JP5711144B2 - 高レベルの必須アミノ酸を分泌する胆汁耐性バチルス組成物 - Google Patents
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Description
(i)バチルス芽胞が、4mMおよび6mMの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、それぞれ18時間および19時間未満以内にバチルス芽胞が0.4OD630の栄養細胞増殖点に達すること、と定義される、迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示すこと、
(ここで栄養細胞増殖点とは、OD値が(栄養細胞の増殖によって)連続的に上昇し始め、0.4のOD630に達する、増殖曲線上の点であり、
(I)ここで胆汁酸塩培地は、本明細書中の実施例1の標準的な公知の非選択的子牛インフュージョンブロス(VIB)培地に、抱合型胆汁酸塩であるタウロデオキシコール酸およびグリコデオキシコール酸ならびに脱抱合型胆汁酸塩であるデオキシコール酸を、タウロデオキシコール酸60%、グリコデオキシコール酸30%、およびデオキシコール酸10%の比率で含む胆汁酸塩混合物を添加したものであり、
ここでODアッセイ分析は次の工程により行われる:
(a)マイクロタイタープレート内のウェルを、培地1ml当たり108個のバチルス芽胞を有する0.150mlの胆汁酸塩培地で満たすこと(すなわちこれがゼロ時間である)、および
(b)大気条件下にて37℃でプレートをインキュベートし、各読取りの前に攪拌して分光光度計を用いてOD630値を測定し、典型的な経時的増殖曲線を取得すること)
および
(ii)バチルス栄養細胞が、参照バチルス細胞DSM19467よりも多い量で少なくとも1の必須アミノ酸を産生しており、ここで当該産生された必須アミノ酸の量は、本明細書の実施例2の標準既知最小塩増殖培地中で37℃で2日間増殖させた後に、実施例2の標準GC−MS方法に基づくアミノ酸アッセイにより計測される
を特徴とするバチルス組成物に関する。
(a)第1の態様の項目(i)の条件下で18時間および19時間未満以内に栄養細胞増殖点に達する程に迅速に発芽および成長することが可能な新たなバチルス芽胞細胞の個々のバチルス芽胞細胞のプールから選択し単離すること;
(b)工程(a)の単離した芽胞細胞から栄養バチルス細胞を作製し、選択し単離した新規な細胞に突然変異を起こして新たな個々のバチルス栄養細胞のプールを得ること;
(c)工程(b)の新たな個々のバチルス栄養細胞のプールから、第一態様の項目(ii)の条件下で、参照バチルス細胞DSM19467よりも高い量で、少なくとも1の必須アミノ酸を産生することができる新たなバチルス栄養細胞を選択し単離すること;および
(d)工程(c)の高生産性栄養バチルス細胞を分析して、この細胞が工程(a)の迅速な発芽および成長を維持していることを確認し、選択したバチルス細胞を単離すること;
を含む方法に関する。
本明細書中の関連用語の全ての定義は、本明細書中の関連する技術的背景との関連で当業者により理解されるものに従う。
「バチルス組成物」という用語は、当技術分野に従って理解される。本明細書中においては、目的の性質を有する多くのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物と理解される。
バチルス細胞は、いずれかの適切な目的のバチルス細胞であってもよい。
バチルス・ズブチリス、バチルス・ユニフラゲラツス(Bacillus uniflagellatus)、バチルス・ラテロプソルス(Bacillus lateropsorus)、バチルス・ラテロスポルスBOD(Bacillus laterosporus BOD)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ポリミキサ(Bacillus polymyxa)、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステロテルモフィルス(Bacillus sterothermophilus)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・テルモフィルス(Bacillus thermophilus)、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、およびバチルス・シルクランス(Bacillus circulans)
からなる群より選択されるバチルス種より選択される少なくとも1つのバチルス細胞である。
上記の通り、第1の態様の項目(i)の胆汁耐性アッセイは、公知の市販の標準的な要素(例えば標準的な培地、胆汁酸塩;標準的なOD測定法)に基づいている。
上記の通り、第1の態様の項目(i)に関して、バチルス芽胞細胞は、本明細書に記載の通り、4mMおよび6mMの胆汁酸塩にて、それぞれ18時間および19時間未満以内に0.4ODの栄養細胞増殖点に達する程に迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示す。
当業者には公知であるが、必須アミノ酸は、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、およびアルギニンからなる群より選択される必須アミノ酸であってもよい。
上記の通り、第1の態様の項目(ii)のアミノ酸アッセイは、標準的な公知の市販の要素(例えば標準的な培地、標準的な試験等)に基づいている。
第1の態様の項目(ii)に関して、バチルス栄養細胞は、好ましくは、第1の態様の項目(ii)の条件下で、少なくとも1つの必須アミノ酸を、参照バチルス細胞DSM19467の少なくとも2倍の量生産している。
上記の通り、本発明の第2の態様は、第1の態様および本明細書中に記載の関連する実施形態のバチルス組成物を他の動物用飼料の材料と併せて動物に投与することを含む、動物への給餌方法に関する。
(1)動物用の飲料水に入れる;
(2)動物に噴霧する;または
(3)ペースト、ゲル、またはボーラスによる適用。
上記の通り、第3の態様は、新規なバチルス細胞のスクリーニングおよび単離方法に関する。
新規なバチルス・ズブチリス株の試料は、寄託日2007年6月27日、受託番号DSM19467で、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig)に寄託されている。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に行わていれる。
培地:
培地は、標準的な市販の非選択的培地である子牛インフュージョンブロス(VIB)(Difco, 234420)であった。
「子牛赤身からの浸出物とペプトンとにより、子牛インフュージョン培地中で、窒素、ビタミン、炭素、およびアミノ酸が得られる。塩化ナトリウムにより、配合物の浸透圧バランスが維持される」と記載されており、
製造指示書に従い、25gの子牛インフュージョンブロス粉末を1Lの精製水に懸濁(2.5%溶液)させ、頻繁に攪拌しながら加熱し、次いで1分間沸騰させて粉末を完全に溶解させることにより培地を調製した。2.5%子牛インフュージョンブロス溶液は、1リットル当たり:
子牛赤身浸出物:10g
プロテオースペプトン:10g
塩化ナトリウム 5g
を含んでいた。
胆汁酸塩の混合物を、ブタ胆汁中の胆汁酸塩の生理的組成および濃度を模して調製し、この胆汁酸塩を、上記で調製した子牛インフュージョンブロス培地に溶解させて、最終胆汁酸塩濃度を8mMとした。
栄養細胞と芽胞とを区別して純粋な芽胞接種用生成物を確保するため、バチルス生成物の芽胞数を、80℃で10分間の+/−加熱処理を用いて測定した。加熱処理に続いて室温に冷却した後、10倍系列希釈を食塩加ペプトン水中で行った。トリプトース血液寒天プレート(Difco 0232-01)の複製に、適当な10倍希釈物からの0.1mlを接種した。プレートを37℃で翌日までインキュベートした。前述の生成物の芽胞数測定に基づいて、芽胞懸濁液を、最終的に算出される芽胞濃度が108CFU/mlに達するように滅菌蒸留水中で調製した。最終接種材料中の栄養細胞および芽胞の数を、上記の方法を用いて測定した。最終濃度108CFU/mlは、0.2〜0.3の開始OD630に相当していた。
滅菌平底96ウェルマイクロタイタープレートを用いた(グライナー・バイオ・ワン社(Greiner Bio-one GmbH)、ドイツ)。各ウェルを、芽胞(1ml当たり約1×108芽胞、開始OD630約0.2〜0.3と同等/に相当)を接種した0.150mlのVIBで満たし、プレートを、各読取りの前に、強度4(高)の1分間の振盪サイクルにて37℃で20時間インキュベートした。
本研究で用いるバチルス細胞により生産されるアミノ酸を測定および定量する方法は、誘導化剤としてクロロギ酸メチルを用いる、水試料についての標準的なGC−MS法である。
最少塩増殖培地にバチルス細胞を接種して37℃、150rpmで増殖させ、2日間増殖させ、次いで、下記の通りアミノ酸の量を上清中で測定した。
(NH4)2SO4(メルク社 1.01217.1000) 1g/l
K2HPO4(メルク社 1.05101.1000) 7g/l
KH2PO4(メルク社 1.04873.1000) 3g/l
MgSO4・7H2O(メルク社 1.05886.1000) 0.1g/l
アミノ酸アッセイは、アミノ酸が培地に分泌されるため、細胞上清で行う。試料を滅菌濾過し、解析するまで−20℃で保持する。
試薬1:内部標準溶液。ノルバリン 1mM:0.0172gのノルバリン+100mlのMQW
試薬2:メタノール/ピリジン 32/8(v/v)(触媒)
試薬3:クロロギ酸メチル p.a.(MCF)(誘導化剤)
試薬4:1% MCF/CHCl3(v/v)(抽出液):1mlのクロロギ酸メチル p.a.+クロロホルム ad 1000ml。
・150μl(25μl+125μ MQW)の試料を、ピペットで2ml注入バイアルに入れる。
・150μlのISを加える
・200μlの1−メタノール/ピリジン 32/8%(v/v)を加える。よく混合する。
・25μlのMCF(クロロギ酸メチル)を加える。ガス発生が生じるまでよく混合する。
・500μlの1% MCF/CHCl3(v/v)を加え、蓋をして激しく混合する。数分以内に相分離が起きる。相分離が遅すぎる場合は、バイアルを遠心分離する(500rpm/10分)。
出発バチルス細胞は、バチルス・ズブチリス細胞GalliPro(登録商標)であった。
DSM19467は胆汁耐性株であり、GalliPro(登録商標)よりも明らかに急速に発芽および成長している。
出発バチルス細胞は、実施例3で選択したバチルス・ズブチリス細胞DSM19467であった。
必須アミノ酸であるロイシンを参照バチルス細胞DSM19467よりも有意に多い量で生産していた多くの株を選択した。
本実施例から、少なくとも1つの必須アミノ酸(ここではロイシンを例とする)を参照バチルス細胞DSM19467よりも有意に多い量で生産する株を、本明細書中の指示に基づいて、日常的にスクリーニングおよび同定できることがわかる。
実施例4で選択した好ましい必須アミノ酸高生産性バチルス細胞の、実施例1に記載の、発芽および芽胞から栄養細胞への成長を迅速に行う能力を再確認する。
1.Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4
2.米国特許出願公開第2003/0124104(A)号
3.米国特許第6255098号
4.国際出願PCT/EP2008/057296
Claims (12)
- 105〜1012CFU/gのバチルス芽胞細胞を含むバチルス組成物であって、
(i)バチルス芽胞が、4mMの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、及び6mMの胆汁酸塩を含む胆汁酸塩培地の存在下で、それぞれ18時間および19時間未満以内にバチルス芽胞が0.4OD630の栄養細胞増殖点に達すること、と定義される、迅速な発芽および芽胞から栄養細胞への成長を示すこと、
(ここで栄養細胞増殖点とは、OD値が(栄養細胞の増殖によって)連続的に上昇し始め、0.4のOD630に達する、増殖曲線上の点であり、
(I)ここで胆汁酸塩培地は、非選択的子牛インフュージョンブロス(VIB)培地に、抱合型胆汁酸塩であるタウロデオキシコール酸およびグリコデオキシコール酸ならびに脱抱合型胆汁酸塩であるデオキシコール酸を、タウロデオキシコール酸60%、グリコデオキシコール酸30%、およびデオキシコール酸10%の比率で含む胆汁酸塩混合物を添加したものであり、
ここでODアッセイ分析は次の工程により行われる:
(a)マイクロタイタープレート内のウェルを、培地1ml当たり108個のバチルス芽胞を有する0.150mlの胆汁酸塩培地で満たすこと(すなわちこれがゼロ時間である)、および
(b)大気条件下にて37℃でプレートをインキュベートし、各読取りの前に攪拌して分光光度計を用いてOD630値を測定し、典型的な経時的増殖曲線を取得すること)
および
(ii)バチルス栄養細胞が、参照バチルス細胞DSM19467よりも少なくとも2倍以上の量の、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、リジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、およびアルギニンからなる群より選択される少なくとも1の必須アミノ酸を産生しており、ここで産生された必須アミノ酸の量は、上清中で、以下の組成:
(NH4)2SO4 1g/l
K2HPO4 7g/l
KH2PO4 3g/l
MgSO4・7H2O 0.1g/l
を有する最少塩増殖培地であって、121℃で15分間オートクレーブにかけられ、そしてオートクレーブにかけたグルコースを終濃度0.5%となるように加えられた培地10mlを入れたチューブ中で、37℃及び150rpmでバチルス細胞を2日間増殖させた後に、誘導化剤としてメチルクロロギ酸を用いて水性サンプルのアミノ酸アッセイに基づく標準GC−MS方法により、計測される
を特徴とするバチルス組成物。 - 組成物のバチルス芽胞細胞が、乾燥(例えば噴霧乾燥)した芽胞細胞として存在する、請求項1に記載のバチルス組成物。
- バチルス細胞が、B.ズブチリス細胞である、請求項1または2に記載のバチルス組成物。
- バチルス芽胞が、請求項1の項目(i)の条件下で、DSM17231として寄託されている参照バチルス・ズブチリス芽胞細胞よりも少なくとも3時間早く栄養細胞増殖点に達し、この時点が少なくともインキュベーション後少なくとも20時間である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
- 請求項1の項目(ii)のバチルス栄養細胞および参照バチルス細胞DSM19467をともに同一条件下で増殖させた時、該栄養細胞が、参照バチルス細胞DSM19467よりも多い量の目的の化合物を生産している、請求項1〜4のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
- 前記必須アミノ酸が、バリン、イソロイシン及びロイシンからなる群から選ばれる少なくとも1のアミノ酸である、請求項5に記載のバチルス組成物。
- 前記必須アミノ酸がロイシンである、請求項6に記載のバチルス組成物。
- 前記バチルス栄養細胞が、請求項1の項目(ii)条件下で、参照バチルス細胞DSM19467よりも少なくとも4倍以上の量で少なくとも1の必須アミノ酸を産生する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のバチルス組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のバチルス組成物を、他の動物用飼料の材料と併せて動物に投与することを含む、動物への給餌方法。
- 動物が、家禽、反芻動物、子牛、ブタ、ウサギ、ウマ、魚、およびペットからなる群より選択される動物である、請求項9に記載の動物への給餌方法。
- 新規なバチルス細胞をスクリーニングし単離する方法であって、以下の工程:
(a)請求項1の項目(i)の条件下で18時間および19時間未満以内に栄養細胞増殖点に達する程に迅速に発芽および成長することが可能な新たなバチルス芽胞細胞の個々のバチルス芽胞細胞のプールから選択し単離すること;
(b)工程(a)の単離した芽胞細胞から栄養バチルス細胞を作製し、選択し単離した新規な細胞に突然変異を起こして新たな個々のバチルス栄養細胞のプールを得ること;
(c)工程(b)の新たな個々のバチルス栄養細胞のプールから、請求項1の項目(ii)の条件下で、参照バチルス細胞DSM19467よりも多い量の少なくとも1の必須アミノ酸を産生することができる新規のバチル栄養細胞を選択及び単離し;そして
(d)工程(c)の高生産性栄養バチルス細胞を分析して、該細胞が工程(a)の迅速な発芽および成長を維持していることを確認し、選択したバチルス細胞を単離すること;
を含む方法。 - バチルス細胞が、B.ズブチリス細胞である、請求項11に記載の、新規なバチルス細胞をスクリーニングし単離する方法。
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