管***的图像。随后通过注射0.3mL 10％荧光素溶液至耳缘静脉中，评估视网膜血管通透性。随后在仅一只眼中注射荧光素后3分钟获得图像，或在一只眼中注射后3分钟接着在对侧眼中注射后大约4-6分钟获得图像，这取决于研究。
图像分析
使用适用于3-6分钟荧光素图像的两项不同技术，评估VEGF对血管通透性的影响。无论使用哪种方案，用来生成和采集数据的步骤均相同，例外是如先前所述的FITC-葡聚糖注射。以为此目的开发的定制设计软件，使用定量地进行分析或通过使用定性评分***评定每幅图像中荧光素渗漏进行分析。如果存在明显炎症，在图像品质不足情况下揭示之前进行排除，或在其中伴随注射存在问题的情况下进行排除。对于两种方案，将数据各自对单项研究报告或作为多项研究的组合结果报告。下文描述两种方法。
定量性图像处理分析
在一些研究中，以使用下文所述方法的图像处理技术对荧光素渗漏定量。
首先，使用两种图像共同的血管特征，将VEGF注射后的FITC-葡聚糖图像和荧光素图像彼此比较，随后：
1.随后从共寄存(co-registered)注册图像裁去髓放线之外的区域，连同图像品质不足用于分析的任何局限化区域。
2.在两种图像中描述了视网膜血管中的几种目的区域，并且增强一幅图像的强度直至目的区域内的信号在两种图像中相等(归一化)。
3.从荧光素渗漏图像扣减对齐的FITC-葡聚糖图像，产生由血管溢出型荧光素组成的图像。
4.将荧光素渗漏对每只眼报告为血管溢出型染料图像中目的裁剪区域内所含像素的平均强度。
相对于盐水对照组，计算每个组中对荧光素渗漏的抑制。统计分析用双尾Student t检验或单因素方差分析伴Dunnett多重比较检验进行。
定性荧光素图像渗漏评定
在一些研究中使用一个为应用于荧光素血管造影术图像开发的三步骤评分***评估视网膜血管通透性。读数仪将每幅荧光素渗漏图像分入三个类别之一。0评分表示没有从视网膜血管渗漏的迹象。1评分表示疑似提示荧光素渗漏。如果感知的渗漏难以察觉，则血管曲度的增加可以用来证实评分1。2评分表示在大部分或全部视网膜血管区域范围内毫无疑义的荧光素渗漏。对掩蔽、随机分配的数据进行图像评定。
无论用于评估血管通透性的方法是什么，测量的荧光信号或感知的血管溢出型染料增加总是与血管渗漏成正比。效力定义为相对于接受盐水注射的动物中观察的信号，测量的荧光信号强度或感知的血管溢出型染料减少。平均荧光信号或图像评分的较低值对应于更大的渗漏抑制作用并因此对应于更大的效力。
玻璃体内施用400ng/眼的人VEGF在处理后48小时导致最大渗漏(图2)。这种血管渗漏可以通过事先IVT施用抗VEGF分子如雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普或NVS4完全抑制(图3)。为了确定抗VEGF分子的作用的持续时间，将抗VEGF分子在hVEGF攻击之前的不同时间施用。在施用抗VEGF分子和hVEGF攻击之间的间隔时间决定抗VEGF分子的作用的持续时间。hVEGF攻击之前4日至28日(在成像前6日至30日)，将抗VEGF抗体注入玻璃体。将由3-5只动物(6-10只眼)组成的每个兔组用相同抗体在相同的时间注射。
为了确定兔渗漏模型中的效力持续时间，将5μg/眼的未修饰抗VEGF抗体(例如：雷珠单抗或NVS4)在hVEGF攻击之前4日至19日(成像前6日至21日，图3)在各种时间以玻璃体内方式施用至每只眼。雷珠单抗和NVS4均具有相似的效力持续时间曲线，如通过荧光素渗漏评分所测定。在hVEGF攻击之前4日和7日施用5μg/眼雷珠单抗或NVS4时，观察到完全抑制荧光素渗漏。在VEGF攻击之前12日施用时，观察到显示部分效力的荧光素渗漏增加。在hVEGF攻击之前18日施用雷珠单抗时，没有实现显著的效力。在一项独立研究中，在hVEGF攻击之前19日施用时，NVS4不显示明显的效力。
与兔常规眼PK数据一起，这些结果表明雷珠单抗和未修饰的/未加标签的VEGF抗原结合片段NVS4，在兔中具有相似的眼停留时间和效力持续时间。在以下研究中，将加肽标签的抗体(例如：与结合HA的肽标签连接的NVS4)与雷珠单抗比较。
实施例3：产生加标签的抗体
产生了与多种眼部靶结合的许多肽标签，例如，结合胶原蛋白II、乙酰透明质酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白的肽标签。对这些肽标签测试它们在眼中增加抗体半衰期的能力。下文的方法描述加单标签和加双标签的抗体的产生和表征。
加单标签的抗体或Fab
产生NVS4融合蛋白，它含有结合上文所列眼部靶之一的单个肽标签，使用GSGGG(SEQ ID NO:31)或GSGG(SEQ ID NO:124，例如参见NVS5和NVS11)接头，使所述肽标签序列(例如：结合HA的标签序列)与NVS4的重链的C末端融合。候选物的产生导致合成编码与该标签序列融合的轻链和重链Fab的氨基酸的核苷酸序列。合成核苷酸以编码重链可变区的氨基酸直至CH1恒定域的末尾半胱氨酸，后接上文描述的GSGGG或GSGG接头，和标签序列。但是，标签序列的融合不限于重链fab的C末端。标签可以被改造以融合在轻链的C端末端以及重链或轻链或者两条链组合的N末端。
加双标签的抗体或Fab
通过将两个或更多个肽标签与NVS4融合产生加多个标签形式的NVS4。肽标签序列：
1)利用GSGGG接头连接至NVS4的重链C末端并利用GSGGG接头连接至NVS4的轻链C末端(例如：NVS1d)，
2)利用GSGGG接头连接至NVS4的重链C末端并利用GSGGG接头连接至NVS4的轻链N末端(例如：NVS1f)，
3)利用GSGGG接头连接至NVS4的重链N末端并利用GSGGG接头连接至NVS4的轻链N末端(例如：NVS1c)，或
4)利用GSGGG接头连接至NVS4的重链N末端并利用GSGGG接头连接至NVS4的轻链C末端，
5)利用GSGGG接头串联连接至NVS4的轻链C末端(例如NVS1e)
6)利用GSGGG接头串联连接至NVS4的重链C末端(例如NVS1h)
7)利用GSGGG接头串联连接至NVS4的重链C末端(例如NVS1g)。
合成了编码与肽标签序列融合的轻链和重链Fab的氨基酸序列的核苷酸。合成核苷酸以编码重链可变区的氨基酸直至CH1恒定域的末尾半胱氨酸和整条轻链，前接或后续上文描述的GSGGG或GSGG接头，和标签序列。
实施例4：肽标签的选择
以下例子描述了可以用来测量肽标签与抗VEGF抗体(例如：NVS4)融合时对其眼部靶的结合作用和/或亲和力的方法。测量结合亲和力的这些方法和其他方法是本领域已知的。
通过测定结合HA的肽标签的结合作用和/或亲和力
使用按照制造商的说明书，评定肽标签和/或加标签的VEGF抗体或抗原结合片段与生物素酰化HA的结合作用。生物传感器(光纤端部)用特殊光学层包覆并且起捕获作用的分子随后与端部连接。将该端部浸入含有靶分子的样品中，所述靶分子与捕获分子结合，并且二者两个形成一个分子层。将一束白光引入光纤并且两束光将反射回背端(back end)。第一束光来自端部作为参考。第二束光来自分子层。两束光的差异将造成一种光谱颜色样式并且该相随分子层厚度变化而变化并且对应于端部表面上分子的数目。当分子与传感器结合时，内参上的反射将保持恒定并且在光纤上分子层和溶液之间的界面随着添加结合的分子而变化。在传感器内部的生物双层干涉测量监测波长偏移随时间推移的这种变化。随着分子结合，信号的波谱将作为在传感器上层增加的函数而变化。这种实时结合测量可以用来计算相互作用的动力学、结合和离去速率并最终通过速率对浓度作图计算浓度。
在以下描述的方法中，将链霉亲和素生物传感器(目录号18-5019)在1X动力学缓冲液(目录号18-5032)中预浸泡10分钟以移走生物传感器端部上保护的蔗糖层。随后，将它浸入含有200μl用1X动力学缓冲液稀释成5μg/ml的生物素酰化17kDa透明质酸(HA)的孔中，并允许生物素酰化HA加载于链霉亲和素生物传感器上持续900秒。随后将捕获的HA生物传感器浸入200μl 1X动力学缓冲液板孔持续300秒，以移除没有被链霉亲和素捕获的残余生物素酰化HA。此后，将结合的HA生物传感器浸入以200nM浓度含有改造的抗体的孔中用于单点结合筛选或连续滴定以确定动力学。允许修饰的目的抗体与生物传感器上的捕获HA结合900秒，并且此后，将它转移并浸入含有200μl 1X动力学缓冲液的孔中2100秒，以允许改造的抗体与抗原HA解离。从分析程序测定结合动力学。
通过ELISA结合法测定肽标签对其眼部靶的结合作用和/或亲和力
使用如下文描述的Meso ScaleELISA测量与抗VEGFFab(NVS4)融合的各种肽标签对眼部靶蛋白的结合，所述眼部靶蛋白包括胶原蛋白II、层粘连蛋白、整联蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白。
将25微升5μg/ml蛋白质在4℃包被在384孔MSD平板(目录号L21XA,Meso Scale)上过夜。将平板在TBS/0.05％Tween-20(Thermo#28360)中洗涤3次并用含有TBS/5％BSA级分V(目录号ICN16006980)/0.1％Tween-20/0.1％TritonX-100的缓冲液在室温封闭最短两小时或在4℃封闭过夜。将平板洗涤1次。将fab的滴定物稀释于含有TBS/2％BSA级分V/0.1％Tween-20/0.1％TritonX-100的缓冲液中并且添加25μl/孔至洗涤的平板以在室温温育1小时。此后，将平板洗涤3次并添加25μl/孔1:1000稀释的抗人IgG-磺基标签标记的检测抗体(目录号R32AJ，Meso Scale)。在室温温育1小时后，将平板洗涤3次并添加25μl/孔的1XRead缓冲液(目录号R92TC)。立即在SECTOR ImagerMeso Scale仪上读取平板。使用GraphPad分析电化学发光信号数据。
结果
在全部情况下，将90种肽标签与抗VEGF Fab(参见实施例3)连接并评估它们在Octet或ELISA中与其相应的推定性眼部靶的体外结合。
将50种推定性结合HA的肽标签序列与抗VEGF Fab连接并评估体外HA结合作用。50种推定性结合HA的肽标签中仅27种展示在体外可度量地与HA结合。
将23种推定性结合胶原蛋白的标签与抗VEGF Fab连接并评估在体外与胶原蛋白II的结合。23种推定性结合胶原蛋白的肽标签中仅3种展示在体外与胶原蛋白II结合。
将7种推定性结合整联蛋白的肽标签与抗VEGF Fab连接并评估在体外与整联蛋白的结合。7种推定性整联蛋白的肽标签中仅1种展示在体外与整联蛋白结合。
结合纤连蛋白的、结合粘连蛋白的、结合弹性蛋白的或结合玻连蛋白的其他标签均没有对它们的相应靶展示显著的可度量结合。
随后在基于PET/CT的大鼠成像PK模型中评估具有阳性靶结合的肽标签。
实施例5：与胶原蛋白II、整联蛋白或HA阳性结合的肽标签的PK 评定
以I-124标记的Fab蛋白玻璃体内注射的大鼠的PET/CT成像
使用如本文所述的大鼠PET/CT成像方法，测量通过Octet和/或ELISA展示与HA、或胶原蛋白II或整联蛋白可度量结合的加标签抗体的眼PK。
使用生碘法(Iodogen method)(1)，进行大鼠眼中注射的蛋白质的放射标记，所述方法利用iodogen包被的管(THERMORockford，IL)。通常，实现放射标记效率>85％和比活性大约7mCi/mg。为了使大鼠做好玻璃体内(IVT)注射的准备，动物用3％异氟烷气体麻醉。眼随后用两滴环喷托酯(1％优选浓度)和2.5-10％去氧肾上腺素扩瞳。还施加一滴局麻药(0.5％丙对卡因)。在解剖显微镜下，用一根30号针在角膜缘下方大约4mm产生一个切口，角度指向眼中央。随后将含有放射性标记蛋白质的平头Hamilton注射器(例如33号)经这切口***玻璃体腔内并且注入约3.5μL放射标记的蛋白质。对眼检查出血或白内障。随后在对侧眼上重复该手术。在放射标记的蛋白质注入大鼠眼中后马上将麻醉的动物置于预热PET成像台上，仰卧。该台配有气体麻醉用鼻罩。随后在扫描仪中移动固定并保定的动物，使用置于胸部下的呼吸传感器监测生命功能(例如呼吸)。在GE Triumph LabPET-8三联小动物扫描仪(Gamma Medica,Northridge,CA)上10分钟静态PET扫描，随后10分钟CT扫描。在完成CT扫描后，将动物从台上移走，置于温暖笼中并进行监测直至正常生理功能完全恢复。IVT注射后PET/CT成像的常见时间点是0、3、6、21、29、46、52、72、94、166、190和214小时。还实施了成像时间点较少(例如0、6、24、48、72和96小时)的较短研究。在最后成像时间点后，通过心脏穿刺、放血和颈椎脱臼法，使麻醉的动物安乐死。将眼和其他器官/组织(血液、肝、脾、肾、胃、肺、心、肌肉和骨)解剖取出并在γ计数器中计数剩余放射性活度。将计数转化成所计数组织/器官的注射剂量/克％(％ID/g)。
随后使用MLEM重构算法重构全部PET图像并且与CT解剖扫描结果共寄存。为了分析，将头部图像划分成右半球和左半球。(Visualization SciencesBurlington，MA)和Amide(Sourceforge.net)分析软件包用来基于CT限定的眼位置绘出PET图像上的3D目的区域(ROI)。考虑衰变修正的注射剂量和动物眼的重量(死后测量)并且对ROI的体积归一化，将目的区域中的PET信号表述为标准摄取值(SUV)。数据随后作图以计算注射的蛋白质在大鼠眼中的清除动力学(例如半衰期或平均停留时间)。
为评估未修饰(例如：未加标签)的抗体或抗原结合片段和加标签的抗体的眼清除，将124I-标记的抗体注入大鼠眼中，并且用基于PET/CT的成像法确定随时间推移的相对抗体水平。将信号强度，作为相对抗体水平的量值，在玻璃体内(IVT)注射后立即测定，并且还在注射后24、48和96小时测定。截止注射后48小时，未修饰的抗体(例如，雷珠单抗)的信号强度下降至初值的1％。在注射后96小时，未修饰的抗体(例如，雷珠单抗)的信号强度低于检测限。因此，该大鼠模型是一种用于鉴定眼中停留时间增加的分子的可用短期体内筛选模型。
在这种大鼠模型中对27种加肽标签的抗体测试到较长的停留时间。较长停留时间由IVT后96小时剩余的注射剂量>1％存在定义。9种加肽标签的抗体具有<1％的注射剂量在96小时剩余。相反，18/27加肽标签的抗体展示在大鼠眼中停留较长，如IVT后96小时处存在>1％的注射剂量剩余所定义。随后在兔渗漏模型中评估这18种加标签的抗体的效力。兔是比短期大鼠模型更临床相关的较长期模型。
实施例6：兔效力：仅一个结合HA的肽标签有效
(实施例2中描述的)兔渗漏模型用来评估与结合胶原蛋白或HA的肽标签连接的抗VEGF抗体或Fab是否在注射后20天抑制血管渗漏(图4和5)。兔提供了一种更大、更像人类规格的眼，在其中检验肽标签和加肽标签的分子的长期效力。22种与结合胶原蛋白的肽标签或结合HA的肽标签连接的抗VEGF Fab按照与5μg/眼雷珠单抗等摩尔的剂量施用。hVEGF攻击后48小时，如上文所述评估荧光素渗漏。对任何测试的VEGF Fab，添加结合胶原蛋白的肽标签并不产生明显的荧光素渗漏抑制作用(图5：NVS67、NVS68和NVS69)。与之相反，添加结合HA的肽标签显示出相同条件下显著抑制荧光素渗漏(NVS1，图5)。结果显示结合胶原蛋白的肽标签与抗VEGF Fab的连接不足以抑制hVEGF并且不足以比未加标签的抗VEGF Fab、NVS4更长时间地阻断血管渗漏。与之相反，添加结合HA的肽标签能够展示显著的效力。因此，肽标签在体内增加半衰期并产生有效作用的能力是本发明和如本文所述的结合HA肽片段独有的。
通过ELISA对兔终末PK的定量
一旦完成测量血管渗漏的成像分析，将动物在当日或在成像后那天处死，将眼摘出并加工以定量玻璃体中的抗体浓度(图4和图6)，如上文在实施例2中所述。雷珠单抗的玻璃体终末浓度是大约5ng/mL。与之相反，有效的加标签抗体NVS1的玻璃体终末浓度是231ng/mL。较高的药物终末水平与第20日处抑制渗漏相关，较低药物终末水平与缺少效力相关。在第20日不显示效力的全部分子的药物终末水平小于100ng/mL(图4)，而抑制荧光素渗漏的分子的药物终末水平(NVS1)大于100ng/mL。与结合HA的不同肽标签连接的三种加标签的抗体具有在第20日高于雷珠单抗10-20倍的药物水平并且仍不显示效力(例如：NVS6、NVS7、NVS8)。有效分子NVS1在第20日的药物水平比未加标签的抗体(例如：雷珠单抗)药物水平高超过40倍，显示与未加标签的抗体相比，加结合HA的肽标签的抗体的眼清除率显著更慢。
仅NVS1展示通过octet可度量的与HA的结合作用，在大鼠眼中停留较长，如通过PET/CT成像所测量，和兔渗漏模型中较长的效力持续时间，如VEGF攻击之前18日施用时，统计显著地抑制荧光素渗漏所定义。结合胶原蛋白II的肽标签无一有效。因此，选择具有SEQ IS NO:32的序列的结合HA的肽片段用于优化。
表3:14种加标签抗体的体外和体内数据总结。未加标签的抗体NVS4用所示序列修饰(接头+肽标签)以产生测试的14种加标签的抗体。(接头序列加下划线)
*NVS67是以串联方式与抗胶原蛋白II scFv融合的抗VEGF scFv。
在尝试改善未能在兔渗漏模型中展示延长效力持续时间的肽标签的亲和力时，通过连接8种推定性结合HA的肽到两种不同Fab(NVS4(一种抗VEGF Fab)和NVS00(一种抗鸡溶菌酶Fab阴性对照))重链和轻链二者的C末端上，产生16种额外的加双标签的Fab。在全部情况下，用NVS4产生8种加双标签的Fab并且用NVS00产生额外的8种加双标签的Fab。当这些肽标签与NVS4或NVS00连接时对它们中任一者没有观察到结合作用差异，并且这16种肽标签Fab对HA的结合不存在明显改善。因此，当多个标签与NVS4抗VEGF Fab连接时，作为单体没有实现阳性兔效力的肽标签的多聚化并未改善这些肽标签的活性。
通过等温量热法按照制造商的方案(GE Healthcare)测定所选择的加肽标签的分子(例如：NVS1、NVS2、NVS36、NVS37、NVS1b和NVS7)的HA结合亲和力。具有单个肽标签例如NVS1、NVS2、NVS36和NVS37的加肽标签分子的亲和力分别是5.5±2μM、8.0±1μM、6.0±1.2μM和7.2±1.5μM。添加多个肽标签，例如在NVS1d中(NVS1d：在实施例13中描述)添加，改善了结合亲和力。NVS1d具有0.48±0.04μM的KD。与之相反，在兔模型中无效的NVS7仅以44±19μM的亲和力结合HA。因此，本发明的有效肽标签显示小于或等于9.0μM的结合亲和力。
实施例7：优化NVS1中结合HA的肽标签以消除糖基化和蛋白酶敏 感性
计算机方式分析鉴定的NVS1(SEQ ID NO:21)的位置N311作为N-连接的糖基化位点。为了防止在这个位点的糖基化，表达NVS1的六种单位点变体(NVS12、NVS19、NVS20、NVS21、NVS22，和NVS23)和12种双位点变体(NVS2a、NVS3a、NVS28、NVS31、NVS49、NVS50、NVS51、NVS52、NVS53、NVS54、NVS55、和NVS56)并对HA结合作用表征。
此外，使用条件培养基实施的蛋白酶敏感性分析鉴定NVS1(SEQ IDNO:21)中的位置R236、K241、和R268为蛋白酶位点。为了防止在R236、K241和R268位置的蛋白酶剪切，表达肽标签的几种单一、双重、三重、四重和五重变体并表征HA结合作用(表4)。此外，将一个额外二硫键改造到肽标签中以产生两种加标签的变体NVS36和NVS37。NVS36或NVS37中的肽标签变体的序列分别是SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36。
Biacore亲和力测定
通过Biacore测量优化的结合HA的肽标签对HA和人VEGF的亲和力。为了确定HA动力学，在BIOCAP Biacore样式中使用生物素酰化的HA，其中捕获生物素酰化的HA并且使样品蛋白质以各种浓度流过。下文将详细描述这种方法。为了测定靶动力学，利用两个不同的样式。第一样式是BIOCAP法，所述方法利用被捕获的生物素酰化靶配体并且使蛋白质样品以各种浓度流过。第二样式是抗fab捕获法，其中fab蛋白质样品被捕获并且使靶蛋白以各种浓度流过。
HA结合动力学和亲和力：
对于HA动力学，利用2种不同方法，其中接触时间和解离时间根据针对HA-生物素和人VEGF的亲和力不同。在两种方法中，样品区室保持在15℃但是分析区室在25℃或37℃运行。在这种方法中，利用四个流动小室进行试验。流动小室1(fc1)充当其中不捕获配体的参考小室，以评估加标签的蛋白质对包覆芯片表面上修饰的链霉亲和素-试剂的非特异性结合。在第二、第三和第四流动小室上，捕获试剂和生物素酰化的HA配体或其他生物素酰化的配体。随后，使加标签的蛋白质和亲本蛋白质以不同的浓度流过。
步骤1 BIOCAP捕获步骤：
试剂在生物素捕获试剂盒(2892034)中提供并且1:3稀释至HBS-EP+运行缓冲液(teknova H8022)中。流速是5μl/分钟并且它流通60秒。捕获水平是大约1500RU。
步骤2 生物素酰化配体捕获步骤：
全部配体以10μl/分钟的速率流过大约20秒或以实现将产生Rmax20的捕获水平。这种方法中测试的生物素酰化配体包含自行产生的生物素酰化HA和生物素酰化人VEGF。下文包括针对HA如何计算Rmax的例子，但是在这种情况下，我们使用更高的捕获水平并使用大约60的Rmax。
以下等式代表实现相对Rmax20的计算：
HA-17kDa:Rmax＝RL*(MW分析物/MW配体)*化学计量20＝RL*(50/17)*1＝7RL
步骤3 蛋白质稀释物(分析物)：
对于具有较高亲和力同时离去速率较快的样品的HA动力学，使蛋白质分析物以60μl/分钟的流速运行，接触时间30秒。分析物浓度在25nM开始并且包括按1:2(1份稀释物对1份缓冲液)的4种稀释物。对于全部稀释物，因离去速率快而包括85秒的解离时间。然而应当指出，蛋白质样品在85秒前达到基线。
对于具有较低亲和力、包含缓慢离去速率的样品的HA动力学，使蛋白质分析物以30μl/分钟的流速运行240秒。蛋白质分析物浓度在25nM开始并且包括按1:2(1份稀释物对1份缓冲液)的6种稀释物。对于全部稀释物，因离去速率慢而包括1000秒的解离时间。
步骤4 再生：
在每个循环结束时对全部流动小室进行再生。生物素捕获试剂盒的再生条件如下。通过将3份再生母液1(8M胍-HCl，28-9202-33)与1份再生母液2(1M NaOH，28-9202-33)混合，制备再生缓冲液。这种缓冲液以20μl/分钟流过流动小室120秒。
使用生物素捕获法的靶蛋白动力学和亲和力：
为了测定靶/配体动力学，将两个流动小室用于这种方法。流动小室1充当仅含有试剂的参考小室并且流动小室2充当含有试剂和生物素酰化靶(例如人VEGF-生物素)的结合小室。该方法由4个步骤组成。
步骤1 生物素捕获试剂：
这种试剂在试剂盒中提供并且1:3稀释入运行缓冲液中。流速是5μl/分钟并且它流通60秒。捕获水平是大约1500RU。
步骤2 生物素酰化配体捕获步骤：
生物素酰化靶/配体以10μl/分钟的速率流过进行设定的接触时间，以实现Rmax20所需的响应单位。
以下等式代表实现相对Rmax20的计算：
VEGF例子：Rmax＝RL*(MW分析物/MW配体)*化学计量20＝RL*(50/50)*1＝20RL
步骤3 抗体稀释物(分析物)：
由于蛋白质分析物对其靶具有强亲和力，因此起始浓度将是10nM并将包括8个连续稀释点。例如，对于一些蛋白质分析物的VEGF动力学，起始浓度是1.25nM并且包括按1:2的7种稀释物。短的解离和较长的解离取决于蛋白质分析物。总体上对于这些亲和力较低的蛋白质分析物的靶动力学而言，蛋白质分析物以60μl/分钟流过240秒并且具有大于1000秒的较长解离时间。
步骤4 再生：
在每个循环结束时对全部流动小室进行再生。生物素捕获试剂盒的再生条件如下。通过将3份再生母液1(8M胍-HCl)与1份再生母液2(1MNaOH)混合，制备再生缓冲液。这种缓冲液以20μl/分钟流过流动小室120秒。
包含分析物、配体和再生缓冲液的样品区室保持在15℃。全部其他运行条件在25℃或37℃在1x HBSE+P缓冲液中实施。最终结果反映双重参考：无分析物时来自参比流动小室和空白结合步骤二者的折射率值扣减。以10Hz采集数据并使用BiacoreT200评价软件(GE)分析。这种程序使用确定每种相互作用的速率和亲和力常数的总体拟合分析法。
蛋白酶敏感性分析
为了评估结合HA的肽标签的蛋白酶解性剪切作用，使用分选酶A介导的反应，将与下表4中所列的结合HA的肽标签的多种变体融合的NVS4在轻链的N末端用Invitrogen AlexaFluor 488作位点特异性标记。将标记的蛋白质(1mg/ml或更高)与CHO K1PD用过的培养基按标记的蛋白质对含有0.05％叠氮钠的用过的培养基1:10比率混合。将反应混合物在37℃伴随振摇下温育。在不同日取出20微升，在第0日开始，并冷冻。在最后指定温育日取出样品后，将16μl(12μl样品+4μl SDS上样染料)加载于Invitrogen的12-16％17孔NuPAGE Tris-Bis凝胶上。使用BioRad Gel Doc2000在AlexaFluor488设定下扫描凝胶。条带向较低分子量的质量位移分析蛋白质的蛋白酶解性剪切作用。
随后在兔渗漏模型中评估对亲本NVS1具有相似结合的两种变体NVS2a和NVS3a(表4)。NVS2a和NVS3a在兔模型中均未展示任何效力，表明位置N311处的糖基化对体内活性重要。在兔渗漏模型中评估对亲本NVS1具有相似结合的四种变体(表4：NVS2、NVS3、NVS36和NVS37)。全部四种分子NVS2、NVS3、NVS36和NVS37在兔模型中均展示与亲本NVS1相似的效力。然而，与NVS1相比，这四种变体NVS2、NVS3、NVS36和NVS37显示增加的蛋白质稳定作用、降低或消除的蛋白酶解性剪切作用和增加的熔点，这些是改善加标签的蛋白质可发展性的关键因素。
这些结果表明，在改变蛋白酶剪切作用的序列修饰之后，仅NVS2、NVS3和NVS36及NVS37保留具有较低眼清除作用和效力持续时间延长的独特体内特性。
表4:优化的NVS1变体。列出的变异存在于与NVS1(SEQ ID NO:21)的重链连接的肽标签序列中。肽标签对应于SEQ ID NO:21的氨基酸229至326。
在兔模型中评估就生物物理特性、氨基酸序列和HA结合作用而言总体上具有最有利属性的选择的代表性蛋白酶抗性或非糖基化变体。更具体地，不评估pI下降、因移除糖基化位点而溶解度差的变体和/或显示出蛋白酶解性剪切作用的那些变体。
SEQ ID NO：141
GSGGGTCRYAGVYHREAQSGKYKLTYAEAKAVCEFEGGHLATYKQLEAARKIGFHVCAAGWMAKGRVGYPIVKPGPNCGFGKTGIIDYGIRLNRSERWDAYCYNASAPPEEDCT
实施例8：优化抗体的进一步表征：NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37
8a：优化VEGF抗体的Biacore测定
通过如上文实施例7中所述的Biacore测量优化VEGF抗体对HA和人VEGF的亲和力。表5列出每个分子的平均结合速率(ka)、解离速率(kd)和总亲和力(KD)，连同几种实验，以及每种测量值和计算值的范围和均值标准误。在25℃测量时，NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37对HA的总亲和力是5.75μM至31nM的范围，并且在37℃测量时，是3.07μM至29nM的范围。与未加标签的Fab(NVS4)相比，全部五种加肽标签的融合分子对VEGF的亲和力较高(表6)。
表6:NVS1、NVS2、NVS3、NVS4、NVS36和NVS37与眼部靶蛋白-人VEGF结合的亲和力。
NVS ID Ka(1/M＊s) Kd(1/s) 亲和力(M)
NVS4 2.71E+06 1.38E-05 5.10E-12
NVS1 5.75E+07 1.01E-05 1.76E-13
NVS2 5.36E+07 1.05E-05 1.95E-13
NVS3 7.39E+07 1.19E-05 1.61E-13
NVS36 3.81E+07 2.50E-05 6.56E-13
NVS37 2.35E+07 7.21E-05 3.07E-12
8b：优化的VEGF抗体的兔效力
兔渗漏模型(实施例2中描述)用来评估优化的抗VEGF抗体是否在注射后20日抑制血管渗漏(图6)。加肽标签的抗体NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37均显著抑制荧光素渗漏，而等摩尔的雷珠单抗则不显著抑制(图6)。与未加标签的抗体-雷珠单抗相比，加结合HA的肽标签的抗体均具有在第20日更高的药物终浓度(图6)。雷珠单抗的玻璃体终末浓度是5ng/ml，而NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37的玻璃体终末浓度分别是231ng/ml、533ng/ml、343ng/ml、722ng/ml和646ng/ml。对于雷珠单抗，这代表0.2％的注射剂量，而优化的抗VEGF抗体的玻璃体终末浓度代表5.6-17.4％的注射剂量。因此，加肽标签的抗体注射剂量百分数在第20日大约28-87倍高于雷珠单抗的注射剂量百分数。药物终末水平和起始剂量用来计算2点PK曲线(图7)。结果显示雷珠单抗、NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37的半衰期值分别是2、4.2、5.6、4.8、5.7和6.8日。因此，与未加标签的抗体(例如：雷珠单抗)相比，与抗体连接的结合HA的肽标签改善NVS1、NVS2、NVS3、NVS36和NVS37的半衰期约2-3.5倍。
这表示加肽标签的抗体的清除作用比未加标签的抗体更缓慢，并且从眼中更慢的清除作用导致在稍后时间与效力增加相关的较高药物水平。加标签的抗体经改造与透明质酸结合，因而延缓抗体从眼中的清除。加标签的抗体的较高药物终末水平、在第20日较高的注射剂量百分数和较长的眼半衰期与这种作用机制一致。因为存在较高水平的加结合HA的肽片段标签的抗体，采用加标签的抗体给药导致更大地抑制VEGF水平。较低VEGF水平与血管渗漏量减少和效力持续时间增加相关(图6和7)。在人wet AMD患者中，需要抑制VEGF水平以防止新血管形成活动复发，并且VEGF水平增加与疾病活动度恢复相关(Muether等人,2012)。因此，与未加标签的抗VEGF抗体相比，预计用加结合HA的肽片段标签的抗体治疗视网膜血管病(例如，wet AMD)患者具有较长的作用持续时间，因而通过维持效力，同时引起给药频率降低有益于患者。
实施例9：兔中NVS1和NVS2的第20日第30日纵向效力和终末PK
为了确定NVS1和NVS2的效力持续时间增加程度，如下文所述，调整兔渗漏模型以评估NVS1和NVS2的效力(图8和图9)。在这些研究中，将6.2μg/眼的NVS1和NVS2(与5μg/眼雷珠单抗等摩尔)以玻璃体内方式在hVEGF攻击之前18、21、24，26或28日施用至不同的兔组。hVEGF攻击后48小时，如上文所述评估荧光素渗漏。在一项研究中，NVS1在全部时间点均实现相似的效力(76-86％)(图8)。NVS1和NVS2均在第20日(81-85％)和第30日(64-67％)实现相似的效力(图9)。与之相反，在hVEGF攻击之前第20日等摩尔剂量的雷珠单抗不抑制血管渗漏(图3)。
一旦完成测量血管渗漏的成像，如上文所述，将动物处死并将眼摘出并处理以便定量玻璃体中总抗体浓度。在IVT给药后第20-21日，雷珠单抗的玻璃体浓度是大约5ng/ml(图6和7)。与之相反，NVS1的玻璃体终末浓度在第20、第23、第26、第28和第30日分别是459ng/ml、261ng/ml、202ng/ml、145ng/ml和142ng/ml，显示眼停留时间明显改善。这些玻璃体终末浓度用来计算NVS1的2点和6点PK曲线(图10)。结果是NVS1的眼半衰期值分别是4.2日和5.2日，表明与雷珠单抗相比NVS1的半衰期改善约2-2.5倍，这类似于图7中的结果。
与没有结合HA的肽标签的抗体相比，用结合HA的肽标签改造的抗体显示抗体从眼的清除作用下降。较高的药物终末水平和较长的眼半衰期与这种作用机制一致。因为在更晚时间点存在较高的NVS1水平，所以与未加标签的抗体相比，用加肽标签的抗体给药导致时间更长地对VEGF水平的更大抑制。在人wet AMD患者中，需要抑制VEGF水平以防止新血管形成活动复发，并且VEGF水平增加与疾病活动度恢复相关(Muether等人,2012)。因此，与未修饰的抗VEGF抗体相比，预计用与结合HA的肽标签连接的抗VEGF抗体治疗wet AMD患者具有较长的作用持续时间，因而通过维持效力，同时引起给药频率降低有益于患者。
实施例10：NVS1和NVS4在食蟹猴中耐受性、效力和终末PK的28 天研究
热性激光诱导脉络膜新血管形成的食蟹猴模型
在食蟹猴热性激光诱导脉络膜新血管形成模型中，激光用来破坏RPE和脉络膜之间的膜屏障(Bruch’s膜)，这导致在激光烧伤部位的新血管形成。可以使用荧光素血管造影术测量损害尺寸和在损害处的渗漏。为了确定作用持续时间，抗VEGF分子可以在热激光手术之前的多个时间施用。施用抗VEGF分子和激光处理之间的间隔时间决定抗VEGF分子的作用持续时间。
环黄斑视网膜局灶性热激光消融法是一种产生脉络膜新血管形成(CNV)损伤以评价年龄相关性黄斑变性(AMD)疗法的常用方法。基于先前基准研究，确定在产生有临床相关的IV CNV损害(级别I–IV用来评定损害严重程度)，使用657nm红色氪激光比绿色氩激光(532nm)更有效。采用675nm氪激光时，可以实现激光处理后超出4周的渗漏持续时间延长，并且因此认为这适合在数周至数月范围内评价抗VEGF药物的作用持续时间。
猴中的玻璃体内(IVT)注射
以***(5-20mg/kg)，咪达***(0.05-0.5mg/kg)和格隆溴铵(0.005mg/kg)的IM混合物镇静未用过药的非人灵长类(食蟹猴)(N＝3，2.4-5.8kg)。如果需要，以静脉内补充性小剂量(0.25-0.5ml)的丙泊酚(2-5mg/kg)维持麻醉深度。将猴仰卧置于加热的手术台上手术显微镜下。眼睑和毗邻组织用碘伏棉拭子棒清洁并将无菌手术膜铺在实验眼上。在接受1-2滴0.5％眼科用碘伏之前，每只眼用0.5％丙对卡因眼***滴入以显效。用无菌BSS淋洗眼并且微海绵用来吸去多余流体。安置儿科用开睑器以拉下眼睑。将Gen凝胶置于外科放大接触透镜(OcularInstruments)的角膜小口中，以增强通过手术显微镜可视化玻璃体和视网膜。细镊子用来夹住结膜并温和地转动眼以暴露角膜缘后在3mm处的注射部位。将0.3cc monoject注射器连同连接的29G针***，斜向下和朝向视网膜呈现角度。一旦斜角可见并定位用于玻璃体中部递送供试品，缓慢地压下柱塞以输送50μl体积材料。缓慢抽出针头并将注射部位用细镊子夹紧以最小化或防止供试品或玻璃体液的任何回流。全部眼均接受1-2滴局部眼用Vigamox(Alcon)以防止感染。记录全部注射观察结果。在送回笼舍之前，对动物给予麻醉拮抗药和预防性镇痛药。
热激光手术
以***(5-20mg/kg)、咪达***(0.05-0.5mg/kg)和格隆溴铵(0.005mg/kg)的IM混合物镇静猴。在手术期间，以静脉内补充性小剂量(0.25-0.5ml)的丙泊酚(2-5mg/kg)维持麻醉深度。在激光处理之前获得基线彩色眼底照片并且用来预定位多个激光烧伤，以确保它们与中心凹等距离并彼此等距离以便最小化这类影响如局灶性视网膜血管出血、CNV损伤合并和干扰中心凹功能。将镇静的动物在订制设计的倾斜式移动成像平台侧卧安置，以定位头部与安装裂隙灯的激光器或成像***照相机透镜对齐用于每次手术。将单滴局部用Alcaine(0.5％丙对卡因，Alcon)滴入每只眼中，此后在小口中安置1X Reichel Mainster接触透镜(Ocular)连同GenTeal凝胶使用600mW、75μm点大小；0.01-0.1秒单脉冲持续时间，红色氪激光设定(Novus Varia Three Mode Laser System,)，在双眼中中心凹外部产生四处激光烧伤。手术后，对猴给予麻醉拮抗药和和预防性镇痛药24小时。
图像采集
在麻醉前30分钟对猴给予IM Zofran(0.1mg/kg)和Benadryl(2.2mg/kg)，以使不可预测性荧光素钠所致呕吐的出现最小化。以***(5-20mg/kg)、咪达***(0.05-0.5mg/kg)和格隆溴铵(0.005mg/kg)的IM混合物镇静猴。在手术期间，以静脉内补充性小剂量(0.25-0.5ml)的丙泊酚(2-5mg/kg)维持麻醉深度。全部成像模式均在基线处、激光处理后和激光处理后2周进行，以记录CNV损伤的外观、厚度和渗漏。彩色眼底镜检查(Zeissff450+N照相机，Carl Zeiss Meditec)用来记录视网膜中央50度的临床外观。还实施红外眼底镜检查、荧光素血管造影术和SD-OCT(Spectralis，Heidelberg Engineering)。在静脉内推注0.1-0.2ml/kg 10％ 后五分钟处使用晚期荧光素血管造影术评估CNV渗漏。还使用5°x15°7线SD-OCT网格内的单线测量CNV损害厚度以覆盖每个烧伤占据的近似面积。用软件测量从RPE至ILM的距离。计算每组的平均厚度和额外终点以评价药物治疗组和对照的效力。
CNV评定方案
在静脉内注射荧光素后五分钟处所获得的晚期荧光素血管造影术图像用来利用广泛接受的四分评定量表主观评定CNV损害(Covance和Krystolik ME等人,Arch Ophthalmol 2002；12:338)。使用以下主观评定量表，不知情、训练有素的评定员评定每个损害(表7)。I级：无过度荧光；II级：显示过度荧光同时无渗漏；III级：早期或中间过渡图像中有过度荧光和晚期渗漏；级别IV：处理区域之外显示过渡和晚期渗漏的明亮过度荧光
IV级损害定义为临床上显著。计数每个组的IV级损害平均数目并用来从每个治疗组产生的激光烧伤总数计算抑制百分数。
使用用过药的食蟹猴，在食蟹猴中实施一项前导性研究，所述用过药的食蟹猴已经以激光如先前所述处理并且被用作盐水对照(图11)。主要读数是NVS1的眼耐受性。另外，在这些动物中，存在如通过荧光素血管造影术所测量的持续性血管渗漏，从而还进行了一项药理活性初步评定。每组总计两只动物(总共4只眼)接受玻璃体内抗VEGF抗体，200μg/眼的NVS1或214μg/眼的NVS2。在药物施用前当日，随后在第2、第7和第28日进行评价(裂隙灯、荧光素血管造影术)。在第28日，如所述那样处死动物，摘出眼，并提取玻璃体以测定药物终末水平。
通过ELISA对食蟹猴眼终末PK定量
使用如下文描述和在图12中显示的标准方法，比较食蟹猴玻璃体中NVS1和NVS4的眼PK曲线。
将摘出的眼剖分并且将玻璃体与其他组织分离并使用TissueLyzer进一步机械匀浆。通过ELISA测量玻璃体中的抗体水平。Maxisorp 384孔平板(Nunc 464718)用碳酸盐缓冲液(28382)中的VEGF(05/10/2011)在4℃包被过夜。在各次温育之间，使用洗板器，将平板用TBST(THERMO28360)洗涤3次。次日，将平板在室温用TBS中的封闭缓冲液(5％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％Triton X-100(P234729)封闭2小时(或在4℃封闭过夜)。将样品稀释于稀释剂(TBS中的2％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％Triton X-100(P234729))中并在平板在室温温育1小时伴以温和振摇。随后，将山羊抗人抗体(bethyl A80-319A)添加至平板在室温持续1小时伴以温和振摇。检测抗体是与HRP缀合的兔抗山羊IgG(H+L)(THERMO31402)。将检测抗体在室温伴以温和振摇下添加至平板持续1小时。添加Ultra TMB持续15分钟(THERMO34028)。反应用2N硫酸猝灭(Ricca8310-32)。在(450–570nm)上读取样品的吸光度。为了反算来自眼组织的Fab回收水平，使用纯化的标准物。对于标准物，所用的最高浓度是200ng/mL，按2倍稀释。
测量玻璃体提取物中的药物终末水平并用来产生2点PK曲线(图12)。未加标签的抗体NVS4具有眼半衰期2.09日，而NVS1具有眼半衰期7.03日。因此，结合HA的肽标签改善眼PK超过3倍。这些结果表明：1)与结合HA的肽标签连接的蛋白质可以在非人灵长类中安全地施用，2)与结合HA的肽标签连接的蛋白质可以在wet AMD模型中有效，和3)可以通过蛋白质与结合HA的肽标签连接，将高的药物水平维持较长时间段。
实施例11：食蟹猴中NVS1和雷珠单抗的51天终末PK
向食蟹猴组(3只动物/组＝6眼/组)玻璃体内施用263μg/眼雷珠单抗或324μg/眼NVS1(NVS1：与雷珠单抗剂量等摩尔)。在施用后21日或51日，处死动物，摘出眼，并通过Gyrolab ELISA测量药物终浓度(图13)。
通过Gyrolab ELISA对食蟹猴终末PK定量
玻璃体样品在室温融化10分钟。在96孔PCR平板(THERMOAB-800，0.2mL Skirted 96孔PCR平板)中，将NVS1样品在Rexxip AN缓冲液(Inc.目录号P0004994)中1:10稀释，而将雷珠单抗样品在Rexxip AN缓冲液中1:4稀释。将样品密封(Inc.，微量平板箔目录号P0003313)并在平板摇床中彻底混合1分钟。确保孔底中不存在空泡，将样品置于GyrolabTM xP工作站中。在GyrolabTM xP工作站上执行一个3步骤C-A-D方法；首先使捕获抗体流过该***，随后流过分析物(样品)，并且随后流过检测物(detector)，在每个步骤之间进行PBS 0.01％Tween20(Calbiochem,Inc.目录号655206)洗涤。在Rexxip AN中含有10％兔玻璃体(LLC.目录号食蟹猴玻璃体)的稀释剂内制备游离型(不与VEGF结合)NVS1量值的标准曲线。将标准物从6000ng/mL1:6连续稀释至0.129ng/mL。
在Rexxip AN中含有25％兔玻璃体(LLC.目录号食蟹猴玻璃体)的稀释剂内制备雷珠单抗TM量值的标准曲线。将标准物从6000ng/mL1:6连续稀释至0.129ng/mL。
在第51日，NVS1和雷珠单抗的平均浓度分别是2070ng/mL和<0.1ng/mL。数据表示对于NVS1，在第51日的玻璃体浓度高于第21日时雷珠单抗的那些玻璃体浓度。起始剂量和第21日及第51日眼药物水平用来计算3点PK曲线(图13)。这些曲线显示，雷珠单抗和NVS1的眼半衰期值分别是2.6日和8.2日，并且显示连接结合HA的肽标签至抗体可以改善猴中的眼PK约3倍。这些结果显示用结合HA的肽标签加标签的抗体的半衰期在眼中明显增加。NVS1抗体经改造与透明质酸结合，因而延缓抗体从眼中的清除过程。随时间推移的较高药物终末水平和较长眼半衰期与这种作用机制一致。
可以在动物中模型如食蟹猴激光CNV(这是wet AMD模型)测试这种延长的效力持续时间。动物将在热激光处理前的多个时间(例如，在0周和8周之间)给药。剂量组将例如包括溶媒对照组(例如，盐水)、用未加标签的对照抗体(例如，雷珠单抗或NVS4)处理的组和用结合HA的肽标签加标签的抗体(例如，NVS2)处理的组。处理足够数目的动物(例如，每个治疗组15-20只动物)将允许统计区分未加标签的抗体和以结合HA的肽标签加标签的抗体之间的效力持续时间。
实施例12：与结合HA的肽标签连接的抗VEGF蛋白增加抗VEGF 蛋白在人类个体中半衰期、终浓度和效力持续时间的用途
12a：肽标签增加更高的终浓度和作用持续时间
与未加标签的蛋白质相比，用与结合HA的肽标签例如，具有SEQ IDNO:32、33、34、35或36的序列的肽标签)连接的抗VEGF蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)治疗在稍晚时间导致更高的药物水平，因此对游离VEGF水平存在更长时间的更大抑制作用。较低游离VEGF水平与疾病病变量减少和效力持续时间增加相关。在人wet AMD患者中，需要抑制VEGF水平以防止新血管形成活动复发，并且VEGF水平增加与疾病活动度恢复相关(Muether等人,2012)。因此，与未加标签的抗VEGF蛋白相比，用与如本文所述的结合HA的肽标签连接的抗VEGF蛋白(例如：NVS1、NVS2、NVS3、NVS36或NVS37)治疗wet AMD患者将具有较长的作用持续时间，因而通过维持效力，同时引起给药频率降低有益于患者。图14A-C中显示这种给药方案的例子。目前，在人类wet AMD患者中每28日玻璃体内给予500μg/眼雷珠单抗以实现最大VEGF抑制和最大目视改善。将等摩尔浓度的加肽标签的抗VEGF蛋白(0.62mg)如此玻璃体内给药，从而玻璃体浓度大于第28日时的雷珠单抗浓度。在图14A中，用于模拟的灰色条带指示以KD 1.7μM与5–15％人玻璃体HA(250μg/ml)结合的加肽标签的抗VEGF蛋白的预测范围。在图14B中，用于模拟的灰色条带指示以范围0.48至7.2μM的KD与15％玻璃体HA结合的加肽标签的抗VEGF蛋白的预测范围。将效力持续时间对HA的KD作图(图14C)，对与5％或15％人玻璃体HA结合的加肽标签的抗VEGF蛋白的KD作图。将效力持续时间定义为为达到第28日雷珠单抗的玻璃体浓度所耗费的时间。全部模拟假定加肽标签的抗VEGF蛋白与玻璃体HA可逆性结合。假定不清除加肽标签的抗VEGF蛋白，例外是加肽标签的抗VEGF蛋白解离以形成游离的HA和游离加肽标签的抗VEGF蛋白。对于加结合HA的肽标签的标签的其他眼治疗药(例如包括其他抗VEGF抗体和结合其他眼部靶的抗体)，预计相似的作用持续时间延长和给药频率降低。
与每月一次或每二月一次雷珠单抗或其他未加标签的抗VEGF分子给药相比，按500μg/眼每四个月一次给药的加肽标签的分子如NVS1、NVS2、NVS3、NVS36或NVS37预计实现相似量的VEGF抑制作用和同步视力改善。在患有其他视网膜血管病的人类患者中，游离VEGF水平和疾病活动度的相似相关性是可能的，因此，采用相似剂量的加标签的抗VEGF抗体时，预计具有与加标签的抗VEGF抗体相似的效力持续时间延长。
12b：半衰期增加对眼药物浓度和给药间隔时间的影响。
相对于无肽标签的分子，连接本发明的肽标签至用于眼内递送的分子可以增加其眼半衰期。与未加标签的分子相比，以结合HA的肽标签增加分子的眼半衰期可以显著地增加给药后药物水平，并且与未加标签的分子相比，加结合HA的肽标签的分子将在玻璃体中耗费更长时间达到它不再治疗有效的浓度水平。
从玻璃体清除玻璃体内施用的生物分子已经显示符合一级指数衰减函数(等式1)(Krohne等人,2008；Krohne等人,2012；Bakri等人,2007b；Bakri等人,2007a；Gaudreault等人,2007；Gaudreault等人,2005)。
Ct＝Ct＝0*e-kt
速率常数k是：
Ct是玻璃体内施用后时间t处的浓度。
Ct＝0是玻璃体内施用后时间0处的浓度。
T1/2是玻璃体内施用后的眼半衰期。
以结合HA的肽标签增加分子的玻璃体内半衰期的影响可以使用以上等式进行建模。为了本实施例的目的，假定未加标签的分子具有5日的眼T1/2。在图14D中，曲线显示在多个时间处剩余的药物的相对量(在时间＝0处100％药物)，和眼T1/2增加25％、50％、75％和100％的影响。图14D显示增加眼半衰期导致玻璃体内施用的分子在初始剂量后全部时间处的较高浓度。表7a显示按30天间隔时间时剩余分子的量(作为初始剂量的百分数)。表7b显示相对未加标签的模型半衰期5天而言剩余的分子的量。例如，半衰期增加25％(例如：从5.0增至6.25天)导致第30日处的药物水平增加2.3倍、第60日处的药物水平增加5.28倍，第90日处的药物水平增加12.13倍、第120日处的药物水平增加27.86倍、第150日药物水平增加64倍。半衰期增加50％(例如：从5.0增至7.5天)导致第30日处的药物水平增加4倍、第60日处的药物水平增加16倍，第90日处的药物水平增加64倍、第120日处的药物水平增加大于250倍、第150日药物水平增加大于1000倍。半衰期增加75％(例如：从5.0增至7.5天)导致第30日处的药物水平增加4倍、第60日处的药物水平增加16倍，第90日处的药物水平增加64倍、第120日处的药物水平增加大于250倍、第150日药物水平增加大于1000倍。半衰期增加100％(例如：从5.0增至10.0天)导致第30日处的药物水平增加8倍、第60日处的药物水平增加64倍，第90日处的药物水平增加大于500倍、第120日处的药物水平增加大于4000倍、第150日药物水平增加大于32000倍。
表7：
因此，增加分子的眼半衰期的肽标签(例如：和结合HA的肽标签)可以显著地改善眼中的药物浓度(即：药物终浓度)并且因此导致增加效力持续时间和延长给药间隔时间。
12c：肽标签增加半衰期、效力持续时间并降低血浆暴露量
可以使用标记的分子和非侵入成像技术如PET或荧光显微术或通过提取眼内流体如玻璃体或眼房水并使用本领域已知的标准ELISA、MSD测定法或质谱法测量浓度，在眼中直接测量输送至眼的分子(即：加肽标签的分子或未加标签的分子)的眼清除率或药代动力学。对于输送至眼的分子，分子在全身循环中的出现取决于从眼的清除速率。这种分子在全身循环中出现的速率和浓度可以用来确定该分子在眼中的药代动力学(Xu L等人,Invest Ophthalmol Vis Sci.,54(3):1616-24(2013))。
可以使用眼PK结合模型类似地评估并预测加肽标签的分子的眼药代动力学。在这个模型中，Fab以特定Kon和Koff速率与一部分玻璃体HA结合。不与HA结合时，Fab将按照与雷珠单抗相同的速率(8.6天半衰期)离开眼并进入血清。基于HA结合模型与来自食蟹猴IVT研究的玻璃体终末浓度数据拟合，估计大约15％猴玻璃体HA与Fab结合。
这个模型可以用来预测加肽标签的分子如NVS2在4.5mL人玻璃体中的眼及血清药代动力学，假定Fab按4:1HA对Fab化学计量、Kon 2x106M-1秒-1和KD 1.7μM与约5-15％人玻璃体HA结合(250μg/mL)。在血清中，加肽标签的分子将具有与雷珠单抗相同的全身分布。使用这个结合模型，将加标签的肽分子的眼及血清模型预测结果与其他抗VEGF分子如雷珠单抗、阿柏西普和贝伐单抗比较。
雷珠单抗眼-血清PK模型基于edXu L等人,Invest Ophthalmol VisSci.,2013。贝伐单抗眼-血清PK模型基于9.82天眼半衰期(Krohne TU等人,Am J Ophthalmol,146(4):508-12(2008))、生物利用率F＝0.65-0.95和如贝伐单抗临床药理学综述STN-12085/0中所述的全身分布。阿柏西普模型使用眼半衰期约4天和如Thai HT等人,Br J Clin Pharmacol,72(3):402-14(2011)中建模的全身分布。
这个预测中眼内的效力持续时间定义为0.5mg IVT施用后每个分子达到28日雷珠单抗的眼浓度所耗费的时间。在加肽标签的分子模拟上的误差线表示NVS2加肽标签的分子的预测范围。加肽标签的分子(例如：NVS2)预测为在IVT低剂量0.08mg时实现一个月效力。加肽标签的分子还预测为提供比0.5mg雷珠单抗更低的血清暴露量。基于阿柏西普标记中所用的给药间隔时间，对阿柏西普的2个月持续时间作图。阿柏西普血清预测结果对应于3q4w施用、接着q8w施用后的游离PK，如阿柏西普标记中所述。
用结合HA的肽标签给分子(例如，和抗VEGF蛋白)加标签导致从眼清除更慢。较慢的眼清除作用导致加肽标签的分子在全身循环中延迟出现并且达到的最大血清浓度低于无肽标签的分子，如图14E中所示。当加标签的和未加标签的分子按等摩尔剂量施用时，加肽标签的分子(例如：NVS2)的全身暴露量显著小于未加标签的分子(例如：雷珠单抗)。NVS2的血清浓度在全部等摩尔剂量均明显低于雷珠单抗。对加标签形式的阿柏西普(例如：NVS80T)和贝伐单抗(例如：NVS81T)预期类似的结果。
实施例13：产生与结合HA的肽标签连接的另外蛋白质和核酸
为了检验结合HA的肽标签延长蛋白质或核酸在眼中半衰期的能力，将本发明的肽标签与结合多种眼部蛋白靶的多种抗体、蛋白质和核酸连接。
产生加肽标签的抗体和蛋白质
加标签的和未加标签的重组抗体和蛋白质通过在HEK293细胞中瞬时转染哺乳动物表达载体来表达并使用标准亲和树脂例如KappaSelect(目录号17-5458-01，GE Healthcare)和HisTrap(目录号17-5255-01,GE Healthcare)纯化。检验了各种抗体和蛋白质样式，包括：Fab、IgG、Fc Trap和蛋白质。这些抗体和蛋白质靶向几种眼部靶，例如C5、因子P、EPO、EPOR、TNFα、因子D、IL-1β、IL-17A、FGFR2或IL-10.
如上文所述，利用GSGGG接头(例如：SEQ ID NO:31)，通过将结合HA的标签序列与Fab的重链的C末端连接，产生与单个肽标签连接的Fab。为了产生加肽标签的IgG(例如：含有结合HA的标签序列的IgG融合物)，利用GSGGG接头(例如：SEQ ID NO:31)，将结合HA的标签序列与IgG的重链或轻链的C末端融合。为了产生含有Fc部分(例如，结合HA的标签连接的Fc trap蛋白)的加肽标签的蛋白质，利用GSGGG接头(例如：SEQ ID NO:31)，将结合HA的标签与蛋白质的Fc部分的C末端连接。为了产生另外的加肽标签的蛋白质，利用GSGGG接头(例如：SEQ IDNO:31)，将结合HA的标签与目的蛋白的C末端连接。在上文描述的全部情况下，候选物的产生使得合成编码所需蛋白质的氨基酸的核苷酸，随后使用上文描述的哺乳动物表达***表达和纯化。
也可以转化本文中例举加肽标签的抗体和肽抗原结合片段并以替代性抗体样式使用。例如，加肽标签的IgG可以转化成加肽标签的Fab或加肽标签的scFv，或反之亦然。
产生加肽标签的核酸
核酸，包括RNA或DNA适配体，可以如下文描述缀合至结合HA的肽。向B-3-(2-羧乙基)-1-(1-(2-肼基-4-甲基戊酰)吡咯烷-2-基)-6-(1-羟乙基)-1,4,7,10-四氧-2,5,8,11-四氮杂三癸-13-酸(198mg，0.280mmol)ACN(体积：1.75mL)中的溶液在室温添加DIPEA(0.098mL，0.559mmol)和A-(3S,6S)-1-((S)-1-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰)吡咯烷-2-基)-3-(2-羧乙基)-6-((R)-1-羟乙基)-1,4,7,10-四氧-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸(32mg，0.056mmol)在DMSO(体积：1.75mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌1小时并且随后使用Sunfire Prep C18纯化，用10％至90％ACN-水+0.1％TFA洗脱以提供27mg纯的所需产物C-(3S,6S)-3-(2-羧乙基)-1-((S)-1-((S)-34-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-异丁基-4,34-二氧-7,10,13,16,19,22,25,28,31-九氧杂-3-氮杂四三十烷-1-oyl)吡咯烷-2-基)-6-((R)-1-羟乙基)-1,4,7,10-四氧-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸。向D-ARC126-NH2(NaHCO3pH 8.5缓冲液中25mg/ml)(18.63mg，230μl，1.807μmol)的溶液添加C-(3S,6S)-3-(2-羧乙基)-1-((S)-1-((S)-34-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-异丁基-4,34-二氧-7,10,13,16,19,22,25,28,31-九氧杂-3-氮杂四三十烷-1-酰基)吡咯烷-2-基)-6-((R)-1-羟乙基)-1,4,7,10-四氧-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酸(100mg/ml在DMSO中)(5.26mg，52.6μl，4.52μmol)。将反应在室温搅拌1.5小时。使粗制物穿过3K MW CO Amicon滤器柱(3KMW临界值)并同时与分选酶缓冲液0.1M Tris pH 8.0+CaCl20.01M+NaCl 0.15M进行缓冲液交换。向F–HA-肽标签(287μL，0.047μmol)在Tris 0.25M pH 7.4+CaCl25mM和NaCl150mM(体积：313μL)中的溶液添加E(57.4μL，0.703μmol)，随后使分选酶A在珠(87μL，0.016μmol)上固定化。将混合物在20℃搅拌2日。所得到的适配体-HA结合肽缀合物是NVS79T。
表8:与结合HA的肽标签连接的蛋白质和核酸的例子
例举的蛋白质和核酸涵盖结合眼中不同靶的蛋白质和核酸的多种例子。
NVS ID 眼部靶 HA标签 形式 HA标签的位置
NVS70 C5 无 Fab 无
NVS70T C5 SEQ ID NO:33 Fab NVS70重链的C末端
NVS71 因子P 无 Fab 无
NVS71T 因子P SEQ ID NO:33 Fab NVS71重链的C末端
NVS72 EPO 无 Fab 无
NVS72T EPO SEQ ID NO:33 Fab NVS72重链的C末端
NVS73 TNFα 无 Fab 无
NVS73T TNFα SEQ ID NO:33 Fab NVS73重链的C末端
NVS74 因子D 无 Fab 无
NVS74T 因子D SEQ ID NO:33 Fab NVS74重链的C末端
NVS75 IL-1β 无 Fab 无
NCS75T IL-1β SEQ ID NO:33 Fab NVS75重链的C末端
NVS76 IL-17A 无 Fab 无
NVS76T IL-17A SEQ ID NO:33 Fab NVS76重链的C末端
NVS77 FGFR2 无 Fab 无
NVS77T FGFR2 SEQ ID NO:33 Fab NVS77重链的C末端
NVS78 EPO 无 Fc Trap 无
NVS78T EPO SEQ ID NO:33 Fc Trap NVS78的Fc的C末端
NVS90 EPOR 无 蛋白质 无
NVS90T EPOR SEQ ID NO:33 蛋白质 NVS90的C末端
NVS79 PDGF-BB 无 适配体 无
NVS79T PDGF-BB SEQ ID NO: 33 适配体 化学地与NVS79缀合
NVS91 IL-10R 无 蛋白质 无
NVS91T IL-10R SEQ ID NO:33 蛋白质 C末端
表8b:加肽标签的分子的序列
加下划线的序列表示用于所述的克隆(即：GGGGG，SEQ ID NO:187)或纯化方法(例如：六组氨酸肽，HHHHHH，SEQ ID NO:188)的额外任选序列。
表9:与结合HA的肽标签连接的VEGF结合蛋白的例子
例子包括与结合HA的肽片段连接的scFv、Fab、全长抗体、DARPin和Fc trap蛋白
表9b:与结合HA的肽标签连接的VEGF结合蛋白的序列
实施例14：实施例13的加肽标签的蛋白质和核酸的进一步表征
通过如实施例7中所述的Biacore测量与HA结合肽标签融合的蛋白质Fc Trap、全长抗体、DARPin和scFv的结合亲和力。
14a：Biacore亲和力测定
在Biacore上分析加肽标签的蛋白质和未加标签的亲本蛋白质的亲和力以如上文实施例7中所述确定对它们主要靶(ex:因子P、C5、TNFα、FGFR2、VEGF、因子D、EPO、IL-17、IL-10R)以及对HA结合的动力学。为了确定HA动力学，在BIOCAP Biacore样式中使用生物素酰化的HA，其中捕获生物素酰化的HA并且使样品蛋白质以各种浓度流过。在如实施例7中所述的亲和力测量中使用生物素酰化的靶配体和生物素酰化的HA：Biacore亲和力测定
使用抗Fab方法测定靶动力学和亲和力：
对于抗Fab捕获法，使用来自的人Fab捕获试剂盒(GE28958325)。关于更详细信息，参考目录编号。对于这种方法，使用HBS-EP+运行缓冲液(teknova H8022)。使用ACM5芯片(BR-1005-30)，并且为此，将抗Fab多克隆抗体根据方案固定化以实现大约5,000RU。参考网址上的目录编号以获得更详细的信息。两个流动小室用于这种方法。流动小室1充当仅含有固定化抗fab试剂的参考小室并且流动小室2充当含有抗fab试剂和蛋白质样品的结合小室。这种方法中测试的蛋白质样品是抗C5、因子P和EPO特异性的。将蛋白质样品以流速10μl/分钟捕获持续特定接触时间，以实现Rmax为20的RU信号。由于蛋白质分析物对其靶具有强亲和力，因此靶分析物的起始浓度将在大约10nM开始并将包括8个连续稀释点。使靶分析物按60μl/分钟流过240秒，取决于样品，伴以大于1000秒短解离时间和更长解离时间。
表10:多种加肽标签的分子的结合亲和力。测量HA和蛋白质靶结合作用。
与结合HA的肽标签连接的全部Fab和蛋白质均显示相似的HA结合亲和力并保留与其主要靶的结合作用(表10)。实际上，与未加标签的分子相比，肽标签的存在改善分子的主要靶结合亲和力(参见实施例15b)。
表11:加肽标签的分子的HA和VEGF结合亲和力。
与结合HA的肽标签连接的全部Fab和蛋白质均显示相似的HA结合亲和力并保留与其主要靶的结合作用(表10)。实际上，与未加标签的分子相比，肽标签的存在改善分子的主要靶结合亲和力(参见实施例15b)。
14b：兔常规眼PK测定
使用如下文描述及在图15和表12中显示的标准方法，将兔玻璃体中与结合HA的肽标签连接的抗体、Fc trap和蛋白质的眼终末浓度与其未加标签的形式比较。
将5μg/眼(约105皮摩尔)未加标签的抗体和6.5μg/眼(约105皮摩尔)加标签的抗体以玻璃体内方式注射入兔眼(每种抗体N＝6只眼)。在注射后21日处死兔并将眼摘出。将摘出的眼剖分并且将玻璃体与其他组织分离并使用TissueLyzer进一步机械匀浆。通过ELISA测量或质谱法玻璃体中的抗体水平。
ELISA方法
Maxisorp 384孔平板(Nunc 464718)用碳酸盐缓冲液(Pierce 28382)中的山羊抗人IgG(H+L)(Thermo Fisher 31119)在4℃包被过夜。在各次温育之间，使用BioTek洗板器，将平板用TBST(THERMO28360)洗涤3次。次日，将平板在室温用TBS中的封闭缓冲液(5％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％TritonX-100(P234729)封闭2小时(或在4℃封闭过夜)。将样品稀释于稀释剂(TBS中的2％BSA(A4503)、0.1％Tween-20(P1379)、0.1％Triton X-100(P234729))中。将样品在平板上在室温伴以温和振摇下温育1小时。检测抗体是与HRP缀合的山羊抗人IgG[F(ab')2])(Thermo Fisher 31414)。将检测抗体在室温伴以温和振摇下添加至平板持续30分钟。添加Ultra TMBed持续15分钟(Thermo Fisher34028)。反应用2N硫酸猝灭(Ricca8310-32)。在SpectraMax(450–570nm)上读取样品的吸光度。为了反算来自眼组织的Fab回收水平，使用纯化的标准物。对于该标准物，2倍稀释时，使用的最大浓度是200ng/mL。不同对的抗体可以用于从兔组织回收Fab。
用于NVS90和NVS90T的ELISA方法
使用包被缓冲液(PBS)和温育缓冲液(含2％BSA(Sigma目录号A4503)和0.1％Tween-20和0.1％Triton-X的PBS)，使用标准结合MSD平板(Meso-Scale384孔：MSD目录号L21XA)实施测定法。将捕获抗体EPO26(Cell Sceinces，目录号26G9C10)以PBS(25μl)中的1μg/ml包被，并在4℃温育过夜。将平板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)中洗涤3次，并且用25μl温育缓冲液在室温封闭2小时。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。将温育缓冲液中的玻璃体稀释物添加至平板(25μl)，并在室温温育60分钟。使用人重组Darbepoietin作为Darbepoietin样品的标准物(11096-26-7，A000123，始于5μg/ml)。使用NVS90T作为NVS90T样品的标准物(始于5μg/ml)。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。添加25μl第一抗体(温育缓冲液中1μg/ml)，并在室温温育60分钟。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。添加25μl抗物种第二Sulfo-TAG抗体(MSD目录号R32AJ-1)并在室温温育60分钟。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次，并添加25μl 1x MSD读数缓冲液T(含表面活性剂，MSD目录号R92TC-1)。在MSD Spector成像仪上读取平板。
用于NVS78和NVS78T的ELISA方法
使用碳酸盐-重碳酸盐包被缓冲液(通过使用BuPH碳酸盐-重碳酸盐缓冲液Packs，Thermo28382产生)，封闭缓冲液(含5％BSA(Sigma，A4503)的TBST)和稀释缓冲液(含2％BSA的TBST)，使用384板孔MaxiSorp ELISA平板(Thermo Scientific，464718)实施测定法。将链霉亲和素(S000-01)按包被缓冲液(20μl/孔)中的1μg/ml包被，并在4℃温育过夜。将平板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)中洗涤3次，并且用封闭缓冲液(50μl/孔)在室温封闭2小时。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。将稀释剂中的1μg/ml huEpo-生物素添加至平板(20μl/孔)，并在室温温育1小时。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。稀释剂中的玻璃体稀释物添加至平板(20μl/孔)。使用EpoR或EpoR-HA作为标准物，始于浓度1μg/ml。在室温温育平板1小时。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。将20μl检测抗体(山羊抗人Fc-HRP，Thermo目录号31413)添加(稀释剂中1:5000)至平板，并且在室温温育>30分钟。将平板在洗涤缓冲液中洗涤3次。添加20μl单步骤Ultra TMB底物溶液。当阳性孔内溶液颜色变成深蓝色时，添加10μl 2N硫酸终止溶液(RICCA，8310-32)至每个孔中以终止反应。立即在谱仪平板读数计上在OD 450-570nm读取平板(MolecularSpectroMax PLUS 384)。
质谱法
还原、烷基化和消化：
将每个孔中的60μL玻璃体样品在室温融化10分钟。将50mMTris-HCl(FisherBP153-500)中的150μL 8M脲(目录号U15-500)添加至每个样品孔，随后添加4μL 2MDTT(目录号D9779)至终浓度40mM DTT。将平板在58℃加热45分钟以变性蛋白质。随后，冷却平板至室温，随后添加8μL1M碘乙酰胺(目录号No.I1149)至终浓度40mM并且在暗处在室温温育45分钟。通过添加1.3mL 50mM碳酸氢铵(Fisher目录号BP2413-500)，稀释脲的终浓度至2M以下。添加10μL0.1μg/μL胰蛋白酶(目录号V5111)并在37℃过夜温育。
SPE净化和过滤：
在消化后，向每份样品添加甲酸(Fluka，目录号56302-50ML-F)至终浓度1％(v/v)以淬灭胰蛋白酶消化。MCX平板(Waters，目录号186000259)用来净化消化的样品。使用SpeedVac(ThermoFisher Savant)完全干燥从清洁过程收集的样品溶液。一旦样品干燥，将60μL缓冲液(0.1％甲酸，1％ACN(SigmaAldrich，目录号34998-4L)和20pg/μL重元素标记的内标物(由ThermoFisher订制)溶液添加至每个孔，并将平板振摇20分钟。使用针对具有10KDa MW CO的超滤滤器(Pall Life Sciences，目录号8164)的AcroPrepTM高级96孔滤板，过滤重构的肽溶液。
LC-MS/MS分析：
将5μL每份过滤的样品加载到300μm X 150mmC18柱(Waters，目录号186003498)。通过以流率5μL/分钟施加5％B(0.1％甲酸中的乙睛)至20％B的5分钟梯度实现分离。使用Waters Xevo TQS质谱仪(Waters)对每份样品监测两种肽(HC_T3：GPSVFPLAPSSK和DDA2：TGIIDYGIR)，以及每种肽的两种过渡物(HC_T3：594.19/699.82和594.19/847；DDA2：504.58/623.68和504.58/736.84)。对于Eylea和含有构建体的Eylea，使用相同的LC柱和条件，在相同质谱仪上监测来自FNWYVDGVEVHNAK的两种过渡物(560.28/697.76和560.28/709.28)。使用来自这些过渡物的MS信号结果，对含有这些肽的药物分子定量。
Gyrolab法
样品准备
玻璃体样品在室温融化10分钟。随后将5μL玻璃体样品在96孔PCR平板(ThermoAB-800，0.2mL Skirted 96孔PCR平板)中1:2稀释于Rexxip AN缓冲液(GyrosInc..目录号P0004994)中。将样品密封(GyrosInc.，微量平板箔目录号P0003313)并在平板摇床中彻底混合1分钟。确保孔底中不存在空泡，将样品置于GyrolabTM xP工作站中。在GyrolabTM xP工作站上执行3步骤C-A-D方法；首先使捕获抗体流过该***，随后流过分析物(样品)，并且随后流过检测抗体。GyrolabTM xP工作站在每个步骤之间执行PBS 0.01％Tween20(Inc.目录号655206)洗涤。在Rexxip AN中含有50％兔玻璃体(LLC.目录号Rabb-玻璃体)的稀释剂内制备用于测量游离Fc药物的标准曲线。将标准物从6000ng/mL 1:6连续稀释至0.129ng/mL。在Rexxip AN中含有10％兔玻璃体(LLC.目录号Rabb-玻璃体)的稀释剂内制备用于测量Fab药物的标准曲线。将标准物从6000ng/mL 1:6连续稀释至0.129ng/mL。
Fab的检测
在GyrolabTM xP工作站中使用Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc.目录号P0004253)分析总药物构建体和游离纯化的药物构建体。Gyros AB
通过向含有链霉亲和素包被粒子的柱施加100μg/mL生物素标记的VEGF测量游离药物。将玻璃体样品施加至活化的柱并通过毛细作用以25nM alexafluor-647标记的山羊抗人IgG-重链和轻链抗体(Bethyl目录号A80-319A)检测。应当指出：使用LifeTechnologies标记试剂盒(目录号A-20186)进行alexafluor标记。在PBS0.01％Tween 20中制备捕获试剂并且在Rexxip F(GyrosInc.P0004825)中制备检测器试剂。
通过施加100μg/mL生物素标记的山羊抗人IgG-重链和轻链抗体(Bethyl目录号A80-319B)测量总药物。将玻璃体样品施加至活化的柱并通过毛细作用用10nM alexafluor-647标记的山羊抗人IgG-重链和轻链抗体(Bethyl目录号A80-319A)检测。
Fc蛋白的检测
在GyrolabTM xP工作站中使用Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc.目录号P0004253)分析总药物构建体和游离纯化的药物构建体。通过向含有链霉亲和素包被粒子的柱施加100μg/mL生物素标记的VEGF测量游离药物。将玻璃体样品施加至活化的柱并通过毛细作用以25nMalexafluor-647标记的抗人Fc特异性抗体(R10，)检测。通过施加25μg/mL生物素标记的山羊抗人IgG-重链和轻链抗体(Bethyl目录号A80-319B)测量总药物。将玻璃体样品施加至活化的柱并通过毛细作用以12.5nM alexafluor-647标记的山羊抗人IgG-重链和轻链抗体(Bethyl Laboratories，目录号A80-319A)检测。
DARPin的检测
在GyrolabTM xP工作站中使用Bioaffy1000 CD(Gyros AB,Inc.目录号P0004253)分析游离纯化的药物构建体。通过向含有链霉亲和素包被粒子的柱施加25μg/mL生物素标记的VEGF测量游离药物。将玻璃体样品施加至活化的柱并通过毛细作用以6.25nM alexafluor-647标记的Penta HIS抗体(目录号35370)检测。
表12:玻璃体终末浓度和计算的2点眼半衰期(t1/2)值。
结合HA的肽标签(SEQ ID#33)与抗原结合片段(包括NVS70、NVS71、NVS72、NVS73、NVS74、NVS75、NVS76和NVS77等)、Fc trap蛋白NVS78和NVS80等和蛋白质NVS84和NVS90等的融合导致这些分子与未加标签的Fab和蛋白质相比更高的眼终浓度。这些数据显示结合HA的肽标签的融合导致眼半衰期(t1/2)改善，与它所融合的分子无关。因此，融合结合HA的肽标签看起来普遍地增加玻璃体内施用的分子的眼停留时间和眼半衰期。
14c：兔效力持续时间
兔渗漏模型用来评估将结合VEGF的生物制品改造以结合HA是否能在注射后20日抑制血管渗漏(图15)。在这项研究中，在施用hVEGF前18日施用按与其相应亲本分子相等的摩尔剂量的以结合HA的肽标签加标签的各种抗VEGF分子。hVEGF攻击后48小时，如上文所述评估荧光素渗漏。与其未加标签的亲本分子相比，作为未加标签的蛋白质NVS80、NVS81、NVS82和NVS84与结合HA的肽标签(例如：SEQ ID NO:33)的融合物的NVS80T、NVS81T、NVS82T和NVS84T在第20日具有明显的效力。在成像后当日处死动物，摘出眼，加工，并且如上文所述通过Gyrolab测量游离药物(不与VEGF结合)水平。NVS80T、NVS81T、NVS82T和NVS84T的游离玻璃体终末浓度范围从25ng/ml至2422ng/ml并且31-220倍高于它们的未加标签的亲本分子NVS80、NVS81、NVS82、和NVS84(图15)。
这些数据显示融合结合HA的标签引起眼中停留时间和效力持续时间的改善，与它所融合的分子无关。相对于全部相应的亲本分子，添加结合HA的部分增加荧光素抑制作用。因此，玻璃体中加HA标签的构建体的量足以抑制hVEGF并阻断血管渗漏，而未加标签的亲本分子的量则不能。
表13:实施例15c中利用的剂量
NVS ID 剂量(皮摩尔/眼)
NVS81 105
NVS81T 105
NVS82 105
NVS82T 105
NVS80 105
NVS80T 105
NVS84 315
NVS84T 315
效力持续时间的增加表示与眼中透明质酸结合、从眼中清除减少(导致在更晚时间点更高的蛋白质水平)和抑制VEGF较长持续时间。在人wetAMD患者中，需要抑制VEGF水平以防止新血管形成活动复发，并且VEGF水平增加与疾病活动度恢复相关(Muether等人,2012)。因此，与未修饰的抗VEGF抗体或蛋白质相比，预计用结合HA的抗VEGF抗体或蛋白质治疗wet AMD患者具有较长的作用持续时间，因而通过维持效力，同时引起给药频率降低有益于患者。这些实验显示，本发明的结合HA的肽标签可以用来在玻璃体中延长抗VEGF蛋白药物的半衰期、增加其终浓度、减少其清除作用并增加其平均停留时间。
14d：兔中NVS1和NVS1d的第20日效力持续时间和终末PK
兔渗漏模型用来评估相对于加单个标签的构建体(NVS1)，具有两个结合HA的部分的分子(NVS1d)是否将增加效力(图16)。在一半的研究组中，将VEGF的量从400ng/眼增加至1200ng/眼，以在不需要研究持续时间增加情况下检验半衰期增加的分子。在hVEGF攻击之前18日，将等摩尔量的NVS1和NVS1d(二者摩尔数与5μg/眼雷珠单抗相等)以玻璃体内方式施用。半数组接受1200ng/眼hVEGF，而剩余兔如前述实施例中那样接受400ng/眼hVEGF。hVEGF攻击后48小时，如上文所述评估荧光素渗漏。采用400ng/眼hVEGF注射时，NVS1和NVS1d均在第20日实现相似的效力(85-91％渗漏抑制作用)。在以1200ng/眼hVEGF攻击的NVS1d组中，实现显著的荧光素渗漏抑制作用(49％)。与之相反，以1200ng/眼hVEGF攻击的NVS1组无效(-2％)。
从总体上看，用NVS1注射、给药后18日以400ng hVEGF攻击的兔的玻璃体终末浓度范围在598ng/ml和953ng/ml之间，而用NVS1d注射、给药后18日以400ng hVEGF攻击的兔的玻璃体终末浓度范围在1048ng/mL和3054ng/mL之间。因此，与采用NVS1所实现的作用相比，玻璃体中NVS1d的量足以阻抑玻璃体中增加数量的hVEGF。这些数据显示，与仅具有一个结合HA的肽标签的抗体(NVS1)相比，含有对HA具备较高亲和力的两个结合HA的肽标签的抗体(NVS1d)具有显著较长的效力持续时间。
实施例15：加结合HA的肽标签的分子的生物物理特性
15a：等电点和溶解度改善
连接结合HA的标签至各种类型的蛋白质(例如：scFv、Fab、IgG和Fc trap)增加与结合HA的标签连接的亲本蛋白质的总等电点和溶解度。表14显示裸露的未加标签的蛋白质的等电点，以及与结合HA的肽标签连接的相同蛋白质的等电点。
结合HA的肽标签还增加该蛋白质对其主要靶/配体的亲和力。表15显示与结合HA的标签连接的各种蛋白质的亲和力相比，这些相同蛋白质对其主要靶/配体的亲和力。令人惊讶地，与无结合HA的标签的亲本蛋白质相比，与结合HA的标签连接的蛋白质对主要眼部蛋白靶/配体的亲和力增加1.2-75倍。
表14:与连接至结合HA的肽标签的蛋白质相比的蛋白质的等电点
15b：眼部靶结合作用
表15：蛋白质与连接至结合HA的肽标签的相同蛋白质相比的靶配体结合亲和力
这些结果清楚的显示连接结合HA的肽标签至一种抗原结合片段、全长抗体、Fc trap、darpin、scFvs和蛋白质增加了这种蛋白质分子对其主要靶(例如VEGF)的亲和力。这是一种出乎意料的特性，因为结合HA的肽标签在空间上与这些抗VEGF蛋白的靶结合区相距甚远。
实施例16：I -124 标记的雷珠单抗和加HA标签的抗体在大鼠中的生物 分布
如下文描述，使用I-124标记的蛋白质测量雷珠单抗和以本发明的结合HA的肽加标签的抗体(NVS1)的生物分布。结果显示对眼外环境下清除作用无任何明显影响情况下，结合HA的肽标签可用于延长眼疗法的作用持续时间。
使用生碘法(Iodogen method)(1)，进行大鼠眼中注射的蛋白质的放射标记，所述方法利用iodogen包被的管(Thermo Scientific，Rockford，IL)。一般，实现放射标记效率>85％和比活性大约7mCi/mg。为了使大鼠做好玻璃体内(IVT)注射的准备，动物用3％异氟烷气体麻醉。眼随后用两滴环喷托酯(1％优选浓度)和2.5-10％去氧肾上腺素扩瞳。还施加一滴局麻药(0.5％丙对卡因)。在解剖显微镜下，用一根30号针在角膜缘下方大约4mm产生一个切口，角度指向眼中央。随后将含有放射性标记蛋白质的平头Hamilton注射器(例如33号)经这切口***玻璃体腔内并且注入约3.5μL放射标记的蛋白质。对眼检查出血或白内障。随后在对侧眼上重复该手术。在放射标记的蛋白质注入大鼠眼中后马上将麻醉的动物置于预热PET成像台上，仰卧。该台配有气体麻醉用鼻罩。随后在扫描仪中移动固定并保证安全的动物，使用置于胸部下的呼吸传感器监测生命功能(例如呼吸)。对于用I-124标记的雷珠单抗注射的动物，IVT注射后72小时，通过心脏穿刺、放血和颈椎脱臼法使动物安乐死。将眼和其他器官/组织(血液、肝、脾、肾、胃、肺、心、肌肉和骨)解剖取出并在γ计数器中计数剩余放射性活度。将计数转化成所计数组织/器官的注射剂量/克％(％ID/g)。对于用I-124标记的加HA标签的抗体(NVS1)注射的动物，IVT注射后72小时，通过心脏穿刺、放血和颈椎脱臼法使动物安乐死。将眼和其他器官/组织(血液、肝、脾、肾、胃、肺、心、肌肉和骨)解剖取出并在γ计数器中计数剩余放射性活度。将计数转化成所计数组织/器官的注射剂量/克％(％ID/g)。
在最后PET/CT成像时间点后立即使大鼠安乐死并通过心脏穿刺法采集血液。从动物抽出血液以便减少器官和组织中所截获的血液相伴放射性活度的量。剖取独立的器官和组织，包括左眼、右眼、血液、肝、脾、肾、肺、心、肌肉、胃、骨和脑，将它们称重并在设置成I-124适用能量窗口(350–750keV)的γ计数器中计数剩余的放射性活度。通过在每只眼中和在双眼中产生1/100稀释注射的剂量制备用于γ计数的两份标准物。标准物用来根据每分钟计数(cpm)以及每只眼中注射的cpm计算动物中注射的总活度。在该γ计数器中计数两个盐水填充管以获得背景活度。从组织cpm扣除背景cpm。扣除背景的cpm随后对注射时间作衰变修正，除以总注射的cpm并乘以100以计算注射的剂量％(％ID)。每只眼中衰变修正的cpm除以该眼中所注射的cpm，并乘以100以计算该眼中的％ID。为了计算％ID/克，将每个计算的％ID除以相应的组织/器官重量。以下参考文献更详细的描述了％ID/g计算：Yazaki PJ等人,2001。
结果和结论：
使用γ计数器(图17)评估IVT施用的放射标记雷珠单抗和NVS1的生物分布。玻璃体内施用I-124标记的雷珠单抗后72小时，在眼中测量到约1.4％的注射剂量。与之相反，玻璃体内施用I-124标记的加HA标签的抗体后166小时，在眼中测量到约11％的注射剂量，显示与雷珠单抗相比，加结合HA的肽标签的抗体的眼停留时间高10倍。在分析的剩余非眼组织中，在眼外部测量到相似量的雷珠单抗和加结合HA结合的肽标签的抗体，显示与雷珠单抗相比，加结合HA的肽标签的抗体的眼外停留时间无显著差异。这些数据显示了令人惊讶的研究结果：与未加标签的分子相比，I-124标记的加肽标签的分子具有显著更高的眼停留时间、较低的眼清除作用和增加的终末眼浓度。但是，在眼外未见结合HA的肽标签的半衰期延长作用。
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Claims (42)

1.结合乙酰透明质酸(HA)的肽标签，其中所述肽标签包含选自以下序列：
a)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36；或
b)SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的序列的95个连续氨基酸。
2.加肽标签的分子，包含根据权利要求1中所述的与蛋白质或核酸连接的肽标签。
3.根据权利要求2中所述的加肽标签分子，其中所述肽标签在所述蛋白质的N末端和/或C末端或在所述核酸的5’和/或3’末端连接。
4.根据权利要求2或权利要求3中所述的加肽标签分子，其中所述肽标签直接连接至所述蛋白质或核酸。
5.根据权利要求2或权利要求3中所述的加肽标签分子，其中所述肽标签经接头间接连接至所述蛋白质或核酸。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的加肽标签分子，其中蛋白质是：
a)分离的抗体或其抗原结合片段；
b)治疗性蛋白；
c)蛋白质受体；或
d)darpin。
7.根据权利要求2或权利要求3中所述的加肽标签分子，其中核酸是适配体。
8.根据权利要求2至5中任一项所述的加肽标签分子，其中分子是结合VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、Il-10、TNFα或FGFR2的蛋白质。
9.根据权利要求2、3、4、5或7中任一项所述的加肽标签分子，其中分子是结合PDGF-BB的核酸。
10.根据权利要求6中所述的加肽标签分子，其中分子是以下分离的抗体或抗原结合片段：
a)其结合VEGF并且包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、2、和3序列，以及分别为SEQ ID NO:11、12和13的轻链CDR1、2和3序列；或
b)其结合C5并且包含分别为SEQ ID NO:37、38和39的重链CDR1、2和3的序列，以及分别为SEQ ID NO:46、47和48的轻链CDR1、2和3序列；或
c)其结合因子P并且包含分别为SEQ ID NO:53、54、55的重链CDR1、2和3的序列，以及分别为SEQ ID NO:65、66和67的轻链CDR1、2和3序列；或
d)其结合EPO并且包含分别为SEQ ID NO:75、76和77的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:86、87和88的轻链CDR1、2和3序列；或
e)其结合EPO并且包含分别为SEQ ID NO:108、109和110的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:117、118和119的轻链CDR1、2和3序列；或
f)其结合IL-1β并且包含分别为SEQ ID NO:189、190和191的重链CDR1、2和3序列，以及分别为SEQ ID NO:198、199和200的轻链CDR1、2和3序列。
11.根据权利要求10中所述的加肽标签分子，其中分子是分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有以下序列的可变重链结构域和可变轻链结构域：
a)分别地SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:17；或
b)分别地SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:49；或
c)分别地SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:71；或
d)分别地SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:92；或
e)分别地SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:120；或
f)分别地SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:201。
12.根据权利要求10或权利要求11中所述的加肽标签分子，其中分子是分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下的重链序列和轻链序列：
a)分别地SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:19；或
b)分别地SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:51；或
c)分别地SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:73；或
d)分别地SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:95；或
e)分别地SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:122；或
f)分别地SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:202。
13.根据权利要求10中所述的加肽标签分子，包含以下序列：
a)SEQ ID NO:21和19；或
b)SEQ ID NO:23和19；或
c)SEQ ID NO:25和19；或
d)SEQ ID NO:27和19；或
e)SEQ ID NO:29和19；或
f)SEQ ID NO:44和51；或
g)SEQ ID NO:63和73；或
h)SEQ ID NO:85和95；或
i)SEQ ID NO:115和122；或
j)SEQ ID NO:196和202。
14.组合物，其包含根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签的分子和可药用赋形剂、稀释剂或载体。
15.根据权利要求所述14的组合物，其被配制用于眼内递送。
16.根据权利要求14或权利要求15中所述的组合物，其包含12mg/眼的加肽标签的分子。
17.核酸，其编码根据权利要求1所述的肽标签。
18.核酸，其编码根据权利要求2至13中任一项所述的加肽标签的分子。
19.表达载体，其包含根据权利要求17或权利要求18中所述的核酸。
20.宿主细胞，其包含根据权利要求19中所述的表达载体。
21.根据权利要求20中所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞系。
22.用于产生根据权利要求1中所述的肽标签或根据权利要求2至13中任一项所述的加肽标签分子的方法，其包括在用于产生所述肽标签或加肽标签分子的适宜条件下培养根据权利要求20或权利要求21中所述的宿主细胞，并且分离所述肽标签或所述加肽标签的分子。
23.根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签分子，其用作药物。
24.根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签分子，其用作眼用药物。
25.根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签分子，其用于治疗个体中与视网膜血管病相关的病况或病症。
26.根据权利要求25所述的加肽标签分子，其用于治疗选自新生血管性年龄相关黄斑变性(wet AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变的病况或病症。
27.根据权利要求14至16中任一项所述的组合物，其用作药物。
28.根据权利要求27中所述的组合物，其用作眼用药物。
29.根据权利要求27或权利要求28中所述的组合物，其用于治疗个体中与视网膜血管病相关的病况或病症。
30.一种治疗个体中眼病况或病症的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求14-16中任一项所述的组合物。
31.一种治疗个体中与视网膜血管病相关的病况或病症的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求14-16中任一项所述的组合物。
32.根据权利要求29所述的组合物或根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中与视网膜血管病相关的病况或病症是新生血管性年龄相关黄斑变性(wet AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
33.根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签分子，其用于治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症。
34.根据权利要求14至16中任一项所述的组合物，其用于治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症。
35.一种治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求2-13中任一项所述的加肽标签分子。
36.一种治疗个体中与黄斑水肿相关的病况或病症的方法，所述方法包括向个体施用根据权利要求14至16中任一项所述的组合物。
37.根据权利要求33或权利要求34所述的组合物或根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中与黄斑水肿相关的病况或病症是糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变、非增生性糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关黄斑变性、视网膜静脉闭塞、多病灶脉络膜炎、近视性脉络膜新血管形成或早产儿视网膜病变。
38.组合物，其包含根据权利要求1所述的肽标签，所述肽标签连接至用于治疗个体中VEGF介导的病症的抗VEGF抗体或其抗原结合片段。
39.治疗个体中VEGF介导的病症的方法，所述方法包括步骤：向个体施用包含与抗VEGF抗体或其抗原结合片段连接的根据权利要求1中所述的肽标签的组合物。
40.根据权利要求38所述的组合物或根据权利要求39所述的方法，其中所述抗VEGF抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:1、2和3的重链CDR1、2、和3序列，以及分别为SEQ ID NO:11、12和13的轻链CDR1、2、和3序列。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的组合物或方法，其中个体中VEGF介导的病症是年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、晶体后纤维增生、与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs’综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。
42.一种产生加肽标签的分子的方法，所述方法包括将根据权利要求1中所述的肽标签与蛋白质或核酸连接。
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