CN107043422B - 抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途，该人源化Fab和人源化抗体含有轻链可变区和重链可变区，所述用途为人补体因子D相关疾病为由人补体因子D升高引起的疾病。

Description

抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途。
背景技术
老年性黄斑变性又称年龄相关性黄斑变性(AMD)，是一种由视网膜中心区的细胞或组织退化和血管增生而引起的疾病，可分为干性AMD和湿性AMD两种。老年性黄斑变性主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。或者引起Bruch膜本断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的Bruch膜进入RPE下及视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管。由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列的继发性病理改变。老年性黄斑变性大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。AMD致盲约占全球致盲的8.7％，全球约有3000万AMD患者，每年约有50万人因为AMD而致盲。美国2004年报告的AMD的患病率为1.47％，约有175万AMD患者，而到2020年，推测将会有高达300万的AMD患者。我国邹海东等作的一项调查显示，大于50岁以上的人群的AMD的患病率为15.5％。其中湿性AMD占11.9％。按照***的人口数据资料，我国在2005年大于50岁以上的人口数为接近3亿。随着人口老龄化，AMD的患病率将显著增加。
补体是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。其作用可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用。补体***是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子***，根据其生物学功能，可分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体(CR)三类，补体***的调控主要有三个途径：经典途径(Classical pathway)、旁路途径(Alternative pathway)和凝集素(MBL)途径(Lectinpathway)，不同的调控途径会影响产生不同的补体蛋白，并发挥不同的作用。补体***非正常激活常常会引起人体免疫***的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤。补体***可以导致局部的炎症，组织损伤以及血管生成因子的上调，与补体过度激活相关的疾病有类风湿性关节炎、老年性痴呆、***性红斑狼疮、缺血性再灌注、急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征等。近期研究表明，旁路途径(Alternative pathway)和凝集素(MBL)途径(Lectinpathway)是抗体介导反应的独立激活机制，是AMD病因中最主要的致病机制[Paul A.et,al.The Immune System and AMD,Curr Ophthalmol Rep(2014)2:14–19]，其中补体因子D(complement factor D，EC:3.4.21.46)是启动替代途径激活的重要成分，属于胰蛋白酶家族。补体因子D在血清中主要以活化形式而存在，具有活性的D因子(D)作用于C3bB，可能在第234-235位的精氨酸-赖氨酸键处将B因子裂解为Ba和Bb两个片段，从而启动替代途径的级联活化反应。
现有技术中抗补体D的抗体存在着种属特异性，抗补体因子抗体(AFD；FCFD4514S；Lampalizumab)针对狗或羊的补体旁路途径(alternative complement pathway，简称AP)有微弱的抑制，而针对兔子、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠或猪的AP没有抑制，而对于人或猴具有相应较强的抑制(Kelly M,et,al.Complement Inhibition in Cynomolgus Monkeys byAnti-Factor D Antigen-Binding Fragment for the Treatment of an Advanced Formof Dry Releated Macular Degeneration,J Pharmacol Exp Ther 351:527-537,December 2014)。
发明内容
本发明的目的之一是提供抗人补体因子D的人源化抗原结合片段Fab或抗人补体因子D人源化抗体，该Fab或抗体与人补体因子D有较好的亲和力、具有更好的稳定性和生物活性。
本发明一方面提供一种抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有氨基酸序列ITSTDIDDDX1N、氨基酸序列GGX2TLRP和氨基酸序列X3QSDS X4PYX5,所述X1为V、M或L，X2为N或A，X3为M或L，X4为L或Y,X5为I或T；重链可变区含有氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列Y1GGY2NY3，所述Y1为A或E，Y2为S、V或P，Y3为N、Y、F、H、S或R；X1、X2、X3、X4、X5不同时满足下述条件：X1为M、X2为N、X3为L、X4为L、X5为T。
所述的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为M、X2为A、X3为L、X3为L和X5为T时，Y1不为A、Y2不为V和Y3不为N或Y1不为E，Y2不为P和Y3不为N。X1、X2、X3、X4、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为V、X2为N、X3为L、X4为L和X5为I时，Y1不为E、Y2不为V和Y3不为S。X1、X2、X3、X4、X5、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为V、X2为N、X3为L、X4为Y和X5为T时，Y1不为E、Y2不为V和Y3不为N或H，或Y1不为E、Y2不为P和Y3不为N。X1、X2、X3、X4、X5、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为V、X2为N、X3为M、X4为L和X5为T时，Y1不为E、Y2不为P和Y3不为N。X1、X2、X3、X4、X5、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为V、X2为A、X3为L、X4为L和X5为T时，Y1不为E、Y2不为V和Y3不为N。X1、X2、X3、X4、X5、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述人源化抗体或其抗原结合片段Fab，优选所述X1为L、X2为A、X3为L、X4为L和X5为T时，Y1不为E、Y2不为V和Y3不为N。X1、X2、X3、X4、X5、Y1、Y2和Y3同时满足上述条件。
所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，包含如下重链可变区和轻链可变区序列：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3、5、8、13、15、17中的任一种；所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19、21、23、25、27、29、31、33中的任一种。
所述的抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述抗原结合片段Fab选自下述任一种：
KH001：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH002：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列8，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH003：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH004：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH005：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH006：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH007：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH008：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27；
KH009：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH010：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH011：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH012：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH013：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH014：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH015：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH016(XY1252)：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH017：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH018：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH019：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH020：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH021：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27；
KH022：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH024：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH027：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH028：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25。
所述Fab的Fd片段的CH1可以是任意类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgM1、IgM2、IgA1、IgA2)的人源恒定区CH1；所述轻链恒定区可为任意类型(κ型或λ型)、亚型(λ1、λ2、λ3、λ4)、或同种异性(κm(1)、κm(2)、κm(3))轻链的人源恒定区。
所述Fab由重链片段和轻链组成，所述重链片段由重链可变区和重链恒定区组成，所述轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。其中所述重链恒定区的氨基酸序列优选与人抗体重链恒定区的氨基酸序列相同，所述轻链恒定区的氨基酸序列优选与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同；其中所述重链恒定区的氨基酸序列为序列39；所述轻链恒定区的氨基酸序列为序列41。
所述抗补体因子D的人源化抗体中，所述重链恒定区可以是任意类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgM1、IgM2、IgA1、IgA2)的人源恒定区；所述轻链恒定区可为任意类型(κ型或λ型)、亚型(λ1、λ2、λ3、λ4)、或同种异性(κm(1)、κm(2)、κm(3))轻链的人源恒定区。
所述抗体由重链或轻链组成，所述重链恒定区的氨基酸序列与人抗体重链恒定区的氨基酸序列相同，所述轻链恒定区的氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同。所述人抗体重链恒定区的氨基酸序列优选为序列43，所述人抗体轻链恒定区氨基酸序列优选为序列41。
本发明更进一步提供选自下述任一种的抗体：
KH-A：其轻链序列为序列45，其重链序列为序列47；
KH-B：其轻链序列为序列49，其重链序列为序列51；
KH-C：其轻链序列为序列45，其重链序列为序列53；
KH-D：其轻链序列为序列49，其重链序列为序列55；
KH-E：其轻链序列为序列57，其重链序列为序列59；
KH-F：其轻链序列为序列57，其重链序列为序列61。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码上述任一所述人源化抗体或抗原结合片段Fab。
上述多核苷酸，优选所述人源化抗体或抗原结合片段Fab中所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列表中序列4、序列6、序列9、序列14、序列16和序列18中的任一种，重链可变区的编码序列为序列表中序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34中的任一种。
上述多核苷酸中优选所述Fab的重链恒定区的编码序列如序列表中序列40所示；所述Fab的轻链恒定区编码序列如序列表中序列42所示；所述抗体的重链恒定区的编码序列如序列表中序列44所示；所述抗体的轻链恒定区的编码序列如序列表中序列42所示。
本发明跟进一步提供选自下述任一种多核苷酸：
KH-A：其轻链序列为序列46，其重链序列为序列48；
KH-B：其轻链序列为序列50，其重链序列为序列52；
KH-C：其轻链序列为序列46，其重链序列为序列54；
KH-D：其轻链序列为序列50，其重链序列为序列56；
KH-E：其轻链序列为序列58，其重链序列为序列60；
KH-F：其轻链序列为序列58，其重链序列为序列62。
本发明还进一步提供上述人源化抗体或抗原结合片段Fab，或上述多核苷酸的用途，其选自以下任一种用途：
d1)在制备预防和/或治疗人补体因子D相关疾病药物中的用途，或
d2)在制备中和人补体因子D产品中的用途，或
d3)在制备定性或定量检测人补体因子D的试剂盒中的用途。
本发明涉及人补体因子D(CFD)相关疾病为由人补体因子D升高引起的疾病；优选类风湿性关节炎、心肌梗死，再灌注损伤或眼病；其中眼病更优选为年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病。其中老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎(endophthalmitis)和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。
本发明还更进一步提供一种药物组合物，含有辅料和活性成分，所述活性成分含有下述物质中的至少一种：上述任一所述人源化抗体或抗原结合片段Fab，或上述任一所述多核苷酸；所述辅料为药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还进一步提供所述抗补体因子D的人源化Fab或抗体的生产方法，具体步骤为：将含所述抗体编码基因的重组载体转染或转化宿主细胞，在适宜条件下进行表达、纯化。其中，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞，优选为哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。其中所述哺乳动物细胞包括但不限于293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NS0细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等，其中所述转染细胞的方法包括但不限于：电穿孔，脂质体介导法，钙介导法等。
一种较佳的所述抗体表达方式是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组蛋白的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中添加氨甲蝶呤(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。
含有所述编码基因序列的抗体表达后，可用酶联免疫吸附法(ELISA)或其他方法测定培养液中的蛋白浓度。对于Fab片段，可用Protein G亲和层析法提纯；IgG蛋白可用Protein A亲和层析法提纯。
相关序列对应如下：
KH023：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH025：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH026：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH029：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH030：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH031：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列7，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH032：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列10，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH033：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列11，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列35；
KH034：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列11，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列36；
KH035：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列12，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列35；
KH036：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH037：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH038：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27；
KH039：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH040：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH000：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列37，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列38。
KH111：所述轻链可变区氨基酸序列为序列11，所述重链可变区氨基酸序列为序列33。
部分轻链可变区的氨基酸和核苷酸的对应关系：编码序列3的核苷酸序列为序列4；编码序列5的核苷酸序列为序列6；编码序列8的核苷酸序列为序列9；编码序列13的核苷酸序列为序列14；编码序列15的核苷酸序列为序列16；编码序列17的核苷酸序列为序列18。
部分重链可变区的氨基酸和核苷酸的对应关系：编码序列11的核苷酸序列为序列63；编码序列19的核苷酸序列为序列20；编码序列21的核苷酸序列为序列22；编码序列23的核苷酸序列为序列24；编码序列25的核苷酸序列为序列26；编码序列27的核苷酸序列为序列28；编码序列29的核苷酸序列为序列30；编码序列31的核苷酸序列为序列32；编码序列33的核苷酸序列为序列34；编码序列29的核苷酸序列为序列30。
部分重链恒定区的氨基酸和核苷酸的对应关系：编码序列39的核苷酸序列为序列40；编码序列43的核苷酸序列为序列44。
部分轻链恒定区的氨基酸和核苷酸的对应关系：编码序列41的核苷酸序列为序列42。
KH102轻链的氨基酸序列为序列106，编码序列106的核苷酸序列为序列107；其重链氨基酸序列为序列108，编码序列108的核苷酸序列为序列109。
本发明还提供由所述Fab衍生的抗原结合片段A或抗原结合片段B。抗原结合片段A为由所述Fab衍生的Fab’、F(ab’)2、Fv、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段；抗原结合片段B为由所述抗体衍生的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv(抗体可变区片段)、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段。
上述F(ab′)2由一对轻链和一对略大于Fd的重链(称为Fd′)组成，胃蛋白酶水解IgG分子产生此片段，它包含两个Fab，可结合2个抗原表位。Fd′约含有235个氨基酸残基，包括VH、CH1和绞链区。Fv由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成，二者以非共价键结合在一起，分子量约为完整抗体分子的1/6，具有单一抗原结合位点。Fv包括ScFv(单链抗体)、DsFv(二硫键稳定抗体)等。ScFv是将VH和VL用一段适当的寡聚核苷酸(接头，linker)连起来，使之表达为单一的肽链。DsFv是在轻链可变区和重链可变区适当部位各引入一个半胱氨酸，形成一个二硫键固定的Fv段，经证实其结合能力及稳定性均优于ScFv。
本发明的抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、或自抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明的另一方面是这些人源化抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)制备用于预防和/或治疗与过度的或不受控制的补体活化有关的病症的药物或组合物的用途。它们包括心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、肠缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注损伤所致补体活化。补体活化已经显示出与炎性状况有关，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物***反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂***反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如***性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。更重要的是补体活化还与眼疾病有关(其病理涉及补体包括经典和旁路补体途径的所有眼状况和疾病)，诸如例如但不限于黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。其中老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期(intermediate)干性AMD或地图样萎缩(geographicatrophy，GA))和渗出性(例如湿性AMD(脉络膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎，另外非渗出性AMD可包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图样萎缩和/或色素结块的存在。
本发明与现有技术的抗体可能存在抗体和抗原结合表位上的差异，本发明具有较高亲和力、稳定性、以及生物活性。
本发明的又一个目的是提供下述遗传材料：含有所述基因的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒。
所述重组载体为表达所述抗体或Fab或抗原结合片段的原核表达载体或真核表达载体。所述重组菌为携带有所述基因的大肠杆菌。所述重组细胞系可为转基因细胞系或融合细胞系，其中转基因细胞系可为转入本发明的抗补体D人源化抗体或Fab或抗原结合片段编码基因的哺乳动物细胞系，优选CHO细胞系，或293细胞及其亚系；融合细胞系可为分泌本发明的抗补体D人源化抗体的杂交瘤细胞。所述重组病毒为携带有所述基因的重组腺病毒或重组腺相关病毒等。所述表达盒是一个DNA分子，从上游至下游依次为如下三个片段：启动子、由所述启动子启动转录的所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段的编码基因和终止子。
将含所述抗体，或所述Fab，或所述抗原结合片段编码基因的重组载体转染或转化宿主细胞，即可表达相应的蛋白，获得所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段。所述宿主细胞可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包含但不限于哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NS0细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等。转染细胞的方法有多种，其中包括但不限于：电穿孔，脂质体介导法，钙介导法等。
一种较佳的所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段的表达方式是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组蛋白的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中添加氨甲喋啶(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。
含有所述编码基因序列组合的Fab或IgG表达后，可用酶联免疫吸附法(ELISA)或其他方法测定培养液中的蛋白浓度。对于Fab片段，可用Protein G亲和层析法提纯；IgG蛋白可用Protein A亲和层析法提纯。
本发明的又一个目的是提供药物组合物，该药物组合物含有辅料和活性成分，所述活性成分含有下述物质中的至少一种：所述抗体，所述Fab，所述抗原结合片段，所述基因，和所述遗传材料；所述辅料为药学上可接受的载体或赋形剂。该药物组合物的活性成分也可只为上述任一Fab或抗体，或上述任一所述抗原结合片段，或上述任一所述基因，或上述遗传材料中的任一种。
下述物质中的任一种在治疗补体D相关疾病中的应用也属于本发明的保护范围：所述抗体，所述Fab，所述抗原结合片段，所述基因，所述遗传材料，和所述药物组合物。
另一方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)。本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和使用指令。本发明提供试剂盒包含装有组合物的第一容器，该组合物包含本发明的一种或多种抗体或其抗原结合片段；和装有缓冲剂的第二容器。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明描述的人源化补体因子D抗体PCR引入位点突变及突变抗体的筛选是通过常规基因重组技术及基于抗原抗体相互作用的免疫学技术所完成，具体实验方法步骤如<<分子克隆>>第三版(Joseph Sambrook，科学出版社，2002年8月1日)及类似实验手册所记载。实施例中涉及到的溶血抑制IC50是将测得的OD值(OD405)输入graphpad prism5软件获得。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、抗原结合片段Fab表达
(一)轻链、重链的获得
通过人工基因合成的方法，合成人源化的抗体Fab轻链和重链序列(苏州金唯智生物有限公司)。每条序列均由可变区和恒定区序列组成，其中：合成的轻链可变区序列为序列63，重链可变区序列为序列34，轻链的恒定区为序列42，重链的恒定区为序列40。
(二)人源化Fab载体的构建
使用PCR定点突变的方法进行人源化Fab表达载体的构建，具体步骤为：以合成的轻重链序列(质粒)或者已获得的突变Fab质粒为模板，每个Fab表达载体的轻重链构建分别含有4条引物，分3次PCR进行扩增，首先应用两个互补的含有相同碱基突变的内侧引物分别同两侧引物进行PCR扩增，再以此PCR产物为模板，两侧引物进行PCR扩增最终获得突变的人源化Fab抗体轻重链片段。
轻链扩增的引物如下：
两侧引物分别为：序列64和序列65
中间突变引物为：序列66与序列67；序列68与序列69；序列70与序列71；序列72与序列73；序列74与序列75；序列76与序列77。
重链扩增的引物如下：
两侧引物分别为：序列78和序列79
中间突变引物为：序列80与序列81；序列82与序列83；序列84与序列85；序列86与序列87；序列88与序列89；序列90与序列91；序列92与序列93；序列94与序列95；序列96与序列97。
将上述获得的轻链和重链片段通过酶切连接的方法分别连接***到可同时表达Fab蛋白轻链和重链的pTLR载体(经过改造的pET22b(+)载体，可在大肠杆菌中表达Fab抗体)中。具体操作为，使用上述引物通过PCR的方法制备两端分别含有酶切位点NdeI和EcoRI的轻链DNA，以及两端分别含有酶切位点NotI和XhoI的各重链片段DNA，将这两个DNA分别克隆入pTLR载体(经过改造的pET22b(+)载体)中的相应限制性内切酶位点之间，即轻链DNA分别***到限制性内切酶NdeI和EcoRI位点之间，各重链片段(Fd)DNA分别***到限制性内切酶NotI和XhoI位点之间，构建数个Fab表达载体。
对pET22b(+)载体进行改造获得上述pTLR载体的具体方法如下：首先通过人工合成一段DNA片段(序列98)，该片段依次含有T7终止子(T7terminator)，T7启动子(T7promoter)、乳糖操纵子(lac operator)、核糖体结合位点(RBS)序列,以及上下两端包含有SalI和NotI酶切位点，pET22b(+)载体和合成的DNA序列分别用Sal I和Not I双酶切后，T4连接酶(NEB)连接后转化，常规方法挑单克隆测序筛选出正确改造的载体。
(三)抗体IgG重组表达载体构建
将上述所获得的重链可变区片段经过密码子优化后(苏州金唯智有限公司)，以重叠PCR将重链片段与恒定区拼接在一起，获得重链序列。将上述获得的轻链和重链序列分别依次重组至表达质粒Freedom pCHO1.0(Life technologies)中，将构建好的重组表达质粒转染CHO-S细胞，表达全长抗体。
具体操作如下所述：(1)轻链将含有适当酶切位点和信号肽序列的引物扩增轻链密码子优化模板(苏州金唯智有限公司)，扩增引物为：序列99和序列100。获得的PCR产物以AvrII酶(NEB公司产品)和BstZ17I酶(NEB公司产品)双酶切后，使用T4连接酶(Takara公司产品)与同样双酶切的Freedom pCHO1.0大片段相连接获得pCHO-L。2)重链需以重叠延伸PCR将可变区与人工合成的IgG4恒定区(苏州金唯智有限公司)拼接在一起，重叠的核苷酸数量为40个，再重组至pCHO-L。含有适当酶切位点和信号肽序列的引物扩增重链模板，在可变区与恒定区分界处设计内侧互补的重叠PCR引物，分别同两侧引物进行PCR扩增，再以此PCR产物为模板，两侧引物进行PCR扩增最终获得拼接的人源化重链PCR产物。扩增引物如下：
两侧引物为：序列101，序列102和序列103
中间引物为：序列104和序列105。
将拼接的PCR产物以EcoRV酶(NEB公司产品)和PacI酶(NEB公司产品)酶切后再重组至同样双酶切的表达质粒pCHO-L中获得pCHO-HL，并经鉴酶切与测序鉴定正确。
实施例2Fab周质蛋白的表达
将上述构建的Fab表达载体分别转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(Tiangen)，涂氨苄青霉素抗性2-YT平板(蛋白胨1.6％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.5％)。第二天选择合适菌落密度的板挑取单克隆菌落接种5ml氨苄青霉素抗性2-YT液体培养基,过夜培养，条件为：37℃，220rpm，16h。次日，将5ml菌液接种到500ml氨苄青霉素抗性2-YT液体培养基，33℃，220rmp培养至OD600为0.6。在培养基中加入IPTG至终浓度为50μM，诱导不同Fab蛋白表达，诱导时间为3h。将诱导表达结束后的培养液在4500rpm，10℃条件下，离心15min，弃上清，沉淀用40ml预冷的TES溶液(Tris24.23g，蔗糖171.2g，EDTA0.186g，溶于1000ml去离子水，调整pH值到8.0)充分重悬菌体沉淀；重悬后再加入66ml预冷的1/5TES溶液到重悬后的菌液中，冰上孵育40min；冰浴结束后，13000rpm，4℃，离心10min；离心后收集上清，上清即为含有Fab蛋白的细胞周质提取液。周质提取液过G-25(GE公司，17-0034-01)柱脱盐处理后，准备Protein G(GE公司17-0618-04)预装柱，平衡液(20mM磷酸缓冲液pH6.5)平衡后蛋白上样，上样结束后继续用平衡液清洗柱子，然后用洗脱液(0.1M Gly-HCl，pH2.5)直接洗脱，收集洗脱样品，并预先在收集样品前按照Tris缓冲液与样品体积比1：9加入1.0M Tris-HCl(PH9.0)于样品收集管里，快速调PH7.0，收集到的液体即为目的蛋白，蛋白经过SDS-PAGE分析纯度后，对蛋白样品进行浓度测定，最后分装后保存于-80℃，得到纯度较高的Fab蛋白。
实施例3不同全长抗体的表达
全长抗体蛋白表达过程包括以下步骤：将上述构建的抗体IgG重组表达载体转染CHO细胞；利用Puromycin(invitrogen公司)和MTX(Sigma公司)联合筛选高表达抗补体因子D蛋白的工程细胞株，扩大培养该细胞株，最后从细胞培养液中分离纯化全长抗体。具体包括：
(1)表达载体的转染
选择宿主细胞CHO-S细胞，使用线性化上述构建的表达载体质粒按Cell lineNucleofector kit V转染试剂(Lonza公司)进行电转染。转染后6孔板置于37℃、8％CO2摇床培养48h。
(2)CHO-S工程细胞株的建立
对转染所得的多克隆细胞进行两个阶段的逐步加压初筛。第一阶段两个pool梯度设置为10P/100M，20P/200M(P＝μg/mL Puromycin，M＝nM MTX)，细胞活率达到85％即进行第二阶段加压筛选，抗生素浓度设置为30P/500M，50P/1000M，培养至活率高于90％即完成初筛得到抗性细胞库后，进入摇瓶培养14天批次评估，选择目的蛋白表达量较高、活性较优的稳定表达pool进行单克隆筛选，获得了100～150个单克隆，选择高产的阳性单克隆细胞扩大培养。应用这些细胞株生产抗体蛋白。
(3)全长抗体的分离制备
利用CHO-S CD Medium(Life technologies公司)培养基，在37℃、8％CO2摇床培养上述CHO-S工程细胞株13天，2000rpm离心后，收集上清，再用MabSelect SuRe亲和层析柱(GE公司)分离纯化得到抗补体因子D抗体。
实施例4.不同Fab和抗体抑制补体旁路途径溶血实验
采用ACH50法测定补体旁路途径活性，将家兔红细胞(自制)在GVB/Mg-EGTABuffer中洗涤3次，并重悬至6×108/ml。用GVB/Mg-EGTA Buffer配制不同浓度的抗因子D抗原结合片段Fab或抗体，浓度分别为44.44nM、22.22nM、11.11nM、5.56nM、2.78nM、1.39nM。将抗体50μl与20％的人血清(Complement C1q-Depleted Serum,Human，234401-1ml，Calbiochem)50μl等体积混匀，室温孵育7min；再加入30μl的红细胞悬液，4℃振荡30s，37℃孵育30min；2000rpm，4℃离心3min，取80μl上清转移至96孔酶标板，405nm测定吸光值。数据表述成相对于在不加抗体时诱导的溶血的百分比。同时设置血清溶解对照组(不加抗体)、无血清对照组(不加人血清)以及质控对照组(以去离子水代替人血清，不加抗体)。
表1抗因子D的抗原结合片段Fab补体旁路途径活性结果
Figure BDA0001215095110000121
Figure BDA0001215095110000131
表2抗因子D的抗体补体旁路途径活性结果
Figure BDA0001215095110000141
实施例5.基于荧光定量PCR分析不同Fab蛋白热稳定性实验
蛋白(抗体)在一定温度下解离暴露荧光基团进而激发出荧光信号，通过荧光定量PCR仪(MJ Research)连续收集蛋白在连续升温过程中荧光信号强度的变化绘制出蛋白的熔解曲线，计算出该蛋白的Tm值，该值的大小正向反映的是蛋白热稳定性的能力。首先使用1×PBS溶液配制抗因子D抗原结合片段Fab浓度为0.4μg/uL，避光加入5倍稀释的SYPRO染料(Cat No.S6650,lift technologies)，总反应体积为50μl，不足部分使用1×PBS溶液补足。实时定量PCR仪上运行熔解曲线实验，熔解曲线设置为25℃逐渐升温至95℃，每0.5℃读数一次，使用仪器自带软件option monitor3进行Tm值分析。
表3抗因子D的Fab蛋白热稳定性
Figure BDA0001215095110000142
Figure BDA0001215095110000151
实施例6.基于差示扫描量热技术(DSC)分析不同抗体蛋白热稳定性实验
通过差示扫描微量热技术(DSC)能够随温度扫描蛋白质热变性过程中的热熔的变化，并最终拟合得到包括半数变性温度Tm在内的各种热力学参数(焓、熵、自由能等)。对于全长抗体分子来说，差示扫描量热技术通常能够更为精确得到抗体CH2、CH3及Fab区的三个热力学半数变性温度。一般来说，由CH2、CH3组成的Fc区段相对固定，因而Fab区的稳定性对于抗体的稳定性具有重要的影响。利用马尔文公司Microcal Auto VP-Capillary DSC仪器以1℃/分钟的升温速度扫描25-100℃之间抗体KH-A、KH-F、以及KH102的热变性过程，并以仪器附带的Origin程序分析数据拟合出Tm值等热力学参数。样品配置于PBS缓冲液中，pH7.4，0.22μm滤膜过滤，浓度1mg/mL。在软件端设定DSC自动清洗程序，以DECON洗涤液清洗后用超纯水彻底清洗进样针、自动进样管路及样品池，整个流程大约30min完成；设定扫描参数：扫描温度范围20-100℃，扫描速度60℃/h，其中先扫描缓冲液平衡仪器4次，再以1X PBS缓冲液为对照依次扫描待测抗体分子。每个样品的扫描时间平均约2h。扫描结束后以DSC自动清洗程序彻底清洗仪器。将原始扫描数据扣除缓冲液对照并以各样品的摩尔浓度归一化，再利用Origin软件将基线拉平，以Non-two-state model拟合数据进行Fab对应区Tm值结果分析。
表4抗因子D的抗体Fab对应区蛋白热稳定性
Figure BDA0001215095110000152
实施例7.抗体不同种属动力学实验
通过利用OctetQK蛋白质相互作用平台，选择Ni-NTA Biosensor作为检测用生物传感器；以适合的浓度(如：10μg/ml)的CFD(猴子CFD或大鼠CFD)作为检测抗原；以200nM、100nM、50nM、25nM、12.25nM、6.25nM、0nM全长抗体蛋白检测抗体与抗原的结合情况，程序设置为：Baseline 120s，Loding 700s，Baseline 120s，Association 700S，Dissociation1500s。选择Ni-NTA Biosensor作为检测用生物传感器；以10ug/ml浓度的CFD(猴子CFD或大鼠CFD)作为检测抗原；以500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM、7.8125nM、0nM为抗CFD Fab蛋白检测浓度梯度，检测Fab蛋白与抗原的结合情况。程序设置为：Baseline120s，Loding 700s，Baseline 120s，Association 700S，Dissociation 1500s。根据结合的曲线计算抗体亲和力KD。
表5.不同Fab或抗体与猴子CFD的亲和力结果
Figure BDA0001215095110000153
Figure BDA0001215095110000161
表5表明本发明Fab或抗体同猴子CFD具有较高的结合。
表6.不同抗体与大鼠CFD的亲和力结果
Figure BDA0001215095110000162
表6表明本发明抗体与大鼠CFD具有一定的结合力。
实施例8.不同抗体或Fab抑制大鼠血清致兔红细胞溶血实验
采用ACH50法测定补体旁路途径活性，将家兔红细胞(自制)在GVB/Mg-EGTABuffer中洗涤3次(4℃，1600rpm离心)，计数后用GVB/Mg-EGTA稀释至1×109cells/ml的细胞悬液，放置于冰上冷却。用GVB/Mg-EGTA Buffer配制不同浓度的抗因子D抗原结合全长抗体，浓度梯度分别为23mg/ml、20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml、5mg/L、1mg/ml，而抗因子D结合片段Fab的浓度为1mg/ml，将50μl的样品和50μl的大鼠血清(自制)混匀，室温振荡30s，室温孵育7min；再加入30μl的红细胞悬液，4℃振荡30s，37℃孵育40min；拿出后冷冻离心(4℃，2000rpm，3min)；转移80ul上清至96孔板，405nm测OD值。数据表述成相对于在不加抗体时诱导的溶血的百分比。KH-000在1.5mg/ml未检测到活性。
表7.全长抗体抑制大鼠血清致兔红细胞溶血实验结果
样品 IC50
KH-A 3.860mg/ml
KH-F 3.956mg/ml
表8.Fab抗体抑制大鼠血清致兔红细胞溶血实验结果
Fab样品浓度(mg/ml) 抑制率(％)
KH021(1.5mg/ml) 3.191
KH027(1.0mg/ml) 28.210
实施例9.不同抗体或Fab对豚鼠或猪的动力学实验
使用OctetQK蛋白质相互作用平台初步对瞬时转染获得的猪和豚鼠的CFD蛋白进行初步的结合情况进行评估，首先将猪(GeneID：396877)、豚鼠(GeneID：100724693)基因序列的C端融合10×His tag由南京金斯瑞生物科技有限公司优化并合成。然后将合成优化后的基因***到表达载体pCHO1.0中，质粒按Cell line Nucleofector kit V转染试剂(Lonza公司)进行电转染宿主细胞DG44，转染后6孔板置于37℃、5％CO2摇床培养48h后，1000g，离心3分钟，使用上清液进行蛋白动力学分析。具体方法如下进行：全长抗体KH-A，KH-F动力学分析选择Protein A作为检测用生物传感器；首先以适合的浓度(如：10μg/ml)将抗体结合至protein A生物传感器上，测试猪和豚鼠CFD的瞬时转染上清同抗体的结合情况，程序设置为：Baseline 120s，Loding 700s，Baseline 120s，Association 700S，Dissociation 1500s。阴性对照设置为未转染质粒的CHO阴性细胞培养液。Fab抗体KH027和KH021动力学分析选择Ni-NTA作为检测用生物传感器；首先将转染上清液分别结合至Ni-NTA生物传感器上，然后使用10μg/ml的Fab抗体测试不同种属的瞬时转染上清同抗体的结合情况，程序设置为：Baseline 120s，Loding 700s，Baseline120s，Association 700S，Dissociation 1500s。
表9.不同Fab或抗体与豚鼠CFD的解离常数
Figure BDA0001215095110000171
表10.不同Fab或抗体与猪CFD的解离常数
Figure BDA0001215095110000172
表9和表10结果表明，抗体及Fab与豚鼠或猪的CFD具有良好的结合力。
实施例10.抗体在兔子玻璃体液中动力学测试实验
抗体的活性根据不同的缓冲体系环境会受到影响，通过采取兔子玻璃体液代替人玻璃体液来模拟抗体在人玻璃体液中的活性，对抗体的活性进行初步评价。在此实验中，通过利用OctetQK蛋白质相互作用平台，选择Ni-NTA Biosensor作为检测用生物传感器；以10μg/ml人CFD蛋白作为检测抗原；以125nM，0nM为抗CFD全长抗体KH-A的检测浓度，以玻璃体液作为检测基质，对抗CFD全长抗体在玻璃体液中的动力学进行检测。程序设置为：Baseline 120s，Loding 700s，Baseline 120s，Association 700S，Dissociation 1500s。根据动力学结合曲线判定抗体的初步活性。
表11.抗体KH-A与人CFD在兔玻璃体液中的解离常数
Figure BDA0001215095110000173
表11显示，抗体KH-A在兔子玻璃体液中同人CFD具有良好的结合活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都康弘生物科技有限公司
<120> 抗补体因子D的人源化Fab和人源化抗体及其用途
<130> KH20160104
<160> 109
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatattcagg tgacccagag tccgagcagc ctgagcgcaa gcgttggtga tcgcgtgacc 60
attacctgca tcaccagcac cgatatcgac gacgacgtga actggtacca gcagaaaccg 120
ggcaaagtgc cgaaactgct gattagcggt ggtaacaccc tgcgtccggg tgtgccgagc 180
cgttttagtg gtagcggtag cggtaccgac tttaccctga ccatcagcag cctgcagccg 240
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<213> 人工序列
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
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Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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<213> 人工序列
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
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Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Val Ser Ser
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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caggtgcagc tggttcagag cggtccggag ctgaaaaaac cgggcgccag cgttaaagtg 60
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<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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<213> 人工序列
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1 5 10 15
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Val Ser Ser
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<400> 32
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<211> 115
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<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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115
<210> 34
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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115
<210> 36
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
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115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 40
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacctgt gacggtctcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgt 309
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 42
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgtacggttg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagttcacc ggtgacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 43
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 44
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggctc accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210> 45
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Ala Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 46
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gacatccagg tgacacagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca tcaccagcac cgacatcgac gacgacatga attggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggtgc ctaagctgct gatctccggc ggcgctaccc tcaggcctgg agtgcctagc 180
cggttcagcg gttctggttc tggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacgtgg ctacctacta ttgcctccag agcgactccc tgccttatac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gaggaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctat 420
ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg aaacagccaa 480
gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctcagctccc ctgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gt 642
<210> 47
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 48
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
caggtgcagc tggtgcagtc cggacctgag ctgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gaccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcaaattt cttccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcga gagggaggga 300
ggcgtgaact actggggcca gggcaccctg gtgacagtgt cctccgcttc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta 600
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca 660
tgcccaccat gcccagcacc tgagttcgag gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 720
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 780
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1320
ggtaaa 1326
<210> 49
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 49
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 50
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gacatccagg tgacacagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca tcaccagcac cgacatcgac gacgacgtga attggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggtgc ctaagctgct gatctccggc ggcaacaccc tcaggcctgg agtgcctagc 180
cggttcagcg gttctggttc tggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacgtgg ctacctacta ttgcctccag agcgactccc tgccttatat cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gaggaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctat 420
ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg aaacagccaa 480
gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctcagctccc ctgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gt 642
<210> 51
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 52
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
caggtgcagc tggtgcagtc cggacctgag ctgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gaccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcaaattt cttccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcga gagggaggga 300
ggcgtgaacc attggggcca gggcaccctg gtgacagtgt cctccgcttc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta 600
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca 660
tgcccaccat gcccagcacc tgagttcgag gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 720
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 780
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1320
ggtaaa 1326
<210> 53
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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<400> 66
ctgctggtac cagttcacgt c 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gacgtgaact ggtaccagca g 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gacgcagggt ggcaccaccg c 21
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
gcggtggtgc caccctgcgt c 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ctgctggtac cagttcaagt c 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gacttgaact ggtaccagca g 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
cctggccaaa gatatacggc a 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tgccgtatat ctttggccag g 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
atcgctctgc atgcaataat a 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tattattgca tgcagagcga t 21
<210> 76
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
tggccaaagg tatacggata gctatcgctc tgcaggca 38
<210> 77
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
tgcctgcaga gcgatagcta tccgtatacc tttggcca 38
<210> 78
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
actgcggccg catgggtaag aaacagttgg ttgtgtttgc tctgcttttg gcttttcttt 60
ctccggccat ggcccaggtg cagctggttc agag 94
<210> 79
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
cagctcgagt caacaagatt tgggctcaac tttc 34
<210> 80
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
ccaattattc acgccgccgg cgcgttcaca atagtacac 39
<210> 81
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gtgtactatt gtgaacgcgc cggcggcgtg aataattgg 39
<210> 82
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
accccaatta ttcacgccgg cctcgcgttc acaatagta 39
<210> 83
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tactattgtg aacgcgaggc cggcgtgaat aattggggt 39
<210> 84
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
accctgaccc caattattag ggccgccctc gcgttcaca 39
<210> 85
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
tgtgaacgcg agggcggccc taataattgg ggtcagggt 39
<210> 86
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
cagggtaccc tgaccccaat aattcacgcc gccctcgcg 39
<210> 87
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
cgcgagggcg gcgtgaatta ttggggtcag ggtaccctg 39
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
ccagggtacc ctgaccccaa aaattcacgc cgccctcgc 39
<210> 89
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gcgagggcgg cgtgaatttt tggggtcagg gtaccctgg 39
<210> 90
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
accctgaccc caattattag agccgccctc gcgttcaca 39
<210> 91
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
tgtgaacgcg agggcggctc taataattgg ggtcagggt 39
<210> 92
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
cagggtaccc tgaccccaat gattcacgcc gccctcgcg 39
<210> 93
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
cgcgagggcg gcgtgaatca ttggggtcag ggtaccctg 39
<210> 94
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
cagggtaccc tgaccccaag aattcacgcc gccctcgcg 39
<210> 95
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
cgcgagggcg gcgtgaattc ttggggtcag ggtaccctg 39
<210> 96
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
cagggtaccc tgaccccacc gattcacgcc gccctcgcg 39
<210> 97
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
cgcgagggcg gcgtgaatcg gtggggtcag ggtaccctg 39
<210> 98
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
catgtcgacg atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 60
gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 120
cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc 180
tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatag cggccgcttg c 231
<210> 99
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
catcctaggg ccaccatgga catgagggtg cccgcccaac tgctgggact gctgctgctg 60
tggctgaggg gcgctaggtg cgacatccag gtgacacagt c 101
<210> 100
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
caggtatact taacactcgc ccctgttga 29
<210> 101
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
actgatatcg ccaccatggc ctggatgatg ctgctgctgg gactgctggc ctatggcagc 60
ggcgtggact cccaggtgca gctggtgcag tc 92
<210> 102
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
actgatatcg ccaccatggc ctggatgatg ctgctgctgg gactgctggc ctatggcagc 60
ggcgtggact ccgaggtgca gctggtgcag tc 92
<210> 103
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
catttaatta atcatttacc cagagacagg gag 33
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gatgggccct tggtggaagc ggaggacact gtcaccaggg 40
<210> 105
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
ccctggtgac agtgtcctcc gcttccacca agggcccatc 40
<210> 106
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 106
Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Ser Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 107
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gacatccagg tgacacagtc ccctagcagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca tcaccagcac cgacatcgac gacgacatga attggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggtgc ctaagctgct gatctccggc ggcaacaccc tcaggcctgg agtgcctagc 180
cggttcagcg gttctggttc tggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacgtgg ctacctacta ttgcctccag agcgactccc tgccttatac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gaggaccgtg gccgctccta gcgtgttcat cttcccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctat 420
ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg aaacagccaa 480
gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctcagctccc ctgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gt 642
<210> 108
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Glu Arg Glu Gly Gly Val Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 109
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
gaggtgcagc tggtgcagtc cggacctgag ctgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcga gaccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag gttcgtgttc tccctggaca ccagcgtgtc caccgcctac 240
ctgcaaattt cttccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcga gagggaggga 300
ggcgtgaaca actggggcca gggcaccctg gtgacagtgt cctccgcttc caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta 600
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca 660
tgcccaccat gcccagcacc tgagttcgag gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 720
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 780
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca ggctcaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1320
ggtaaa 1326

Claims (24)

1.一种抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，含有轻链可变区和重链可变区，
其中轻链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列ITSTDIDDDVN、氨基酸序列GGNTLRP和氨基酸序列LQSDSLPYT，重链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列EGGY2NY3，所述Y2为S、V或P，Y3为N、Y、F、H、S或R，且当Y2为S或P时，Y3为N，当Y2为V时，Y3为N、Y、F、H、S或R；
或者其中轻链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列ITSTDIDDDVN、氨基酸序列GGNTLRP和氨基酸序列LQSDSLPYI，重链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列EGGY2NY3，所述Y2为S、V或P，Y3为N、Y、H或R，且当Y2为S或P时，Y3为N，当Y2为V时，Y3为N、Y、H或R；
或者其中轻链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列ITSTDIDDDVN、氨基酸序列GGNTLRP和氨基酸序列MQSDSLPYT，重链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列EGGY2NY3，所述Y2为S或V，Y3为N、Y、F、H、S或R，且当Y2为S时，Y3为N，当Y2为V时，Y3为N、Y、F、H、S或R；
或者其中轻链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列ITSTDIDDDVN、氨基酸序列GGNTLRP和氨基酸序列LQSDSYPYT，重链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列EGGVNF；
或者其中轻链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列ITSTDIDDDMN、氨基酸序列GGATLRP和氨基酸序列LQSDSLPYT，重链可变区CDR1-3分别为氨基酸序列1、序列2和氨基酸序列EGGVNY3，所述Y3为Y或H。
2.根据权利要求1所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述抗原结合片段Fab选自下述任一种：
KH001：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH003：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH004：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH005：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH006：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH007：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH008：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27；
KH009：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH010：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH011：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列33；
KH012：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列21；
KH013：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH014：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH015：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH016：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列13，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH017：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH018：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH019：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列23；
KH020：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25；
KH021：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27；
KH022：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列29；
KH024：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列17，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列19；
KH027：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31；
KH028：所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列5，所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列25。
3.根据权利要求1或2所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于所述Fab由重链片段和轻链组成，所述重链片段由重链可变区和重链恒定区的CH1和部分铰链区组成，所述轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。
4.根据权利要求3所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述重链恒定区的CH1氨基酸序列与人抗体重链恒定区CH1的氨基酸序列相同，所述轻链恒定区的氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同。
5.根据权利要求4所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述重链恒定区CH1和部分铰链区的氨基酸序列为序列39，所述轻链恒定区的氨基酸序列为序列41。
6.根据权利要求5所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述抗体由重链或轻链组成，所述重链恒定区的氨基酸序列与人抗体重链恒定区的氨基酸序列相同，所述轻链恒定区的氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同。
7.根据权利要求6所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述人抗体重链恒定区的氨基酸序列为序列43，所述人抗体轻链恒定区氨基酸序列为序列41。
8.根据权利要求7所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab，其特征在于，所述抗体选自下述任一种：
KH-A：其轻链序列为序列45，其重链序列为序列47；
KH-B：其轻链序列为序列49，其重链序列为序列51；
KH-C：其轻链序列为序列45，其重链序列为序列53；
KH-D：其轻链序列为序列49，其重链序列为序列55；
KH-E：其轻链序列为序列57，其重链序列为序列59；
KH-F：其轻链序列为序列57，其重链序列为序列61。
9.由权利要求1-8中任一项所述抗补体因子D的人源化抗体或其抗原结合片段Fab衍生的抗原结合片段，其特征在于：所述衍生抗原结合片段为Fab’、F(ab’)2、Fv。
10.一种多核苷酸，其编码权利要求1-9中任一项所述人源化抗体、抗原结合片段Fab、或前述人源化抗体、抗原结合片段Fab衍生的抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，所述人源化抗体或抗原结合片段Fab中所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列表中序列4、序列6、序列14、序列16和序列18中的任一种，重链可变区的编码序列为序列表中序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32、序列34中的任一种；且当所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列4时，其重链可变区的编码序列为序列20、序列22、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32或序列34，当所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列6时，其重链可变区的编码序列为序列26或32，当所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列14时，其重链可变区的编码序列为序列22、序列24、序列26、序列30、序列32或序列34，且当所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列16时，其重链可变区的编码序列为序列20、序列24、序列26、序列28、序列30、序列32或序列34，当所述抗体的轻链可变区的编码序列为序列18时，其重链可变区的编码序列为序列20。
12.根据权利要求10或11所述的多核苷酸，其特征在于：所述Fab的重链恒定区的编码序列如序列表中序列40所示；所述Fab的轻链恒定区编码序列如序列表中序列42所示。
13.根据权利要求10或11所述的多核苷酸，其特征在于：所述抗体的重链恒定区的编码序列如序列表中序列44所示；所述抗体的轻链恒定区的编码序列如序列表中序列42所示。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于：所述抗体选自下述任一种多核苷酸： KH-A：其轻链序列为序列46，其重链序列为序列48； KH-B：其轻链序列为序列50，其重链序列为序列52； KH-C：其轻链序列为序列46，其重链序列为序列54； KH-D：其轻链序列为序列50，其重链序列为序列56； KH-E：其轻链序列为序列58，其重链序列为序列60； KH-F：其轻链序列为序列58，其重链序列为序列62。
15.下述遗传材料：含有权利要求10-14中任一项所述多核苷酸的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒。
16.根据权利要求15所述的遗传材料，其特征在于，所述重组载体为表达所述Fab或抗体或抗原结合片段的原核表达载体或真核表达载体。
17.根据权利要求15所述的遗传材料，其特征在于，所述重组菌为携带有所述多核苷酸的大肠杆菌。
18.根据权利要求15所述的遗传材料，其特征在于，所述重组细胞系为转入所述多核苷酸的哺乳动物细胞系。
19.根据权利要求18中的所述遗传材料，其特征在于，所述重组细胞系为CHO细胞系，或293细胞及其亚系。
20.根据权利要求15所述的遗传材料，其特征在于，所述重组病毒为携带有多核苷酸的重组腺病毒或重组腺相关病毒。
21.权利要求1-9中任一所述人源化抗体或抗原结合片段Fab的用途：d2)在制备中和人补体因子D产品中的用途，或 d3)在制备定性或定量检测人补体因子D的试剂盒中的用途。
22.权利要求10-14中任一所述多核苷酸的用途：d2)在制备中和人补体因子D产品中的用途，或 d3)在制备定性或定量检测人补体因子D的试剂盒中的用途。
23.权利要求15-20中任一项所述遗传材料的用途：d2)在制备中和人补体因子D产品中的用途，或 d3)在制备定性或定量检测人补体因子D的试剂盒中的用途。
24.一种药物组合物，含有辅料和活性成分，所述活性成分含有下述物质中的至少一种：权利要求1-9中任一所述人源化抗体或抗原结合片段Fab，或权利要求10-14中任一所述多核苷酸，或权利要求15-20任一所述遗传材料；所述辅料为药学上可接受的载体或赋形剂。
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