JPS5823365B2 - サイキンセイサツチユウザイ オヨビ ソノセイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は胞子欠損を有する産前性細菌から得られる殺虫
物質を有効成分として含有する細菌性殺虫剤およびその
細菌性殺虫剤の製造方法に関する。

従来使用されている化学殺虫剤は人畜、魚類などに有害
で、取扱い方法を誤ると大事をひき起す危険性が多分に
存在している。

しかも、従来から広く使用されている化学殺虫剤に対し
害虫自体に薬剤抵抗性が生じてきており、その効力が減
退する現状にある。

このため近年、従来の化学殺虫剤にかわる天敵や昆虫病
原性細菌・ウィルス等の利用についての研究が盛んに行
なわれている。

その代表例としては、欧米においては一般農林害虫に駆
除効果を示すバチルス・チューリンゲンシスを利用した
微生物農薬が実用散布されている。

バチルス・チューリンゲンシスでは菌体内に胞子と毒素
の結晶体が形成され、通常培養の終期には菌体の細胞壁
が自然に破れて、胞子と結晶体は菌体外に遊離される。

この結晶体をりんし目昆虫の幼虫が摂食すると幼虫は死
滅するが、胞子と結晶体を分離することは困難であるた
め、通常両者を含む製剤が殺虫剤として利用されている
。

〔文献基：たとえばバチルス・チューリンゲンシス・ベ
ルリネル（Ａ、Ｋｒｉｅｇ、Ｂａｃｉ ｆｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢｅｒｌｉｎｅｒ、Ｂｅｒｌ
ｉｎ（１９６１））。

しかし、これらの毒素は蚕にも毒性を示すことから、わ
が国のような養蚕国においては繁殖能をもつ胞子を含む
製剤を直ちに使用できない欠点がある。

すなわち、生きた胞子を含む微生物農薬を殺虫剤として
散布すると胞子から多量の菌が増殖し、それが飛散して
、蚕を死滅させ蚕糸業に多大なる損害をもたらすことも
考えられる。

そのため、生きた胞子を含まない製剤を殺虫剤として利
用することは養蚕業の盛んなわが国においては特に望ま
しい。

しかも、ある種の増殖能のある菌を農薬として多量にか
つ反復して使用することは、将来何らかの意味で生物相
を乱す場合も想定される（ひいては公害となる）。

そこで増殖能のないものを利用することは無公害農薬と
しての最高の条件をみたすことになる。

このためには、まず殺菌処理を行なって増殖能を消去す
ることが考えられ、現在様々の物理的または化学的殺菌
処理が盛んに試みられている。

これらの殺菌処理方法のうち通常操作が簡単で工業的な
熱処理殺菌法が望まれる。

しかし、バチルス・チューリンゲンシスを強く熱処理す
ると菌体や胞子を殺すことはできるが、この殺菌法は殺
虫毒素活性をも著しく低下させる欠点を有する（表１を
参照）。

また、菌体内毒素に影響することなく生菌体、胞子のみ
を特異的に撲滅することのできる薬剤としてβ−プロピ
オラクトン、過酸化水素を使用する化学的殺菌法が報告
されているが〔日本蚕学雑誌、第４０巻第４０号２６９
〜２７４頁 （１９７１年）〕、これらの殺菌法によって胞子を完全
に死滅させるのは困難であり、かつβ−プロピオラクト
ンは価格が高く、また過酸化水素が不安定のため取り扱
いの面で問題があり、いずれも実用的面で難点がある。

ここにおいて、本発明者らは上記の欠点を改良するため
種々の実験を試みた結果、胞子形成能を有する産前性バ
チルス・チューリンゲンシスを変異誘起剤で処理するこ
とにより胞子形成能力のみを欠如し、殺虫毒素生成能力
は保持している胞子欠損株を作ることに成功し、本発明
を完成した。

すなわちこの胞子欠損株は温和な熱処理によって殺虫毒
素の活性を低下させずに容易に完全に死滅するため、こ
の胞子欠損株を使用すれば完全に殺菌された殺虫物質を
容易に製造し得るのである。

温和な熱処理操作だけで殺虫毒素活性を損うことなく完
全に殺菌された殺虫物質を得る技術を見出したことは工
業上非常に画期的なことである。

本発明において使用される微生物は胞子欠損を有する産
毒性細菌（産毒性細菌の胞子欠損株）であればよく、そ
の例としては公知のバチルス・チューリンゲンシス・ア
レステー由来のＡｄ７３に１６Ｃ１より変異誘導された
バチルス・チューリンゲンシス・アレステーＰ１５Ａ−
１（微工研に微工研菌寄第２４５８号として寄託してい
る。

）または、公知のバチルス・チューリンゲンシス・アイ
ザワイ由来のＩ７３に１６Ｂ１より変異誘導されたバチ
ルス・チューリンゲンシス・アイザワイ・Ｉ４５１１（
微工研に微工研菌寄第２４５９号として寄託している。

）などがある。本発明において用いられる微生物には通
常の変異誘導操作によって誘導されたまたは天然土壌か
ら見いだされた胞子欠損を有する産毒性細菌すべてが含
まれる。

本発明に使用される胞子欠損株およびその親株の菌学的
性質の比較結果を以下に記載する。

変異株Ｐ１５Ａ−１、Ｉ４５１１共、胞子形成能力のな
い点を除いてはバチルス・チューリンゲンシスとしての
種の特性を保持している。

上述の変異誘導法としては、たとえば紫外線照射、Ｘ線
照射または化学的薬剤（たとえば、ニトロソグアニジン
、２−アミノプリン、アザセリン、アクリジンオレンジ
、ジエチルサルフエイトまたは亜硝酸など）による方法
などがある。

本発明に使用する微生物の具体的な採取例を示せば下記
実験例１の如くであり、胞子欠損の度合は実験例２の如
くである。

実験例 １ 親株（胞子形成能を有する株）をＮＢ培地（肉エキス０
．５チ、ポリペプトン１％、食塩０．２％、ブドウ糖０
．１％、ｐＨ７，０）に植え、約１７時間振盪培養を行
ない、この培養液５ＴｒＬｌをＮＢ培地１００麻に植え
継ぎ、４時間振盪培養を行なう。

無菌の遠心管を用い、１００１′ＩＬｌ培養液を５，０
００ｒｌｌＩｌｌ ０分間遠心し、得られる菌体を１０
１ｎｆＩニトロソグアニジン含有０．８５％食塩水１０
ｍ１に懸濁し、３０分間、３０℃で振盪する。

次いで、その懸濁液をＮＢ培地で１，０００倍に希釈し
、３０℃で４時間振盪培養する。

その培養液を１０．１００ 。１．０００倍希釈して、
その０．１ｍｌをＮＢ寒天培地に塗抹し、３０℃恒温室
で１晩静置し、その後室温で３〜５日放置する。

混光の強いコロニーを選択し、ＮＢ寒天培地上に移植し
、３０℃恒温室で一晩静置する。

次いで、白金線で５ｍ７ＮＢ培地に植え、４８時間、３
０℃で振盪培養を行ない、培養液を検鏡して、胞子欠損
し、かつ自己溶解で細胞破壊している培養液を選び、そ
の培養液１．５−を試験管に取り、７０℃、３０分熱処
理を行ない、次いでその１ｍＡ！をＮＢ寒天培地に混合
して、３０℃恒温室に２日間静置する。

コロニーを作らない菌株を胞子欠損株とする。

実験例 ２ （１）実験方法 親株（胞子形成能を有する株）または突然変異株（胞子
欠損株）をＮＢ培地で３０℃、４８時間培養し、得られ
る培養液１５ｍ１を試験管にとり、各温度で３０分間熱
処理を行なう。

次いで、その熱処理液をＮＢ寒天培地に塗抹し、３０℃
で培養する。

（２）結果 結果を表２に示す。

（３）考察 いずれの変異株もその４８時間目培養液を６０℃、６５
℃の熱処理によりその生菌数が零になるが、親株（胞子
形成能を有する株）では、８０℃、９０℃め熱処理によ
り生菌数は減少するが、９０℃熱処理でも１０４個／ｍ
ｌの生菌が残存している。

すなわち、変異株はいずれも全く胞子を生成せず、胞子
欠損株になっていることを示す。

また、後に示すようにこの変異株の殺虫毒素の生成能力
は親株とほとんど変わらない。

以上の事実から明らかなように、細菌性殺虫剤の製造に
胞子欠損株を使用すると工業的に実施容易で有利な熱殺
菌法により、殺虫毒素の活性を損うことなく完全に殺菌
された殺虫物質を得ることができ、またこのように耐熱
性の弱い細菌は当然殺菌剤など他の殺菌手段に対しても
弱いのでこの胞子欠損株による殺虫剤製造技術は工業上
非常に画期的なものである。

また、本発明に使用する胞子欠損株は非常に溶菌しやす
く、殺虫毒素の生成終了後細菌の約９０係は溶菌死滅す
る。

したがって殺菌操作をおこなわずとも生菌をあまり含ま
ない殺虫剤として使用できる。

胞子は土壌中などで非常に安定であり、長く生存し得る
ので土壌などの環境が胞子にとって発芽、増殖に適した
環境に変化すると急激に菌が増える。

それ故に、胞子と殺虫毒素を含有する殺虫剤を使用した
場合、多量の菌の増殖を起こし、蚕に感染し、死滅させ
、蚕糸業に多大なる損害をもたらすことは上述した通り
である。

一方、胞子を含有しない生菌体は土壌中で非常に不安定
であり、消滅しやすい。

したがって胞子欠損株の場合はその生菌を含んだ殺虫物
質を殺虫剤として使用しても、有用子株の場合と異なり
、蚕糸業に多大なる損害をもたらす心配は非常にすくな
い。

それ故に胞子欠損株の場合はその生菌体を含んだままの
製剤でもかなり安全度の高い殺虫剤として使用してもよ
い。

しかし、蚕に対する安全性の上では胞子欠損株の場合も
殺菌処理後の製剤を使用した方が望ましい。

本発明の細菌性殺虫剤の有効成分である「胞子欠損を有
する産毒性細菌から得られる殺虫物質」としては遊離結
晶毒素、生菌体、死菌体、それらの混合物、菌体および
／または遊離殺虫毒素を含有する培養液の濃縮液または
その乾燥粉末などが含まれる。

本発明の細菌性殺虫剤の製造方法は下記の如く行なわれ
る。

胞子欠損を有する産毒性細菌を通常使用される培地およ
び好気的培養条件下で培養し、遊離結晶毒素、菌体、ま
たは菌体および／または遊離結晶毒素含有培養物などを
得る。

さらに、生菌を完全に殺菌する場合には生菌体、または
生菌体および／または遊離結晶毒素含有培養物などに通
常の殺菌処理を行えばよい。

本発明に使用する培地として炭素給源、窒素給源、無機
塩類およびビタミンなどを主成分として含有する天然培
地または合成培地などがあげられる。

炭素給源として、たとえばショ糖、麦芽糖、グルコース
、フラクトース、カンショ糖、テンサイ糖蜜またはコー
ン糖蜜なと、窒素給源として、たとえば硫安、塩安、綿
実粉、大豆粉またはカゼイン氷解物などが使用される。

本発明に使用する培養方法は通常用いられる好気的培養
条件下で行えばよく、特に大量生産を行なう場合は通気
深部培養が望ましい。

培養終了後、培養液から殺虫物質（たとえば結晶毒素、
菌体など）を採取する方法は通常使用される方法、たと
えば、遠心分離法、沢過法などを用いればよい。

なお、培養終了後菌体および／または遊離結晶毒素など
を含有する培養液を濃縮または乾燥させて粉末にする際
、通常使用されている濃縮法または乾燥法を使用すれば
よい。

ただし、この際約６５℃以下の温度で行なうことが望ま
しＧ）。

本発明に使用する殺菌処理方法としては通常使用される
処理法、たとえば熱処理、超音波処理、放射線照射など
の物理的殺菌法、ホルマリン、過酸化水素、亜硫酸塩類
、ニトロフリルアクリル酸アミド、フリルフラマイド、
塩素化合物、β−プロピオラクトン、亜硝酸塩、硝酸塩
、界面活性剤、エチレンオキシド、プロピレンオキシド
などの化学的殺菌法、自己溶解、ファージ処理、または
リゾチーム処理などの生物学的殺菌法などがあげられる
。

このうち熱処理による殺菌法または化学的殺菌法は工業
上特に望ましい方法である。

一般農薬と同様に、殺虫剤の有効成分である殺虫物質に
、たとえばカオリン、ベントナイト、タルク、硅藻土、
小麦粉、糖類、活性炭などの増量剤、展着剤、粘漿剤、
安定剤を添加して粉剤、粒剤、錠剤、水和剤などとして
使用することができる。

また、必要に応じて殺虫毒素活性を阻害しない範囲にお
いて他の種の殺虫剤、殺菌剤、除草剤、植物生長調整剤
、共力剤、誘引剤、香料、植物栄養剤、肥料などを配合
し、混合使用することもできる。

本発明により得る殺虫剤はたとえばコナガ、ニカメイチ
ュウ、イラガ、モンシロチョウ、ヨトウガ類、ギアゲハ
、シロシタヨトウ用、シャチホコガの類、ヒトリガの類
、イチモンジセセリなどに効果がある。

本発明の胞子欠損株を使用して製造した殺虫剤は、蚕に
害をおよぼす菌の繁殖の恐れがなく、安心して使用でき
、桑の葉や蚕に直接殺虫剤を散布しない限り広く田、畑
、原野、森林などで害虫を駆除あるいは防除に使用でき
る。

０本発明によって得られた細菌性殺虫剤の生物試験 実験例 ３ （モンシロチョウおよびシロシタヨトウに対する効果。

）１、試験方法 実施例１に従って製造された真空乾燥菌体１００〜を秤
量し、これに蒸留水１０ｍ１を加えて充分攪拌して懸濁
液を作成した。

さらに、蒸留水を加えて所定濃度の水溶液に調製した。

次にカンラン葉片（モンシロチョウ用）およびトウモロ
コシ葉（シロシタヨトウ用）を所定の薬液中に浸漬し、
葉表裏に付着したことを確認した後、室内風乾し、昆虫
（供試虫数１０頭）に給餌した（２５℃）。

一定時間後の死亡虫数を調査した。

３．考察 変異株の殺虫活性は親株の殺虫活性にくらべ供試濃度１
０ｍ９／ｒＩＬｌで多少劣るが充分な活性を保持してい
ることを示す。

実験例 ４ （カイコおよびエリサンに対する効果。

）１、供試サンプル 培養液を３回水洗して、再び水に懸濁させたものを蒸留
水で希釈して使用した。

対照区は水のみを使用した。

２、供試昆虫および試験方法。

０カイコ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ エリサン Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ
いずれも詳化時より人工飼料で長日条件下（１６Ｌ・８
Ｄ）２５℃飼育した２〜５令幼虫で脱皮直後の起蚕を使
用した。

０起蚕５〜１０頭を穴あきシャーレに沢紙をしいて入れ
、約２０時間で完全に食べつくす量の人工飼料を用意し
、この飼料を所定の薬剤中に浸漬して直ちに給餌した。

１日後には古い餌をすて、無処理の人工飼料を与えた。

観察は毎日３日間行なった（２５℃）。

３、結果 ４、考察 変異株は親株と比較して、殺虫力において全く遜色がな
い。

実験例 ５ （温度処理効果） ■、実験方法 完全な殺菌性殺虫剤（無胞子、無生菌）をつくるために
胞子欠損株に６０℃、３０分間熱処理を行なった。

生物試験方法は実施例４と同じ方法で行なった。

２、結果 親株：バチルス・チューリンゲンシス・アレステーＡｄ
７３に１６Ｃ１ 胞子欠損株１：バチルス・チューリンゲンシス・アレス
テーＰ１５Ａ−１ 胞子欠損株２：バチルス・チューリンゲンシス・アレス
テーＰ８９３４ ※：培養液（ｂｒｏｔｈ）そのままの水による希釈度 ３、考察 胞子欠損株の殺虫毒素は６０℃、３０分間の熱処理で１
００倍希釈においてほとんど失活せず、かつ生菌は完全
になくなる。

以下具体的に実施例を示すが、本発明は実施例だけに限
定するものではないことは言うまでもない。

実施例 １ ５００ｍｌ容量の坂ロコルベンに０．５％肉エキス、１
．０％ポリペプトン、０．１係グルコース、０．２％食
塩からなる１００ｍ１の培地（ｐＨ７，０）を入れ、そ
れにバチルス・チューリンゲンシス・アレステーＰ１５
Ａ−１を接種し、振盪条件下（１２０ｒ９りで１８時間
、３０℃で前培養する。

７０１容テストファーメンタ−（攪拌数４０Ｏｒｐｍ
）に１．０％ポリペプトン、０．１係グルコース、０．
２チ食塩からなる培地（ｐＨ７，０） ３０１３を入れ
て、上記の前培養液１００ｍ１（菌体）を植え、３０℃
で好気培養条件下（１分間当り４５１の無菌空気をテス
トファーメンタ−に送り込む）で培養する。

３０１培養液を冷却式連続遠心分離機で回転数９０００
ｒｐＨｌで連続遠心分離する。

得られた沈澱を８００７７１１の水または工業用アルコ
ールに懸濁し、上記遠心分離機で回転数９０００ｒｌ）
ＩＩＩ、１０分間遠心分離する。

この操作を３回くり返して行なう。得られる沈澱を真空
乾燥する。

実施例 ２ ３０１培養液を６５℃、３０分熱処理する操作を追加す
ること以外実施例１に従って行なう。

実施例 ３ バチルス・チューリンゲンシス・アレステーＰ １５
Ａ−１の代りにバチルス・チューリンゲンシス・アイザ
ワイＩ４５１１を使用すること以外実施例１に従って行
なう。

実施例 ４ バチルス・チューリンゲンシス・アレステーＰ１５Ａ−
１−の凍結乾燥粉末２５部をタルク７５部と混合した粉
剤、１０アール当り１００ｇ以上使用する。

実施例 ５ バチルス・チューリンゲンシス・アイザワイＩ４５１１
の培養液の乾燥粉末２５係、ドデシルベンゼンスルホン
酸ソーダ２％、ジナフチルメタンジスルホン酸ソーダ２
％、珪藻土とクレーとの混合物７６係を混合粉砕して水
利剤とする。

実施例 ６ バチルス・チューリンゲンシス・アイザワイＩ４５１１
の殺菌処理した菌体含有培養液の乾燥粉末２５部と珪藻
土７５部を混合した粉剤、１０アール当り１０部以上使
用する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 胞子欠損を有するバチルス・チューリンゲンシス・
   アレステーＰ１５Ａ−１またはバチルス・チューリンゲ
   ンシス・アイザワイ・Ｉ４５１１から得られる殺虫物質
   を有効成分として含有することを特徴とする細菌性殺虫
   剤。 ２ 胞子欠損を有するバチルス・チューリンゲンシス・
   アレステーＰ１５Ａ−１またはバチルス・チューリンゲ
   ンシス・アイザワイ・１４５１１を培養し、殺菌処理を
   施すことなく殺虫物質を採取することを特徴とする細菌
   性殺虫剤の製造方法。 ３ 胞子欠損を有するバチルス・チューリンゲンシス・
   アレステーＰ１５Ａ−１またはバチルス・チューリンゲ
   ンシス・アイザワイ・Ｉ４５１１を培養し、殺菌処理を
   経て殺虫物質を採取することを特徴とする細菌性殺虫剤
   の製造方法。