CN106399149A

CN106399149A - 杀蚊幼制剂—孑孓清培养基配方

Info

Publication number: CN106399149A
Application number: CN201610528775.5A
Authority: CN
Inventors: 徐军
Original assignee: Bazhou Point Of Green Agriculture And Forestry Technology Co Ltd
Current assignee: Bazhou Point Of Green Agriculture And Forestry Technology Co Ltd
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2017-02-15

Abstract

杀蚊幼－孑孓清无色无味，专杀蚊幼－孑孓，杀蚊幼广谱，效果稳定，不污染环境，对人畜禽鱼虾和有益昆虫无毒无害。并能彻底净化水质，达到综合防治效果。该菌从自然罹病蚊幼分离的。在LB培养基中生长良好。经分离纯化，生理生化鉴定，确定该菌为苏云金芽胞杆菌以色列亚种（Bacillusthuringiensis subsp israelensis Bti)。该菌对淡色库蚊（Culex pipiens pallens）等8种蚊幼有极强杀伤力。该菌生长中所产生的毒素蛋白起杀伤作用，蚊幼取食后，2~12小时破坏蚊幼的胃蛋白酶，迫使蚊幼不能生长发育得败血病死亡。Bti在芽孢形成过程中，合成五种具有杀伤蚊幼的活性蛋白。

Description

杀蚊幼制剂—孑孓清培养基配方

技术领域

本发明是经过分离、筛选、多次纯化、生理、生化鉴定得到的一种病原微生物—细菌，该菌为苏云金芽胞杆菌以色列亚种（Bacillusthuingiensis subsp israelensis 简称Bti)。该菌在实验室做了大量分离、筛选、纯化、生理、生化鉴定、16SDNA序列分析和多种动物的慢性、亚急性、急性等安全性试验外，还进行摇瓶、小罐、中灌、大罐和10吨灌生产发酵。除了能够实现稳定产业化生产外，更重要的是，还要筛选出能够适宜Bti发酵生长良好所需要的碳源、氮源、磷源培养基有效成分。本公司在长期生产发酵中，研制了出适宜Bti发酵生长旺盛、芽孢数量多、芽孢质量好、高质量形成晶体蛋白毒素（该Bti菌株在发酵生长过程中能产生5种以上晶体蛋白毒素）的培养基。苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)是一种重要的兼型病原微生物—细菌，已知可分为40个血清种和54个血清亚种，对蚊幼虫—孑孓有毒效的菌株有3种，血清型为H-14(以色列亚种)、PG-14(摩氏变种)和73-E10-2(达姆施塔特变种)，应用最广的是苏云金芽孢杆菌以色列亚种。BtHi-14由Goldbery(1972)和Margelit(1977)在以色列分离出。该菌对蚊幼虫—孑孓有较高的专一性，在宿主肠道内，晶体蛋白原毒素在高pH值和适合的酶的作用下，很快转变为较小的有毒亚单位，蚊幼虫—孑孓吞食晶体蛋白后，引起中肠细胞破裂得败血病症而死亡。我国20世纪70年代开始对以色列亚种进行中试生产，生产的杀蚊幼剂在野外污水池、水稻田以浓度1~3mg/L应用，24小时杀灭库蚊，对伊蚊幼虫—孑孓防治效果达90%，对按蚊幼虫—孑孓也有良好效果。至今该制剂年产数百万吨，主要用来杀灭容器积水中的伊蚊幼虫—孑孓，特别是饮水水缸中的埃及伊蚊幼虫—孑孓。在我国南、北方有较大面积的应用，施药1~2天后蚊幼虫—孑孓密度明显下降，有效率均在93%~95.3%。国内研制的苏云金芽孢杆菌以色列亚种—187漂浮颗粒剂防治水稻田里的中华按蚊，持效期为16天；巴州点绿农林科技有限公司研制的杀蚊幼制剂—孑孓清在野外芦苇湿地、污水处理厂、水稻田、养殖场污水排放区域等地施药1天后，查结果，杀死淡色库蚊幼虫—孑孓98%、杀死中华按蚊幼虫—孑孓100%、杀死致倦库蚊幼虫—孑孓100%、杀死凶小库蚊幼虫—孑孓99%、杀死曼蚊幼虫—孑孓100%、杀死和呐蚊幼虫—孑孓98%，有的区域100%。持效期都在45天以上，效果稳定。

背景技术

杀蚊幼制剂－孑孓清使用的细菌是分离到的一株苏云金芽孢杆菌以色列亚种；属革兰氏阳性长杆菌，在适宜的pH值和营养充足条件下，杆菌在生长发育过程中，能形成椭圆形孢子。杆菌在生长发育形成孢子最后阶段时，生长成为具有极强杀伤力的蛋白毒素－蛋白晶体。蚊幼虫—孑孓取食蛋白晶体进入消化道后，被碱性肠液破坏成较小单位的δ－内毒素，破坏蚊幼虫—孑孓的胃蛋白酶，使中肠停止蠕动，中肠上皮细胞慢慢解离，蚊幼虫—孑孓开始停止取食。芽孢在蚊幼虫—孑孓的中肠开始萌发，经被破坏的肠壁进入血腔后开始大量繁殖，最后致使蚊幼虫—孑孓全身瘫痪，使蚊幼虫—孑孓得败血病症而死。

杀蚊幼制剂—孑孓清产品功能：杀蚊幼虫—孑孓广谱、效果稳定、持效期长，对人、畜、禽和有益昆虫无毒、无害，应用安全、使用方便、省工省时、不污染环境、运输方便、靶目标准确、性能稳定。是杀灭蚊幼虫—孑孓、有效控制和减少成蚊密度、把成蚊传播丝虫病、登革热、疟疾、黄热病、脑炎、盘尾丝虫病，虫媒病毒传染病的传播等降到最低限度。长期使用，不产生抗性，还能彻底净化水质。

杀蚊幼制剂—孑孓清作用机理：主要活性成分是半包晶体－蛋白毒素。蚊幼虫－孑孓取食后，很快能破坏孑孓的胃蛋白酶，被碱性肠液破坏成较小单位的δ－内毒素。使中肠停止蠕动，中肠上皮细胞慢慢解离，蚊幼虫—孑孓开始停止取食。芽孢在蚊幼虫—孑孓中肠萌发，经被破坏的肠壁进入血腔后开始大量繁殖，致使蚊幼虫—孑孓全身瘫痪，使蚊幼虫—孑孓，无能力再取食而得败血病症死亡。

杀蚊幼制剂—孑孓清用量：水域区为1－3ml /m²。家禽、家畜饲养场、养猪场、养牛场、污水处理厂、城市水管网区、城市下水道、河流、堰塘等区域蚊幼虫—孑孓发生量严重区域、或是有机质含量高的区域，为3－5 ml / m²。

发明内容：本发明主要用于杀蚊幼制剂——孑孓清产业化生产用的液体发酵培养基配方。

培养基配方(％) （LB斜面培养基全球通用在此处省略）

发酵液体培养基：

酵母粉 3.0

玉米浆 2.5

葡萄糖 2.0

氯化钙 0.1 （CaCl）

碳酸钙 0.1 （CaCO₃）

磷酸二氢钾 0.1　（KH₂P0₄）

添加剂 0.3　复合维生素若干

pH值(灭菌前) 7.5

碳源、磷源培养基：

碳源　2.5

磷酸二氢钾 0.3　　　（KH₂PO₄）

氯化钙　0.2　　　（CaCl₂）

氯化锌　 0.03　　（ZnCl₂ ）

三氯化铁 0.05　　（FeCl₃ ）

氯化镁　 0.005　　（MgC1₂）

氯化钴　0.005　　（CoC1₂）

氯化铜　 0.005　　（CuC1₂ ）

添加剂　 0.3

复合维生素若干；

氮源、磷源培养基：

氮源　2.7

磷酸二氢钾 0.3　　（KH₂ PO₄）

磷酸氢二钾 0.3　　（K₂ HPO₄）

氯化钙　0.2　　（CaC1₂）

氯化锌　0.05　（ZnC1₂）

三氯化铁 0.05　（FeC1₃）

氯化钴　0.005　（CoC1₂）

氯化铜　0.005　（CuC1₂）

添加剂 0.3

复合维生素若干：

单一碳源、氮源配方筛选原料：

山芋粉，马铃薯粉，木薯粉，玉米饼粉，玉米粉，糖蜜。

单一氮源配方筛选原料

蛋白胨，酵母粉，黄豆饼粉，蚕蛹粉，鱼粉，花生饼粉，棉籽饼粉（不要抗虫棉的棉籽饼）。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种几丁质酶氨基酸序列

Ichi 151 DCDKYARCGNFGELKRLKAKYPHLKTIISVGGWTWSNRFSDMAADEKTRKVFAFSTVAFL

Ac 243 SAWDEPYKGNFGNLMALKQAHPDLKILPSVGGWTLSDPFYFLG-DKTKRDTFVASVREFL

Al 241 VDAKDPIRGVYSQLMALKQRYPDLKILPSVGGWTLSDPFHGFT-NKANPDTFVASVKQFL

BcAl 132 DTWDQPIAGNINQLNKLKQTNPNLKTIISVGGWTWSNRFSDVAATAATREVFANSAVDFL

Bl 128 DVWDEPIRGNFKQLLKLKKSHPHLKTFISVGGWTWSNRFSDVAADPVARGNFAASAVEFL

Bs 125 DTWDEPIRGNFKQLLKLKKNHPHLKTFISVGGWSWSNRFSDVAADPAARENFAASAVNFL

Ct 91 AILDTPIRGHFGQLIKYKEQYPHVRTLISVGGWTESKYFSDVALTEESRNTFADSCVEFL

Sm 243 TAWDDPYKGNFGQLMALKQAHPDLKILPSIGGWTLSDPFFFMG-DKVKRDRFVGSVKEFL

Ichi 211 RAYG-FDGVDLDWEYPGVETIPGGSYRP-EDKQNFTLLLQDVRNALN

Ac 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGQGANPSLGGP-NDGATYVVLMKELRAMLD

Al 300 KTWKFYDGVDIDWEFPGGDGPNPDLGDPINDGPAYVALMQELRAMLD

BcAl 192 RKYN-FDGVDLDWEYPVSGGLDGNSKRP-EDKQNYTLLLSKIREKLD

Bl 188 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQEVRKKLD

Bs 185 RKYG-FDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRP-EDKFNYTLLLQDVREKLD

Ct 151 RTYR-FDGVDIDWEYPVSGGMPENIRRP-EDKQNFTLLLKCLREKLD

Sm 302 QTWKFFDGVDIDWEFPGGKGANPNLGSP-QDGETYVLLMKELRAMLD

Claims

1.苏云金芽孢杆菌以色列亚种广泛存在自然界中，国外和我国的研究机构及部分大专院校，先后对该菌进行不同程度的研究和应用，因此，各自用的培养基成分有所不同；由于培养基成分不同，发酵培育的芽孢、晶体蛋白毒素等数量、产量、质量都会有极大的差别；而我们研制的培养基配方，特别是液体发酵生产用的培养基配方与其他单位用的都不同，所以我们生产出来的芽孢杆菌以色列亚种制剂的效价，要高出其他生产厂家两倍多，国家标准是400单位，其他厂家都只能达到350单位，巴州点绿农林科技有限公司研制的均在1000单位以上（本发明在10吨发酵罐中，用黄豆饼粉、玉米淀粉等为底物发酵28小时，取样检测，效价平均为2899Iu/uL，其性能指标分别达到22100Iu/mg，活性孢子数4*1709个/g以上，细度为99%通过标准300目筛），所以，特要求对该培养基成分的配方得到应有得保护。