RU2514658C2

RU2514658C2 - Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств

Info

Publication number: RU2514658C2
Application number: RU2011102548/10A
Authority: RU
Inventors: Леонардо БОРРАС; Дэвид УРЕХ
Original assignee: ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2014-04-27
Also published as: DK3241843T3; PT2307455T; US20110268728A1; MX346024B; JP2011525496A; WO2009155725A1; RU2014104577A; DK2307455T3; KR20110022714A; LT3241843T; CN102076715B; HRP20211356T1; CY1119626T1; US20170096482A1; SI2307455T1; HRP20171250T1; SI3241843T1; CA2728829A1; AU2009264566B2; ZA201008595B

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ использования анализа последовательностей и рациональных стратегий улучшения растворимости иммуносвязывающих средств и, в частности, одноцепочечных антител (scFv). Способ предусматривает проведение нескольких замещений на гидрофильные остатки, выявленные путем анализа базы данных выбранных стабильных последовательностей scFv. Также описано одноцепочечное антитело, полученное таким способом, и композиция, его включающая. Изобретение может быть использовано в медицине. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 14 табл., 4 пр.

Description

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США 61/075692, озаглавленной «Оптимизация растворимости иммуносвязывающих средств», поданной 25 июня 2008 г.

Предпосылки создания изобретения

Доказано, что антитела являются очень эффективными и успешными терапевтическими агентами при лечении рака, аутоиммунных заболеваний и других нарушений. Хотя клинически обычно используются полноразмерные антитела, применение фрагментов антитела может дать ряд преимуществ, таких как повышенная проникающая способность в ткани, отсутствие Fc-эффекторной функции в сочетании со способностью добавлять другие эффекторные функции и вероятностью меньшего системного побочного действия благодаря более короткому системному времени полужизни in vivo. Фармакокинетические свойства фрагментов антител показывают, что они могут быть особенно подходящими для локализованных терапевтических подходов. Кроме того, в некоторых системах экспрессии легче продуцировать фрагменты антител, чем полноразмерные антитела.

Одним типом фрагментов антител является одноцепочечное антитело (scFv), которое состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (V_H), связанного с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) линкерной последовательностью. Таким образом, scFv не содержит всех доменов константных областей антитела, и аминокислотные остатки исходной границы раздела вариабельный/константный домен (остатки поверхности раздела) становятся открытыми для растворителя. scFv можно получать из полноразмерного антитела (например, молекула IgG) c помощью разработанных методов рекомбинантной инженерии. Однако трансформация полноразмерного антитела в scFv часто приводит к плохой стабильности и растворимости белка, низким выходам при получении и высокой тенденции к агрегации, что повышает риск иммуногенности.

Соответственно, предпринимались попытки для улучшения свойств scFv, таких как растворимость. Например, Nieba L. и др. (Prot. Eng. (1997) 10:435-444) выбрал три аминокислотных остатка, известных как остатки поверхности раздела, и осуществил их мутацию. Авторы наблюдали повышенную периплазматическую экспрессию мутированного scFv в бактериях, а также пониженную скорость термоиндуцированной агрегации, хотя термодинамическая стабильность и растворимость существенно не изменялись. Кроме того, в своей публикации авторы ясно указывают, что они не наблюдали каких-либо улучшений растворимости структуры нативного белка сконструированных scFv, как было определено методом ПЭГ-осаждения. Также сообщалось о других исследованиях, в которых был проведен сайт-направленный мутагенез определенных аминокислотных остатков в scFv (см., например, Tan, P.H. et al. (1988) Biophys. J. 75:1473-1482; Worn, A. and Pluckthun, A. (1998) Biochem. 37:13120-13127; Worn, A. and Pluckthun, A. (1999) Biochem. 38:8739-8750). В данных разнообразных исследованиях аминокислотные остатки, выбранные для мутагенеза, были выбраны на основании их известных положений в структуре scFv (например, по данным исследований молекулярного моделирования).

В другом подходе определяющие комплементарность области (CDR) очень плохо экспрессируемого scFv прививали на каркасные области scFv, для которого было продемонстрировано наличие подходящих свойств (Jung, S. and Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966). Полученный scFv показал повышенную экспрессию в растворе и термодинамическую стабильность.

Прогресс в инженерии scFv с целью улучшения их растворимости и других функциональных свойств систематизирован в виде обзора, например, Worn, A. and Pluckthun, A. (2001) J. MoI. Biol. 305:989-1010. Однако все еще сохраняется потребность в новых подходах, которые дают возможность рационального конструирования иммуносвязывающих средств, в частности scFv с превосходной растворимостью. Более того, все еще необходимы способы инженерии scFv и других типов антител для придания им повышенной растворимости - в особенности растворимости нативного белка.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение относится к иммуносвязывающему средству, содержащему мотив повышенной растворимости в вариабельной области тяжелой цепи VH, а также к способам инженерии иммуносвязывающих средств, таких как антитела scFv, для придания им повышенной растворимости. В конкретных вариантах осуществления способы по изобретению включают замещение аминокислот в последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи иммуносвязывающего средства, которые являются потенциально проблематичными с точки зрения растворимости, на предпочтительные аминокислотные остатки, которые придают повышенную растворимость. Например, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления гидрофобный остаток заменяют на гидрофильный остаток.

Предпочтительно разработанное иммуносвязывающее средство, иммуносвязывающее средство, использованное или полученное с помощью способов инженерии по изобретению, представляет собой scFv, но другие иммуносвязывающие средства, такие как полноразмерные иммуноглобулины, Fab фрагменты, однодоменные антитела (например, Dab) и нанотела, также могут быть сконструированы в соответствии с данным способом. Изобретение также охватывает иммуносвязывающие средства, полученные в соответствии со способом конструирования, а также композиции, содержащие иммуносвязывающие средства и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте изобретение относится к иммуносвязывающему средству, содержащему один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):

(а) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;

(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и

(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или

(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;

(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и

(c1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или

(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;

(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и

(c2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или

(а3) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;

(b3) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и

(c3) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.

В другом аспекте изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, содержащего (i) вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, где вариабельная область тяжелой цепи содержит остатки каркасной области V_H, и/или (ii) вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, где вариабельная область легкой цепи содержит остатки каркасной области V_L, где указанный способ включает:

А) выбор по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах остатков каркасной области V_H, остатков каркасной области V_L или остатков каркасной области V_H и V_L для мутации; и

В) проведение мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений, выбранных для мутации,

где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах остатков каркасной области V_H, то замещение протекает в одном или нескольких аминокислотных положениях тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 103 и 144 (согласно правилам нумерации АНо), и/или

где если по меньшей мере одно или несколько аминокислотных положений, выбранных для мутации, находятся в пределах остатков каркасной области V_L, то замещение протекает в аминокислотном положении легкой цепи, выбранном из группы, состоящей из положений 15, 52 и 147 (согласно правилам нумерации АНо; аминокислотного положения 15, 44 и 106 при использовании нумерации Кабата).

По меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, и аминокислотный(е) остаток(ки), вставленный(е) в выбранное(ые) положение(я), описаны далее более подробно. В нумерации аминокислотных положений, приведенной ниже, используется система нумерации АНо; соответствующие положения с использованием системы нумерации Кабата описаны далее в данном описании, и таблицы преобразования для систем нумераций АНо и Кабата приведены ниже в подробном описании. Аминокислотные остатки указаны с использованием стандартного однобуквенного обозначения.

Неожиданно было установлено, что присутствие указанных мутаций в указанных положениях повышает общую растворимость иммуносвязывающего средства, не оказывая отрицательного влияния на другие функциональные свойства белка. Например, в случае комбинации трех повышающих растворимость мутаций V12S, L144S и V103T в VH scFv было установлено, что указанные замещения отвечают за примерно 60% всей растворимости scFv. Это отличается от попыток, указанных в предшествующих результатах в данной области для повышения выхода экспрессии иммуносвязывающих средств. Например, в патенте США 6815540 описана модификация иммуносвязывающего средства за счет понижения гидрофобности во внутрицепочечной междоменной области раздела. Для этой цели было выявлено 16 положений вариабельного каркаса тяжелой цепи, которые могли быть индивидуально заменены одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из 10 аминокислот. Было установлено, что повышается выход экспрессии генерированных мутантов. Более того, та же группа исследователей опубликовала в 1999 г., т.е. тремя годами позднее даты приоритета указанного патента США, статью (см. Jung, S., Honegger, A. and Pluckthun, A. (1997) Prot. Eng. 10:959-966), указывающую, что в нескольких исследованиях сообщалось о том, что замена гидрофобных поверхностных остатков на более гидрофильные улучшает выход продуцирования. Согласно концепции данных авторов повышение продуктивности связано с улучшенным кинетическим порционированием между правильной укладкой и агрегированием неуложенного вещества, тогда как растворимость нативного белка существенным образом даже не затрагивается, так же как и термодинамическая стабильность. Таким образом квалифицированному специалисту ясно, что параметр растворимости Plückthun и др. относится только к экспрессии в растворе, а не к растворимости в целом нативного белка.

Краткое описание рисунков

Изобретение станет более понятно и задачи, отличающиеся от указанных выше, станут очевидными при рассмотрении следующего подробного описания. В данном описании приведены ссылки на прилагаемые рисунки.

На фиг.1 показаны кривые растворимости при ПЭГ-осаждении для ESBA105 дикого типа (Е105) и его растворимых вариантов.

На фиг.2 показаны профили термической денатурации для ESBA105 дикого типа (Е105) и его растворимых вариантов, измеренные в термоисследовании в широком диапазоне температур (25-96°С).

На фиг.3 показаны результаты исследования методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), которые показывают поведение при деградации различных растворимых мутантов ESBA105 после инкубации в условиях теплового стресса.

На фиг.4 показаны кривые термической денатурации EP43max и его оптимизированных вариантов, определенные анализом методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FRIR).

На фиг.5 показана термическая стабильность 578min-max и 578min-max_DHP в соответствии с измерениями методом FRIR.

Фиг.6а и 6b иллюстрируют растворимость 578min-max и 578min-max_DHP, определенную методом осаждения с помощью сульфата аммония.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к способам повышения растворимости иммуносвязывающих средств. Более конкретно, в настоящем изобретении раскрываются способы оптимизации иммуносвязывающих средств путем введения аминокислотных замещений в иммуносвязывающем средстве, которые улучшают растворимость иммуносвязывающего средства. Изобретение также относится к специализированным иммуносвязывающим средствам, например scFv, полученным в соответствии со способами по изобретению.

Для того чтобы изобретение можно было легче понять, первоначально будут определены некоторые термины. Если не определено другого, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют такие же значения, какие обычно понимаются обычным специалистом в данной области, к которой принадлежит изобретение. Хотя для практической реализации или проверки изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные приведенным в данном описании, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие отмеченные в описании ссылки включены в него путем ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Термин «антитело», как он использован в данном описании, является синонимом «иммуноглобулина». Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой полноразмерные иммуноглобулины или их фрагменты, включающие по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как одноцепочечные вариабельные домены, Fv (Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 или другие фрагменты, хорошо известные специалисту в данной области.

Термин «каркасный участок антитела» или «каркасный участок», как он использован в данном описании, относится к части вариабельного домена, либо VL (вариабельная область легкой цепи), либо VH (вариабельная область тяжелой цепи), которая служит в качестве основы для антигенсвязывающих петлевых фрагментов данного вариабельного домена (Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242).

Термин «CDR антитела» или «CDR», как он использован в данном описании, относится к гипервариабельным участкам антитела, которые состоят из антигенсвязывающих петлевых фрагментов в соответствии с определением Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. Каждый из двух вариабельных доменов фрагмента Fv антитела содержит, например, три CDR.

Термин «одноцепочечное антитело» или «scFv» относится к молекуле, включающей вариабельную область тяжелой цепи антитела (V_H) и вариабельную область легкой цепи антитела (V_L), связанные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общие структуры: NH₂-V_L-линкер-V_H-COOH или NH₂-V_H-линкер-V_L-COOH.

В данном описании термин «идентичность» относится к сопоставлению последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одно и то же основание или мономерную субъединицу аминокислоты (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, или положение в каждом из двух полипептидов занимает лизин), то соответствующие молекулы являются идентичными по данному положению. «Процент идентичности» для двух последовательностей представляет собой функцию числа совместимых положений, используемых совместно в двух последовательностях, деленную на число сравниваемых положений × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются совместимыми, то две последовательности имеют 60% идентичность. В качестве примера ДНК-последовательности CTGACT и CAGGTT имеют 50% идентичность (3 из 6 общих положений являются совместимыми (равноценными)). Обычно сравнение проводят, когда две последовательности совмещены для получения максимальной идентичности. Такое совмещение можно обеспечить с использованием, например, метода Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, легко осуществимого с помощью компьютерных программ, таких как программа Align (DNAstar, Inc.).

«Подобными» последовательностями являются те, которые при сопоставлении используют совместно идентичные и аналогичные остатки аминокислот, где подобные остатки представляют собой консервативные замещения для соответствующих аминокислотных остатков в сопоставленной ссылочной последовательности. В этом отношении «консервативное замещение» остатка в ссылочной последовательности представляет собой замещение остатком, который физически или функционально подобен соответствующему ссылочному остатку, например имеет аналогичный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи и тому подобное. Таким образом, «консервативно замещенная модифицированная» последовательность представляет собой ту, которая отличается от ссылочной последовательности или последовательности дикого типа тем, что в ней присутствует одно или несколько консервативных замещений. «Процентом подобия» между двумя последовательностями является функция числа положений, которые содержат согласованные остатки или консервативные замещения, совместно занимаемые двумя последовательностями, деленного на число сравниваемых положений и умноженного на фактор 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях согласуются, и 2 из 10 положений содержат консервативные замещения, то две последовательности имеют 80%-е положительное подобие.

Термин «консенсусная аминокислотная последовательность», как он использован в данном описании, относится к аминокислотной последовательности, которая может быть генерирована с использованием матрицы из по меньшей мере двух и, предпочтительно, более согласованных аминокислотных последовательностей, давая пробелы в согласовании, такие что возможно определить наиболее часто встречающийся остаток аминокислоты в каждом положении. Консенсусная последовательность представляет собой такую последовательность, которая включает аминокислоты, которые наиболее часто представлены в каждом положении. В том случае когда две или более аминокислот равным образом представлены для одного положения, консенсусная последовательность включает обе или все из данных аминокислот.

Аминокислотная последовательность белка может быть проанализирована на разных уровнях. Например, консервативность или вариабельность может проявляться на уровне единственного остатка, уровне множества остатков, уровне множества остатков с промежутками и т.д. Остатки могут проявлять сохранение идентичного остатка или могут сохраняться на уровне классов. Примеры классов аминокислот включают класс аминокислот с полярными, но незаряженными боковыми цепями или группами R (серин, треонин, аспарагин и глутамин); с положительно заряженными группами R (лизин, аргинин и гистидин); с отрицательно заряженными группами (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота); с гидрофобными группами R (аланин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин и тирозин); и класс специальных аминокислот (цистеин, глицин и пролин). Другие классы известны специалисту в данной области и могут быть определены с использованием структурных тенденций или других данных для оценки замещаемости. В этом смысле выражение «способная к замещению аминокислота» может относиться к любой аминокислоте, которая может быть замещена и поддерживает функциональную сохранность в данном положении.

Однако будет понятно, что аминокислоты одного и того же класса могут изменяться в определенной степени по их биофизическим свойствам. Например, будет понятно, что некоторые гидрофобные группы R (например, аланин, серин или треонин) являются более гидрофильными (т.е. обладают более высокой гидрофильностью или более низкой гидрофобностью), чем другие гидрофобные группы R (например, валин или лейцин). Относительная гидрофильность или гидрофобность могут быть определены с использованием известных в данной области методов (см., например, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) и Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).

В данном описании, когда одна аминокислотная последовательность (например, первая последовательность V_H или V_L) совмещена с одной или несколькими дополнительными аминокислотными последовательностями (например, одной или несколькими последовательностями V_H или V_L в базе данных), положение аминокислоты в одной последовательности (например, первой последовательности V_H или V_L) можно сравнить с «соответствующим положением» в одной или нескольких дополнительных аминокислотных последовательностях. В данном описании выражение «соответствующее положение» относится к эквивалентному положению в последовательности(ях) при сравнении, когда последовательности совмещены оптимальным образом, т.е. когда последовательности совмещены для достижения наиболее высокого процента идентичности или процента подобия.

В данном описании термин «база данных антител» относится к коллекции двух или более аминокислотных последовательностей антител («множество» последовательностей) и обычно относится к коллекции из десятков, сотен и даже тысяч аминокислотных последовательностей антител. База данных антител может хранить аминокислотные последовательности, например, состоящие из коллекции V_H областей антител, V_L областей антител или и тех, и других, или может хранить коллекцию последовательностей scFv, включающих области V_H и V_L. Предпочтительно, база данных хранится в доступной для поиска форме, фиксированной как, например, на компьютере с доступной для поиска компьютерной программой. В одном варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из последовательностей антител эмбрионального типа. В другом варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из последовательностей «созревших» антител (с полностью сформированной трехмерной структурой) (например, база данных Кабата последовательностей «созревших» антител, например база данных KBD). Еще в одном варианте осуществления база данных антител представляет собой базу данных, включающую или состоящую из функционально отобранных последовательностей (например, последовательностей, отобранных по QC анализу).

Термин «иммуносвязывающее средство» относится к молекуле, которая содержит весь или часть антиген-связывающего сайта антитела, например весь или часть вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, так что иммуносвязывающее средство специфически распознает антиген-мишень. Неограничивающие примеры иммуносвязывающих средств включают полноразмерные молекулы иммуноглобулина и scFv, а также фрагменты антител, включая, но не ограничиваясь указанным, (i) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) F(ab)' фрагмент, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух Fab фрагментов, связанных с помощью дисульфидного мостика в шарнирном участке; (iii) Fab' фрагмент, который по существу представляет собой Fab с частью шарнирной области (см. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3 дополненное издание. 1993)); (iv) Fd фрагмент, состоящий из доменов V_H и C_H1; (v) Fv фрагмент, включающий домены V_H и V_L одной цепи антитела, (vi) однодоменное антитело, такое как фрагмент Dab (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), который состоит из V_H или V_L домена, антитело верблюдовых (см. Hamers-Casterman, et al., Nature 363: 446-448 (1993), and Dumoulin, et al., Protein Science 11: 500-515 (2002)) или антитело акулы (например, Ig-NARs акулы, Nanobodies®); и (vii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена.

В данном описании термин «функциональное свойство» относится к свойству полипептида (например, иммуносвязывающего средства), для которого улучшение (например, относительно обычного полипептида) является желательным и/или выигрышным для специалиста в данной области, например, для улучшения свойств при получении или терапевтической эффективности полипептида. В одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой стабильность (например, термическую стабильность). В другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой растворимость (например, в условиях клетки). Еще в одном варианте осуществления функциональное свойство представляет собой поведение при агрегации. Еще в одном следующем варианте осуществления функциональное свойство представляет собой экспрессию белка (например, в прокариотической клетке). Еще в одном другом варианте осуществления функциональное свойство представляет собой эффективность рефолдинга (пересворачивание белка) после солюбилизации включения в соответствующем процессе очистки. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антигена не является функциональным свойством, которое желательно улучшить. Еще в одном варианте осуществления улучшение функционального свойства не включает существенного изменения в аффинности связывания антигена.

Термин «растворимость», как он использован в данном описании, относится к растворимости нативного белка, т.е. мономерного, неагрегированного и функционального иммуносвязывающего средства. Выражение «повышенная растворимость» означает улучшение растворимости нативного белка, которое предпочтительно определяют с помощью по меньшей мере одного из следующих методов: ПЭГ-осаждение, осаждение сульфатом аммония, выход рефолдинга или любой другой способ для определения растворимости, известный специалисту в данной области. Метод ПЭГ-осаждения представляет собой способ в соответствии с описанным Atha и др., в "Mechanism of Precipitation of Proteins by Polyethylene Glycols", JBC, 256: 12108-12117 (1981). Осаждение сульфатом аммония может быть осуществлено, например, следующим образом: готовят 10 мкл аликвоты растворов белка с концентрацией 20 мг/мл, к каждой из которых добавляют 10 мкл раствора (NH₄)₂SO₄ разной степени насыщенности (например, 35%, 33%, 31%, 29%, 25%, 20% и 15%) с последующим интенсивным перемешиванием в течение 5 секунд и 30-минутным инкубированием при комнатной температуре. После центрифугирования при 6000 об/мин при 4^оС в течение 30 мин определяют концентрацию белка в супернатанте. В таком способе предметом сравнения для различных белков является значение V50, которое представляет собой процент насыщенности раствора (NH₄)₂SO₄, при котором осаждается 50% белка. V50 определяют из графика содержания растворенного белка, определенного в супернатанте, относительно использованного процента насыщенности раствора (NH₄)₂SO₄. Выход рефолдинга соответствует проценту правильно сложенного белка, полученного в присутствии солюбилизированных веществ включения в соответствующем способе получения/очистки. Термин «растворимость», как он использован в данном описании, не относится к растворимой экспрессии.

Иммуносвязывающие средства с улучшенной растворимостью

В первом аспекте разработано иммуносвязывающее средство, включающее один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):

Неожиданно было установлено, что присутствие указанных аминокислот в указанных положениях повышает общую растворимость всего иммуносвязывающего средства. Например, в случае комбинации трех повышающих растворимость мутаций V12S, L133S и V103T в VH scFv было найдено, что указанные замещения ответственны примерно на 60% за общую растворимость scFv. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, одно или несколько замещений в указанных положениях можно использовать для улучшения растворимости любого иммуносвязывающего средства.

Иммуносвязывающее средство предпочтительно представляет собой антитело scFv, полноразмерный иммуноглобулин, фрагмент Fab, Dab или нанотело.

В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство дополнительно включает одну или несколько аминокислот из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Присутствие одной или нескольких указанных аминокислот в соответствующих положениях придает иммуносвязывающему средству повышенную растворимость.

Указанные здесь аминокислоты могут присутствовать в природных иммуносвязывающих средствах или их производных, или иммуносвязывающее средство может быть сконструировано таким образом, чтобы оно включало одну или несколько вышеуказанных аминокислот.

В предпочтительном варианте осуществления раскрытое в данном описании иммуносвязывающее средство специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.

Инженерия иммуносвязывающих средств с повышенной растворимостью

Как подробно описано в деталях, описанный здесь подход на основании последовательностей был успешно использован для идентификации определенных замещений аминокислотных остатков, которые придают повышенную растворимость. Примеры перечисляют иллюстративные и предпочтительные замещения аминокислот в определенных аминокислотных положениях в пределах VH областей и необязательно в VL области иммуносвязывающего средства (например, scFv). Иллюстративные замещения включают замещения проблематичных остатков аминокислот (например, открытых для растворителя гидрофобных остатков) в аминокислотных положениях, которые являются более гидрофильными и которые существуют с большей частотой в базе данных (например, базе данных зрелого антитела (KDB)). Особенно предпочтительное замещение представляет собой наиболее часто встречающийся остаток, который является более гидрофильным, чем проблематичный остаток. В других вариантах осуществления более гидрофильную аминокислоту выбирают из группы, состоящей из аланина (А), серина (S) и треонина (Т).

Соответственно, изобретение относится к способам инженерии, в которых одно или несколько специфических замещений аминокислот проводят в иммуносвязывающем средстве, таком как антитело scFv. Такие замещения можно провести с использованием стандартных методов молекулярной биологии, таких как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез и тому подобные.

Как указано в примерах, следующие аминокислотные положения были идентифицированы как проблематичные аминокислоты (т.е. так называемые «гидрофобные участки») для модификации указанных последовательностей V_H или V_L:

V _H: аминокислотные положения 2, 4, 5, 12, 103 и 144; и

V _L: аминокислотные положения 15, 52 и 147.

Использованная нумерация представляет собой систему нумерации АНо; таблицы преобразования для перевода нумерации АНо в систему нумерации Кабата приведены в таблицах 1 и 2.

Неожиданно было установлено, что замещение в двух или более положениях 12, 103, 144 VH (в соответствии с системой нумерации) влияет на общую растворимость иммуносвязывающего средства целиком. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, по меньшей мере два замещения в указанных положениях можно использовать для улучшения растворимости любого иммуносвязывающего средства.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, такого как антитело scFv, в котором проводят по меньшей мере два аминокислотных замещения в одном или нескольких выявленных аминокислотных положениях, см. выше, получая тем самым вариантные (т.е. мутированные) формы иммуносвязывающих средств.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу конструирования иммуносвязывающего средства, при этом способ включает:

А) выбор для мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах области V_H, области V_L или областей V_H и V_L; и

В) проведение мутации по меньшей мере в двух аминокислотных положениях, выбранных для мутации,

где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах области V_H, замещение проводят по меньшей мере в двух аминокислотных положениях тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 12, 103 и 144 (в соответствии с правилом нумерации АНо; аминокислотных положений 11, 89 и 108 при использовании нумерации Кабата), и/или

где если по меньшей мере два аминокислотных положения, выбранных для мутации, находятся в пределах области V_L, замещение проводят по меньшей мере в двух аминокислотных положениях легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из положений 15, 52 и 147 (в соответствии с правилом нумерации АНо; аминокислотных положений 15, 44 и 106 при использовании нумерации Кабата).

В некоторых вариантах осуществления аминокислотное положение занято гидрофобной аминокислотой (например, лейцин (L) или валин (V)). В одном варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи представляет собой лейцин (L). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 15 легкой цепи представляет собой валин (V). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 52 легкой цепи представляет собой фенилаланин (F). В другом варианте осуществления аминокислота в аминокислотном положении 147 легкой цепи представляет собой валин (V).

Предпочтительно мутация представляет собой замещение аминокислоты в выбранном аминокислотном положении на более гидрофильную аминокислоту. В других вариантах осуществления более гидрофильную аминокислоту выбирают из серина (S) или треонина (Т).

В некоторых вариантах осуществления способ включает а) выбор для мутации по меньшей мере двух аминокислотных положений в пределах иммуносвязывающего средства; и b) проведение мутации по меньшей мере в двух аминокислотных положениях, выбранных для мутации, где мутация включает по меньшей мере два замещения, выбранных из группы, состоящей из:

(i) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 11 при использовании нумерации Кабата);

(ii) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 89 при использовании нумерации Кабата); и

(iii) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи при использовании нумерации АНо (положение 108 при использовании нумерации Кабата).

В более предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере в одном из аминокислотных положений 12, 103 и 144 тяжелой цепи находится треонин (Т).

В следующих вариантах осуществления мутация включает замещение на треонин (Т) в аминокислотном положении 15 легкой цепи при использовании нумерации АНо или нумерации Кабата и/или замещение на аланин (А) в аминокислотном положении 147 легкой цепи при использовании нумерации АНо (положение 106 по правилам нумерации Кабата).

В других вариантах осуществления мутация приводит по меньшей мере к 2-кратному увеличению растворимости (например, 2-кратному, 2,5-кратному, 3-кратному, 3,5-кратному, 4-кратному или большему увеличению растворимости).

В другом варианте осуществления мутация не оказывает неблагоприятного воздействия на термическую стабильность, рефолдинг, выход экспрессии, агрегацию и/или активность связывания иммуносвязывающего средства.

В некоторых вариантах осуществления мутация дополнительно включает одну или несколько стабилизирующих мутаций в аминокислотном положении (правило нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Было доказано, что данные мутации оказывают влияние на стабильность иммуносвязывающего средства.

В другом аспекте данное изобретение относится к иммуносвязывающему средству, полученному в соответствии со способом по изобретению.

В некоторых иллюстративных вариантах осуществления иммуносвязывающее средство, сконструированное в соответствии со способом по данному изобретению, представляет собой известное в данной области иммуносвязывающее средство, которое связывает антиген-мишень, имеющий терапевтическое значение, или иммуносвязывающее средство, которое включает вариабельные области (области VL и/или VH) одну или несколько CDR (например, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 и/или CDRH3), полученные из иммуносвязывающего средства, имеющего терапевтическое значение. Например, иммуносвязывающие средства, одобренные в настоящее время Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) или другими регулирующими органами, могут быть сконструированы в соответствии со способом по изобретению. Более конкретно, данные иллюстративные иммуносвязывающие средства включают, но не ограничиваются указанным, антитела по отношению к CD3, такие как муромонаб (Orthoclone® OKT3; Johnson&Johnson, Brunswick, NJ; см. Arakawa et al. J. Biochem, (1996) 120:657-662; Kung and Goldstein et al., Science (1979), 206: 347-349), антитела по отношению к CD11, такие как эфализумаб (Raptiva®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), антитела по отношению к CD20, такие как ритуксимаб (Rituxan®/Mabthera®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), тозитумомаб (Bexxar®, GlaxoSmithKline, Лондон) или ибритумомаб (Zevalin®, Biogen Idec, Кэмбридж MA) (см. патенты США № 5736137; 6455043 и 6682734), антитела по отношению к CD25 (IL2Rα), такие как даклизумаб (Zenapax®, Roche, Базель, Швейцария) или базиликсимаб (Simulect®, Novartis, Базель, Швейцария), антитела по отношению к CD33, такие как гемтузумаб (Mylotarg®, Wyeth, Мэдисон, NJ - см. патенты США № 5714350 и 6350861), антитела по отношению к CD52, такие как алемтузумаб (Campath®, Millennium Pharmacueticals, Кэмбридж, MA), антитела по отношению к GpIIb/gIIa, такие как абциксимаб (ReoPro®, Centocor, Horsham, PA), антитела по отношению к TNFα, такие как инфликсимаб (Remicade®, Centocor, Хоршэм, PA) или адалимумаб (Humira®, Abbott, Abbott Park, IL - см. патент США № 6258562), антитела по отношению к IgE, такие как омализумаб (Xolair®, Genentech, Южный Сан-Франциско, CA), антитела по отношению к RSV, такие как паливизумаб (Synagis®, Medimmune, Гейтерсбург, MD - см. патент США № 5824307), антитела по отношению к EpCAM, такие как эдреколомаб (Panorex®, Centocor), антитела по отношению к EGFR, такие как цетуксимаб (Erbitux®, Imclone Systems, Нью-Йорк, NY) или панитумумаб (Vectibix®, Amgen, Thousand Oaks, CA), антитела по отношению к HER2/neu, такие как трастузумаб (Herceptin®, Genentech), антитела по отношению к α4 интегрину, такие как натализумаб (Tysabri®, BiogenIdec), антитела по отношению к C5, такие как экулизумаб (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals, Chesire, CT), и антитела по отношению к VEGF, такие как бевацизумаб (Avastin®, Genentech - см. патент США № 6884879) или ранибизумаб (Lucentis®, Genentech).

В некоторых иллюстративных вариантах осуществления иммуносвязывающее средство, сконструированное в соответствии со способом по данному изобретению, представляет собой определенное вышеизвестное в данной области иммуносвязывающее средство. В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство представляет собой антитело scFv. В других вариантах осуществления иммуносвязывающее средство представляет собой, например, полноразмерный иммуноглобулин, Dab, нанотело или фрагмент Fab.

Несмотря на все вышесказанное в различных вариантах осуществления некоторые иммуносвязывающие средства исключены из использования в способах инженерии по изобретению и/или исключены из композиции иммуносвязывающего средства, полученной способами инженерии. Например, в различных вариантах осуществления имеется условие, что иммуносвязывающее средство не представляет собой любое антитело scFv или его вариант, как описано в публикациях РСТ WO 2006/131013 и WO 2008/006235, такое как ESBA105 или его варианты, которые описаны в публикациях РСТ WO 2006/131013 и WO 2008/006235, содержание каждой из которых специально включено в данное описание путем ссылки.

Предпочтительно раскрытое в данном описании иммуносвязывающее средство, использованное для раскрываемого здесь способа или полученное описанным здесь способом, соответственно, представляет собой антитело scFv, но также охватывает другие иммуносвязывающие средства, такие как полноразмерные иммуноглобулины, фрагменты Fab или любой описанный здесь другой тип иммуносвязывающего средства (например, Dab или нанотела).

В предпочтительном варианте осуществления иммуносвязывающее средство, как оно раскрывается в данном описании, использованное для раскрываемого здесь способа или полученное раскрываемым здесь способом, соответственно, специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.

Данное изобретение, кроме того, охватывает композиции, включающие описанные здесь иммуносвязывающие средства и фармацевтически приемлемый носитель.

Композиции и препараты scFv

Другой аспект изобретения относится к композиции scFv, полученного в соответствии со способами по изобретению. Таким образом, изобретение относится к композиции сконструированного scFv, в который были введены одна или несколько увеличивающих растворимость мутаций в аминокислотную последовательность по сравнению с оригинальным рассматриваемым scFv, где мутация(и) были введены в положения гидрофобных остатков аминокислот. В одном варианте осуществления scFv сконструирован таким образом, что он содержит одно мутированное аминокислотное положение (например, одно положение в каркасной области). В других вариантах осуществления scFv сконструирован таким образом, что он содержит два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти мутированных аминокислотных положений (например, положений в каркасной области).

В некоторых вариантах осуществления мутация дополнительно включает одну или несколько стабилизирующих мутаций, описанных в заявке РСТ № РСТ/СН2008/000285, озаглавленной «Способы модификации антител и модифицированные антитела с усовершенствованными функциональными свойствами», поданной 25 июня 2008 г., или в предварительной заявке на патент США сер. № 61/069056, озаглавленной «Способы модификации антител и модифицированные антитела с усовершенствованными функциональными свойствами», поданной 12 марта 2008 г., обе из которых включены в данное описание путем ссылки. Например, иммуносвязывающее средство может дополнительно включать замещение в аминокислотном положении (правила нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из (а) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи. Одна или несколько мутаций в указанных положениях воздействуют на общую стабильность всего иммуносвязывающего средства. В других вариантах осуществления мутация дополнительно включает следующие стабилизирующие мутации (правила нумерации АНо): (а) аспарагиновая кислота (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи, (b) глутаминовая кислота (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи, (с) аргинин (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи, (d) лейцин (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи и (е) аланин (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.

Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим препаратам композиций scFv по изобретению. Такие препараты обычно включают композицию scFv и фармацевтически приемлемый носитель. Как использовано в данном описании, «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие поглощение агенты и тому подобные, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для, например, внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального, эпидермального (например, с помощью инъекции или вливания) или местного (например, в глаз или на кожу) введения. В зависимости от пути введения scFv может быть покрыт материалом для защиты соединения от действия кислот или других природных условий, которые могут дезактивировать соединение.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут включать одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Выражение «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не оказывает каких-либо нежелательных токсикологических эффектов (см., например, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают те, которые получены из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, ортофосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная и тому подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Основно-аддитивные соли включают производные щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобные, а также нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобные.

Фармацевтическая композиция по изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и тому подобные; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобные, и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобные.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие, как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или за счет использования поверхностно-активных веществ.

Данные композиции также могут содержать вспомогательные добавки, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Защиту от присутствия микроорганизмов можно гарантировать как с помощью методов стерилизации, см. выше, так и путем включения в состав различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбитановой кислоты и тому подобного. Также может оказаться желательным включение в состав композиций изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобных. Кроме того, пролонгированное поглощение фармацевтической инъекционной формы можно достичь путем включения агентов, которые замедляют поглощение, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для последующего применения. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением тех случаев когда какая-либо обычная среда или агент являются несовместимыми с активным соединением, подразумевается их применение в фармацевтических композициях по данному изобретению. В состав композиций также могут быть включены добавочные активные соединения.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосомного препарата или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобные) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов покрытий, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным будет включение в состав композиций изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированного поглощения инъекционных композиций можно достичь путем включения в композицию агентов, которые замедляют поглощение, например моностеаратные соли и желатин.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем введения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель вместе с одним из или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как это требуется, с последующей стерилизацией путем микрофильтрования. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), с помощью которых получают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из предварительно стерилизованного фильтрованием их раствора.

Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и конкретного пути введения. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения единичной препаративной лекарственной формы, обычно будет представлять собой количество композиции, которая вызывает терапевтическое действие. Обычно из расчета на сто процентов, данное количество будет колебаться от примерно 0,01 процента до примерно девяносто девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0,1 процента до примерно 70 процентов, наиболее предпочтительно от примерно 1 процента до примерно 30 процентов активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Режимы дозировки регулируют для обеспечения оптимальной желаемой ответной реакции (например, терапевтической ответной реакции). Например, можно ввести один болюс, можно на протяжении времени вводить несколько раздельных доз или дозировка может быть пропорционально снижена или повышена в соответствии с показаниями по необходимости для терапевтической ситуации. Особенно выгодно получать парентеральные композиции в виде единичной дозированной лекарственной формы для легкости введения и равномерности дозирования. Термин «единичная дозированная лекарственная форма», как он использован в данном описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для субъектов, подвергаемых лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Подробное описание единичных препаративных лекарственных форм по изобретению диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического действия, которое нужно достичь, и (b) ограничений, присущих в данной области компаундированию такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.

Системы нумерации положений в антителах

Таблицы перевода приведены для двух различных систем нумерации, использованных для идентификации положений остатков аминокислот в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела. Система нумерации Кабата описана дополнительно Kabat и др. (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Система нумерации AHo описана дополнительно в публикации Honegger, A. и Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670).

Нумерация вариабельной области тяжелой цепи

Таблица 1
Таблица перевода для положений остатков в вариабельной области тяжелой цепи

Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 2. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 4. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 3. Колонка 5. Положение остатка в системе нумерации Кабата. Колонка 6. Соответствующий номер в системе нумерации АНо для положения, указанного в колонке 5.

Нумерация вариабельной области легкой цепи

Таблица 2
Таблица перевода для положений остатков в вариабельной области легкой цепи

Другие варианты осуществления

Понятно, что изобретение также включает любые методологии, ссылки и/или композиции, указанные в приложениях (А-С) предварительной заявки на патент США сер. № 60/905365 (приоритет по заявке WO 08/110348) и приложениях (А-J) предварительной заявки на патент США сер. № 60/937112 (приоритет по заявке WO 09/000098), включая, но не ограничиваясь указанным, базы данных, данные по биоинформатике, данные манипулирования и способы интерпретации при компьютерном моделировании эксперимента, функциональные анализы, предпочтительные последовательности, предпочтительное(ые) положение(я) остатков/изменения, идентификацию и выбор каркасной области, изменения каркасной области, сравнительный анализ первичной структуры и интеграцию CDR и предпочтительные изменения/мутации.

Дополнительную информацию, касающуюся данных методологий и композиций, можно найти в заявках на патент США 60/819378 и 60/899907 и PCT публикации WO 2008/006235, озаглавленных "scFv Antibodies Which Pass Epithelial And/Or Endothelial Layers" и поданных в июле 2006 г. и 6 февраля 2007 г. соответственно; WO 06131013A2, озаглавленной "Stable And Soluble Antibodies Inhibiting TNFα", поданной 6 июня 2006 г.; EP 1506236A2, озаглавленной "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same", поданной 21 мая 2003 г.; EP 1479694A2, озаглавленной "Intrabodies ScFv with defined framework that is stable in a reducing environment" и поданной 18 декабря 2000 г.; EP 1242457B1, озаглавленной "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof", поданной 18 декабря 2000 г.; WO 03097697A2, озаглавленной "Immunoglobulin Frameworks Which Demonstrate Enhanced Stability In The Intracellular Environment And Methods Of Identifying Same", поданной 21 мая 2003 г.; и WO 0148017A1, озаглавленной "Intrabodies With Defined Framework That Is Stable In A Reducing Environment And Applications Thereof", поданной 18 декабря 2000 г.; и публикации Honegger et al., J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001).

Кроме того, понятно, что изобретение также включает методологии и композиции, подходящие для открытия и/или усовершенствования других форматов антител, например полноразмерные антитела или их фрагменты, например Fab, Dab и тому подобные. Соответственно, принципы и остатки, выявленные в данном изобретении в качестве подходящих для выбора или изменения с целью достижения желаемых биофизических и/или терапевтических свойств, можно использовать для широкого круга иммуносвязывающих средств. В одном варианте осуществления терапевтически значимые антитела, например, одобренные Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA), усовершенствуют путем модификации одного или нескольких положений остатков, как раскрывается в данном описании.

Изобретение, однако, не ограничено инженерией иммуносвязывающих средств. Например, специалисту в данной области будет понятно, что способы по изобретению могут быть применены для инженерии других, неиммуноглобулиновых, связывающих молекул, включая, но не ограничиваясь указанным, связывающие молекулы фибронектина, такие как Аднектины (см. WO 01/64942 и патенты США № 6673901, 6703199, 7078490 и 7119171), Аффитела (см., например, патенты США № 6740734 и 6602977 и WO 00/63243), Антикалины (так же известные, как липокалины) (см. WO 99/16873 и WO 05/019254), доменные белки (см. WO 02/088171 и WO 04/044011) и анкирин-повторяющие белки, такие как Дарпины или лейцин-повторяющие белки (см. WO 02/20565 и WO 06/083275).

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют следующие примеры, которые не следует рассматривать как дополнительно ограничивающие. Содержание всех фигур и всех ссылок, патентов, опубликованных и неопубликованных патентных заявок, процитированных в данном описании, специально включено в данное описание путем ссылки во всей своей полноте.

Пример 1. Образование scFv с улучшенной растворимостью

В данном примере структурное моделирование и подход на основании анализа последовательности были использованы для выявления мутаций в каркасной области scFv, которые приводят к улучшенной растворимости.

а) Структурный анализ

Трехмерную 3D структуру ESBA 105 scFv моделировали с использованием автоматического сервера гомология-моделирование структуры белка, доступного через вэб-сервер ExPASy. Структуру анализировали в соответствии с относительной поверхностью, доступной для растворителя, (оПДР) и остатки классифицировали следующим образом: (1) открытые для остатков, демонстрирующих оПДР≥50%, и (2) частично открытые для остатков с 50%≤оПДР≥25%. Гидрофобные остатки с оПДР≥25% рассматривались как гидрофобные участки. Для оценки площади, доступной для растворителя, для каждого из выявленных гидрофобных участков проводили расчеты для 27 PDB файлов с высокой гомологичностью по отношению к ESBA105 и разрешением выше 2,7Å. Средние оПДР и стандартные отклонения рассчитывали для гидрофобных участков и подробно изучали для каждого из них.

Таблица 3
Оценка гидрофобных участков поверхности

Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Средняя площадь, доступная для растворителя, рассчитанная из 27 PDB файлов. Колонка 4. Стандартные отклонения от колонки 3. Колонки 5-9. Структурная роль гидрофобных участков, выбранных из АНо.

Большинство гидрофобных участков, выявленных в ESBA105, соответствуют области контакта вариабельных-константных доменов (VH/CH). Это коррелирует с предшествующими выявленными данными по открытым для растворителя гидрофобным участкам в формате scFv (Nieba et al., 1997). Два гидрофобных участка (VH2 и VH5) также вносят вклад во взаимодействие VL-VH и соответственно были исключены из последующего анализа.

b) Конструирование мутаций, способствующих растворимости

Была осуществлена выборка всего 122 VL и 137 VH последовательностей из вэб-страницы (www.bioc.uzh.ch/antibody) Анны-Марии Хонеггер (Annemarie Honegger). Последовательности первоначально соответствовали структурам 393 антител в Fv или Fab формате, извлеченных из банка данных белков (PDB) (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Последовательности использовали для анализа вне зависимости от вида или подгруппы для увеличения вероятности выявления альтернативных аминокислот с более высокой гидрофильностью, чем нативные остатки. Последовательности, имеющие более чем 95% идентичность с любой другой последовательностью в пределах базы данных, исключали для уменьшения отклонения. Последовательности совмещали и анализировали частоту появления остатков. Инструменты и алгоритмы анализа последовательности применяли для выявления и отбора гидрофильных мутаций для нарушения гидрофобных участков в ESBA105. Последовательности сопоставляли в соответствии с системой нумерации АНо для вариабельного домена иммуноглобулина (Honegger and Pluckthun 2001). Анализ ограничивали каркасными областями.

Частоту встречаемости остатка, f(r), для каждого положения, i, в созданной пользователем базе данных рассчитывали по числу раз, когда конкретный остаток наблюдается в пределах набора данных, деленному на общее число последовательностей. На первой стадии частоту появления различных аминокислот рассчитывали для каждого гидрофобного участка. Частоту появления остатка для каждого гидрофобного участка, выявленного в ESBA105, анализировали в рамках созданной пользователем базы данных, описанной выше. В таблице 4 приведена частота встречаемости остатков в гидрофобных участках, деленная на все количество остатков целиком, присутствующее в базе данных.

Таблица 4
Частота появления остатка для 259 последовательностей зрелых антител в формате scFv или Fab для гидрофобных участков, выявленных в ESBA105

На второй стадии частоту появления гидрофильных остатков в гидрофобных участках использовали для конструирования мутаций, ответственных за растворимость, путем выбора наиболее часто встречающегося гидрофильного остатка в каждом гидрофобном участке. В таблице 5 приведены растворимые мутанты, выявленные с использованием данного подхода. Гидрофобность исходных и мутантных остатков рассчитывали как среднюю гидрофобность для величин, опубликованных в нескольких статьях, и выражали как функцию уровня открытости боковой цепи для растворителя.


*Гидрофобный участок в положении 144 заменяли не на наиболее часто встречающийся гидрофильный остаток в базе данных, а на серин, поскольку он уже содержался в CDR донорах ESBA105.
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Средняя площадь, доступная для растворителя, рассчитанная из 27 PDB файлов. Колонка 4. Исходные остатки в ESBA105. Колонка 5. Средняя гидрофобность для колонки 4 по выборке из АНо. Колонка 6. Наиболее часто встречающийся гидрофильный остаток в положении, указанном в колонке 1. Средняя гидрофобность для колонки 6 по выборке из АНо/

с) Исследование растворимости вариантов ESBA105

Мутации, ответственные за растворимость, вводили по отдельности или во множестве комбинаций и исследовали выход рефолдинга, экспрессию, активность, стабильность и характер агрегации. В таблице 6 показаны различные комбинации мутаций, ответственных за растворимость, введенных в каждый из оптимизированных вариантов ESBA105 на основании потенциального вклада в растворимость и уровня риска, что мутация могла бы изменять связывание с антигеном.

Таблица 6
Конструирование растворимых вариантов для ESBA105

Исследовано отдельно во втором круге. * Черта внизу отделяет число мутаций, содержащихся в легкой и тяжелой цепях соответственно.
Колонка 1. Положение остатка в системе нумерации АНо. Колонка 2. Домен для положения, указанного в колонке 1. Колонка 3. Исходный остаток в ESBA105 в различных гидрофобных участках. Колонка 4. Различные варианты, содержащие мутации, ответственные за растворимость, в указанных положениях.

d) Измерения растворимости

Максимальную растворимость ESBA105 и его вариантов определяли методом ПЭГ-осаждения, как первоначально описано Atha et al. (JBC, 256: 12108-12117 (1981)). В данном способе измеряют концентрацию белка в супернатантах, полученных при центрифугировании смесей ПЭГ-белок, и строят график в логарифмических координатах относительно концентрации ПЭГ. Раствор белка с концентрацией 20 мг/мл смешивали в соотношении 1:1 с растворами ПЭГ, насыщенность которых колебалась от 30 до 50%. Данные условия были выбраны на основании профиля растворимости, наблюдаемого для ESBA105 дикого типа после эмпирического определения линейной зависимости LogS (S=растворимость) относительно концентрации ПЭГ (% вес/об.). Кривые растворимости нескольких примеров вариантов ESBA105, которые проявляли превосходную растворимость, представлены на фиг.1. Полный список значений растворимости также приведен в таблице 7.

Таблица 7
Оцененная максимальная растворимость и активность мутантов по сравнению с исходным ESBA105

е) Измерения термостабильности

Измерения термостабильности для исходного ESBA105 и последующих растворимых вариантов проводили с использованием Фурье-ИКС ATR спектроскопии. Молекулы исследовали термически в широком диапазоне температур (25-95°С). Профиль денатурации получали посредством использования преобразования Фурье для сигналов интерферограммы (см. фиг.2). Профили денатурации использовали для аппроксимации средних точек термических переходов разворачивания (ТМ) для каждого из вариантов ESBA105 с применением сигмоидальной модели Больцмана (таблица 8).

iii. Измерения агрегации

ESBA105 и его растворимые варианты также анализировали во времязависимом тесте для оценки деградации и особенностей агрегации. С этой целью растворимые белки (20 мг/мл) инкубировали при повышенной температуре (40°С) в фосфатном буфере при рН 6,5. Контрольные образцы выдерживали при -80°С. Образцы анализировали после периода инкубации в течение двух недель для оценки деградации (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)) и агрегации (SEC). Это давало возможность отбросить варианты, которые были склонны к деградации (см. фиг.3), или те из них, которые проявляли тенденцию к образованию растворимых или нерастворимых агрегатов (см. таблицу 9)

Таблица 9
Измерения нерастворимой агрегации

iv. Экспрессия и рефолдинг растворимых вариантов

Для растворимых мутантов также исследовали экспрессию и выход рефолдинга относительно исходной молекулы ESBA105. Результаты данных исследований представлены в таблице 10.

Таблица 10
Экспрессия и рефолдинг растворимых вариантов

Хотя все гидрофильные мутанты, ответственные за растворимость, проявляли лучшую растворимость по сравнению с исходной молекулой ESBA105, только некоторые из этих молекул были подходящими с точки зрения других биофизических свойств. Например, многие варианты обладали сниженной термостабильностью и/или выходом рефолдинга относительно исходной молекулы ESBA105. В частности, гидрофильная замена в положении VL147 резко понижала стабильность. Мутации, ответственные за растворимость, которые существенно не влияли на термическую стабильность, соответственно были объединены и подвергнуты дополнительному термическому стрессу для подтверждения их свойств.

Три мутанта, содержащие комбинацию четырех различных мутаций, ответственных за растворимость (Opt1.0, Opt0.2 и VH:V103T), существенно улучшали растворимость ESBA105, не влияя на воспроизводимость методов, активность или термическую стабильность. Однако мутант, имеющий комбинированные мутации Opt1.0 и Opt0.2 в ESBA105 (Opt 1_2), содержал повышенное количество нерастворимых агрегатов после инкубации в течение 2 недель при 40^оС (см. таблицу 9). Этот факт может быть объяснен ролью валина (Val) в положении VL15 во вращении бета-складчатой конформации, поскольку Val обладает наибольшей склонностью к бета-складчатой конформации из всех аминокислот. Этот результат показывает, что единственная мутация, ответственная за растворимость в положении VL15, является допустимой, но не в сочетании с растворимыми мутантами, которые разрывают другие гидрофобные участки. Соответственно, мутации, содержащиеся в Opt 0_2 и VH:V103T, были выбраны в качестве лучших исполнителей для улучшения свойств растворимости молекул scFv.

Пример 2. Генерирование scFv, обладающих повышенной растворимостью и стабильностью

Варианты ESBA105, выявленные при конструировании растворимости, были дополнительно оптимизированы путем замещения стабилизирующими мутациями, выявленными в анализе контроля качества (КК). Было создано всего 4 конструкции, которые содержали от 1 до 3 мутаций, ответственных за растворимость, которые были выявлены выше в примере 1, в сочетании со всеми стабилизирующими мутациями, выявленными при КК 7.1 и 15.2 (т.е. D13N и V83E в домене VL и V78A, K43 и F67L в домене VH). Все оптимизированные конструкты давали более растворимый белок, чем scFv дикого типа (см. таблицу 11). Комбинация стабилизирующих и усиливающих растворимость мутаций существенно не влияла ни на активность, ни на стабильность молекул scFv.

Таблица 11
scFv с оптимизированной растворимостью и стабильностью

Значения растворимости для всех 4 вариантов использовали для деконволюционного анализа вклада каждой мутации в растворимость scFv. Очевидно, что все мутации вносили свой вклад в растворимость scFv аддитивным образом, даже хотя несколько из данных остатков расположены относительно близко друг к другу как в первичной последовательности, так и в трехмерной (3D) структуре. Анализ показал, что комбинация трех усиливающих растворимость мутаций в домене VH (V12S, L144S, V103T (или V103S)) отвечает за ~60% растворимости scFv. Поскольку гидрофобные участки сохраняются в вариабельных доменах всех иммуносвязывающих средств, такую оптимальную комбинацию мутаций можно использовать для улучшения растворимости виртуально любого scFv или молекулы другого иммуносвязывающего средства.

Пример 3. Вариант Epi43max, эффективного связывающего агента для TNFα с оптимизированной растворимостью

В таблице 12 указаны характеристические данные для трех оптимизированных вариантов Epi43max, эффективного связывающего агента для TNF. EP43_maxDHP представляет собой вариант EP43max с увеличенной растворимостью и включает в себя три вышеуказанные мутации, повышающие растворимость (V→S в положении 12 по AHo, V→T в положении 103 по AHo и L→T в положении 144 по AHo). Варианты EP43_maxmin и EP43_minmax были генерированы путем перемещения домена между "min" и "max" привитыми фрагментами. В частности, вариант "minmax" включает минимальную (только CDR-привитой фрагмент) привитую версию легкой цепи и максимальную привитую версию тяжелой цепи (т.е. привитой кроличий CDR плюс остатки кроличьей каркасной области антитела, вовлеченной в связывание с антигеном). Наоборот, вариант "maxmin" включал в себя максимальную привитую версию легкой цепи и минимальную привитую версию тяжелой цепи. Кривые термической денатурации EP43max и его оптимизированных вариантов сравнивали с использованием Фурье-ИКС анализа (см. фиг.4). Было установлено, что Epi43minmax имеет более низкую среднюю точку разворачивания трехмерной структуры, чем Epi43max. Более того, minmax вариант проявлял стадию перехода к разворачиванию, что указывает на то, что оба домена разворачиваются при очень близких температурах.

Таблица 12
Биофизические характеристики для трех оптимизированных вариантов Epi43max, эффективного связывающего агента для TNF

Пример 4. Производные VEGF-иммуносвязывающих средств с повышенной растворимостью

Помимо описанных выше TNF-иммуносвязывающих средств (ESBA105 и Epi43max) был проведен инжиниринг нескольких растворимых производных VEGF-иммуносвязывающих средств в соответствии со способами по изобретению. В частности, данные варианты VEGF-иммуносвязывающих средств были сконструированы таким образом, чтобы они имели разорванный гидрофобный участок («DHP») путем выбора следующих остатков: (а) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи; (b) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи и с) серин (S) или треонин (Т) в положении 144 последовательности аминокислот тяжелой цепи. Биофизические характеристики данных DHP-вариантов сравнивали с их прототипами дикого типа. Данные характеристики включали температуру плавления или т.пл. (определенную с помощью Bio-ATR), процент потери β-складчатой конформации при 60^оС (определенный с помощью AquaSpec), процент потери белка после осаждения при 60°С, растворимость методом осаждения сульфатом аммония, выход рефолдинга при продуцировании и уровни экспрессии в E. coli.

Как указано ниже в таблице 14, растворимость одного из VEGF-иммуносвязывающих средств ((ESBA578minmax FWl.4 DHP) была существенно выше за счет введения DHP-мотива. Более того, другие биофизические свойства (например, термическая стабильность) либо не затрагивались неблагоприятным образом, либо улучшались при введении мотива. Кривые термической стабильности, использованные для определения температуры плавления для 578min-max и его варианта с оптимизированной растворимостью (578min-max_DHP), показаны на фиг.5 и в таблице 13, тогда как кривые осаждения сульфатом аммония, использованные для определения значений растворимости, показаны на фиг.6.

Таблица 13

Таблица 14
Биофизические характеристики VEGF-иммуносвязывающих средств

Эквиваленты

Специалистам в данной области будет понятно или они будут способны выяснить с использованием не более чем рутинных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления описанного здесь изобретения. Подразумевается, что следующая формула изобретения охватывает такие эквиваленты.

Claims

1. Одноцепочечное антитело (scFv) для использования в качестве терапевтического средства, содержащее один из следующих повышающих растворимость мотивов в аминокислотных положениях 12, 103 и 144 тяжелой цепи (АНо нумерация):
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(c) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а1) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b1) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с1) серин (S) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи; или
(а2) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b2) треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и
(с2) треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.

2. Одноцепочечное антитело по п.1, дополнительно содержащее:
(a) аспарагиновую кислоту (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовую кислоту (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинин (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцин (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи;
и/или
(e) аланин (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.

3. Способ повышения растворимости одноцепочечного антитела
в нативном состоянии, содержащего вариабельную область (V_H) тяжелой цепи или ее фрагмент, включающий:
A) выбор для мутации по меньшей мере трех аминокислотных положений в пределах области V_H, и
B) проведение мутации по меньшей мере в трех аминокислотных положениях, выбранных для мутации,
где по меньшей мере три аминокислотных положения выбраны из группы аминокислотных положений тяжелой цепи, состоящей из положений 12, 103 и 144 (в соответствии с правилом нумерации АНо), и проведение мутации включает замещение аминокислоты в выбранном аминокислотном положении на гидрофильную аминокислоту.

4. Способ по п.3, где гидрофильная аминокислота представляет собой:
(a) серин (S) в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи;
(b) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи; и/или
(c) серин (S) или треонин (Т) в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи.

5. Способ по п.3 или 4, где аминокислота в выбранном для мутации аминокислотном положении представляет собой гидрофобную аминокислоту.

6. Способ по п.5, где гидрофобная аминокислота представляет собой лейцин (L) или валин (V).

7. Способ по п.3 или 4, где аминокислота, выбранная для мутации:
(a) аминокислоты в аминокислотном положении 12 тяжелой цепи представляет собой валин (V);
(b) аминокислоты в аминокислотном положении 103 тяжелой цепи представляет собой валин (V); и
(c) аминокислоты в аминокислотном положении 144 тяжелой цепи представляет собой лейцин (L).

8. Способ по п.3 или 4, где мутация не оказывает неблагоприятного влияния на термическую стабильность, рефолдинг, выход экспрессии, агрегацию и/или активность связывания одноцепочечного антитела.

9. Способ по п.3 или 4, где мутация приводит к по меньшей мере 2-кратному увеличению растворимости.

10. Способ по п.3 или 4, где проведение мутации дополнительно включает стадию введения одной или нескольких мутаций в аминокислотном положении (правило нумерации АНо), выбранном из группы, состоящей из
(a) аспарагиновой кислоты (D) в аминокислотном положении 31 легкой цепи;
(b) глутаминовой кислоты (Е) в аминокислотном положении 83 легкой цепи;
(c) аргинина (R) в аминокислотном положении 43 тяжелой цепи;
(d) лейцина (L) в аминокислотном положении 67 тяжелой цепи; и
е) аланина (А) в аминокислотном положении 78 тяжелой цепи.

11. Одноцепочечное антитело для использования в качестве терапевтического средства, полученное способом по любому из пп.3-10.

12. Одноцепочечное антитело по любому из пп.1, 2 или 11, где одноцепочечное антитело специфически связывается с TNFα человека или VEGF человека.

13. Композиция для использования в терапии, содержащая одноцепочечное антитело по любому из пп.1, 2, 11 или 12 и фармацевтически приемлемый носитель.