CN106232133A - 带有淀粉结合蛋白(sbp)标签的免疫刺激蛋白的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明系关于一种在有需要的对象中预防或治疗病毒及原生动物感染的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。本发明亦关于一种在有需要的对象中诱发干扰素‑γ生产的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。本发明进一步关于在有需要的对象中提高饲料摄取量,生长速率或降低饲料转换率的方法,包含:向该对象口服或注射投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。
Description
技术领域
本发明系关于投予来自灵芝属(Ganoderma)物种的免疫刺激蛋白的功效。
发明背景
淀粉结合蛋白(SBP)系一源自米根霉葡萄糖淀粉酶(Rhizopus oryzaeglucoamylase(RoSBD))的结合区域,其为碳水化合物结合模块家族21(carbohydrate-binding module family 21(CBM21))的一员,具有粗淀粉结合活性。SBP可作为亲和标签被良好地应用于融合蛋白工程与大肠杆菌(Escherichia coli)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)***中的纯化。SBP的三种氨基酸序列已被揭露于美国专利号7662918中。
灵芝在中国医药中是一种稀有和珍贵的药草。其已经在中国被发现认识超过5000年以上。有很多种不同的灵芝,包括红色的赤芝(Ganoderma lucidum)、棕色的树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、红色的松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、黑色的紫芝(Ganodermasinense)、及深褐色的海味灵芝(Ganoderma oregonense)。
赤芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst)是一种中国传统的药用真菌,其具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒、抗菌、抑制血小板凝集等及其它功效。已发现赤芝具有抗过敏活性(Chen H.Y et al.,J.Med.Mycol.1992;33:505-512)及保肝作用(Lin J.M.et al.,Am.J.Chin.Med.1993;21(1):59-69)。亦发现纯化自赤芝的免疫调节蛋白(LZ-8)具有抑制全身过敏反应、治疗肝癌及预防糖尿病的功效(Kino K.et al.,J.Biol.Chem.1989;264(1):472-8)。然而,尚未有人发展将LZ-8应用于饲料上。
最近,Yun Cao等人揭露在东亚地区商业化种植的赤芝(被称作灵芝)与真正的赤芝其实是不同的物种,并提出一个灵芝新物种称作灵芝(Ganoderma lingzhi),其系分布于东亚地区(Y.C et.al.,Fungal Diversity.2012;56(1):49-62)。因此,LZ-8应被视为纯化自灵芝(Ganoderma lingzhi)而非赤芝。此外,分离自不同灵芝种类的真菌免疫调节蛋白已显示出具有相似的氨基酸序列和功用(Lin.WH et.al.,J.Biol.Chem.1997;272(32):20044-20048.,Jinn TR,et.al.,Biosci Biotechnol Biochem.2006;70(11):2627-2634.;Huang L et.al.,Proteins.2009;75(2):524-7)。
干扰素(IFN)-γ不仅是TH1CD4、CD8和天然杀伤细胞(NK)的标志,也是一个重要的抗病毒介质,是从中枢神经***(CNS)消灭病毒的核心。干扰素-γ已知与各种抗病毒机制有关,如麻疹病毒(MV)、疱疹单纯型病毒(HSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、及呼吸道融合病毒(Chesler DA,Reiss CS.Cytokine Growth Factor Rev.2002 Dec;13(6):441-54;vanSchaik SM,Obot N,Enhorning G,Hintz K,Gross K,Hancock GE,Stack AM,WelliverRC.J Med Virol.2000 Oct;62(2):257-66)。
球虫病是一种动物肠道的寄生虫病,由原生动物球虫所引起。该疾病藉由接触受感染的粪便或摄食受感染的组织在动物之间传播。腹泻是主要的症状,在严重的情况下可能会演变成出血。大多数受到球虫感染的动物都是无症状的,但是年幼或免疫能力受损的的动物可能会遭受严重的症状和死亡。虽然球虫可感染的动物范围很广,包括人类、鸟类、和家畜,但是他们通常具有物种专一性。在家禽中,大多数的球虫病系由属于艾美耳球虫属(Eimeria)的物种引起并感染肠道中的不同位置。球虫病在乳猪中是相当常见普遍的,通常由包括艾美耳球虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、及隐孢子虫属(Cryptosporidia)的三种属类所引起。
美国专利号8163519揭露真菌免疫调节蛋白(FIP)保护石斑鱼免于虹彩病毒或哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染,然而其系透过腹膜内注射FIP或喂食包含FIP的酵母菌。美国专利号8163519亦揭露在Der p刺激的小鼠中FIP会减少干扰素-γ,证实了FIP可作用来抑制过敏反应。虽然美国专利号8163519亦揭露「来自未喂食FIP的Balb/c小鼠或来自Derp刺激小鼠的脾细胞如果以FIP重新刺激,会产生比对照组更多的IFN-r(463.8及1100.7)」,应注意到FIP系在体外(in vitro)直接刺激脾细胞,这意味着当在体内(in vivo)投予FIP时,该效果可能不存在。因此,需要更多的实验来证实FIP与干扰素-γ在体内(in vivo)的相关性。
Lin等人(An immunomodulatory protein,Ling Zhi-8,induced activation andmaturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB andMAPK pathways;J Leukoc Biol.2009Oct;86(4):877-89)研究注射LZ-8在BALB/c小鼠中的免疫调节效果,结果显示IFN-γ上升。然而,当口服投予LZ-8时该效果可能不存在,因为消化道中复杂的化学反应可以改变LZ-8的结构。因此,口服投予LZ-8的效果并无法藉由注射的结果来轻易预期。仍需要更进一步的实验来证实当口服投予LZ-8时LZ-8与干扰素-γ的相关性。
发明内容
本发明藉由体内(in vivo)实验探究灵芝属物种免疫刺激蛋白LZ-8的投予功效,并检验LZ-8在营养物质利用及/或免疫***上可能的机制。投予LZ-8与病毒或原生动物感染的相关性亦被研究。
除非另外特别界定,否则本文中所用之术语将具有一般熟习此项技术者通常所理解之含义。如本申请所用之以下术语应具有以下含义:
术语“μg/kg BW/天”系指“微克/每天每公斤体重”。
术语“淀粉结合蛋白(SBP)”系指具有淀粉结合活性的结合蛋白。
术语“生长速率”系指在特定周期和背景下一特定变量所得到的增加量。在本发明中,该特定变量可为重量,体积或尺寸。
术语“饲料转换率(FCR)”系一种度量法,测量动物将饲料质量转换为增加所需产出的效率。例如,对于乳用母牛来说,该产出系牛奶,而对于作为肉食来源被豢养的动物如肉牛、猪、鸡、及鱼来说,该产出系动物所获得的质量。
术语“食物”系指可以口服使用的所有产品,例如食物、饮料、药物、营养补充品及动物饲料。
术语“免疫刺激蛋白”系指会在对象中加强免疫反应的蛋白。
本发明提供一种在有需要的对象中诱发干扰素-γ生产的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。同样的,本发明提供一种组合物在制备用于诱发干扰素-γ生产的医药品、食品或饲料产品的用途,其中该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。较佳地,该灵芝属物种系选自灵芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、松杉灵芝(Ganodermatsugae)、紫芝(Ganoderma sinense)、或海味灵芝(Ganoderma oregonense)。较佳地,该免疫刺激蛋白系LZ-8。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白系藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。在一较佳实施例中,该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。较佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kg BW/天。在一较佳实施例中,该淀粉结合蛋白(SBP)系由SEQ IDNO:3之氨基酸序列所组成;该LZ-8系由SEQ ID NO:4之氨基酸序列所组成。在一较佳实施例中,该对象系一哺乳动物、鸟、鱼或虾。在一实施例中,上述方法在该对象中加强了对病毒及原生动物的抵抗力。
本发明亦提供一种在有需要的对象中提高饲料摄取量,增加生长速率或降低饲料转换率的方法,包含:向该对象口服或注射投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。同样的,本发明提供一种组合物在制备用于提高饲料摄取量,增加生长速率或降低饲料转换率的医药品、食品或饲料产品的用途,其中该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。较佳地,该灵芝属物种系选自灵芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganodermasinense)、或海味灵芝(Ganoderma oregonense)。较佳地,该免疫刺激蛋白系LZ-8。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白系藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。在一较佳实施例中,该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。较佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kgBW/天。在一较佳实施例中,该淀粉结合蛋白(SBP)系由SEQ ID NO:3之氨基酸序列所组成;该LZ-8系由SEQ ID NO:4之氨基酸序列所组成。在一较佳实施例中,该对象系一哺乳动物、鸟、鱼或虾。
本发明进一步提供一种在有需要的对象中预防或治疗病毒及原生动物感染的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。同样的,本发明提供一种组合物在制备用于预防或治疗病毒及原生动物感染的医药品、食品或饲料产品的用途,其中该组合物包含一复合物,该复合物系由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白系来自灵芝属(Ganoderma)物种。较佳地,该灵芝属物种系选自灵芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、树舌灵芝(Ganoderma applanatum)、松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganoderma sinense)、或海味灵芝(Ganodermaoregonense)。较佳地,该免疫刺激蛋白系LZ-8。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白系藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。在一较佳实施例中,该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。在一较佳实施例中,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。较佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kg BW/天。在一较佳实施例中,该淀粉结合蛋白(SBP)系由SEQ ID NO:3之氨基酸序列所组成;该LZ-8系由SEQ ID NO:4之氨基酸序列所组成。在一较佳实施例中,该对象系一哺乳动物、鸟、鱼或虾。在一较佳实施例中,该病毒感染系藉由选自由新城疫病毒(Newcastle disease virus)、家禽传染性支气管炎病毒、马立克病病毒(Marek's disease virus)、禽流感病毒、猪环状病毒、猪霍乱病毒(hogcholera virus)、猪流感病毒、及赖利斯德病毒(Lelystad virus)所组成群组之病毒。较佳地,该病毒感染系藉由选自由新城疫病毒、家禽里奥病毒(avian reovirus)、及猪环状病毒所组成群组之病毒。在一较佳实施例中,该原生动物感染系球虫病。较佳地,该球虫病系由选自艾美耳球虫属(Eimeria)物种的球虫原生动物所引起。更佳地,该艾美耳球虫属物种系柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)。
附图简述
图1A-1C显示在鸡只中口服SBP-LZ-8对新城疫病毒(NDV)感染的效果。图1A:1xLD50;图1B:10xLD50;图1C:100xLD50。
图2A-2C显示在鸡只中口服SBP-LZ-8对家禽里奥病毒(ARV)感染的效果。图2A:1xLD50;图2B:10xLD50;图2C:100xLD50。
图3显示在鸡只中口服SBP-LZ-8对禽球虫感染的效果。
实施例
下列实施例并非作为限制而仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例1:LZ-8蛋白的制备
SBP-LZ-8蛋白的建构与表达
将SBP基因(SEQ ID NO:1)以PCR扩增并融合至LZ-8的C端。LZ-8的DNA序列系SEQID NO:2。将该融合的SBP-LZ-8蛋白基因在AOX1启动子的控制下克隆进巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA(购自Invitrogen)并转化进巴斯德毕赤酵母X33(购自Invitrogen)。将带有SBP-LZ-8基因的巴斯德毕赤酵母转化株于BMGY培养基(100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0),1%甘油,1%酵母菌萃取物,2%蛋白胨)中培养24小时。离心回收细胞并将其重新悬浮于BMMY培养基(100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0),0.5%甲醇,1%酵母菌萃取物,2%蛋白胨)中。每24小时加入甲醇(0.5%v/v)以诱导SBP-LZ-8表达。诱导3天后,离心将细胞移除并收集无细胞发酵液以SDS-PAGE分析。
SBP-LZ-8的发酵及纯化
将表达SBP-LZ-8的转化株接种于300ml YPD(1%酵母菌萃取物,2%蛋白胨及2%葡萄糖)中于30℃培养24小时。将300ml的菌种培养物注入含有40L FBS培养基[26.7ml/lH3PO4(85%)、0.93g/l CaSO4、18.2g/l K2SO4、14.9g/l MgSO4·7H2O、4.13g/l KOH,并用NH4OH调整至pH 5.0],并添加PTM1微量盐类(6g/l CuSO4·5H2O、0.08g/l KI、3g/l MgSO4·H2O、0.2g/l Na2MoO4、0.02g/l H3BO3、0.5g/l CoCl2、20g/l ZnCl2、65g/l FeSO4·7H2O、0.2g/l生物素、及5ml H2SO4)及3%甘油的100L发酵槽进行批式发酵约24小时,直到甘油被耗尽之后溶氧(DO)的快速增加。接着甘油馈料批式培养24小时,在馈料批式进程结束时OD600增加到超过500,之后添加甲醇以诱导SBP-LZ-8的表达并持续4天。在无细胞的发酵上清液中加入适量的淀粉以藉由淀粉与SBP标签之间的特异性吸附作用来纯化SBP-LZ-8。回收结合SBP-LZ-8的淀粉并干燥。可用10mM甘氨酸盐酸盐缓冲液(pH 11.0)从淀粉冲提出SBP-LZ-8,使用BCA法(Pierce)作蛋白质浓度定量。SBP-LZ-8系SBP(SEQ ID NO:3)与LZ-8(SEQ ID NO:4)的融合蛋白,其维持了LZ-8的活性并被使用于下列的实例中。
实施例2:LZ-8对离乳仔猪生长表现的影响
材料与方法
本试验在财团法人台湾动物科技研究所的实验猪场中进行。该猪场除部分字段、猪只供试验使用外,其它仍维持商业操作。因此,试验猪只的饲养环境、管理条件与其它生产用猪只一致。
动物及处理
选取杂交猪36头(平均体重7.8kg),随机分为3组,每组3栏、每栏4头猪:(1)对照组(无添加SBP-LZ-8)、(2)低剂量SBP-LZ-8组(每天100μg/kg BW)、及(3)高剂量SBP-LZ-8组(每天600μg/kg BW)。喂食猪只添加有抗生素的饲料历时28天。饲料配方及营养成分列于表1中。
表1.试验饲料的化合物与营养成分
(1)在一吨饲料中加入STP-500(1.2kg)及卡巴多司(Carbadox)(0.5kg)。
测定
在试验开始及结束时将猪只个别称重。纪录每栏的体重及饲料采食量以计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、及饲料转换率(FCR,ADFI/ADG)。
于第14天及第28天,每栏取一公一母猪只采血以测定葡萄糖、尿素氮(BUN)、三酸甘油脂(Kodak Ektachem DT-II System,Rochester,NY)、及干扰素-γ(ELISA kit,Invitrogen,CA)浓度。
统计
将数据以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生长参数时使用栏作为实验单位,在分析血液参数时则使用猪作为实验单位。
结果
存活率
本试验中的饲料添加有抗生素(STP-500及Carbadox)。试验过程中,没有猪只死亡或被淘汰。所以,本试验无法确定SBP-LZ-8对仔猪存活率的影响(表2)。
表2.饲料添加SBP-LZ-8对离乳仔猪生长表现与存活率的影响
N=3(每组3栏,每栏4头。试验期间为4周。)(*P<0.05)
生长表现
根据仔猪的日采食量来设计饲料中添加的SBP-LZ-8量,使仔猪SBP-LZ-8的摄取量维持在100μg/kg BW或600μg/kg BW。
饲料中添加SBP-LZ-8能促进仔猪日增重,效果以摄取量在100μg/kg BW时(+13.2%,表2)达显著差异(P<0.05)。虽然统计无显著差异(P>0.05),SBP-LZ-8 100μg/kg BW摄取量亦能使日采食量增加9.8%,并改善饲料转换率3%。SBP-LZ-8 600μg/kg BW摄取量的效果不如100μg/kg BW摄取量,但在日增重(+4.7%)及日采食量(+3.8%)可观查到部分改善效果。高剂量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)可能过度刺激了免疫***,造成能量与蛋白质的浪费,所以对于生长表现的效果反而不如低剂量的SBP-LZ-8(100μg/kg BW)显著。本试验发现在饲料中应用抗生素的同时,添加SBP-LZ-8(100μg/kg BW)能显著促进仔猪生长表现,包括采食量,生长率、及饲料利用率的提升。
试验结束时,喂食有SBP-LZ-8(100μg/kg BW)的猪只体重较对照组高1.6kg(P<0.05),而高剂量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)则只使体重多增加了0.6kg。
血液参数
各组猪只在第14天及第28天的葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂浓度没有显著差异(表3)。喂食有SBP-LZ-8(100μg/kg BW)的猪只组则倾向有比对照组略高的葡萄糖浓度(P<0.1)。
表3.饲料添加SBP-LZ-8对离乳仔猪血液参数的影响
(*P<0.05,**P<0.01)
对于干扰素-γ来说,饲料中添加SBP-LZ-8会刺激干扰素-γ的生产(表3)。在喂食SBP-LZ-814天后,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干扰素-γ的浓度增加了103%(P<0.05),而600μg/kg BW的SBP-LZ-8也有相似的效果,使干扰素-γ的浓度比对照组增加了120%(P<0.01)。在第28天,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干扰素-γ的浓度增加了62%(P>0.05),而高剂量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)对干扰素-γ也维持了相同的效果,使干扰素-γ的浓度比对照组增加了150%(P<0.01)。由此可见,高剂量的SBP-LZ-8可以延长对干扰素γ的影响。
结果显示,饲料中添加SBP-LZ-8有利于离乳猪的生长表现。SBP-LZ-8对生长的作用与消化和吸收无关,因为葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂皆无发现明显变化。至于提高离乳仔猪的生长表现,100μg/kg BW剂量的SBP-LZ-8比600μg/kg BW的高剂量有更好的效果。
实施例3:LZ-8对离乳仔猪生长表现的影响(无抗生素)
材料与方法
本试验在财团法人台湾动物科技研究所的实验猪场中进行。该猪场除部分字段、猪只供试验使用外,其它仍维持商业操作。因此,试验猪只的饲养环境、管理条件与其它生产用猪只一致。
动物及处理
选取离乳仔猪80头(平均体重8.0kg),随机分为4组,每组5栏、每栏4头猪:(1)正对照组(有添加抗生素STP-500及Carbadox)、(2)负对照组(无添加抗生素)、(3)低剂量SBP-LZ-8(每天50μg/kg BW)且无抗生素组、及(4)高剂量SBP-LZ-8(每天100μg/kg BW)且无抗生素组。喂食猪只饲料历时28天。饲料配方及营养成分列于表4中。
表4.试验饲料的化合物与营养成分
(1)只在正对照组的一吨饲料中有加入STP-500(1.2kg)及卡巴多司(Carbadox)(0.5kg)。
测定
在试验开始及结束时将猪只个别称重。纪录每栏的体重及饲料采食量以计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、及饲料转换率(FCR,ADFI/ADG)。
于第14天及第28天,每栏取一公一母猪只采血以测定葡萄糖、尿素氮(BUN)、三酸甘油脂(Kodak Ektachem DT-II System,Rochester,NY)、及干扰素-γ(ELISA kit,Invitrogen,CA)浓度。
统计
将数据以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生长参数时使用栏作为实验单位,在分析血液参数时则使用猪作为实验单位。
结果
存活率
存活率约90-95%。饲料中有无抗生素或SBP-LZ-8对离乳仔猪的存活率并无影响(表5)。
表5.饲料添加SBP-LZ-8对离乳仔猪生长表现与存活率的影响
N=5(每组5栏,每栏4头。试验期间为5周。)
抗生素为STP-500及卡巴多司(Carbadox)(a vs.b,P<0.05;a vs.c,P<0.001;bvs.c,P<0.05)
生长表现
与正对照组相比,以无抗生素的饲料喂食的猪只有较低的日增重(-22.5%,P<0.001)、日采食量(-19.1%,P<0.05)、及较高的饲料转换率(+4.4%,P<0.05)。
在饲料无抗生素的情况下,添加50μg/kg BW的SBP-LZ-8对生长表现没有影响。100μg/kg BW的SBP-LZ-8则使日增重与负对照组比相比增加了13.5%(P<0.05)。虽然SBP-LZ-8组的日增重及日采食量表现没有正对照组佳,但是SBP-LZ-8组的饲料转换率却表现较好(-3.8%,P<0.05)。因此,在没有添加抗生素的情况下,SBP-LZ-8可改善离乳仔猪的生长表现(包括提高日增重和降低饲料转换率)的。
血液参数
各组猪只在第14天及第28天的葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂浓度没有显著差异(表6)。
表6.饲料添加SBP-LZ-8对离乳仔猪血液参数的影响
(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)
在干扰素-γ浓度方面,无抗生素添加组(负对照组、SBP-LZ-8 50μg/kg BW组)的干扰素-γ浓度与正对照组相近(P>0.05)。然而,100μg/kg BW的SBP-LZ-8有刺激干扰素-γ生成的效果(表6)。在喂饲100μg/kg BW的SBP-LZ-8历时14天后,干扰素-γ的浓度提高了40%(P<0.01)。而在第28天,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干扰素-γ的浓度提高了32%(P<0.05)。因此,在喂食无抗生素饲料的情况下,长期喂饲SBP-LZ-8能促进干扰素-γ生成或分泌。
结果显示,喂食无抗生素饲料的猪只有较低的生长表现。添加SBP-LZ-8到无抗生素饲料中则会提升生长表现。SBP-LZ-8的作用与营养代谢无关,因为葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂皆不被影响。本试验中发现在不添加抗生素的情况下,给予100μg/kg BW剂量的SBP-LZ-8能有利离乳仔猪的生长表现。
实施例4:LZ-8对离乳仔猪生长表现及猪第二型环状病毒(PCV2)抗体效价的影响
猪第二型环状病毒(PCV2)是一种非常小的DNA病毒,会特异性地感染猪只。本实验系探讨在商业操作的环境中添加SBP-LZ-8的饲料对感染PCV2的离乳仔猪的生长表现和存活率的影响,以检验添加SBP-LZ-8是否有利于猪只生产。
材料与方法
本试验在台湾云林县的一个每年销售有2000只猪的商业养殖场中进行。已知几乎所有台湾的猪场皆感染有PCV2。将买来的猪在适应期间测试其PCV2抗体效价。挑选具有PCV2抗体的猪只(被认为已感染)来进行本实验。在一星期的适应期后,选出200只离乳仔猪(购自附近的商业养殖场)用于进行实验。
动物及处理
将猪只(平均体重10.4kg)随机分为对照组及SBP-LZ-8组(每天100μg/kg BW),每组5栏(每栏20头猪)。喂食猪只市售的离乳饲料(添加有抗生素)28天,接着再喂食生长猪饲料(grower diet)28天。试验期间为56天。饲料的营养成分列于表7中。
表7.试验饲料的营养成分
测定
在每阶段开始及结束时将同一栏的猪只群体称重。纪录每栏的体重及饲料采食量以计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、及饲料转换率(FCR,ADFI/ADG)。
于第28天及第56天,每栏取10只猪采血以测定干扰素-γ的浓度。
统计
将数据以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生长参数时使用栏作为实验单位,在分析血液参数时则使用猪作为实验单位。
结果
生长表现及存活率
在第一阶段期间(第1-28天),添加SBP-LZ-8使日采食量增加5.4%且日增重亦增加了7.3%。然而,在对照组与实验组之间的差异并不显著(P>0.05)。死亡或自试验淘汰的猪只数目在对照组中(14只)高于实验组(6只)。因此,在饲料中添加SBP-LZ-8使离乳仔猪的存活率增加了8%。
表8.SBP-LZ-8对商业养殖场中离乳仔猪的生长表现及存活率的影响
N=5(每组5栏,每栏20头。试验期间为8周。)(*P<0.05)
在第二阶段期间(第29-56天),添加SBP-LZ-8使日采食量增加7.2%(P>0.05)且日增重亦增加了9.6%(P<0.05)。SBP-LZ-8的添加也稍微减少了饲料转换率,虽然在对照组与实验组之间的差异并不显著。与第一阶段相比,死亡或自试验淘汰的猪只数目在第二阶段中较少。实验组与对照组相比仍维持了较佳的存活率(表8)。
因此,在离乳饲料及生长猪饲料中添加SBP-LZ-8历时56天增进了饲料采食量并使最终体重增加了1.77kg(P<0.05)。添加SBP-LZ-8有较高的存活率表示SBP-LZ-8可有效治疗PCV2,亦表示可出售更多的猪只并节省成本。
血液参数
在喂饲56天后,干扰素-γ的浓度在SBP-LZ-8组中显著较高(P<0.05)(表9)。
表9.SBP-LZ-8对商业养殖场中离乳仔猪的血液参数的影响
(*P<0.05)
实施例5:口服SBP-LZ-8在鸡只中对新城疫病毒(NDV)感染的影响
将SBP-LZ-8添加到无抗生素的市售饲料中并使其浓度为100μg/kg BW,以该饲料喂饲鸡只一星期,然后注射1xLD50、10xLD50、或100xLD50NDV Sato来攻毒。结果显示于表10及图1A-1C。在高剂量(10-100xLD50)NDV攻毒下,虽然在第7天于有或没有SBP-LZ-8的组别都观察到100%的死亡率,但SBP-LZ-8的添加确实延缓了疾病的发作。在经1xLD50 NDV攻毒后,喂饲SBP-LZ-8的鸡只中没有观察到死亡。在没有SBP-LZ-8的组别中,经1xLD50 NDV攻毒后,在第3天观察到10%的死亡率,第4天观察到30%的死亡率,第7天观察到50%的死亡率。该结果表示在低剂量攻毒(1xLD50 NDV)下,口服投予SBP-LZ-8能够预防NDV感染造成的死亡,而对照组在第7天导致了50%的死亡率。在这些实验进行前已经确认鸡只并无NDV抗体反应(HI<2)。因此,SBP-LZ-8展现了抗NDV的活性,包括延缓疾病发作以及减少死亡率。
表10.
实施例6:口服SBP-LZ-8在鸡只中对家禽里奥病毒(ARV)感染的影响
将SBP-LZ-8添加到无抗生素的市售饲料中并使其浓度为100μg/kg BW,以该饲料喂饲鸡只一星期,然后经由足垫注射103(1xLD50)、104(10xLD50)、或105(100xLD50)TCID50ARV 1733来攻毒。结果显示于表11及图2A-2C。当使用105ARV攻毒时,于有或没有SBP-LZ-8的组别都在第8天开始观察到疾病症状,如关节肿胀和跛行,而100%的鸡只都在第11天表现出症状。当使用104ARV攻毒时,于有或没有SBP-LZ-8的组别都在第7-8天开始观察到疾病症状,如关节肿胀和跛行,而在第13天时,SBP-LZ-8组中的100%的鸡只都表现出症状,对照组中则有90%表现出症状。当使用103ARV攻毒时,于第14天在SBP-LZ-8组中并没有观察到如关节肿胀和跛行的疾病症状,至于对照组则是在第8天有10%的鸡只表现出临床症状,且在第11天有100%的鸡只表现出症状。这些结果表示SBP-LZ-8对低剂量ARV攻毒提供了完全的保护,但对于高剂量攻毒的保护效果则不显著。
表11.
实施例7:口服SBP-LZ-8在鸡只中对禽球虫病(avian coccidia)感染的影响
将SBP-LZ-8添加到无抗生素的市售饲料中并使其浓度为100μg/kg BW,以该饲料喂饲鸡只一星期,然后经由口服10,000个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)卵囊来攻毒。结果显示于表12及图3。在有SBP-LZ-8的组别中,于攻毒后的第7天观察到20%死亡率,直到第20天都是一样。在没有SBP-LZ-8的组别中,于攻毒后的第6天观察到20%死亡率、第8天观察到40%死亡率、以及第20天观察到55%死亡率。该结果表示口服投予SBP-LZ-8显著地延缓疾病发作并减少死亡率。
表12.
实施例8:口服投予SBP-LZ-8的抗病毒活性
在一个非正式的田间试验中,向20000只生长在禽流感病毒流行区的产蛋鸡投予SBP-LZ-8。在禽流感病毒流行季节,饲料里没有添加SBP-LZ-8的情况下,蛋的产量显著减少了30%。以含有SBP-LZ-8(浓度为100μg/kg BW)的饲料喂饲产蛋鸡,在投予SBP-LZ-8 3~7天之后,产蛋率恢复到正常水平。
在另一实验中,2000只感染马立克病(Marek's Disease)的产蛋鸡被喂饲以含有SBP-LZ-8(浓度为100μg/kg BW)的饲料,而另外2000只感染马立克病(Marek's Disease)的产蛋鸡则被喂饲以不含SBP-LZ-8的饲料。在不含SBP-LZ-8的饲料组中有超过300只鸡于生长期死亡,而在喂饲SBP-LZ-8的组中死亡的鸡只少于20只。
在有2000只生长肥育猪的农场进行SBP-LZ-8试验。改场原先买来的离乳仔猪因为免疫问题,死亡率为15%,且存活下来的猪体重增加缓慢。在喂饲SBP-LZ-8(浓度为100μg/kg BW)1个月后,死亡率减少到6%,并且在存活的健康猪只中观察到较佳的生长表现。
根据这些数据,可推测出口服投予SBP-LZ-8可刺激IFN-γ产生,从而促进动物的病毒抗性。
一个熟知此领域技艺者能很快体会到本发明可很容易达成目标,并获得所提到之结果及优点,以及那些存在于其中的东西。本发明中之组合物、其制造程序与方法乃较佳实施例的代表,其为示范性且不仅局限于本发明领域。熟知此技艺者将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中,并在申请专利范围中界定。
本发明的内容叙述与实施例均揭示详细,得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明,即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处,仍应视为不脱离本发明之精神及范围。
说明书中提及之所有专利及出版品,都以和发明有关领域之一般技艺为准。所有专利和出版品都在此被纳入相同的参考程度,就如同每一个个别出版品都被具体且个别地指出纳入参考。
在此所适当地举例说明之发明,可能得以在缺乏任何要件,或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书之描述而非限制,同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明之特点或其部份之名词及表达,但需认清的是,在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此,应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明,但是熟知此技艺者仍会修改和改变其中所揭示的内容,诸如此类的修改和变化仍在本发明之申请专利范围内。
Claims (41)
1.一种在有需要的对象中治疗病毒及原生动物感染的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白来自灵芝属(Ganoderma)物种。
2.如权利要求1所述的方法,其中该灵芝属物种选自灵芝(G.lingzhi)、赤芝(G.lucidum)、树舌灵芝(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫芝(G.sinense)、或海味灵芝(G.oregonense)。
3.如权利要求1所述的方法,其中该免疫刺激蛋白是LZ-8。
4.如权利要求1所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白是藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。
5.如权利要求1所述的方法,其中该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。
6.如权利要求1所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。
7.如权利要求6所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。
8.如权利要求7所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kgBW/天。
9.如权利要求1所述的方法,其中该淀粉结合蛋白(SBP)由SEQ ID NO:3的氨基酸序列所组成。
10.如权利要求3所述的方法,其中该LZ-8由SEQ ID NO:4的氨基酸序列所组成。
11.如权利要求1所述的方法,其中该对象是鸟、鱼或虾。
12.如权利要求1所述的方法,其中该对象是哺乳动物。
13.如权利要求1所述的方法,其中该病毒感染是藉由选自由新城疫病毒、家禽里奥病毒、家禽传染性支气管炎病毒、马立克病病毒、禽流感病毒、猪环状病毒、猪霍乱病毒、猪流感病毒、及赖利斯德病毒所组成群组的病毒。
14.如权利要求13所述的方法,其中该病毒感染是藉由选自由新城疫病毒、家禽里奥病毒、及猪环状病毒所组成群组的病毒。
15.如权利要求1所述的方法,其中该原生动物感染是球虫病。
16.如权利要求15所述的方法,其中该球虫病是由选自艾美耳球虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、及隐孢子虫属(Cryptosporidia)物种的球虫原生动物所引起。
17.如权利要求16所述的方法,其中该艾美耳球虫属物种是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)。
18.一种在有需要的对象中诱发干扰素-γ生产的方法,包含:向该对象口服投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白来自灵芝属(Ganoderma)物种。
19.如权利要求18所述的方法,其中该灵芝属物种选自灵芝(G.lingzhi)、赤芝(G.lucidum)、树舌灵芝(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫芝(G.sinense)、或海味灵芝(G.oregonense)。
20.如权利要求18所述的方法,其中该免疫刺激蛋白是LZ-8。
21.如权利要求18所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白是藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。
22.如权利要求18所述的方法,其中该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。
23.如权利要求18所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。
24.如权利要求23所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。
25.如权利要求24所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kgBW/天。
26.如权利要求18所述的方法,其中该淀粉结合蛋白(SBP)由SEQ ID NO:3的氨基酸序列所组成。
27.如权利要求20所述的方法,其中该LZ-8由SEQ ID NO:4的氨基酸序列所组成。
28.如权利要求18所述的方法,其中该对象是鸟、鱼或虾。
29.如权利要求18所述的方法,其中该对象是哺乳动物。
30.一种在有需要的对象中提高饲料摄取量,增加生长速率或降低饲料转换率的方法,包含:向该对象口服或注射投予一有效量的组合物,该组合物包含一复合物,该复合物由一带有淀粉结合蛋白(SBP)标签的免疫刺激蛋白及一SBP结合基质所组成,其中该免疫刺激蛋白来自灵芝属(Ganoderma)物种。
31.如权利要求30所述的方法,其中该灵芝属物种选自灵芝(G.lingzhi)、赤芝(G.lucidum)、树舌灵芝(G.applanatum)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫芝(G.sinense)、或海味灵芝(G.oregonense)。
32.如权利要求30所述的方法,其中该免疫刺激蛋白是LZ-8。
33.如权利要求30所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白是藉由将一淀粉结合蛋白与一免疫刺激蛋白融合来提供。
34.如权利要求30所述的方法,其中该SBP结合基质系选自淀粉、藻酸盐、支链淀粉、糊精树脂、或直链淀粉树脂。
35.如权利要求30所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。
36.如权利要求35所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量范围为50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。
37.如权利要求36所述的方法,其中该带有SBP标签的免疫刺激蛋白的剂量为100μg/kgBW/天。
38.如权利要求30所述的方法,其中该淀粉结合蛋白(SBP)由SEQ ID NO:3的氨基酸序列所组成。
39.如权利要求32所述的方法,其中该LZ-8由SEQ ID NO:4的氨基酸序列所组成。
40.如权利要求30所述的方法,其中该对象是鸟、鱼或虾。
41.如权利要求30所述的方法,其中该对象是哺乳动物。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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