CN104736162A - 改善的家禽饲养场实践 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改善家禽饲养设施内的环境的方法，包括减少家禽设施中的氨产生、抑制家禽垃圾中的脲酶、降低家禽垃圾中的致病菌水平、改善家禽饲养场的生产力、减少或防止大量生产的家禽设施中繁殖的家禽中的足皮肤炎和控制家禽垃圾中的害虫。还描述了适用于这类方法的组合物，其包含至少一种芽孢杆菌属的微生物和至少一种生物表面活性剂，其中所述生物表面活性剂的存在量为2mg/L-7000mg/L。

Description

改善的家禽饲养场实践
发明领域
本发明涉及改善家禽饲养设施内的环境的方法，包括减少家禽设施中的氨产生、抑制家禽垃圾中的脲酶、降低家禽垃圾中的致病菌水平、改善家禽饲养场的生产力、减少或防止大量生产的家禽设施中繁殖的家禽中的足皮肤炎和控制家禽垃圾中的害虫。还描述了适用于这类方法的组合物，其包含至少一种芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物和至少一种生物表面活性剂，其中所述生物表面活性剂的存在量为2mg/L－7000mg/L。
发明背景
为了给越来越多的人口提供食物，谷物、肉类、蔬菜和乳制品的总产量在过去的50年内已经增加了70％。相应地，养禽业的增长已经得到了显著增加。在2010年，美国的雏鸡、蛋、火鸡和小鸡的总产值为347亿美元，比2009年增加了10％。美国的家禽出口从2008年到2010年每年接近70亿磅重量。此外，对于家禽市场的专门鸡肉食品部的关注在增加。
为了维持家禽产量和家禽产量的增长，居留数以万计到数以百万计的家禽的大量生产设施在家禽饲养中常见。然而，这些设施存在有害于禽类健康并且导致饲喂缓慢、体重低和/或导致禽类群体疾病的生产问题。
巨大设施中家禽的紧密接触是指禽类不仅接触其自身的粪便，而且接触其他禽类的粪便。这导致胃肠病原体通过设施快速传播。一些家禽的胃肠病原体例如沙门氏菌属(Salmonella)的菌种、梭菌属(Clostridium)的菌种、弯曲杆菌属(Camplylobacter)的菌种和埃希氏菌属(Escherichia)的菌种也对人体致病，而在家禽饲养所中的水平被监测。
在传统上，通过将抗生素施用于家禽控制致病菌在家禽群体中的水平。然而，近来来一些国家，例如欧洲国家，已经禁止使用也应用于人体的抗生素，因为出现了抗生素抗性致病菌。
杀灭家禽中的致病菌的一种方式一直是向其饲料中添加益生菌微生物，并且已经发现这种方式可以改善禽类健康、肉类产量和蛋产量(Khalid等人,"Effect of Probiotic on some Physiological Parametersin Broiler Breeders",International Journal of Poultry Science,2011,10(8)：626-628)。
给家禽饲喂的益生菌可以包括非致病性微生物，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(US 4,919,936,US 7,247,299和US 7,754,469)。然而，这些组合物必须适合于家禽食用且具有抗生素活性的任何另外的饲料添加剂可以由工业管理部门管理。
此外，一些致病菌包括脲酶，其水解家禽粪便中发现的脲和尿酸且由此产生氨。设施中高水平的氨对禽类健康有害且工业管理部门要求大量生产家禽的设施中氨的水平必须保持低于25ppm。
控制氨水平目前在生产的前8－10天内通过使用添加到垃圾中的中和酸的化学品得以实现。常用的中和酸的化学品包括硫酸盐、亚硫酸氢盐和有机酸，例如柠檬酸。然而，这些中和化学品仅在生产开始期间具有活性且在生产约10天时耗尽。随后，使用通风机进行控制。使用中和酸的化学品的另一个困难在于它们接触禽类足并且导致或加剧因葡萄球菌属(Staphylococcus)感染导致的足皮肤炎及其足起疱。
包含芽孢杆菌属的菌种的组合物因其分泌破坏废物的胞外酶的能力也应用于除臭组合物(US 8,025,874)。这些组合物之一包含枯草芽孢杆菌的特定菌株NRRL B-50147且特别适用于控制动物垫层中的气味。然而，这些组合物需要应用枯草芽孢杆菌的特定菌株并且还包括其他吸附剂，例如粘土。这种组合物显示也不适合于大规模应用于环境中，例如大量生产家禽的农场。
对有效处理大量生产家禽设施的方法存在需求，其用于减少和/或控制氨产生并且有效控制和/或减少家禽垃圾和家禽粪肥中的致病菌，由此减少气味，防止家禽和消费者中的感染并且改善家禽健康和生产力。
发明概述
本发明部分地基于如下发现：包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂如枯草菌表面活素的组合物用于控制大量生产家禽饲养设施中的致病菌和氨的产生。
在本发明的一个方面中，提供了改善家禽饲养设施内的环境的方法，包括向家禽饲养设施内的家禽垃圾或家禽粪肥施用包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂在该组合物中的存在量约为2mg/L－7000mg/L。
在一些实施方案中，通过控制或减少家禽饲养设施中氨的产生来改善环境。在一些实施方案中，控制或减少氨产生至少部分地由控制或减少家禽垃圾中产生脲酶的细菌和/或减少或抑制家禽垃圾或家禽粪肥中的脲酶导致。
在一些实施方案中，通过控制或减少家禽垃圾或家禽粪肥中的致病菌来改善环境。
在一些实施方案中，通过控制家禽垃圾害虫如甲虫和苍蝇及其相应的幼虫来改善环境。
在一些实施方案中，环境的改善改善了家禽设施内的饲喂、布置、体重增长和其他生产措施。
在本发明的另一个方面中，提供了防止或减少家禽饲养设施中家禽中的足垫皮炎(足皮肤炎)和坏疽性皮炎的方法，包括向家禽饲养设施中的家禽垃圾施用包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂在该组合物中的存在量约为2mg/L－7000mg/L。
在一些实施方案中，防止或减少足皮肤炎是控制家禽垃圾中葡萄球菌属和或假单胞菌属(Pseudomonas)微生物的结果。在一些实施方案中，通过减少在家禽垃圾中使用或不使用中和酸的化合物来减少或防止足皮肤炎。
在本发明的另一个方面中，提供了包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂在该组合物中的存在量约为2mg/L－7000mg/L。
在一些实施方案中，所述组合物包含50－7000mg/L的生物表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物是浓缩物，在使用前进一步稀释。在这些实施方案中，所述生物表面活性剂的存在量为500mg/L－7000mg/L，尤其是800mg/L－7000mg/L或850mg/L－6000mg/L。在一些实施方案中，所述组合物为稀释形式，其包含2mg/L－850mg/L的生物表面活性剂，尤其是2mg/L－800mg/L或2mg/L－500mg/L。在一些实施方案中，所述组合物还包含表面活性剂，尤其是阴离子型表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物包含芽孢杆菌属菌种RSA-203。
发明详述
1.定义
本文所用的冠词"一种(a)"和"一种(an)"是指合乎冠词语法的一种或一种以上(即至少一种)。作为实例，“一种元素”是指一种元素或一种以上元素。
本文所用的术语"约"是指与用量、水平、值、尺寸、大小或量相比可变化30％、25％、20％、15％或10％的用量、水平、值、尺寸、大小或量。
在本说明书上下文和如下权利要求中，除非另有要求，否则措词"包含"和变化形式如"含有"和"包括"应理解为是指包含所述的整体或步骤或整体组或步骤组，但不排除任何其他的整体或步骤或整体组或步骤组。
本文所用的术语"家禽饲养设施内的环境"是指家禽饲养设施如库房的家禽居留区域，其中繁殖家禽和/或其中产蛋并且包括库房的地板或楼层、库房中的家禽垃圾、库房中的空气和空气质量和库房内部的硬表面。
本文所用的术语“家禽”是指由人养驯的禽类，目的在于获得蛋、肉类和/或羽毛。家禽包括鸡、水禽和猎禽。家禽的实例包括小鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑、雉鸡、斑鸠、鸽、食火鸟、鸵鸟和美洲鸵。
本文所用的术语“酒槽”是指得自甘蔗或甜菜加工的制糖工业副产物。发酵在糖加工过程中产生的糖蜜产生乙醇和抗坏血酸。这种发酵后遗留的残留物称作酒糟。酒糟是粘性液体，其具有2-10％w/v的总固体含量，高酸度pH4-5和高BOD(30000–40000)。
2.本发明的方法
本发明涉及改善家禽饲养设施、尤其是大量生产的家禽设施内的环境的方法。该方法包括使家禽垃圾或家禽粪肥接触包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂在该组合物中的存在量约为2mg/L－7000mg/L。这些方法可以用于家禽饲养所以控制或减少致病菌、控制或减少氨的产生、治疗或预防家禽足皮肤炎或控制或防止家禽设施中的害虫群袭。该组合物还可以改善家禽设施中的生产力。
家禽饲养设施可以是这样的设施，其中生产用于消费的家禽，或这样的设施，其中保持家禽持续产蛋、羽毛或其他家禽产品。
在一些实施方案中，所述方法用于控制家禽垃圾或家禽粪肥中的致病菌。所述致病菌可以是家禽的胃肠病原体。所述致病菌可以导致家禽中的疾病，例如腹泻或足皮肤炎。所述致病菌还可以是感染人体的致病菌。在一些实施方案中，所述致病菌选自沙门氏菌属的菌种、梭菌属的菌种、弯曲杆菌属的菌种、埃希氏菌属的菌种、假单胞菌属的菌种和葡萄球菌属的菌种。例如，致病菌可以选自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)。所述细菌可以对标准抗生素或疫苗的发生抗性，也可以不发生抗性。
在本发明的另一个方面中，提供了治疗或预防家禽足皮肤炎或坏疽性皮炎的方法。家禽足皮肤炎也称作足垫皮炎且坏疽性皮炎是侵害寄居在家禽垃圾覆盖的环境中的家禽的足病症。在一些情况中，足皮肤炎或坏疽性皮炎因存在家禽垃圾附加品种而加剧，诸如中和酸，其用于控制家禽垃圾中氨的产生，例如白矾、亚硫酸氢盐和其他酸。家禽足皮肤炎或坏疽性皮炎可能因葡萄球菌属或铜绿假单胞菌导致，其存在于家禽垃圾中存在的家禽粪便物质中。这些病症导致感染和家禽足上的水疱、踝关节烧伤和/或乳腺水疱。
在一些实施方案中，所述方法用于控制或减少家禽设施中产生的氨。认为氨因家禽垃圾或家禽粪肥中的家禽粪便中的脲和尿酸水解产生。脲和尿酸水解产生氨因存在脲酶而加速，所述脲酶存在于家禽粪便中或由家禽粪便中的细菌分泌。不希望受到理论约束，认为所述组合物通过控制或杀灭粪便物质中包含脲酶的微生物降低了家禽粪便中的酶活性。脲酶催化粪便物质中尿酸降解成氨。因此，在本发明的一个方面中，提供了用于控制或抑制家禽垃圾或家禽粪肥中脲酶活性的方法。
在一些实施方案中，将家禽设施中氨的浓度控制到低于25ppm的水，即在家禽设施中允许的氨的最大浓度。在一些实施方案中，将氨的浓度维持在低于20ppm、15ppm或10ppm。有利地，可以将氨的浓度维持在低于25ppm2-50天，例如5-50天，10-50天，15-50天，20-50天，尤其是足以使家禽从小鸡生长至成年鸡的时间期限。有利地，低于25ppm的氨的浓度减少或消除了对在设施中使用对运行而言能量集中和昂贵的通风机的需求。
在另一个方面中，本发明的方法涉及控制家禽垃圾中的害虫。在具体的实施方案中，所述害虫是无脊椎动物害虫，诸如昆虫。在一个实施方案中，所述害虫选自拟步虫，尤其是拟步虫幼虫，和苍蝇，诸如马蝇、小马蝇、黑色垃圾苍蝇、马蝇、较少的家蝇、厩螫蝇、反吐丽蝇、丽蝇、鲜艳的苍蝇(fresh flies)、尾蛆蝇和其他家庭苍蝇。
在本发明的另一个方面中，所述方法改善了家禽和家禽设施的生产力。致病菌的减少和/或氨水平的降低改善了家禽的一般健康，从而增加了其饲喂和生长并且产生了健康足。生产力增加自身可以表现为家禽的平均重量增加、产更多的蛋或更大的蛋和/或产生用于亚洲食品市场的健康易卖的鸡足。
在一些实施方案中，将所述组合物或稀释的组合物喷雾在家禽垃圾上。在一些实施方案中，以净方式使用所述组合物。在其他实施方案中，例如，用水稀释所述组合物。然而，维持生物表面活性剂的杀菌浓度至少为2mg/L，尤其是50mg/L。在一些实施方案中，用2份水中1份v/v组合物-30份水中1份v/v组合物、例如2-25份水中1份组合物、5-20份水中1份组合物、尤其是10份水中1份组合物、11份水中1份组合物、12份水中1份组合物、13份水中1份组合物、14份水中1份组合物、15份水中1份组合物、16份水中1份组合物、17份水中1份组合物、18份水中1份组合物、19份水中1份组合物或20份水中1份组合物稀释所述组合物。
当稀释本发明的组合物时，该组合物可以包含约1-40％v/v，尤其是1-30％v/v、1-20％v/v、1-15％v/v、1-12％v/v或1-10％v/v，更具体地是约2-8％的稀释的组合物。
可以将稀释或未稀释的组合物以1加仑/50平方英尺－1加仑/150平方英尺(0.8L/m2－0.27L/m2)、尤其是1加仑/75平方英尺－1加仑/125平方英尺(0.54L/M2－0.33L/m2)或1加仑/90平方英尺－1加仑/120平方英尺(0.45L/m2－0.34L/m2)的量施用于家禽垃圾。
在一些实施方案中，所述家禽垃圾包含一种或多种木屑、锯末屑、稻草、花生皮、稻壳、细碎甘蔗和其他低成本干燥吸收剂、低成本有机材料。所用有机材料的类型可以被当地的农作物及其干的有机废物指示。
在一些实施方案中，将所述组合物施用于家禽窝群之间的家禽垃圾且因此该垃圾包含引入下一窝小鸡前的粪便物质。可以在引入下一窝小鸡1-10天之前，尤其是3-7天之前将本发明的组合物施用于家禽垃圾。
在一些实施方案中，将所述组合物施用于家禽粪肥，例如产蛋设施，诸如包含关在笼中的家禽的那些设施中。
在一些实施方案中，可以在施用本发明的组合物之前或之后对家禽垃圾或家禽粪肥进行废物堆积风干处理。在一些实施方案中，将所述组合物施用于包含孢子形式的微生物的堆放物上。
3.本发明的组合物
在本发明的一个方面中，提供了包含至少一种芽孢杆菌属微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂在该组合物中的存在量约为2mg/L－7000mg/L。
在具体的实施方案中，所述至少一种来自芽孢杆菌属的微生物是益生菌微生物。在一些实施方案中，所述组合物包含一种来自芽孢杆菌属的微生物。在其他实施方案中，所述组合物包含一种以上来自芽孢杆菌属的微生物，例如2、3、4、5或6种微生物。在一些实施方案中，所述至少一种来自芽孢杆菌属的微生物选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popillae)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，尤其是枯草芽孢杆菌和藓样芽孢杆菌及其混合物，更特别地是枯草芽孢杆菌。
在一些实施方案中，所述至少一种来自芽孢杆菌属的微生物是枯草芽孢杆菌的特定菌株，尤其是枯草芽孢杆菌枯草亚种NRRL B-3383(US Department of Agriculture,Agricultural Research Service,ARSCulture Collection NRRL)、枯草芽孢杆菌ATCC21331、枯草芽孢杆菌ATCC21332、枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP.7666)和枯草芽孢杆菌RSA-203或其混合物。在一些实施方案中，所述所述至少一种来自芽孢杆菌属的微生物包含枯草芽孢杆菌RSA-203。在一些实施方案中，所述至少一种来自芽孢杆菌属的微生物是枯草芽孢杆菌NRRLB-3383和枯草芽孢杆菌RSA-203的组合。
RSA-203是枯草芽孢杆菌菌株的微生物。它是能够形成内生孢子的杆状、需氧、革兰氏阳性、β-溶血微生物。核酸序列分析证实它是枯草芽孢杆菌菌株。该微生物的样品于2013年1月9日寄存在ATCC保藏中心,10801University Boulevard,Manassas,Virginia20110-2209,United States of America并且分配了登记号___________________。
RSA-203产生大量生物表面活性剂枯草菌表面活素。如果培养条件包括在培养过程中除去起泡物(foamate)，则可以在培养基中以250mg/L－1000mg/L的量且在起泡物中以850mg/L－2g/L的量产生枯草菌表面活素。
在一些实施方案中，所述微生物处于营养状态。在其他实施方案中，所述微生物处于休眠状态，例如内生孢子。在其他实施方案中，所述微生物以休眠状态和营养状态的混合物存在。
所述组合物可以包含任何适量的芽孢杆菌属的微生物，以便在施用于家禽垃圾时达到适合的群体。不希望受到理论约束，认为所述微生物能够比其他微生物如致病菌更有效地利用家禽垃圾中的食物源。这导致芽孢杆菌属的微生物优于其他微生物，使得其他微生物不繁殖或死亡。芽孢杆菌属的微生物的适合量为1x104cfu/mL-1x1013cfu/mL。
在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂由所述组合物中的芽孢杆菌属的微生物产生。在其他实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂不由所述组合物中的芽孢杆菌属的微生物产生。
在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂是抗菌肽，尤其是环脂肽生物表面活性剂。在一些实施方案中，所述生物表面活性剂是枯草菌表面活素、地衣素(lichenysin)、伊枯草菌素、芬芥素(fengycin)之一或其混合物，更特别的是枯草菌表面活素、地衣素或其混合物，最特别的是枯草菌表面活素。这些生物表面活性剂各自可以包含脂肽的脂肪酸部分的长链可变的化合物的混合物。
环脂肽类如枯草菌表面活素具有环肽部分和衍生自脂肪酸的部分。枯草菌表面活素具有7个氨基酸的环肽，包括D-和L-氨基酸，Glu-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Leu，从N-末端通过C12-C17β-羟基脂肪酸连接至C-末端，以形成环状部分，如下所示。
地衣素具有与不同于枯草菌表面活素的氨基酸序列的类似结构，Gln-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Ile，从N-末端通过C12-C17β-羟基脂肪酸连接至C-末端，以形成环状部分。
芬芥素是具有序列Glu-D-Orn-Tyr-D-Allo-Thr-Glu-D-Ala-Pro-Glu-D-Tyr-Ile的环脂肽，其中该肽在3位的酪氨酸苯氧基与10位上的Ile的C-末端之间环化，所述脂肪酸连接于所述肽，与N-末端形成酰胺。
伊枯草菌素是指一组具有序列Asn-D-Tyr-D-Asn-Gln-Pro-D-Asn-Ser的环肽类，其中N-末端和C-末端通过可变长度的β-氨基脂肪酸连接。
所述组合物包含2mg/L－7000mg/L、例如50mg/L－7000mg/L用量的生物表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物是浓缩物形式，其可以在使用前稀释。例如，所述浓缩物可以包含浓度为500mg/L－7000mg/L、800mg/L－7000mg/L或850mg/L－6000mg/L的生物表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物是稀释形式且包含2mg/L－850mg/L、尤其是2mg/L－800mg/L或2mg/L－500mg/L的生物表面活性剂。在一些实施方案中，所述组合物包含用量为约50mg/L－4000mg/L,50mg/L－2000mg/L、100mg/L－2000mg/L、400mg/L－2000mg/L或约750mg/L－1500mg/L的生物表面活性剂。
所述组合物包含水性载体，例如水、缓冲剂或培养肉汤。在一些实施方案中，所述水性组合物的pH被缓冲至3-8。例如，柠檬酸缓冲液可以用于维持3-6的pH，或磷酸盐缓冲液，例如磷酸一钠、磷酸二氢钾、磷酸二钠或磷酸氢二钾可以用于维持4.8－8的pH。在一些实施方案中，所述组合物具有3-6的pH。在其他实施方案中，所述组合物具有6-8的pH。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种表面活性剂。该表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型、非离子型或两性离子型。在一些实施方案中，所述表面活性剂具有12或以上、尤其是12-14的亲水亲油平衡值(HLB)。适合的表面活性剂包括McCutcheon'sEmulsifiers&Detergents，国际版,1998中涉及的那些和后续版本，例如1998版HLB索引223-231页上涉及的那些。典型的非离子型表面活性剂包括聚(环氧乙烷)的烷基和聚烷基酯类、聚(环氧乙烷)的烷基和聚烷基醚类、任选聚乙氧基化的山梨糖醇烷基和聚烷基酯类、任选聚乙氧基化的山梨糖醇烷基和聚烷基醚类、烷基和聚烷基糖苷类或聚糖苷类、特别是烷基和聚烷基糖苷类或聚糖苷类、蔗糖的烷基和聚烷基酯类、任选聚乙氧基化的甘油的烷基和聚烷基酯类、任选聚乙氧基化的甘油的烷基和聚烷基醚类及其混合物。典型的阴离子型表面活性剂包括烷基醚硫酸盐、羧酸盐、氨基酸衍生物、磺酸盐例如线性烷基苯磺酸盐或磺酸、异硫代硫酸盐、牛磺酸盐、磺基琥珀酸盐、烷基磺基乙酸盐、多肽类、C10-C30的金属盐、特别是C12-C20脂肪酸的金属盐、特别是金属硬脂酸盐及其混合物。在特定的实施方案中，所述表面活性剂是线性烷基苯磺酸盐或磺酸，尤其是十二烷基苯磺酸。
适合的聚(环氧乙烷)的烷基和聚烷基酯类包括这样的化合物，其具有2-200数量的环氧乙烷(EO)单元，例如硬脂酸酯40EO、硬脂酸酯50EO、硬脂酸酯100EO、月桂酸酯20EO、月桂酸酯40EO、二硬脂酸酯150EO。适合的聚(环氧乙烷)的烷基和聚烷基醚类包括这样的化合物，其具有2-200数量的环氧乙烷(EO)单元，例如鲸蜡基醚23EO、油醚50EO、植物甾醇30EO、硬脂醇聚醚40、硬脂醇聚醚100、beheneth100。适合的任选聚乙氧基化的山梨糖醇烷基和聚烷基酯类包括这样的化合物，其具有0－100数量的环氧乙烷(EO)单元，例如月桂山梨坦4或20EO，特别是聚山梨醇酯20(或聚氧乙烯(20)月桂山梨坦)，例如由公司Uniqema销售的产品Tween20、来自BASF的棕榈山梨坦20EO、硬脂山梨坦20EO、油酸山梨坦20EO或克列莫佛(RH40,RH60等)。适合的任选聚乙氧基化的山梨糖醇烷基和聚烷基醚类包括这样的化合物，其具有0－100数量的环氧乙烷(EO)单元。适合的烷基和聚烷基糖苷类或聚糖苷类包括这样的化合物，其包含具有6-30个碳原子且尤其是6-18乃至8－16个碳原子且包含糖苷基团、尤其是包含1-5、特别是1、2-3个糖苷单元的烷基。例如，烷基聚糖苷类可以选自：癸基糖苷(烷基-Cg/Cn-聚糖苷(1.4))，例如在名称Mydol下由公司Kao Chemicals销售的产品或在名称Plantacare2000 下由公司Henkel销售的产品和在名称ORAMIX NS下由公司SEPPIC销售的产品；辛酰基/辛基糖苷，例如在名称Plantacare KE下由公司Cognis销售的产品或名称ORAMIX CG下由公司SEPPIC销售的产品；月桂基糖苷，例如在名称Plantacare1200 下由公司Henkel销售的产品或在名称Plantaren1200下由公司Henkel销售的产品；椰基糖苷，例如在名称Plantacare818下由公司Henkel销售的产品；辛酰基糖苷，例如在名称Plantacare810 下由公司Cognis销售的产品；及其混合物。适合的蔗糖的烷基和聚烷基酯类包括，例如Crodesta F150、在名称Crodesta SL40下销售的蔗糖一月桂酸酯和由Ryoto Sugar Ester销售的产品，例如在相关物Ryoto Sugar Ester P1670、Ryoto Sugar Ester LWA1695和RyotoSugar Ester01570下销售的棕榈酸蔗糖酯。适合的任选聚乙氧基化的甘油的烷基和聚烷基酯类包括这样的化合物，其具有0－100数量的环氧乙烷(EO)单元和1-30数量的甘油单元，例如单月桂酸六甘油酯和PEG-30甘油硬脂酸酯。适合的任选聚乙氧基化的甘油的烷基和聚烷基醚类包括这样的化合物，其具有0－100数量的环氧乙烷(EO)单元和1-30数量的甘油单元。实例包括Nikkol鲨肝醇100、Nikkol鲛肝醇100。适合的烷基醚硫酸盐包括，例如在名称SIPON AOS225或TEXAPON N702下由公司Henkel销售的硫酸月桂基醚钠(C12-1470-30)(2.2EO)、在名称SIPON LEA370下由公司Henkel销售的硫酸月桂基醚铵(C12-1470-30)(3EO)、在名称RHODAPEX AB/20下由公司Rhodia Chimie销售的烷基(C12-C14)醚(9EO)硫酸铵和在名称EMPICOL BSD52下由公司Albright&Wilson销售的钠和镁的月桂基醚和油醚硫酸盐的混合物。
所述表面活性剂的存在量有助于在施用所述组合物时湿润家禽垃圾。适合的量包括占组合物的0.01-10％wt/wt，尤其是0.1％-5％wt/wt，更特别是0.1-1％wt/wt。
在一些实施方案中，所述组合物还包含有机酸。在一些实施方案中，所述有机酸选自柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、抗坏血酸等，尤其是柠檬酸。包括所述有机酸是为了将pH调节至3-6并且可以有助于中和在将组合物施用于垃圾时存在于家禽垃圾中或在将组合物施用于家禽垃圾后产生的游离的氨。
所述组合物的其他任选的成分包括香料，例如柠檬油提取物等。这种香料可以是合成的或天然的，但优选天然的；和染料，其可以用于鉴定处理过的家禽垃圾。适合的燃料包括食品级染料，例如FD&C绿#5、FD&C绿#3、FD&C蓝#1、FD&C蓝#2、FD&C红#40、FD&C红#3、FD&C黄#5、FC&C#6、绿S、喹啉黄、淡红A、大红4R、专利蓝V、胭脂树红、叶绿素(chlorophylin)、胭脂红、甜菜苷、西红花、姜黄、番茄红素、接骨木汁、pandan和蝴蝶豌豆。
本发明的组合物可以在微生物培养物中制备。可以通过标准培养技术生产来自芽孢杆菌属的微生物。例如，向生物反应器中加入软化水、盐和营养物并且混合。然后给培养基接种期望的微生物培养物。然后给生物量充氧，搅拌，在适合的温度，例如35℃下温育，直到得到期望的微生物生长。根据在600nm的光密度(OD600nm)确定期望的微生物生长。在特定的实施方案中，将培养持续至光密度达到OD600nm>1.5-2.5，尤其是1.7-2.0。
典型方法包括向生物反应器中加入软化水、磷酸二氢钾、磷酸二钠、硝酸铵、酵母提取物、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、乙二胺四乙酸钠(EDTA)和葡萄糖。混合后，给培养基接种适合的芽孢杆菌属。然后给培养物充氧，以300rpm在35℃搅拌约12小时。在细胞密度达到1x1014菌落形成单位(cfu)/mL或OD600nm1.7-2.0时，培养过程完成。
而在一些实施方案中，所述组合物可以包含含有从培养过程直接产生的足量的微生物和生物表面活性剂的培养基。在其他实施方案中，将所述生物表面活性剂加入到培养基中或包含营养或内生孢子状态的微生物的组合物中。
在一些实施方案中，所述培养过程可以使用不产生足量的用于本发明的生物表面活性剂的芽孢杆菌属微生物进行。在一些实施方案中，所述培养过程包括通过起泡蒸馏连续除去生物表面活性剂的步骤，由此促使所述微生物产生大量生物表面活性剂，因为生物表面活性剂在生产时耗尽。在其他实施方案中，例如，分离内生孢子形式的芽孢杆菌属的微生物，且其不在培养基中，且因此不含生物表面活性剂。在这些实施方案中，将期望量的生物表面活性剂加入到所述微生物中以形成本发明的组合物。
所述生物表面活性剂可以如上所述生产或通过本领域公知的其他方法生产。生物表面活性剂如枯草菌表面活素的生产描述在文献中，例如描述在US 3,687,926,JP-A-6-121668,US 3,030,789,US 7,011,969,Wei等人Enz.Microbiol.Technol.,1989,22:724-728,Sheppard等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,27:486-489,Mulligan等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,(1989),31:486-489,Kim等人J.Ferment.Bioeng.,1997,84:41-46和Cooper等人,Appl.Environ.Microbiol.,1981,42:408-412中。
在特定的实施方案中，所述组合物中芽孢杆菌属的微生物是产生生物表面活性剂的微生物。
可以用任何产生生物表面活性剂的微生物生产生物表面活性剂。然而，在特定的实施方案中，所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物来自芽孢杆菌属，例如它们可以选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌、环状芽孢杆菌及其混合物。在一些实施方案中，一种产生生物表面活性剂的微生物存在于液体培养基中。在其他实施方案中，两种产生生物表面活性剂的微生物存在于液体培养基中。在另一个实施方案中，三种产生生物表面活性剂的微生物存在于液体培养基中。在其他实施方案中，四种产生生物表面活性剂的微生物存在于液体培养基中。在一些实施方案中，所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物是五种产生生物表面活性剂的微生物的混合物。所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物可以是已知产生改善的收率的生物表面活性剂的微生物菌株。例如，芽孢杆菌属的许多菌种产生生物表面活性剂，然而，已知枯草芽孢杆菌和藓样芽孢杆菌产生大量的生物表面活性剂。此外，已知芽孢杆菌属的特定菌株产生改善收率的生物表面活性剂，例如枯草芽孢杆菌ATCC21331、枯草芽孢杆菌ATCC21332、枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP.7666)。产生生物表面活性剂的微生物的许多菌株是可商购的或公众可得到的。在特定的实施方案中，所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物选自枯草芽孢杆菌NRRLB-3383或枯草芽孢杆菌ATCC21331，它们两者都是公众可得到的。在其他实施方案中，所述产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌RSA-203，即发现产生大量生物表面活性剂枯草菌表面活素的枯草芽孢杆菌的新菌株。
在一些实施方案中，所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌和藓样芽孢杆菌的混合物。在其他实施方案中，所述至少一种产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌的混合物。在这些实施方案中，可以调整每种微生物的比例以确定所产生的不同生物表面活性剂的量。在一些实施方案中，枯草芽孢杆菌在产生生物表面活性剂的微生物的混合物中以占该混合物约50-98％、尤其是60-95％、70-95％,80-95％、更特别地约90％存在。
在一些实施方案中，用于液体培养基中的碳源是糖或碳水化合物。适合的碳源的实例包括葡萄糖、甘油、淀粉、蔗糖、糖蜜和酒糟或其混合物。在一些实施方案中，所述碳源包含葡萄糖。在其他实施方案中，所述碳源包含酒糟。
在一些实施方案中，液体培养基中碳源如葡萄糖、糖蜜和/或酒糟的量为3-20％w/v，尤其是3-15％w/v，更具体地是3-12％w/v或3-10％w/v，最具体地约为10％w/v。在一些实施方案中，可以改变碳源的量以便在培养肉汤中得到期望浓度的生物表面活性剂。
所产生的生物表面活性剂优选是环脂肽生物表面活性剂，例如枯草菌表面活素、地衣素、伊枯草菌素、芬芥素及其混合物。这些生物表面活性剂各自可以包含脂肽的脂肪酸部分的长链可变的化合物的混合物。调节生长条件和营养物能够产生具有可变比例的脂质脂肪酸链长的生物表面活性剂。
在一些实施方案中，所产生的生物表面活性剂选自枯草菌表面活素和地衣素及其混合物。在其他实施方案中，所产生的生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
培养过程的温度为25℃-40℃，尤其是30℃-40℃，更特别地约为30℃-35℃，例如32℃-35℃。所用的温度可以取决于产生生物表面活性剂的微生物的特性。本领域技术人员可以通过常规试验方法确定用于给定细菌群体的适合的温度。
将培养基的pH维持在4-8，尤其是6-8或6-7.5，更特别是6.3-7.2，例如6.3-6.7。
将至少一种产生生物表面活性剂的微生物的接种物以达到起始OD600nm等于0.1-0.15的量加入到培养基中。在一些实施方案中，所述接种物为具有OD600nm为1.3-2.5的培养物。在一些实施方案中，所述接种物为对数中期生长中的培养物，其具有的OD600nm为1.3-1.6，将其以达到起始OD600nm等于0.1-0.15的量加入到新培养物中。所需量易于计算，例如，可以以10％v/v的比例加入具有OD600nm为1.5的接种物以得到具有OD600nm为0.15的新培养基。
在一些实施方案中，液体培养基还包含可异化(catabolizable)氮源。在一些实施方案中，可异化氮源选自含氮的无机盐或含氮的有机化合物，例如铵盐、硝酸盐、脲、蛋白胨、肉浸出物、酵母提取物、豆饼、玉米浆、蛋白胨或来源于豆类如大豆、赤豆、豌豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆和青豆的粉或这种粉的提取物或其混合物。在具体的实施方案中，可异化氮源是无机盐，诸如铵盐或硝酸盐，尤其是硝酸铵、氯化铵、乙酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸镁和硝酸钙或其混合物。在特定的实施方案中，可异化氮源是硝酸铵、硝酸钠、氯化铵或其混合物，例如硝酸钠、硝酸铵或其混合物。
存在于液体培养基中的可异化氮源的量取决于来源的性质和来源内氮的利用度。例如，氮源可以以1－20g/L的量存在。当氮源是无机氮源时，它可以以1－10g/L、尤其是2－7g/L、更具体地是3.5－4.5g/L的量存在。
在一些实施方案中，液体培养基还包含至少一种无机盐，诸如硫酸盐、磷酸盐、氯化物，尤其是金属例如锰、铁、钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐、氯化物。在一些实施方案中，所述无机盐选自诸如锰、镁、钠、钾和铁这样的离子的硫酸盐和磷酸盐或这种盐的混合物。在特定的实施方案中，所述的至少一种无机盐选自硫酸锰、磷酸钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁及其混合物，尤其是磷酸钠、硫酸锰和硫酸亚铁或其混合物。
无机盐的量随所用盐的不同可变。如果存在磷酸盐来源，则其存在量约为1－10g/L，尤其是2－7g/L，更具体地是4－7g/L，最特别地是5－6g/L。如果加入无机酸是为了提供痕量元素，例如铁、锰和钙，则其量可以在1mg/L－5g/L之间改变，例如可以加入的钙盐的量为0.5g/L－1g/L，可以加入的铁盐的量为1-10mg/L，可以加入的锰盐的量为0.5－1g/L，可以加入的镁盐的量为0.5g/L－5g/L。
在一些实施方案中，培养基还包含螯合剂。特定的螯合剂包括氨基羧酸及其盐，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、二己烯三胺亚乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、1,2-二氨基-环己烷三乙酸、乙二醇-双([β]-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、二己烯三胺亚乙酸(DPTA)、三乙四胺六乙酸(TTG)、氨基二乙酸和羟乙基氨基乙酸。特定的螯合剂是EDTA的盐和混合盐，诸如EDTA的二钾、铵、钙、二钠、三那和四钠盐，最优选EDTA的二钠或四钠盐，尤其是EDTA二钠。螯合剂的存在量为占培养基的0.1-5mg/L，尤其是0.5-3mg/L，更具体地是1-2.5mg/L。
培养方法可以以小规模在实验烧瓶中在温育箱中进行或可以以大规模进行，诸如以工业化规模在生物反应器中进行。该方法在需氧条件下进行。
培养过程的期限取决于培养条件。在一些实施方案中，培养过程具有8－120小时、尤其是8－72小时、8－48小时或8－24小时、例如10－14小时的期限。培养过程的期限依赖于为生产枯草菌表面活素而达到细胞密度大于1.3的OD600nm。
在一些实施方案中，该过程还包含给培养基通气以提供溶解氧。典型地，该过程包括以1L/分钟-3L/分钟、尤其是约1.5L/分钟的速率使空气通过培养基起泡。通气速率易于由本领域技术人员确定。通气可以从培养过程开始进行或可以在培养过程已经开始后开始，尤其是从培养过程开始时开始。在特定的实施方案中，通气将溶解氧的浓度维持在约20－40％，尤其是25－35％。在一些实施方案中，将溶解氧浓度维持在约30％。
一旦生物表面活性剂生产开始，则培养基因存在生物表面活性剂而起泡。在一些实施方案中，可以通过给起泡物喷雾醇如乙醇和溶剂如二氯甲烷或丙酮的混合物控制泡沫产生。在一些实施方案中，进行发酵的生物反应器是防爆的。在一些实施方案中，泡沫采集设备是防爆的。根据进入泡沫柱的泵压和流速确定设备必须承受的压力程度。
在一些实施方案中，促使起泡物产生并且从培养容器中采集起泡物。起泡物包含产生的生物表面活性剂。通过旋转阀将泡沫采集入具有适度真空的罐或具有破碎泡沫的喷雾塔的罐。可以从采集的起泡物中分离生物表面活性剂。在一些实施方案中，通过酸化、然后进行液/液萃取且然后蒸发液体分离生物表面活性剂。
在其他实施方案中，在培养过程完成后，从培养基中分离生物表面活性剂。例如，可以离心粗培养基以除去生物量。然后用酸如HCl将上清液酸化至酸性pH，例如pH2。酸性pH导致生物表面活性剂沉淀，可以将酸性上清液置于4℃下一定时间期限，以确保沉淀完成。然后，例如通过离心或过滤采集沉淀，重新混悬于水。将混悬液的pH调节至碱性pH，例如pH8，以增溶沉淀。可以用有机溶剂如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、尤其是二氯甲烷萃取得到的水溶液，蒸发有机相，得到高纯度结晶形式的生物表面活性剂。在一些实施方案中，可以在培养过程中或在培养完成后通过泡沫蒸馏采集生物表面活性剂。可以将采集或分离的生物表面活性剂加入到包含芽孢杆菌属的其他培养物或组合物中，尤其是其中所述微生物是内生孢子形式。这使得本发明的组合物具有高于通常可以得自该微生物或该微生物所耐受的浓度的生物表面活性剂。
可以通过将生物表面活性剂添加到包含所述微生物的组合物中得到生物表面活性剂的量为2mg/L－7000mg/L来制备本发明的组合物。在一些实施方案中，所述微生物在培养基中。在其他实施方案中，所述微生物在水中，尤其是去离子水。在一些实施方案中，所述微生物在培养肉汤中并且用水、尤其是去离子水稀释。
在一些实施方案中，如果产生生物表面活性剂的微生物是来自芽孢杆菌属的微生物，则培养应用所述组合物的微生物也产生生物表面活性剂。因此，所述微生物和组合物中的至少一种生物表面活性剂可以在单一步骤中产生。在该实施方案中，所述组合物可以包含培养基和生物表面活性剂。在该实施方案中，如果需要生物表面活性剂增加，则可以再加入生物表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一些芽孢杆菌属的微生物是孢子形式。此时，还可以加入如上所述的表面活性剂。
在一些实施方案中，稀释来自同时生产芽孢杆菌属的微生物和生物表面活性剂的培养肉汤并且通过将该培养肉汤添加到水、pH调节剂如氢氧化钠、磷酸二氢钾或柠檬酸和表面活性剂的混合物中内生孢子形成。
在一些实施方案中，在内生孢子形成后，再向所述组合物中加入生物表面活性剂，例如加入量为100－1000mg/L，尤其是约400－750mg/L。
本发明的组合物包含任何量的所述微生物，然而，在一些实施方案中，所述微生物的存在量约为1x104cfu/mL-1x1013cfu/mL。
在本发明的另一个方面中，提供了微生物枯草芽孢杆菌RSA-203。
现在参照下列实施例描述本发明，这些实施例示例本发明的一些优选的方面。然而，应理解本发明的下列描述的特殊性并不能取代在先描述的一般性。
附图简述
图1是使用不同量的硫酸根离子的微生物随时间生长的图解表示。
实施例
实施例1：枯草菌表面活素生物表面活性剂的生产
将来自细菌培养物的枯草芽孢杆菌NRRL B-3383菌株(最初得自United States Department of Agriculture)以2％体积/体积的接种物转入包含2.5L10％基于酒糟的MMS肉汤的4L摇瓶。基于酒糟的MMS肉汤包含：
将所述摇瓶置于150rpm的定轨振荡器(SKC6100,Jeio Tech)上，同时在30℃温育(MCO-801C Incubator,Sanyo)。72小时后，从温育箱中取出摇瓶，通过在4℃以8,500rpm离心20分钟(SorvallEvolution RC)从粗培养肉汤中除去生物量。
使用HCl使得到的上清液的pH达到pH2.0，导致枯草菌表面活素沉淀，将上清液贮存在4℃下过夜，以确保完全沉淀。通过在4℃以8,500rpm离心20分钟采集沉淀。在沉淀中采集约2.5g/L粗物质。将沉淀混悬于去离子水，使用1M NaOH将pH调节至8.0。用等体积的二氯甲烷萃取水溶液。分离二氯甲烷层，使其蒸发至得到纯化的结晶枯草菌表面活素，其量为50mg/L－750mg/L。
对比纯枯草菌表面活素(Sigma Aldrich,98％纯)的标准组合物检查结晶枯草菌表面活素样品的纯度。通过LC-MS分析标准组合物显示峰具有的保留时间为1.03、1.23、1.61、1.74、2.15和2.93分钟。基于峰面积计算纯度。
经测定使用上述方法测试的4种样品的纯度为80％、56％、58％和61％。
实施例2：枯草菌表面活素和地衣素掺合物的生产
枯草芽孢杆菌和藓样芽孢杆菌用于接种包含10％基于糖蜜的MMS肉汤的4L摇瓶。基于蜜糖的MMS肉汤包含：
将所述摇瓶置于150rpm的定轨振荡器(SKC6100,Jeio Tech)上，同时在30℃温育(MCO-801C Incubator,Sanyo)。72小时后，从温育箱中取出摇瓶，通过在4℃以8,500rpm离心20分钟(SorvallEvolution RC)从粗培养肉汤中除去生物量。
实施例3：
在1升生物反应器中，制备包含800mL软化水、磷酸二氢钾(20.4g)、磷酸二钠(28.4g)和酵母提取物(5g)的缓冲溶液。混合缓冲液，将pH调节至7。然后将缓冲液高压灭菌。在1L升生物反应器中，将200mL所述缓冲溶液与硫酸镁(2mL的12g/100mL溶液)、氯化钙(1mL,0.1M)、七水硫酸亚铁(1mL,15.7g/100mL溶液)、一水合硫酸锰(1mL,3.8g/100mL溶液)、EDTA钠(1mL,0.18g/100mL溶液)和葡萄糖(20mL,20g/80g去离子水)和硝酸铵(10mL,82g/200mL溶液)混合。将芽孢杆菌属菌种的孢子以2％wt接种入生物反应器。将生物量在35℃以300rpm搅拌12小时。将芽孢杆菌属温育至细胞密度达到1x1014cfu/mL且OD600nm为2.2。
实施例4：芽孢杆菌属和生物表面活性剂的共生产
将2200lbs(998kg)软化水加入到560加仑(2200L)不锈钢反应器中，温至35℃。加入8.7lbs(3.95kg)磷酸二氢钾和13.3lbs(6kg)磷酸二钠，混合该组合物。加入硫酸镁(240g)、氯化钙(33g)、溶于100mL水的EDTA(2.2g)、硫酸亚铁(104g)、硫酸锰(41.7g)、一水合葡萄糖(10.7lbs,4.85kg)、高压灭菌的酵母提取物(2.14lbs,0.97kg)、氯化铵(6.1lbs,2.77kg)和硝酸钠(9.6lbs,4.35kg)，在35℃温度下持续混合。加入具有OD600nm为2.2且表面张力大于50达因/cm的23L芽孢杆菌属接种物。混合该混合物，维持在35℃，用过滤的空气充氧至溶解氧水平为50％。当培养基达到光密度为1.7-2.0吸光度(Absorbence)单位时，停止培养。
实施例5：组合物
然后通过进一步稀释实施例4中生产的培养基制备用于本发明的组合物。在1000加仑不锈钢稀释反应器中，在搅拌的同时加入2200lbs(998kg)软化水和磷酸二氢钾(5lbs,2.27kg)。加入氢氧化钠(5-60lbs,2.27-27.2kg)和<1％wt非离子型十二烷基苯磺酸。用氢氧化钠将pH调节至6-8。然后加入培养的细菌和培养基，混合该组合物。检查表面张力，再加入浓缩的枯草菌表面活素泡沫冷凝物，得到表面张力为27-35达因/cm。
实施例6：组合物
重复实施例5的方法，除外用柠檬酸将pH调节至3.5-5。
实施例7：小鸡垃圾中氨的产生
将包含小鸡粪便的小鸡垃圾分入2个等量的立方码的箱子。监测1个未进一步处理的箱子的氨产生(对照)。通过用包含芽孢杆菌属菌种包括枯草芽孢杆菌的微生物、糖蜜残留物和枯草菌表面活素的组合物喷雾小鸡粪便处理另一个箱子。该组合物来源于培养过程且用水稀释至每升5-25％，且以1L/100平方米的比例处理垃圾。
结果：
对照箱子具有20ppm的氨浓度。经处理的箱子具有8ppm的氨浓度。
实施例8：家禽库房中氨的产生
使用4个家禽库房(雏鸡)，它们各自具有22,000平方英尺(2044m2)面积且容纳22,300只家禽。在所有4个库房中，在库房中放置家禽小鸡后5天处理家禽垃圾。
用实施例4的组合物处理库房1。将12.5(47.3L)加仑的实施例5的组合物与185加仑(700L)的水混合，然后掺合，喷雾在半个库房中包含锯屑和堆肥的家禽垃圾上。在另一半库房中再用在185加仑(700L)水中的12.5加仑(47.3L)组合物重复该过程。
用实施例5的组合物处理库房2。将12.5(47.3L)加仑的实施例5的组合物与185加仑(700L)的水混合，然后掺合，喷雾在半个库房中包的家禽垃圾上。在另一半库房中再用在185加仑(700L)水中的12.5加仑(47.3L)组合物重复该过程。
用pH调整的物质硫酸氢铝处理库房3和4。在每个库房中，将1650磅(748kg)硫酸氢铝在500加仑(1893L)水中掺合，喷雾在家禽垃圾上。
在每个库房中，用安装和从200加仑(757L)罐中进料的机械化6喷嘴喷雾器施加水处理，所述的罐固定在4轮车辆上。施用后，用牵引机将家禽垃圾堆放。
在处理后，从每个库房中取出垃圾样品并且分析氨气。
将家禽小鸡放入库房并且在第1、5、16、21和39天取空气样品，使用Drager管(Drager Safety Inc.,Pittsburgh,PA,USA)分析氨浓度。结果如表1中所示。
表1
第1天 第5天 第16天 第21天 第39天
库房1 10 10 20 20 12
库房2 10 10 20 20 15
库房3 0 20 18 >25 全通风
库房4 0 20 18 >25 全通风
全通风表示需要库房机械通风以控制氨浓度。
评价所有4个库房中的家禽的健康、发病率和体重。所有4个库房中的家禽都属于良好健康状态。
通过爪分级分析家禽的足：健康爪分级为1，直到受感染和起疱的爪分级为4。在库房1和2中，爪分级为1.无禽类足上起疱。
库房1和2中的发病率水平比库房3和4平均减少了133只禽。
库房1和2中禽类的体重比库房3和4增加了15-20点。这等同于库房1和2中在35天内重量总计又增加了11,000lbs。
实施例9:
在实施例8的家禽饲养所试验的第21天时，取家禽垃圾样品，通过在琼脂平板上铺板分析垃圾。温育平板，然后通过革兰氏染色法染色。仅存在革兰氏阳性种类。
实施例10：沙门氏菌属病原体的控制
通过在121℃的最低温度高压灭菌35分钟对小鸡粪肥灭菌，以确保样品不包括竞争性细菌。灭菌后，给小鸡粪肥接种肠沙门氏菌并且温育24小时。温育后，用实施例6的组合物通过将约100μL组合物喷雾在小鸡粪肥(25g)上处理小鸡粪肥的非对照样品。对照样品包括灭菌的小鸡粪肥和接种肠沙门氏菌且温育24小时的灭菌的小鸡粪肥，但不用实施例6的组合物处理这些对照品。
分析样品的细菌生长，即生长培养基(ATCC培养基3，营养琼脂)上的肠沙门氏菌和枯草芽孢杆菌。在灭菌后(时间0)、接种和温育24小时(时间0)进行对照品分析，并且在施用实施例6的组合物后3、6、24、48和96小时对测试样品进行分析。
增补的三糖铁(TSI)试验用于区分芽孢杆菌属的菌种与沙门氏菌属的菌种之间的生长。肠沙门氏菌产生硫化氢，导致在本试验中出现深色，而芽孢杆菌属的菌种不会产生这种颜色。
在4天内评价肠沙门氏菌的存在。4天期限后，给测试样品再接种肠沙门氏菌并且温育24小时。然后再在4天期限内评价样品。最初给再接种的样品接种温育24小时的肠沙门氏菌，用实施例5的组合物处理，温育4天，然后再接种肠沙门氏菌，温育24小时。然后在0时(对照品)、然后在3、6、24、48和96小时时分析样品。结果如表2中所示。
表2
在用实施例6的组合物处理3小时-96小时的任何试验样品中未观察到致病性肠沙门氏菌生长。此外，3小时-96小时内再接种样品中无肠沙门氏菌生长。
这表明包含芽孢杆菌属的微生物和生物表面活性剂的组合物有效地抗小鸡粪肥中发现的肠沙门氏菌。该处理在3小时内有效且具有长效作用。
实施例11：害虫控制
将25加仑(95L)实施例6的组合物加入到400加仑(1514L)水中，喷雾在21,000平方英尺的家禽垃圾上。然后堆积垃圾。检查垃圾的拟步虫幼虫并且采集发现的任何幼虫且监测。拟步虫幼虫在接触垃圾处理2小时内死亡。在处理后24小时在经处理的垃圾内未发现活的拟步虫幼虫。
实施例12：空肠弯曲杆菌病原体的控制
通过在121℃的最低温度高压灭菌35分钟对小鸡粪肥灭菌，以确保样品不包括竞争性细菌。灭菌后，给小鸡粪肥接种空肠弯曲杆菌。用实施例6的组合物通过将约100μL组合物喷雾在小鸡粪肥(25g)上处理小鸡粪肥的非对照样品。对照品包括灭菌的小鸡粪肥和接种空肠弯曲杆菌的灭菌的小鸡粪肥，但都不用实施例6的组合物处理样品。在42℃温育样品。
分析样品在空肠弯曲杆菌培养基上的细菌生长。分别在灭菌后(时间0)、接种和温育24小时(时间0)进行对照品分析，并且在施用实施例6的组合物后3、6、24、48和96小时对测试样品进行分析。
96小时测试期后，给测试样品再接种空肠弯曲杆菌。在0时评价样品(对照品4)以证实细菌的活力。然后将再接种的样品温育96小时并且再次评价。结果如表3中所示。
表3
在用实施例6的组合物处理3小时-96小时的任何试验样品中未观察到致病性空肠弯曲杆菌。96小时后再接种样品中也无生长。
这表明包含芽孢杆菌属的微生物和生物表面活性剂的组合物有效地抗小鸡粪肥中发现的空肠弯曲杆菌。该处理在3小时内有效且具有长效作用。
实施例13：家禽产蛋设施中氨的控制
评价具有笼中的禽类和落在传送带上的粪肥的4层产蛋设施的氨浓度。在该设施中，来自顶层的粪肥由传送带输送至将顶层与底层隔离的v-形平台通道。当门开启时，粪肥(16000lbs)沉积在约6英尺高的堆积物上。
在4个位置上用实施例5的组合物喷雾粪肥堆积物。在位置1和2处，净施用组合物。在位置3和4处，用水按照1：16稀释施用实施例5的组合物。如果氨的水平低于50ppm，则不使用通风机。
当保持不处理粪肥时且不使用通风机分散产生的氨时，设施中的氨水平达到500ppm。当使用通风机时，氨的水平降至<50ppm。
在处理后间隔对氨水平采样且结果如表4中所示。
表4
日期 时间 位置1 位置2 位置3 位置4 位置5
30/10 9.21am 19ppm 18ppm 23ppm 23ppm 25ppm
4/11 8.03am 46ppm 44ppm 50ppm＊ 52ppm＊ 56ppm＊
10/11 3.10pm 30ppm 21ppm 30ppm 31ppm 41ppm
12/11 9.36am 11ppm 6ppm 13ppm 11ppm 19ppm
15/11 10.05am 26ppm 22ppm 42ppm 40ppm 40ppm
20/11 3.30pm 29ppm 24ppm 36ppm 41ppm 45ppm
22/11 8.29am 39ppm 28ppm 35ppm 36ppm 41ppm
24/11 9.40am 31ppm 29ppm 36ppm 40ppm 44ppm
28/11 7.51am 29ppm 39ppm 47ppm 53ppm 55ppm
＊无效喷雾导致氨的水平增加，但在正确地再施用时下降。
结果显示将本发明的组合物施用于家禽粪肥能够维持氨的水平低于50ppm28天以上。
作为变化，可以通过用连续低剂量喷雾处理粪肥，同时使其沉积在平台通道上或同时位于平台通道上，以便提供更大的接触表面积。
实施例14：可选的生物表面活性剂生产
表5
将适量的过滤水加入到生物反应器中并且达到35℃。从此时开始连续给水冲氧。按照指定顺序加入上述表5中举出的营养物。恰在接种所述制剂前加入铵和硝酸盐源，与防止因缺乏氮导致的任何污染细菌。以达到最初OD66nm≈0.15的量加入接种物。根据在OD66nm的光密度测量值监测培养条件和过程。
根据表面张力测量值监测生物表面活性剂产量。可以通过测定净培养液和制备稀释液使肉汤的表面张力递增，以确定生物表面活性剂水平高于临界胶束浓度(CMC)。表面张力直到稀释枯草菌表面活素低于CMC才增加。
可以通过在MMS-Y和血琼脂平板上培养样品监测微生物菌株。如果使用混合的培养物并且菌落类型可以在琼脂平板上分化，则应连续稀释接种物和最终培养物以便进行每种菌株的平板计数。这不仅可以确定培养物的纯度，而且可以确定一种菌株是否明显地与其他菌株竞争。
实施例15：不同浓度的硫酸盐对培养物的影响
通过从培养基中除去所有硫酸盐来源并且用氯化物盐替代它们测试硫酸盐对培养肉汤的作用。所述培养肉汤包含用氢氧化钾调节至pH7的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液。然后用硫酸钠(1.8M)以1mL/L、0.8mL/L、0.6mL/L、0.4mL/L和0.2mL/L的不同浓度点样。每隔半小时，评价光密度、pH和表面张力。本试验使用RSA-203细菌菌株进行。
结果如图1中所示。结果显示微生物在具有氯化物盐的孔中使用硫酸盐等同地生长。在所有样品中，表面张力均下降且截止到5小时时仍然保持稳定在约27达因。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.改善家禽饲养设施内的环境的方法，包括向所述家禽饲养设施中的家禽垃圾或家禽粪肥施用包含芽孢杆菌属(Bacillus)的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂以约2mg/L－7000mg/L的量存在于该组合物中。
2.权利要求1的方法，其中所述家禽饲养设施中氨的产生被减少或得到控制。
3.权利要求2的方法，其中所述家禽垃圾或家禽粪肥中的脲酶被减少和/或受到抑制。
4.权利要求1的方法，其中所述家禽垃圾中的致病菌得到控制和/或减少。
5.权利要求4的方法，其中所述致病菌选自沙门氏菌属(Salmonella)的菌种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的菌种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌种、埃希氏菌属(Escherichia)的菌种、假单胞菌属(Pseudomonas)的菌种和梭菌属(Clostridium)的菌种的一种或多种。
6.权利要求5的方法，其中所述致病菌选自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugenosa)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的一种或多种。
7.权利要求1的方法，其中所述家禽设施的生产力得到改善。
8.权利要求1的方法，其中家禽垃圾中的害虫得到控制。
9.权利要求9的方法，其中所述害虫是拟步虫幼虫。
10.防止或减少家禽饲养设施中家禽足皮肤炎或坏疽性皮炎的方法，包括向所述家禽饲养设施中的家禽垃圾施用包含芽孢杆菌属的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂以约2mg/L－7000mg/L的量存在于该组合物中。
11.权利要求1－4任一项的方法，其中通过喷雾在所述家禽垃圾上施用所述组合物。
12.权利要求1－11任一项的方法，其中所述生物表面活性剂以2－850mg/L的量存在。
13.权利要求1－12任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的至少一种菌株。
14.组合物，包含所述芽孢杆菌属的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂，其中所述生物表面活性剂的存在量为2mg/L－7000mg/L。
15.权利要求14的组合物，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物的存在量为1x104cfu/mL－1x1013cfu/mL。
16.权利要求14或权利要求15的组合物，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物以营养状态、作为内生孢子或营养状态和内生孢子的混合物存在。
17.权利要求14－16任一项的组合物，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)及其混合物。
18.权利要求17的组合物，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌及其混合物。
19.权利要求14－18任一项的组合物，其中所述枯草芽孢杆菌是RSA-203。
20.权利要求14－19任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素(lichenysin)、芬芥素(fengycin)、伊枯草菌素及其混合物。
21.权利要求20的组合物，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素及其混合物。
22.权利要求21的组合物，其中所述生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
23.权利要求14－22任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂的存在量为50－7000mg/L。
24.权利要求14－22任一项的组合物，还包含表面活性剂。
25.权利要求24的组合物，其中所述表面活性剂是烷基苯磺酸表面活性剂。
26.于2013年1月9日以登记号PTA-13451寄存在ATCC的为RSA-203的微生物。

Claims (26)

1.改善家禽饲养设施内的环境的方法，包括向所述家禽饲养设施中的家禽垃圾或家禽粪肥施用包含芽孢杆菌属(Bacillus)的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂以在约2mg/L和7000mg/L之间的量存在于该组合物中。
2.权利要求1的方法，其中所述家禽饲养设施中氨的产生被减少或得到控制。
3.权利要求2的方法，其中所述家禽垃圾或家禽粪肥中的脲酶被减少和/或受到抑制。
4.权利要求1的方法，其中所述家禽垃圾中的致病菌得到控制和/或减少。
5.权利要求4的方法，其中所述致病菌选自沙门氏菌属(Salmonella)的菌种、弯曲杆菌属(Campylobacter)的菌种、葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌种、埃希氏菌属(Escherichia)的菌种、假单胞菌属(Pseudomonas)的菌种和梭菌属(Clostridium)的菌种中的一种或多种。
6.权利要求5的方法，其中所述致病菌选自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugenosa)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)中的一种或多种。
7.权利要求1的方法，其中所述家禽设施的生产力得到改善。
8.权利要求1的方法，其中家禽垃圾中的害虫得到控制。
9.权利要求9的方法，其中所述害虫是拟步虫幼虫。
10.防止或减少家禽饲养设施中家禽足皮肤炎或坏疽性皮炎的方法，包括向所述家禽饲养设施中的家禽垃圾施用包含芽孢杆菌属的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂的组合物，其中所述生物表面活性剂以在约2mg/L和7000mg/L之间的量存在于该组合物中。
11.权利要求1－4任一项的方法，其中通过喷雾在所述家禽垃圾上施用所述组合物。
12.权利要求1－11任一项的方法，其中所述生物表面活性剂以2－850mg/L的量存在。
13.权利要求1－12任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的至少一种菌株。
14.组合物，包含所述芽孢杆菌属的至少一种微生物和至少一种生物表面活性剂，其中所述生物表面活性剂的存在量为2mg/L－7000mg/L。
15.权利要求14的组合物，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物的存在量为1x104cfu/mL－1x1013cfu/mL。
16.权利要求14或权利要求15的组合物，其中所述芽孢杆菌属的至少一种微生物以营养状态、作为内生孢子或者营养状态和内生孢子的混合物存在。
17.权利要求14－16任一项的组合物，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)及其混合物。
18.权利要求17的组合物，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌、藓样芽孢杆菌及其混合物。
19.权利要求14－18任一项的组合物，其中所述枯草芽孢杆菌是RSA-203。
20.权利要求14－19任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素(lichenysin)、芬芥素(fengycin)、伊枯草菌素及其混合物。
21.权利要求20的组合物，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素及其混合物。
22.权利要求21的组合物，其中所述生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
23.权利要求14－22任一项的组合物，其中所述生物表面活性剂的存在量为50－7000mg/L。
24.权利要求14－22任一项的组合物，还包含表面活性剂。
25.权利要求24的组合物，其中所述表面活性剂是烷基苯磺酸表面活性剂。
26.于2013年1月9日以登记号_______________寄存在ATCC的为RSA-203的微生物。
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