CN106754549A - 可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末及其制备方法，复合乳酸杆菌粉末含有：植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌及微囊外壁。将菌种活化划线于相应的平板，再将活化后的单克隆接种于种子培养基培养；将发酵培养基作为一级种子培养基，加入低聚果糖或海藻糖中的一种作为促进乳酸菌生长剂，灭菌；将培养获得的初级活化种子接种于一级种子培养基中培养，再接种于发酵培养基中培养；发酵结束后，管式离心机离心收集菌体，得菌泥，混合均匀后，再平铺于样品冻干机的样品板，并将菌泥分成小块；将获得的植物乳杆菌粉末与维生素C、葡萄糖、淀粉混合，对样品进行乳化、混合、造粒、干燥，制备成包埋着乳酸菌体的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖，尤其是涉及一种可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末及其制备方法。
背景技术
抗生素应用在畜牧业产生了巨大的经济效益。但抗生素的大量使用所伴随的负面效应也日益突出，主要表现为病原微生物的耐药性的产生以及药物在动物体内的残留，从而对人类的健康产生直接或者潜在的危害。抗生素在饲料中的应用遇到严峻的挑战。以及目前我国饲料改善肉蛋白品质通过化学药品的方法逐步引起人们的忧虑，如苏丹红，瘦肉精等违禁药物的添加及抗生素的过量添加来改善肉蛋品质等层出不穷，对食品安全造成威胁。开发安全无毒绿色的生物饲料添加剂来改善肉品质是目前畜牧业发展的趋势。因此抗生素替代品(微生态制剂等)的研究开发成为近年来绿色饲料添加剂的热点，其中植物乳杆菌的应用备受关注。植物乳杆菌是农业部批准认可用于饲料添加剂的菌种，其特征是产酸、产酶的抑制肠道病原菌的作用。植物乳杆菌通过改善动物肠道的微生态环境和提高动物的免疫力而提高动物的生产性能，而且在动物产品中无残留。但是采用传统的碳氮源优化的方法能使乳杆菌达到109CFU/ml后，再提高碳氮源含量后很难进一步提高菌体含量。市售乳酸球菌保持活力较长，而乳酸杆菌产品保质期较短，但杆菌有不同于球菌的特殊的生理活性。
本申请人在中国专利CN103497906A中公开一种微生态制剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。微生态制剂含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少一种和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；
植物乳杆菌包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806，保藏编号CCTCC NO:M 2013293；
嗜酸乳杆菌包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCCNO:M 2013294。
在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治病害，提高存活率，净化养殖水质制剂中应用。
发明内容
本发明目的在于针对当前抗生素滥用的情况，提供可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的应用。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末含有：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7及其微囊外壁。
所述微囊外壁可采用水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白等中的至少两种作为微囊外壁，所述微囊外壁可通过微囊制粒机对样品进行乳化、混合、造粒、干燥，制备成包埋着乳酸菌体的微囊外壁，制成可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806的保藏编号为CCTCC NO：M2013293；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7的保藏编号为CCTCC NO：M2013294。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法包括以下步骤：
1)配制种子培养基500ml，灭菌；
2)将冻存的菌种活化划线于相应的平板，再将活化后的单克隆接种于种子培养基培养；
3)配制发酵培养基，将50L发酵培养基作为一级种子培养基，加入低聚果糖或海藻糖中的一种作为促进乳酸菌生长剂，灭菌；
4)将步骤2)培养获得的初级活化种子接种于50L一级种子培养基中培养，再通过移种管接种于1000L发酵培养基中培养，活菌数≥8×109CFU/mL；
5)发酵结束后，管式离心机离心收集菌体，得菌泥；
6)将步骤5)获得的菌泥添加维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖等中的至少两种作为保护剂，混合均匀后，再平铺于样品冻干机的样品板，并将菌泥分成小块；
7)将步骤6)获得的植物乳杆菌粉末与维生素C、葡萄糖、淀粉混合，采用水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白等中的至少两种作为微囊外壁，通过微囊制粒机对样品进行乳化、混合、造粒、干燥，制备成包埋着乳酸菌体的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末。
在步骤1)中，所述灭菌的温度可为115℃，灭菌的时间可为30min。
在步骤2)中，所述培养可静置培养18h。
在步骤3)中，所述低聚果糖或海藻糖可采用质量百分浓度为0.5％低聚果糖或海藻糖，所述灭菌可在115℃灭菌30min。
在步骤4)中，所述接种于50L一级种子培养基中培养可采用静置培养12h；所述接种于1000L发酵培养基中培养可采用静置培养48h。
在步骤6)中，所述维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖等中的至少两种的添加量按质量百分比可为菌泥的1％。
在步骤7)中，所述维生素C的加入量按质量百分比可为植物乳杆菌粉末的1％，所述葡萄糖的加入量按质量百分比可为植物乳杆菌粉末的20％，所述淀粉的加入量按质量百分比可与植物乳杆菌粉末等量；所制得的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的直径可为300μm。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末可促进凡纳滨对虾生长，提高对虾免疫力和抗病力，增加对虾摄食量，提高对虾存活率。
由此可见，所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末可在制备防治对虾病害药物、饲料添加剂、对虾生长促进剂等中应用。所述饲料添加剂、对虾生长促进剂中无残留，无毒害，是绿色的健康的新型饲料添加剂和对虾生长促进剂。
所述对虾病害包括红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病、偷死症及由弧菌引起的症状等。
本发明选用的菌株特性及功能如下
植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌：所述植物乳杆菌CCTCC NO：M2013293和嗜酸乳杆菌CCTCC NO：M2013294可以产生B组维生素、胡萝卜素及胞外多糖等，进入水产动物肠道，可以调节肠道菌群平衡，能产类细菌素和乳酸，抑制病原菌生长，提高养殖动物机体免疫力和抗病力。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末可促进对虾生长，提高对虾抗病力，存活率。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末应用于对虾养殖的使用方法和用量如下：
日常饲养时，取菌剂拌料喂养。每次伴料量为10％投喂量每日拌料投喂，每日拌料一次，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。拌料投喂一段时间后，对虾摄食旺盛、肠道粗实、未见肠炎等发生。
所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末可用于防治凡纳滨对虾养殖期间病害的发生，包括：红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病、偷死症及由弧菌引起的症状；有效缓解或预防病害发生，极大地降低病害造成的死亡率；同时能改善养殖水质，降低水体弧菌含量，增强凡纳滨对虾消化吸收功能和抗病能力，提高对虾产量和质量，缩短养殖周期。
本发明所述植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌通过筛选获得能够产生B组维生素、胡萝卜素、及胞外多糖，进入肠道能够持续繁殖，从而能提高肉蛋品质，所述的植物乳杆菌是从苹果园落叶土壤中筛选了一株植物乳杆菌，实验发现具有产酸能力强、菌株活力强等优点。通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质抑制或者杀灭病原菌，同时提高养殖动物免疫力和抵抗力，达到防治病害的目的；再者有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢、提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的，在饲料中加入此添加剂，可以促进凡纳滨对虾消化吸收，调节对虾肠道菌群稳定，提高凡纳滨免疫力和肠道增粗的作用。植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294，两种微生物已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
制备例说明：上述已经对本发明的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备进行说明：植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294两种微生物的固体制剂为例进行说明。制备方法并不局限于实施例所述，公知的能够达成制备目的的方法均可以，以下实施例将对本发明作进一步的说明。
包含植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294，两种微生物已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例1一种微生态制剂的制备
植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCCNO：M2013293和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基：发酵培养基配方(W/V)：糖蜜6％，红糖3％，酵母膏0.03％，蛋白胨0.6％，低聚糖0.5％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.05％，碳酸钙0.5％，发酵条件为37℃，静置培养36～48h，活菌数≥109CFU/mL；
离心后冻干获得的乳酸杆菌粉末与1％的维生素C、20％重量的葡萄糖、等倍重量的淀粉、混合均匀，采用水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白中的至少两种作为微囊外壁，通过微囊制粒机对样品进行乳化、混合、造粒、干燥制备成直径在约300μm内包埋着乳酸菌体的小颗粒
复合菌剂稳定性实验：复合菌在温下避光保存0个月、1个月、3个月、6个月后，分别取样检测菌剂中乳酸菌含量。乳酸菌采用MRS固体培养基加2％碳酸钙稀释平板法检测，计数时只计算菌落周围有溶钙圈的菌落。实验组为经微囊制粒后的菌剂与载体混合物，对照组为等量未制粒菌粉与载体混合物参见表1。
表1
实施例2本发明的微生态制剂在对虾养殖中的应用试验1
一、材料与方法
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2、试验对虾：将对虾分为6组其中包括两组对照组，每组300尾体长为2cm小虾。
3、试验水体：试验用水取自砂滤海水。
4、试验场地：试验在80cm×100cm×100cm(长×宽×高)的玻璃纤维缸中进行。试验缸置于室内靠窗自然条件下放置。
5、试验方法：试验周期60天，该试验采取对虾常规饲料拌料喂养，试验组每天拌一次料投喂，拌料量为10％投喂量，对照组只相同投喂量条件投喂。在试验的第30天、45天、60天统计每组对虾的重量及存活情况。
二、试验结果
1、对促进生长的影响
结果表明，试验组与对照相比，实验组体重平均提高约12％，差别具有统计学意义(P<0.05)
2、对存活率的影响
结果表明，试验组与对照组对虾存活率分别为85.6％和68.9％，试验组比对照组高近16％，差异具统计学意义(P<0.05)
3、有益菌在肠道和水体中的存活情况
通过检测对虾肠道以及养殖水体中肠乳酸杆菌存活数发现，其中乳酸杆菌在肠道中的存活数高达6×105CFU/g，水体中检测到一定数量的乳酸杆菌(>600CFU/ml)。
实施例3本发明的微生态制剂在对虾虾苗养殖中的应用试验
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2、试验对虾：投苗至30天的对虾全程使用。
3、试验场地：某对虾养殖场设4口实验池和4口对照池，体积为4m×4m×1.5m,水深1m。
4、试验方法：日常饲养时，取实施例1复合菌剂拌料投喂。每天拌料两次，每次加复合菌剂量为10％投喂饲料量。而对照组对虾投喂不加菌剂的饲料。
5、试验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在控制水体弧菌数和防治对虾病害等方面，具体为：(1)pH值稳定，小型浮游生物生长快；(2)使用实施例1复合菌剂，水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂；(3)试验组虾苗生长快，相比对照组平均体长长约1cm，期间无发生病害，存活率高，相比对照组存活率提高约25％，说明对对虾虾苗养殖期间有良好作用。
实施例4本发明的微生态制剂在对虾养殖中的应用试验2
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2、试验对虾：投苗至30天的对虾全程使用。
3、试验场地：某对虾养殖场设4口实验池和4口对照池，体积为6m×8m×1.5m,水深1.2m。
4、试验方法：日常饲养时，取实施例1复合菌剂拌料投喂。每天拌料两次，每次加复合菌剂量为10％投喂饲料量。连续投喂3天后停用2天，再连用3天。而对照组对虾投喂不加菌的饲料。
5、试验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在控制水体弧菌数和防治对虾病害等方面，具体为：(1)pH值稳定，藻类生长旺盛，未见倒藻等发生；(2)定期使用实施例1复合菌剂，水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，虾苗生长快，期间无发生病害，存活率高(3)增加摄食量，将复合菌拌饲料投喂对虾，连续投喂3天后可见对虾肠道增粗，肠道中充满食物，活力较高；当对虾呈现病态，出现断肠等肠炎症状时，使用实施例1复合菌剂拌料投喂2天，第三天观察可见肠道恢复正常，摄食情况好转。养殖全程，使用实施例1复合菌剂的4口实验池对虾基本未见病害发生，而4口对照池常有病害发生，使用较多的消毒剂，其中有2口中对照池因病害严重致对虾大规模死亡而最终排塘。对虾最终收成时，实验池比对照池增产约1000～1500kg/亩。
实施例5本发明的微生态制剂在对虾苗养殖中的应用
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2、试验对虾：日本囊虾。
3、试验厂地：福建宁德市霞浦县某养殖厂。
4、试验方法：选择8口日本囊虾试验池(长6m×宽5m×高1m)，放苗密度为150尾/m3，其中4口为对照池，4口为实验池，养殖期间，往实验池拌料投喂，拌料量为10％投喂量，每天拌料两餐。其他养殖条件均相同，直至出成虾。
5、实验结果：将复合菌拌饲料投喂对虾，连续投喂3天后可见对虾肠道增粗，肠道中充满食物，活力较高实验池虾摄食正常，健康活跃，实验期间未见任何病害发生水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，生长快期间无发生病害，存活率为82.3％相比对照组69.5％高出12.8％，且实验组虾体长相比对照组体长长约1cm。
结论
本发明所述的通过微胶囊包埋技术将复合乳酸菌粉末包埋在微胶囊中，可以较大延长乳酸菌的保存活力，并在促进对虾生长，提高对虾抗病力与免疫力，净化养殖水质，增加对虾摄食量，提高养殖质量和产量等方面具有显著效果，水产养殖中具有重要的应用价值。
Claims (10)
1.可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末，其特征在于其含有：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7及其微囊外壁；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806的保藏编号为CCTCC NO：M2013293；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7的保藏编号为CCTCC NO：M2013294。
2.如权利要求1所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末，其特征在于所述微囊外壁采用水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白中的至少两种作为微囊外壁。
3.如权利要求1或2所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末，其特征在于所述微囊外壁通过微囊制粒机对样品进行乳化、混合、造粒、干燥，制备成包埋着乳酸菌体的微囊外壁，制成可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末。
4.如权利要求1所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)配制种子培养基500ml，灭菌；
2)将冻存的菌种活化划线于相应的平板，再将活化后的单克隆接种于种子培养基培养；
3)配制发酵培养基，将50L发酵培养基作为一级种子培养基，加入低聚果糖或海藻糖中的一种作为促进乳酸菌生长剂，灭菌；
4)将步骤2)培养获得的初级活化种子接种于50L一级种子培养基中培养，再通过移种管接种于1000L发酵培养基中培养，活菌数≥8×109CFU/mL；
5)发酵结束后，管式离心机离心收集菌体，得菌泥；
6)将步骤5)获得的菌泥添加维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖等中的至少两种作为保护剂，混合均匀后，再平铺于样品冻干机的样品板，并将菌泥分成小块；
7)将步骤6)获得的植物乳杆菌粉末与维生素C、葡萄糖、淀粉混合，采用水溶性食用胶、环状糊精、纤维素衍生物、明胶、酪蛋白等中的至少两种作为微囊外壁，通过微囊制粒机对样品进行乳化、混合、造粒、干燥，制备成包埋着乳酸菌体的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末。
5.如权利要求4所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述灭菌的温度为115℃，灭菌的时间为30min；
在步骤2)中，所述培养是静置培养18h。
6.如权利要求4所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述低聚果糖或海藻糖采用质量百分浓度为0.5％低聚果糖或海藻糖，所述灭菌是在115℃灭菌30min。
7.如权利要求4所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述接种于50L一级种子培养基中培养是采用静置培养12h；所述接种于1000L发酵培养基中培养是采用静置培养48h。
8.如权利要求4所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖中的至少两种的添加量按质量百分比为菌泥的1％。
9.如权利要求4所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的制备方法，其特征在于在步骤7)中，所述维生素C的加入量按质量百分比为植物乳杆菌粉末的1％，所述葡萄糖的加入量按质量百分比为植物乳杆菌粉末的20％，所述淀粉的加入量按质量百分比与植物乳杆菌粉末等量；所制得的可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末的直径为300μm。
10.如权利要求1所述可长期保存的水产养殖用复合乳酸杆菌粉末在制备防治对虾病害药物、饲料添加剂、对虾生长促进剂中应用；所述对虾病害可包括红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病、偷死症及由弧菌引起的症状。
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