CN106635902B

CN106635902B - 一种凝结芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106635902B
Application number: CN201611196824.6A
Authority: CN
Inventors: 刘明刚; 李坤; 卢祯鑫
Original assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Current assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-01-10
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN106635902A

Abstract

本发明涉及了一种保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌和其在禽畜消化方面的应用。所述凝结芽孢杆菌的产乳酸能力强，促进禽畜对饲料的消化，可应用于禽畜饲养方面。所述凝结芽孢杆菌可分泌大量乳酸，有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能，促进畜禽对饲料的消化吸收。同时，所述凝结芽孢杆菌具有优良的环境抗逆性，有效抑制有害菌的生长，快速降低环境中的氨气，改善养殖环境，可用于畜禽尸体无害化处理、养殖场除臭抑菌。本发明还提供了一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物和一种用于养殖场除臭抑菌的组合物。

Description

一种凝结芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌及其应用。

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，革兰阳性，属于硬(或厚)壁菌门。凝结芽孢杆菌分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡。

目前，微生物饲料添加剂是采用农业部认可的有益微生物经发酵制成的生物制剂，是抗生素的最佳替代品。用于提高畜、禽的健康水平的人工培养菌及其代谢产物，可调整畜、禽体内的微生态失调，保持微生态平衡，是激发动物自身有益菌种繁殖增长，同时抵制有害菌系生长的微生物制品。微生物饲料添加剂存在的主要问题是优良菌种的选择和由于菌种失活导致的微生物饲料添加剂活性降低。

我国是牲畜养殖大国，畜牧业发展的同时，由于牲畜饲料基数大，每天因自然死亡和病害死亡的牲畜数量相当庞大。根据动物死亡原因，动物尸体的来源可以分为自然淘汰或自然死亡，病害死亡两种形式。自然死亡淘汰危害较小，因疫病死亡的动物尸体不当处理不但对水源、土壤、大气污染严重，还容易造成疫病的传播和蔓延。患有***、猪瘟、高致病性禽流感等具有强传染性的染疫动物尸体，甚至严重威胁到人类的生命与健康。传统的动物死尸处理主要有填埋法、消毒法、焚烧法、化制法、生物降解法(发酵法)。其中，利用生物降解法处理动物尸体，但处理尸体的时间过长或有恶臭产生。

发明内容

本发明人通过对凝结芽孢杆菌的研究、筛选和验证，提供了一种产乳酸能力强的凝结芽孢杆菌，该凝结芽孢杆菌株和含有其成分的组合物，可有效运用于饲料添加剂的生产、养殖场除臭抑菌、病死畜禽尸体无害化处理。

为本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国微生物菌种保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2016440的凝结芽孢杆菌。保藏日期为：2016年9月1日，分类命名的拉丁名称：Bacillus Coagulans，本发明的凝结芽孢杆菌的产乳酸能力强，可促进禽畜对饲料的消化。

为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌在禽畜饲养方面的应用。在饲养过程中，在动物饲料或饮水中添加保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016440的凝结芽孢杆菌。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌可分泌大量乳酸，有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能，促进畜禽对饲料的消化吸收。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供一种微生物饲料添加剂，所述微生物饲料添加剂中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌做为有效成分。

为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供一种养殖场除臭抑菌的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌做为有效成分。

进一步地，养殖场除臭抑菌的组合物，包括50重量份保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌、100重量份保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌、100重量份保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌和750重量份的蒙脱石粉。其中，保藏号为CCTCCM2016440的凝结芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁹CFU/g～5.0×10⁹CFU/g，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌的活菌数为2.0×10⁹CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌的活菌数为5.0×10⁸CFU/g～5.0×10⁹CFU/g。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌具有优良的环境抗逆性，有效抑制有害菌的生长，快速降低环境中的氨气，改善养殖环境。

为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌做为有效成分。

进一步地，用于畜禽尸体无害化处理的组合物，包括100重量份保藏号为CCTCCM2016440的凝结芽孢杆菌、100重量份保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌、100重量份保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌和700重量份的沸石粉。其中，保藏号为CCTCCM2016440的凝结芽孢杆菌的活菌数为2.0×10⁸CFU/g～1.0×10⁹CFU/g，保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌的活菌数为3.0×10⁹CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁹CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌具有优良的环境抗逆性，有效抑制有害菌的生长，可高效产生有机酸反应，快速降低环境中的氨气，改善环境。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌为发明人在固态发酵培养时，凝结芽孢杆菌株产生变异，从培养中分离筛选而出，该菌株比ATCC(美国典型培养物保藏中心)7050模式菌株的生长速度快1倍以上，产乳酸能力强。

该菌株细胞杆状，单个、成对，菌落表面微湿润、无光泽，无突起、平坦，不透明，呈白色；中间微厚边缘较薄，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则形；在培养基里层：菌落形态呈点状，周围有透明圈；在显微镜下观察：细胞杆状，两端钝圆，有芽孢，芽孢端生无鞭毛；形成内生孢子，革兰氏染色阳性(G+)，兼性厌氧，可发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶。该凝结芽孢杆菌产生乳酸能力强，可促进禽畜对饲料的消化。

在分离筛选中，所用的样品为ATCC(美国典型培养物保藏中心)7050模式菌株的自选变异株，所用培养基按：1000ml蒸馏水、酵母浸出粉2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，吐温80 1.0g，L-半胱氨酸0.1g，溴甲酚紫0.06g，琼脂15.0g的配方配置，pH控制在7.0。

用质量体积百分比0.85％NaCl、0.05％吐温80在1000ml的蒸馏水中配置稀释溶液。用稀释溶液稀释样品，得到样品液。

将样品液涂布在以上培养基后，在厌氧培养箱37℃、培养72小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌。

将分离出的单菌进行乳酸检测试验中进行试验，筛选出乳酸产量最高的单菌。该菌株在微好氧条件下，葡萄糖含量为5.00g/L浓度时，产酸量为1.50g/L。筛选出的菌种为保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016440的凝结芽孢杆菌。

筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时需要进行活化、培养，获得一定数量的纯种菌。

凝结芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

a、菌种活化：将处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化

b、菌种扩大培养：将菌种依次经过一级种子摇床培养、二级种子罐培养、三级种子罐培养、发酵罐进行扩大培养。

所述菌种扩大培养用培养基包括如下组分：玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆、酵母浸粉、K₂HPO₄、蛋白胨、MgSO₄.7H₂O；所述培养基的pH值为7.0。

实施例1养鸡场试验

本试验选用31周龄的海兰褐蛋鸡720只，随机分为3组，对照组1、对照组2和测试组各240只，试验期为21天。试验日粮：玉米61.5％，豆粕23.4％，麦麸2％，石粉8.1％，复合预混料5％，试验期间不投喂保健类抗生素。

对照组1不加菌，其他饲喂条件相同；对照组2和测试组在试验期间在饲料中添加0.1‰的微生物饲料添加剂。其中对照组2微生物饲料添加剂包括1％保藏号为CCTCCM2016442的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁹cfu/g)和99％葡萄糖，试验组微生物饲料添加剂由1％保藏号为CCTCC M2016442的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁹cfu/g)、0.1％保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁸cfu/g)，98.9％的葡萄糖组成。

试验结果如下：

项目

个蛋重(g)

产蛋率(％)

破蛋率(％)

次蛋率(％)

只日耗料(g)

料蛋比

对照组1

63.4±1.25

87.3±4.29

0.68±0.34

0.44±0.33

125.2±9.3

2.26

对照组2

63.0±1.54

87.7±3.86

0.57±0.28

0.45±0.28

120.2±5.5

2.18

测试组

63.3±0.72

87.7±2.18

0.49±0.15

0.42±0.25

118.7±4.9

2.15

试验结果显示，测试组的单蛋重、产蛋率与对照组无明显差异，但其标准差更稳定，表明添加保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌能提高鸡产蛋的稳定性。在饲料利用方面，测试组日耗料量比对照组1降低5.2％，料蛋比降低4.9％，其效果比对照组更为明显。结果表明，在保藏号为CCTCC M2016442的枯草芽孢杆菌的基础上，添加保藏号为CCTCCM2016440的凝结芽孢杆菌，可增强产蛋稳定性，提高饲料利用率。

实施例2保育猪饲喂试验

在猪场保育舍随机选取3栏保育猪，每栏20头，其中2栏为对照组，1栏作为测试组。

对照组1使用不含微生物添加剂的饲料，试验期间投喂保健用金霉素、酸化剂和甜味剂。

对照组2在饲料中添加0.1％的微生物饲料添加剂，微生物饲料添加剂由10g枯草芽孢杆菌(保藏号为CCTCC M2016442的枯草芽孢杆菌，活菌数为1.0×10⁹cfu/g)、990g的葡萄糖混合制得。试验期间不使用保健用金霉素、酸化剂和甜味剂。

测试组在饲料中添加0.1％的微生物饲料添加剂，微生物饲料添加剂由1g保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁸cfu/g)、10g保藏号为CCTCCM2016442的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁹cfu/g)、989g的葡萄糖混合制得。试验期间不使用保健用金霉素、酸化剂和甜味剂。

在饲喂保育猪31天后，对保育猪进行检测，各组均无死亡，结果如下表所示：

试验结果显示，测试组的平均日增重量高于对照组1和对照组2，测试组的平均日采食量和对照组无明显差别，低于对照组1，测试组料肉比低于对照组1和对照组2。且在试验过程中，测试组排出的粪便臭味明显比对照组1和对照组2低，可降低养殖过程中圈舍内的臭味。

实施例3一种养殖场除臭抑菌的组合物

用50重量份保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌(活菌数为2.0×10⁹cfu/g)、100重量份保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)、100重量份保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10⁹cfu/g)，与750重量份的蒙脱石粉混合均匀，配制成养殖场除臭抑菌的组合物。

实施例4猪舍除臭抑菌试验

在猪场选取四栋猪舍为测试对象，猪舍1为对照组1，猪舍2为对照组2，猪舍3为对照组3，猪舍4为测试组，四栋猪舍面积和空间大小均相同，猪舍内各有1000头左右育肥猪。

对照组1使用清水喷雾；

对照组2使用100g保藏号为CCTCC M2016441枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)和900g蒙脱石粉混合均匀，溶于100L清水制备的对照溶剂2；

对照组3采用100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)、100g保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10⁹cfu/g)，与800g蒙脱石粉混合均匀，溶于100L清水制备的对照溶剂3。

测试组使用实施例3配置的养殖场除臭抑菌的组合物1kg，溶于100L清水制备的测试溶剂。

用喷雾器均匀喷洒除臭溶剂在猪舍的地面、墙壁上，5天后进行臭气、氨气气体的浓度检测，结果如下表所示：

其中，臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T14675),氨气采用次氯酸钠-水杨酸分光光度法(GB/T14679)。

试验5天后对猪舍采食区、排粪区和猪栏墙壁进行大肠菌群平板计数，取样面积25cm²。结果如下表：

检测区域	对照组1	对照组2	对照组3	测试组
					采食区	1.5×10<sup>6</sup>CFU	3.3×10<sup>5</sup>CFU	1.6×10<sup>3</sup>CFU	1.3×10<sup>3</sup>CFU
排粪区	6.1×10<sup>6</sup>CFU	9.7×10<sup>5</sup>CFU	3.2×10<sup>4</sup>CFU	4.7×10<sup>4</sup>CFU
					猪栏墙壁	3.9×10<sup>5</sup>CFU	5.2×10<sup>4</sup>CFU	8.7×10<sup>2</sup>CFU	6.4×10<sup>2</sup>CFU

试验结果表明：试验组抑菌剂添加保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌，与对照组相比可明显降低环境的氨气，同时，添加该菌对环境中的大肠菌群有一定的抑制作用。

实施例5一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物

100重量份保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌(活菌数为1.0×10⁹cfu/g)，100重量份保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)、100重量份的保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为2.0×10⁹cfu/g)，与700重量份的沸石粉混合均匀，制成一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物。

实施例6畜禽尸体无害化处理

选取40只病死鸡和20头死猪尸体，分为相同质量的4份，其中3份为对照组，1份为测试组，每份加入由锯末、稻壳基质组成的5立方米垫料中。

对照组1向垫料中添加1000g沸石粉；

对照组2向垫料中添加100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)和900g的沸石粉；

对照组3向垫料中添加100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)和100g保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为2.0×10⁹cfu/g)和800g沸石粉；

测试组向垫料中添加实1000g施例5制备的一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物。

堆肥发酵完成后取样测试，对照组1检测含有沙门氏菌，鸡瘟、猪瘟病毒检测结果为阴性。测试组、对照组3和对照组2并未检出沙门氏菌，鸡瘟、猪瘟病毒检测结果均为阴性。

对照组1共需26天完成发酵，发酵过程产生恶臭味；对照组2需10天完成发酵，但垫料中存在的油脂只有少量分解，发酵过程中有氨臭味和少量臭气产生；对照组3需10天完成发酵，发酵后垫料中油脂分解，不油腻，发酵过程有有氨臭味和少量臭气产生；而测试组10天完成发酵，发酵后垫料不油腻，发酵过程有几乎不产生臭气和氨气。

结果表明添加保藏号为CCTCC M2016440的凝结芽孢杆菌，显著减少了氨气的排放，提高了人工操作过程中的舒适度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016440的凝结芽孢杆菌（ Bacillus Coagulans ）。

2.一种微生物饲料添加剂，其特征在于，所述微生物饲料添加剂中含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌作为有效成分。

3.一种用于养殖场除臭抑菌的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌作为有效成分。

4.根据权利要求3所述的用于养殖场除臭抑菌的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌、保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌（ Bacillus Subtilis ）和保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌（ Bacillus Subtilis ）。

5.一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的凝结芽孢杆菌作为有效成分。

6.根据权利要求5所述的用于畜禽尸体无害化处理的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌、保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌和保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌。