CN1638782A - 抗白斑综合征病毒igy - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗虾白斑病毒的卵黄抗体，更具体地说，涉及一种经过虾白斑病毒或其蛋白注射而被免疫的动物所产的蛋，一种分离自这种蛋的卵黄抗体，以及一种包括所述卵黄抗体的用于控制虾白斑病毒感染的组合物。本发明所述的抗虾病毒的卵黄抗体作用于虾白斑病毒抑制其感染，因而可用作防止虾病毒感染的药物。

Description

抗白斑综合征病毒IGY

技术领域

本发明涉及一种抗虾白斑病毒卵黄抗体，更具体地说，涉及从经过注射虾白斑病毒或其蛋白而被免疫的蛋鸡产的蛋中获取的卵黄抗体。

背景技术

随着虾养殖技术的建立，以斑节对虾(Penaeus mondon)为主的虾养殖业在许多国家蓬勃开展起来，包括泰国、中国、墨西哥、巴西等。但是，自从虾感染症状的危害被报道以来，现在已经认识到这是虾养殖业中的严重问题。

就虾感染症状而言，有病原性细菌的弧菌病(vibrio disease)和病原性病毒的杆状病毒(baculoviral)感染症状等。特别是，起初发生于亚州地区的虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)已经逐渐被认为是迄今最致命的虾疾病。最近报道称这种病毒正向拉丁美洲及美国扩散。

Lightner博士(Arizona University，US)于1999年年初在位于中美洲太平洋海岸的虾养殖场中鉴定出白斑病毒，并将其通知了国际动物流行病办公室(Office Internationale des Epizooties，O.I.E)。在过去6～7年间，这种病毒对亚州国家的虾养殖业造成了严重的破坏，其致死力极强，在爆发期间能够导致水产养殖场中90％以上的虾死亡。在韩国，自1993年该病毒首次报道以后，危害逐年增强，到1996年时达到高峰，1996年后情况趋于稳定。但是，白斑病毒仍然是虾养殖业中最严重的障碍。

被虾白斑病毒感染的虾壳上出现0.5～2.0mm的白斑。这种白斑是由于钙盐的沉积而形成的。这些白斑起初出现于腹部5和6壳节(shell segment)和壳，随后扩散至全身的壳，并且由于肉质结合松散而易于分离。由于载色体的扩散，感染后的虾呈粉色或红棕色，而且近乎100％会在症状首次出现后3～10天内死亡。

作为控制虾感染症状的方法，抗生素通常用于抵抗包括弧菌病的细菌感染症状。但是最近，由于抗生素的广泛使用，抗药性细菌的出现成为一大难题，此外，施用抗生素并不能保证充分的控制效果。另外，由于还没有开发出任何针对病毒感染的有效药物，因此，可以说还没有有效的控制手段。

哺乳动物如家养动物和人，已经采用了控制病毒感染的主动免疫。主动免疫是指一种借助抗病原体的相应抗体的功效来抵御感染症状的免疫功能，这些抗体是通过向人、家养动物等物种施用病原体，如灭活或减毒的病毒、细菌等，激发的自身-免疫能力而产生的。在养殖地区，为了控制感染而开展的主动免疫研究进展良好。在日本(专利公报No.56-53286，专利公报No.56-53287，专利未决公开No.58-50026)，基于对养殖鱼类的弧菌病的研究，用于鱼类养殖的主动免疫已经投入使用。

已知无脊椎动物，例如虾，不存在任何特异性的使用抗体的免疫功能，但是已公开了可以通过用虾弧菌(vibrio Penaeus)灭活的生物质来促进虾血细胞功能的活性增殖从而达到控制弧菌病感染的效果(未决公开日本专利No.3-204820)。无脊椎动物的免疫被认为是由通过血细胞的增殖的体内防御功能提供的，而并非通过使用抗体的特异性免疫功能，但是还没有任何有关其详细机制的研究。

作为抗虾感染症状的控制方法，被动免疫也已受到了关注。通过向家养动物如禽类，而不是虾，施用病原体，得到相应的抗体，然后用该抗体控制虾感染，从而产生被动免疫。用产蛋母鸡的卵黄抗体实现被动免疫的已知实例有：防止由于链球菌变体(Streptococcus mutans)菌株吸附到牙齿导致龋齿的发生(J.Dent，Res.，70，162-166，1991)，防止由于轮状病毒(rotaviral)吸附到肠上皮细胞导致的轮状病毒腹泄的发生(Microbiol.Immunol.，34，617-629，1990)，等等这些都已经公开。

在鱼类养殖区，防止黄狮鱼(yellow tail)感染杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)，防止比目鱼(flatfish)的弧菌病等，都是被动免疫的已知实例。使用抗体对鱼类抗感染进行被动免疫的效果已有公开(未决公开日本专利No.1-168246)。但是，无脊椎动物的体内防御机制明显不同于脊椎动物的免疫机制，现在还没有关于利用被动免疫控制无脊椎动物如虾感染的任何具体文献。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种抗虾白斑病毒的控制方法。

本发明的另一目的是提供一种使用抗虾白斑病毒抗体的控制方法。

本发明的另一目的是提供一种抗虾白斑病毒的卵黄抗体。

本发明的另一目的是提供一种控制虾感染症状的组合物，其中含有抗虾白斑病毒的卵黄抗体。

为了解决这些技术任务，本发明提供了一种动物产的蛋，该动物通过施用虾白斑病毒或其蛋白而被免疫。

另外，本发明提供了一种由蛋中分离的抗虾白斑病毒的抗体。

另外，本发明提供了一种包括蛋的抗虾白斑病毒的组合物。

另外，本发明提供了一种抗虾白斑病毒的控制方法，该方法包括：(a)通过向动物施用虾白斑病毒抗原使动物被免疫；以及(b)向虾施用抗虾白斑病毒抗体，该抗体获自经过免疫的动物。

具体实施方式

本发明人制备了抗虾白斑病毒的抗体，并且开发了一种使用该抗体控制虾白斑病毒的组合物。

本发明的抗体具有针对虾白斑病毒的特异性结合活性。更优选地，所述抗体为针对虾白斑病毒、VP24、VP26或VP18蛋白具有特异性结合活性的蛋白质。

本发明的抗体是用经过免疫的动物所产的蛋制备的，该动物被施用了虾白斑病毒抗原从而被免疫。所述动物优选为禽类，例如鸡、鸭、火鸡等，最优选为蛋鸡。通过向动物注射抗原从而使动物被免疫，来得到含抗体的蛋。该操作相关领域的普通技术人员很容易就可完成。

例如，可以通过下列方式向动物注射抗原：肌内注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射或经口给药，优选肌内注射。抗原的注射量为10μg～1mg抗原蛋白量，更优选，根据动物身体状况或其他情况施用不同的量。此外，反复施用抗原直至抗体量达到最大值。蛋黄中特异性抗体(针对相应抗原具有特异性结合活性的抗体)量的变化采用免疫测定等方法测定。

虾白斑病毒的抗原是灭活的虾白斑病毒、减毒的虾白斑病毒、或虾白斑病毒蛋白，优选为选自下列蛋白质中的一种或多种：VP24(SEQ ID NO：1)、VP26(SEQ ID NO：2)、VP28(SEQ ID NO：3)、及其片段。

本发明的抗体可以用常规抗体分离方法从蛋中纯化得到。另外，也可将蛋本身制成粉并干燥用作抗体来源，以及全蛋粉末、卵黄粉末或含水卵黄蛋白粉末也包括在内。

另外，本发明提供了一种抗-虾白斑病毒组合物，其中含有所述的蛋或卵黄抗体。可将所述组合物混入饲料中或养殖的水中。

本发明的抗-虾白斑病毒组合物含有一种抗虾感染症状的特异性抗体，并且可进一步包括从经免疫的鸡所产的蛋得到的全蛋粉末、卵黄粉末、含水卵黄蛋白粉末、或蛋抗体纯化粉末。控制用组合物中蛋或卵黄抗体混合量没有具体限制，但是优选为0.01wt.％～10wt.％，更优选0.1wt.％～1wt.％，最优选根据卵黄抗体的滴度进行适当调整。

另外，控制用组合物可配制为常规剂型，例如粉末、颗粒、丸剂等，当向虾幼体经口施用时，最优选用喷雾干燥等方法制备成粉末。

本发明所述的抗虾白斑病毒抗体可使用重组蛋白以低成本大规模制得，该重组蛋白源自病毒蛋白中已知致病性最强的蛋白的分离的DNA。另外，所述的具有抗虾白斑病毒的特异性控制效果的卵黄抗体，由于使用的是可食用蛋因而无害，而且由于蛋中含有丰富的天然蛋白因而具有极高的营养。

另外，本发明提供了一种抗虾白斑病毒的控制方法，该方法包括：(a)通过施用虾白斑病毒抗原使动物得到免疫；以及(b)向虾施用抗虾白斑病毒抗体，该抗体取自上述免疫后的动物。

为了更好地理解本发明，下面给出本发明的优选实施例。但是，下列实施例的给出只是为了更易于理解本发明；而本发明不应局限于这些实施例。实施例1：制备虾白斑病毒抗原

(1)分离虾白斑病毒DNA。

将杀死的虾组织用PBS混合，粉碎为均匀的碎片，然后离心5分钟获取沉淀。将沉淀与2.5ml裂解缓冲液混合，然后加入0.2ml SDS(20％)及1ml蛋白酶K，加入1ml NaCl后，将其充分混合。向混合液加入10ml 99.9％EtOH从而回收DNA，然后加入920μl悬浮缓冲液(基因组DNA提取试剂盒，BIO101)将其悬浮。向悬液中加入25μl RNase MIX，50μl细胞裂解缓冲液，以及12μl蛋白酶混合物，然后充分混合。混合液在56℃下培养2小时，随后与250μl盐析混合物及EtOH混合，然后干燥。将干燥产物溶解于10mM Tris(pH8.0)从而回收DNA。

(2)PCR扩增VP24、VP26、VP28基因

为了检测病毒的型以及转染病毒基因后的细胞表达，进行RT-PCR。

用源自相应基因核苷酸序列的DNA寡聚体作为RT-PCR的引物。提取mRNA后，用寡聚-dT和逆转录酶合成cDNA(莫罗尼氏鼠白血病病毒)，用该cDNA为模板再次进行PCR扩增。扩增后的PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行鉴定，然后将其克隆入pGEMT-easy载体，然后对其核苷酸序列进行分析。

SEQ ID NO：1是虾白斑病毒VP24的核苷酸序列，SEQ ID NO：2是虾白斑病毒VP26的核苷酸序列，SEQ ID NO：3是虾白斑病毒VP28的核苷酸序列，它们与已知的核苷酸序列等同。

(3)亚克隆VP24、VP26、VP28蛋白基因

分离自世界各地的所有虾白斑病毒基因已经被克隆且储存于GenBank。因此，使用获自GenBank的基因特异性引物，将VP24、VP26、VP28基因亚克隆入细菌表达载体pET-28b(+)，然后转化入BL21。

(4)大规模生产VP24、VP26、VP28蛋白

大规模培养转化菌株，然后离心从而获得虾白斑病毒蛋白，VP24、VP26及VP28抗原。

将转化菌涂布于LB(Luria-Bertani)培养基，37℃孵育6～12小时，将其转移入5L含卡那霉素的液体培养基中，90rpm振摇培养6小时。向培养基加入2ml的1M IPTG后，在相同条件下再培养2小时，离心(4,000rpm，15分钟，4℃)从而获得沉淀，然后用细胞裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.4)裂解。然后将裂解产物在4℃下3,000rpm离心15分钟，除去沉淀的大肠杆菌生物质，只收取含蛋白的上清部分，然后进行超速离心(13,500rpm，4℃，30分钟)。为了提高获得的沉淀物的纯度，在同样条件下重复进行3次超速离心从而获得含VP24、VP26及VP28蛋白的终产物。

(5)制备复合蛋白抗原

将重组蛋白VP24、VP26及VP28蛋白按相同比例混合制备疫苗用的复合蛋白抗原。

实施例2：抗虾白斑病毒卵黄抗体的制备

首先，向已开始产蛋的21周龄蛋鸡(Hy-Line Brown)腿部肌肉注射0.3ml(蛋白量：100μg/鸡)乳化组合物，其中含有以1∶1比例混合的虾白斑病毒复合蛋白抗原混合物及氟氏佐剂(Sigma Chemical Co.)。随后，在6周内以两周为间隔共进行3次加强注射直到生成足量抗体。

测定转移入蛋黄中白斑病毒抗体滴度的变化，收集具有高的抗体滴度的免疫鸡蛋，然后打碎。将打碎的卵黄溶液匀浆，63℃灭菌30分钟，然后喷雾干燥制备抗虾白斑病毒的卵黄抗体粉末。

实施例3：从卵黄分离抗体

将上述实施例2收集的卵黄溶液过滤后，将5ml卵黄溶液与5ml蒸馏水混合，接着再与20mlλ-角叉菜聚糖(lambda carrageenan)混合，然后室温放置30分钟。将该混合物在20℃下3,000×g离心15分钟，只收集上清。向上述上清加入19％硫酸钠，使其完全溶解后在室温下放置40分钟，然后10,000×g离心15分钟从而得到沉淀，然后将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液获得纯化的免疫球蛋白(IgY)。

实施例4：测定虾白斑病毒抗体滴度

为了测定实施例3得到的免疫球蛋白与虾白斑病毒间的抗原-抗体反应，用ELISA方法测定抗体滴度。

将重组蛋白VP24、VP26及VP28稀释至0.5μg/ml的浓度，然后包被96-孔板。首先将全抗体稀释至100μg/ml的浓度，然后连续稀释两次，加入每个孔中让其反应。通过用山羊抗-鸡IgY-AP偶联物显色反应测定终点，以每mg抗体的滴度表示。作为该试验的结果，上述实施例3制得的卵黄溶液中每一种蛋白的抗体滴度都约为20,480。

实施例5：控制用组合物的制备及控制效果

该实施例中，研究了抗虾白斑病毒免疫卵黄抗体的控制效果。

将虾幼体分为4组，每组500只幼体。作为对照的组，用虾养殖场通常使用的各种饲料处理。向与对照组所用的相同的各种常用饲料中加入浓度分别为0.5％、1.0％和2.0％的卵黄抗体，将饲料与水按1∶1比例混合，搅拌均匀，然后冻干再次制粉。施用这样得到的饲料的组分别定名为实验组1～3。

为了感染虾白斑病毒，取感染了白斑病毒的、杀死并冻存于-80℃的虾3g，灭菌，在30ml缓冲盐溶液中匀浆，然后离心(12,000×g，30分钟)从而得到上清，然后用0.45μm微孔滤膜过滤。

通过向每一试验水箱中加入10ml的滤液实现病毒感染。检查每一组在15天中死亡的虾幼体的数目以测定虾幼体的存活率。对照和试验组中虾幼体的存活率列于表1。

	对照组	试验组1	试验组2	试验组3
					卵黄抗体含量(％)	0	0.5	1.0	2.0
虾存活率(％)	0	56	72	88

                               表1

未经卵黄抗体处理的对照组的存活率为0％，而试验组显示存活率随施加的卵黄抗体浓度的升高而升高。包括卵黄抗体的比较的组的存活率表现出统计学显著性差异(p＜0.01)，因此，试验的可靠性得到支持。

实施例6：抗虾白斑病毒的免疫卵黄抗体的治疗效果

用马来西亚的中国对虾(Penaeus orientalis)用中国广东省，Damgang，Namsado测定抗虾白斑病毒的免疫卵黄抗体的治疗效果。在养殖条件下继续养殖80天，用白斑病毒侵袭后15天，300,000只虾减少至150,000只，白斑遍布虾的头和躯干。这时，向饲料中添加了浓度为2％的抗虾白斑病毒免疫卵黄抗体粉末的结果为，在施用第1天时，有500只虾被侵袭，在施用第2天时有9只被侵袭，第3天时60只被侵袭，在从第3天傍晚开始，侵袭后的虾开始摄食。连续施用至第四天时，60只虾被侵袭，在施用第5天时20只虾被侵袭，第6天时6只被侵袭，施用第7天时30只虾被侵袭。从施用的第8天起，虾的死亡数目随时间减少，施用第9天时，不再有新的死亡虾出现。

在实际的养殖场中进行了抗虾白斑病毒免疫卵黄抗体测试试验，可以发现对于已经被病毒侵袭了的虾有治疗效果。

如上所述，本发明的抗虾白斑病毒卵黄抗体当施用于虾时表现出极佳的控制效果。另外，由于所述卵黄抗体是用食用的蛋制备的，因而安全无毒，可以长期给虾施用。

Claims (8)

1、一种动物所产的蛋，该动物通过施用虾白斑病毒抗原而被免疫。

2、权利要求1中的蛋，其中所述动物是禽类。

3、权利要求1中的蛋，其中所述的白斑病毒抗原选自：灭活的虾白斑病毒、减毒的虾白斑病毒，以及白斑病毒蛋白。

4、权利要求1中的蛋，其中所述的虾白斑病毒抗原是选自VP24、VP26及VP28中的一种或多种蛋白。

5、一种抗虾白斑病毒的抗体分离自权利要求1～4中任一项所述的蛋。

6.一种抗虾白斑病毒组合物，其中含有权利要求1～4中任一项所述的蛋。

7、一种抗虾白斑病毒组合物，其中含有权利要求5所述的抗虾白斑病毒的抗体。

8、一种虾白斑病毒的控制方法，该方法包括：

(a)通过向动物施用虾白斑病毒抗原使动物被免疫；以及

(b)向虾施用抗虾白斑病毒抗体，该抗体获自经过免疫的动物。