TWI589586B - 帶有澱粉結合蛋白(sbp)標籤的免疫刺激蛋白的用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於投予來自靈芝屬(Ganoderma)物種的免疫刺激蛋白的功效。
澱粉結合蛋白(SBP)係一源自米根黴葡萄糖澱粉酶(Rhizopus oryzae glucoamylase(RoSBD))的結合區域,其為醣類吸附模組家族21(carbohydrate-binding module family 21(CBM21))的一員,具有粗澱粉結合活性。SBP可作為親和標籤被良好地應用於融合蛋白工程與大腸桿菌(Escherichia coli)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)系統中的純化。SBP的三種胺基酸序列已被揭露於美國專利號7662918中。
靈芝在中國醫藥中是一種稀有和珍貴的藥草。其已經在中國被發現認識超過5000年以上。有很多種不同的靈芝,包括紅色的赤芝(Ganoderma lucidum)、棕色的樹舌靈芝(Ganoderma applanatum)、紅色的松杉靈芝
(Ganoderma tsugae)、黑色的紫芝(Ganoderma sinense)、及深褐色的海味靈芝(Ganoderma oregonense)。
赤芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst)是一種中國傳統的藥用真菌,其具有抗腫瘤、調節免疫、抗病毒、抗菌、抑制血小板凝集等及其他功效。已發現赤芝具有抗過敏活性(Chen H.Y et al.,J.Med.Mycol.1992;33:505-512)and hepatoprotective effect(Lin J.M.et al.,Am.J.Chin.Med.1993;21(1):59-69)及保肝作用(Lin J.M.et al.,Am.J.Chin.Med.1993;21(1):59-69)。亦發現純化自赤芝的免疫調節蛋白(LZ-8)具有抑制全身過敏反應、治療肝癌及預防糖尿病的功效(Kino K.et al.,J.Biol.Chem.1989;264(1):472-8)。然而,尚未有人發展將LZ-8應用於飼料上。
最近,Yun Cao等人揭露在東亞地區商業化種植的赤芝(被稱作靈芝)與真正的赤芝其實是不同的物種,並提出一個靈芝新物種稱作靈芝(Ganoderma lingzhi),其係分佈於東亞地區(Y.C et.al.,Fungal Diversity.2012;56(1):49-62)。因此,LZ-8應被視為純化自靈芝(Ganoderma lingzhi)而非赤芝。此外,分離自不同靈芝種類的真菌免疫調節蛋白已顯示出具有相似的胺基酸序列和功用(Lin.WH et.al.,J.Biol.Chem.1997;272(32):20044-20048.,Jinn TR,et.al.,Biosci Biotechnol Biochem.2006;70(11):2627-2634.;Huang L et.al.,Proteins.2009;75(2):524-7)。
干擾素(IFN)-γ不僅是TH1 CD4、CD8和自然殺手細胞(NK)的標誌,也是一個重要的抗病毒介質,是從中樞神經系統(CNS)消滅病毒的
核心。干擾素-γ已知與各種抗病毒機制有關,如麻疹病毒(MV)、疱疹單純型病毒(HSV)、水泡性口炎病毒(VSV)、及呼吸道融合病毒(Chesler DA,Reiss CS.Cytokine Growth Factor Rev.2002 Dec;13(6):441-54;van Schaik SM,Obot N,Enhorning G, Hintz K,Gross K,Hancock GE,Stack AM,Welliver RC.J Med Virol.2000 Oct;62(2):257-66)。
球蟲病是一種動物腸道的寄生蟲病,由原生動物球蟲所引起。該疾病藉由接觸受感染的糞便或攝食受感染的組織在動物之間傳播。腹瀉是主要的症狀,在嚴重的情況下可能會演變成出血。大多數受到球蟲感染的動物都是無症狀的,但是年幼或免疫能力受損的的動物可能會遭受嚴重的症狀和死亡。雖然球蟲可感染的動物範圍很廣,包括人類、鳥類、和家畜,但是他們通常具有物種專一性。在家禽中,大多數的球蟲病係由屬於艾美球蟲屬(Eimeria)的物種引起並感染腸道中的不同位置。球蟲病在乳豬中是相當常見普遍的,通常由包括艾美球蟲屬(Eimeria)、同形球蟲屬(Isospora)、及隱孢子蟲屬(Cryptosporidia)的三種屬類所引起。
美國專利號8163519揭露真菌免疫調節蛋白(FIP)保護石斑魚免於虹彩病毒或哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)感染,然而其係透過腹膜內注射FIP或餵食包含FIP的酵母菌。美國專利號8163519亦揭露在Der p刺激的小鼠中FIP會減少干擾素-γ,證實了FIP可作用來抑制過敏反應。雖然美國專利號8163519亦揭露「來自未餵食FIP的Balb/c小鼠或來自Der p刺激小鼠的脾細胞如果以FIP重新刺激,會產生比對照組更多的IFN-r(463.8及1100.7)」,應注意到FIP係在體外(in vitro)直接刺激脾細胞,這意味著當
在體內(in vivo)投予FIP時,該效果可能不存在。因此,需要更多的實驗來證實FIP與干擾素-γ在體內(in vivo)的相關性。
Lin等人(An immunomodulatory protein,Ling Zhi-8,induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB and MAPK pathways;J Leukoc Biol.2009 Oct;86(4):877-89)研究注射LZ-8在BALB/c小鼠中的免疫調節效果,結果顯示IFN-γ上升。然而,當口服投予LZ-8時該效果可能不存在,因為消化道中複雜的化學反應可以改變LZ-8的結構。因此,口服投予LZ-8的效果並無法藉由注射的結果來輕易預期。仍需要更進一步的實驗來證實當口服投予LZ-8時LZ-8與干擾素-γ的相關性。
本發明藉由體內(in vivo)實驗探究靈芝屬物種免疫刺激蛋白LZ-8的投予功效,並檢驗LZ-8在營養物質利用及/或免疫系統上可能的機制。投予LZ-8與病毒或原生動物感染的相關性亦被研究。
除非另外特別界定,否則本文中所用之術語將具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。如本申請案所用之以下術語應具有以下含義:術語「μg/kg BW/天」係指「微克/每天每公斤體重」。
術語「澱粉結合蛋白(SBP)」係指具有澱粉結合活性的結合蛋白。
術語「生長速率」係指在特定週期和背景下一特定變量所得到的增加
量。在本發明中,該特定變量可為重量,體積或尺寸。
術語「飼料轉換率(FCR)」係一種度量法,測量動物將飼料質量轉換為增加所需產出的效率。例如,對於乳用母牛來說,該產出係牛奶,而對於作為肉食來源被豢養的動物如肉牛、豬、雞、及魚來說,該產出係動物所獲得的質量。
術語「食物」係指可以口服使用的所有產品,例如食物、飲料、藥物、營養補充品及動物飼料。
術語「免疫刺激蛋白」係指會在對象中加強免疫反應的蛋白。
本發明提供一種在有需要的對象中誘發干擾素-γ生產的方法,包含:向該對象口服投予一有效量的組合物,該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。同樣的,本發明提供一種組合物在製備用於誘發干擾素-γ生產的醫藥品、食品或飼料產品的用途,其中該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。較佳地,該靈芝屬物種係選自靈芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、樹舌靈芝(Ganoderma applanatum)、松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganoderma sinense)、或海味靈芝(Ganoderma oregonense)。較佳地,該免疫刺激蛋白係LZ-8。在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白係藉由將一澱粉結合蛋白與一免疫刺激蛋白融合來提供。在一較佳實施例中,該SBP
結合基質係選自澱粉、藻酸鹽、支鏈澱粉、糊精樹脂、或直鏈澱粉樹脂。在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。較佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量為100μg/kg BW/天。在一較佳實施例中,該澱粉結合蛋白(SBP)係由SEQ ID NO:3之胺基酸序列所組成;該LZ-8係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。在一較佳實施例中,該對象係一哺乳動物、鳥、魚或蝦。在一實施例中,上述方法在該對象中加強了對病毒及原生動物的抵抗力。
本發明亦提供一種在有需要的對象中提高飼料攝取量,增加生長速率或降低飼料轉換率的方法,包含:向該對象口服或注射投予一有效量的組合物,該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。同樣的,本發明提供一種組合物在製備用於提高飼料攝取量,增加生長速率或降低飼料轉換率的醫藥品、食品或飼料產品的用途,其中該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。較佳地,該靈芝屬物種係選自靈芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、樹舌靈芝(Ganoderma applanatum)、松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganoderma sinense)、或海味靈芝(Ganoderma oregonense)。較佳地,該免疫刺激蛋白係LZ-8。
在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白係藉由將一澱粉結合蛋白與一免疫刺激蛋白融合來提供。在一較佳實施例中,該SBP結合基質係選自澱粉、藻酸鹽、支鏈澱粉、糊精樹脂、或直鏈澱粉樹脂。在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。較佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量為100μg/kg BW/天。在一較佳實施例中,該澱粉結合蛋白(SBP)係由SEQ ID NO:3之胺基酸序列所組成;該LZ-8係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。在一較佳實施例中,該對象係一哺乳動物、鳥、魚或蝦。
本發明進一步提供一種在有需要的對象中預防或治療病毒及原生動物感染的方法,包含:向該對象口服投予一有效量的組合物,該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。同樣的,本發明提供一種組合物在製備用於預防或治療病毒及原生動物感染的醫藥品、食品或飼料產品的用途,其中該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係來自靈芝屬(Ganoderma)物種。較佳地,該靈芝屬物種係選自靈芝(Ganoderma lingzhi)、赤芝(Ganoderma lucidum)、樹舌靈芝(Ganoderma applanatum)、松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganoderma sinense)、或海味靈芝(Ganoderma oregonense)。
較佳地,該免疫刺激蛋白係LZ-8。在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白係藉由將一澱粉結合蛋白與一免疫刺激蛋白融合來提供。在一較佳實施例中,該SBP結合基質係選自澱粉、藻酸鹽、支鏈澱粉、糊精樹脂、或直鏈澱粉樹脂。在一較佳實施例中,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為25μg/kg BW/天至900μg/kg BW/天。較佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為50μg/kg BW/天至600μg/kg BW/天。更佳地,該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量為100μg/kg BW/天。在一較佳實施例中,該澱粉結合蛋白(SBP)係由SEQ ID NO:3之胺基酸序列所組成;該LZ-8係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。在一較佳實施例中,該對象係一哺乳動物、鳥、魚或蝦。在一較佳實施例中,該病毒感染係藉由選自由新城病病毒(Newcastle disease virus)、家禽傳染性支氣管炎病毒、馬立克病病毒(Marek's disease virus)、禽流感病毒、豬環狀病毒、豬瘟病毒(hog cholera virus)、豬流感病毒、及賴利斯德病毒(Lelystad virus)所組成群組之病毒。較佳地,該病毒感染係藉由選自由新城病病毒、家禽里奧病毒(avian reovirus)、及豬環狀病毒所組成群組之病毒。在一較佳實施例中,該原生動物感染係球蟲病。較佳地,該球蟲病係由選自艾美球蟲屬(Eimeria)物種的球蟲原生動物所引起。更佳地,該艾美球蟲屬物種係盲腸型球蟲(Eimeria tenella)。
圖1A-1C顯示在雞隻中口服SBP-LZ-8對新城病病毒(NDV)感染的效果。
圖1A:1x LD50;圖1B:10x LD50;圖1C:100x LD50。
圖2A-2C顯示在雞隻中口服SBP-LZ-8對家禽里奧病毒(ARV)感染的效果。
圖2A:1x LD50;圖2B:10x LD50;圖2C:100x LD50。
圖3顯示在雞隻中口服SBP-LZ-8對禽球蟲感染的效果。
下列實施例並非作為限制而僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
將SBP基因(SEQ ID NO:1)以PCR擴增並融合至LZ-8的C端。LZ-8的DNA序列係SEQ ID NO:2。將該融合的SBP-LZ-8蛋白基因在AOX1啟動子的控制下選殖進巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表現載體pPICZαA(購自Invitrogen)並轉形進巴斯德畢赤酵母X33(購自Invitrogen)。將帶有SBP-LZ-8基因的巴斯德畢赤酵母轉型株於BMGY培養基(100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0),1%甘油,1%酵母菌萃取物,2%蛋白腖)中培養24小時。離心回收細胞並將其重新懸浮於BMMY培養基(100mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0),0.5%甲醇,1%酵母菌萃取物,2%蛋白腖)中。每24小時加入甲醇(0.5% v/v)以誘導SBP-LZ-8表現。誘導3天後,離心將細胞移除並收集無細胞發酵液以SDS-PAGE分析。
將表現SBP-LZ-8的轉型株接種於300ml YPD(1%酵母菌萃取物,2%蛋白腖及2%葡萄糖)中於30℃培養24小時。將300ml的菌種培養物注入含有40L FBS培養基[26.7ml/l H3PO4(85%)、0.93g/l CaSO4、18.2g/l K2SO4、14.9g/l MgSO4.7H2O、4.13g/l KOH,並用NH4OH調整至pH 5.0],並添加PTM1微量鹽類(6g/l CuSO4.5H2O、0.08g/l KI、3g/l MgSO4.H2O、0.2g/l Na2MoO4、0.02g/l H3BO3、0.5g/l CoCl2、20g/l ZnCl2、65g/l FeSO4.7H2O、0.2g/l生物素、及5ml H2SO4)及3%甘油的100L發酵槽進行批式發酵約24小時,直到甘油被耗盡之後溶氧(DO)的快速增加。接著甘油饋料批式培養24小時,在饋料批式進程結束時OD600增加到超過500,之後添加甲醇以誘導SBP-LZ-8的表現並持續4天。在無細胞的發酵上清液中加入適量的澱粉以藉由澱粉與SBP標籤之間的特異性吸附作用來純化SBP-LZ-8。回收結合SBP-LZ-8的澱粉並乾燥。可用10mM甘胺酸鹽酸鹽緩衝液(pH 11.0)從澱粉沖提出SBP-LZ-8,使用BCA法(Pierce)作蛋白質濃度定量。SBP-LZ-8係SBP(SEQ ID NO:3)與LZ-8(SEQ ID NO:4)的融合蛋白,其維持了LZ-8的活性並被使用於下列的實例中。
本試驗在財團法人台灣動物科技研究所的實驗豬場中進行。該豬場除部分欄位、豬隻供試驗使用外,其他仍維持商業操作。因此,試驗豬隻的飼養環境、管理條件與其他生產用豬隻一致。
動物及處理
選取雜交豬36頭(平均體重7.8kg),隨機分為3組,每組3欄、每欄4頭豬:(1)對照組(無添加SBP-LZ-8)、(2)低劑量SBP-LZ-8組(每天100μg/kg BW)、及(3)高劑量SBP-LZ-8組(每天600μg/kg BW)。餵食豬隻添加有抗生素的飼料歷時28天。飼料配方及營養成分列於表1中。
測定
在試驗開始及結束時將豬隻個別稱重。紀錄每欄的體重及飼料採食量以計算平均日增重(ADG)、平均日採食量(ADFI)、及飼料轉換率(FCR,ADFI/ADG)。
於第14天及第28天,每欄取一公一母豬隻採血以測定葡萄糖、尿素氮(BUN)、三酸甘油脂(Kodak Ektachem DT-II System,Rochester,NY)、及干擾素-γ(ELISA kit,Invitrogen,CA)濃度。
統計
將數據以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生長參數時使用欄作為實驗單位,在分析血液參數時則使用豬作為實驗單位。
存活率
本試驗中的飼料添加有抗生素(STP-500及Carbadox)。試驗過程中,
沒有豬隻死亡或被淘汰。所以,本試驗無法確定SBP-LZ-8對仔豬存活率的影響(表2)。
生長表現
根據仔豬的日採食量來設計飼料中添加的SBP-LZ-8量,使仔豬SBP-LZ-8的攝取量維持在100μg/kg BW或600μg/kg BW。
飼料中添加SBP-LZ-8能促進仔豬日增重,效果以攝取量在100μg/kg BW時(+13.2%,表2)達顯著差異(P<0.05)。雖然統計無顯著差異(P>0.05),SBP-LZ-8 100μg/kg BW攝取量亦能使日採食量增加9.8%,並改善飼料轉換率3%。SBP-LZ-8 600μg/kg BW攝取量的效果不如100μg/kg BW攝取量,但在日增重(+4.7%)及日採食量(+3.8%)可觀查到部分改善效果。高劑量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)可能過度刺激了免疫系統,造成能量與蛋白質的浪費,所以對於生長表現的效果反而不如低劑量的SBP-LZ-8(100μg/kg BW)顯著。本試驗發現在飼料中應用抗生素的同時,添加SBP-LZ-8(100μg/kg BW)能顯著促進仔豬生長表現,包括採食量,生長率、及飼料利用率的提昇。
試驗結束時,餵食有SBP-LZ-8(100μg/kg BW)的豬隻體重較對照組高1.6kg(P<0.05),而高劑量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)則只使體重多增加了0.6kg。
血液參數
各組豬隻在第14天及第28天的葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂濃度沒有顯著差異(表3)。餵食有SBP-LZ-8(100μg/kg BW)的豬隻組則傾向
有比對照組略高的葡萄糖濃度(P<0.1)。
對於干擾素-γ來說,飼料中添加SBP-LZ-8會刺激干擾素-γ的生產(表3)。在餵食SBP-LZ-8 14天後,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干擾素-γ的濃度增加了103%(P<0.05),而600μg/kg BW的SBP-LZ-8也有相似的效果,使干擾素-γ的濃度比對照組增加了120%(P<0.01)。在第28天,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干擾素-γ的濃度增加了62%(P>0.05),而高劑量的SBP-LZ-8(600μg/kg BW)對干擾素-γ也維持了相同的效果,使干擾素-γ的濃度比對照組增加了150%(P<0.01)。由此可見,高劑量的SBP-LZ-8可以延長對干擾素γ的影響。
結果顯示,飼料中添加SBP-LZ-8有利於離乳豬的生長表現。SBP-LZ-8對生長的作用與消化和吸收無關,因為葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂皆無發現明顯變化。至於提高離乳仔豬的生長表現,100μg/kg BW劑量的SBP-LZ-8比600μg/kg BW的高劑量有更好的效果。
本試驗在財團法人台灣動物科技研究所的實驗豬場中進行。該豬場除部分欄位、豬隻供試驗使用外,其他仍維持商業操作。因此,試驗豬隻的飼養環境、管理條件與其他生產用豬隻一致。
動物及處理
選取離乳仔豬80頭(平均體重8.0kg),隨機分為4組,每組5欄、每
欄4頭豬:(1)正對照組(有添加抗生素STP-500及Carbadox)、(2)負對照組(無添加抗生素)、(3)低劑量SBP-LZ-8(每天50μg/kg BW)且無抗生素組、及(4)高劑量SBP-LZ-8(每天100μg/kg BW)且無抗生素組。餵食豬隻飼料歷時28天。飼料配方及營養成分列於表4中。
測定
在試驗開始及結束時將豬隻個別稱重。紀錄每欄的體重及飼料採食量以計算平均日增重(ADG)、平均日採食量(ADFI)、及飼料轉換率(FCR,ADFI/ADG)。
於第14天及第28天,每欄取一公一母豬隻採血以測定葡萄糖、尿素氮(BUN)、三酸甘油脂(Kodak Ektachem DT-II System,Rochester,NY)、及干擾素-γ(ELISA kit,Invitrogen,CA)濃度。
統計
將數據以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生長參數時使用欄作為實驗單位,在分析血液參數時則使用豬作為實驗單位。
存活率
存活率約90-95%。飼料中有無抗生素或SBP-LZ-8對離乳仔豬的存活率並無影響(表5)。
生長表現
與正對照組相比,以無抗生素的飼料餵食的豬隻有較低的日增重(-22.5%,P<0.001)、日採食量(-19.1%,P<0.05)、及較高的飼料轉換率(+4.4%,P<0.05)。
在飼料無抗生素的情況下,添加50μg/kg BW的SBP-LZ-8對生長表現沒有影響。100μg/kg BW的SBP-LZ-8則使日增重與負對照組比相比增加了13.5%(P<0.05)。雖然SBP-LZ-8組的日增重及日採食量表現沒有正對照組佳,但是SBP-LZ-8組的飼料轉換率卻表現較好(-3.8%,P<0.05)。因此,在沒有添加抗生素的情況下,SBP-LZ-8可改善離乳仔豬的生長表現(包括提高日增重和降低飼料轉換率)的。
血液參數
各組豬隻在第14天及第28天的葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂濃度沒有顯著差異(表6)。
表6. 飼料添加SBP-LZ-8對離乳仔豬血液參數的影響
在干擾素-γ濃度方面,無抗生素添加組(負對照組、SBP-LZ-8 50μg/kg BW組)的干擾素-γ濃度與正對照組相近(P>0.05)。然而,100μg/kg BW的SBP-LZ-8有刺激干擾素-γ生成的效果(表6)。在餵飼100μg/kg BW的SBP-LZ-8歷時14天後,干擾素-γ的濃度提高了40%(P<0.01)。而在第28天,100μg/kg BW的SBP-LZ-8使干擾素-γ的濃度提高了32%(P<0.05)。因此,在餵食無抗生素飼料的情況下,長期餵飼SBP-LZ-8能促進干擾素-γ生成或分泌。
結果顯示,餵食無抗生素飼料的豬隻有較低的生長表現。添加SBP-LZ-8到無抗生素飼料中則會提昇生長表現。SBP-LZ-8的作用與營養代謝無關,因為葡萄糖、尿素氮、或三酸甘油脂皆不被影響。本試驗中發現在不添加抗生素的情況下,給予100μg/kg BW劑量的SBP-LZ-8能有利離乳仔豬的生長表現。
豬第二型環狀病毒(PCV2)是一種非常小的DNA病毒,會特異性地感染豬隻。本實驗係探討在商業操作的環境中添加SBP-LZ-8的飼料對感染PCV2的離乳仔豬的生長表現和存活率的影響,以檢驗添加SBP-LZ-8是否有利於豬隻生產。
本試驗在台灣雲林縣的一個每年銷售有2000隻豬的商業養殖場中進行。已知幾乎所有台灣的豬場皆感染有PCV2。將買來的豬在適應期間測試其PCV2抗體效價。挑選具有PCV2抗體的豬隻(被認為已感染)來進行本實驗。在一星期的適應期後,選出200隻離乳仔豬(購自附近的商業養殖場)用於進行實驗。
動物及處理
將豬隻(平均體重10.4kg)隨機分為對照組及SBP-LZ-8組(每天100μg/kg BW),每組5欄(每欄20頭豬)。餵食豬隻市售的離乳飼料(添加有抗生素)28天,接著再餵食生長豬飼料(grower diet)28天。試驗期間為56天。飼料的營養成分列於表7中。
測定
在每階段開始及結束時將同一欄的豬隻群體稱重。紀錄每欄的體重及飼料採食量以計算平均日增重(ADG)、平均日採食量(ADFI)、及飼料轉換率(FCR,ADFI/ADG)。
於第28天及第56天,每欄取10隻豬採血以測定干擾素-γ的濃度。
統計
將數據以SAS(SAS Inst.Inc.,Cary,NC,USA)中的GLM程序分析。在分析生長參數時使用欄作為實驗單位,在分析血液參數時則使用豬作為實驗單位。
生長表現及存活率
在第一階段期間(第1-28天),添加SBP-LZ-8使日採食量增加5.4%且日增重亦增加了7.3%。然而,在對照組與實驗組之間的差異並不顯著(P>0.05)。死亡或自試驗淘汰的豬隻數目在對照組中(14隻)高於實驗組(6隻)。因此,在飼料中添加SBP-LZ-8使離乳仔豬的存活率增加了8%。
在第二階段期間(第29-56天),添加SBP-LZ-8使日採食量增加7.2%(P>0.05)且日增重亦增加了9.6%(P<0.05)。SBP-LZ-8的添加也稍微減少了飼料轉換率,雖然在對照組與實驗組之間的差異並不顯著。與第一階段相比,死亡或自試驗淘汰的豬隻數目在第二階段中較少。實驗組與對照組相比仍維持了較佳的存活率(表8)。
因此,在離乳飼料及生長豬飼料中添加SBP-LZ-8歷時56天增進了飼料採食量並使最終體重增加了1.77kg(P<0.05)。添加SBP-LZ-8有較高的存活率表示SBP-LZ-8可有效治療PCV2,亦表示可出售更多的豬隻並節省成本。
血液參數
在餵飼56天後,干擾素-γ的濃度在SBP-LZ-8組中顯著較高(P<0.05)(表9)。
將SBP-LZ-8添加到無抗生素的市售飼料中並使其濃度為100μg/kg BW,以該飼料餵飼雞隻一星期,然後注射1x LD50、10x LD50、或100x LD50 NDV Sato來攻毒。結果顯示於表10及圖1A-1C。在高劑量(10-100x LD50)NDV攻毒下,雖然在第7天於有或沒有SBP-LZ-8的組別都觀察到100%的死亡率,但SBP-LZ-8的添加確實延緩了疾病的發作。在經1x LD50 NDV攻毒後,餵飼SBP-LZ-8的雞隻中沒有觀察到死亡。在沒有SBP-LZ-8的組別中,經1x LD50 NDV攻毒後,在第3天觀察到10%的死亡率,第4天觀察到30%的死亡率,第7天觀察到50%的死亡率。該結果表示在低劑量攻毒(1x LD50 NDV)下,口服投予SBP-LZ-8能夠預防NDV感染造成的死亡,
而對照組在第7天導致了50%的死亡率。在這些實驗進行前已經確認雞隻並無NDV抗體反應(HI<2)。因此,SBP-LZ-8展現了抗NDV的活性,包括延緩疾病發作以及減少死亡率。
將SBP-LZ-8添加到無抗生素的市售飼料中並使其濃度為100μg/kg BW,以該飼料餵飼雞隻一星期,然後經由足墊注射103(1x LD50)、104(10x LD50)、或105(100x LD50)TCID50 ARV 1733來攻毒。結果顯示於表11
及圖2A-2C。當使用105 ARV攻毒時,於有或沒有SBP-LZ-8的組別都在第8天開始觀察到疾病症狀,如關節腫脹和跛行,而100%的雞隻都在第11天表現出症狀。當使用104 ARV攻毒時,於有或沒有SBP-LZ-8的組別都在第7-8天開始觀察到疾病症狀,如關節腫脹和跛行,而在第13天時,SBP-LZ-8組中的100%的雞隻都表現出症狀,對照組中則有90%表現出症狀。當使用103 ARV攻毒時,於第14天在SBP-LZ-8組中並沒有觀察到如關節腫脹和跛行的疾病症狀,至於對照組則是在第8天有10%的雞隻表現出臨床症狀,且在第11天有100%的雞隻表現出症狀。這些結果表示SBP-LZ-8對低劑量ARV攻毒提供了完全的保護,但對於高劑量攻毒的保護效果則不顯著。
將SBP-LZ-8添加到無抗生素的市售飼料中並使其濃度為100μg/kg BW,以該飼料餵飼雞隻一星期,然後經由口服10,000個盲腸型球蟲(Eimeria tenella)卵囊來攻毒。結果顯示於表12及圖3。在有SBP-LZ-8的組別中,於攻毒後的第7天觀察到20%死亡率,直到第20天都是一樣。在沒有SBP-LZ-8的組別中,於攻毒後的第6天觀察到20%死亡率、第8天觀察到40%死亡率、以及第20天觀察到55%死亡率。該結果表示口服投予SBP-LZ-8顯著地延緩疾病發作並減少死亡率。
在一個非正式的田間試驗中,向20000隻生長在禽流感病毒流行區的產蛋雞投予SBP-LZ-8。在禽流感病毒流行季節,
飼料裡沒有添加SBP-LZ-8的情況下,蛋的產量顯著減少了30%。以含有SBP-LZ-8(濃度為100μg/kg BW)的飼料餵飼產蛋雞,在投予SBP-LZ-8 3~7天之後,產蛋率恢復到正常水平。
在另一實驗中,2000隻感染馬立克病(Marek's Disease)的產蛋雞被餵飼以含有SBP-LZ-8(濃度為100μg/kg BW)的飼料,而另外2000隻感染馬立克病(Marek's Disease)的產蛋雞則被餵飼以不含SBP-LZ-8的飼料。在不含SBP-LZ-8的飼料組中有超過300隻雞於生長期死亡,而在餵飼SBP-LZ-8的組中死亡的雞隻少於20隻。
在有2000隻生長肥育豬的農場進行SBP-LZ-8試驗。改場原先買來的離乳仔豬因為免疫問題,死亡率為15%,且存活下來的豬體重增加緩慢。在餵飼SBP-LZ-8(濃度為100μg/kg BW)1個月後,死亡率減少到6%,並且在存活的健康豬隻中觀察到較佳的生長表現。
根據這些數據,可推測出口服投予SBP-LZ-8可刺激IFN-γ產生,從而促進動物的病毒抗性。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標,並獲得所提到之結果及優點,以及那些存在於其中的東西。本發明中之組合物、其製造程序與方法乃較佳實施例的代表,其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊
含在本發明的精神中,並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細,得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明,即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處,仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品,都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度,就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明,可能得以在缺乏任何要件,或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制,同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達,但需認清的是,在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此,應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明,但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容,諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
<110> 善笙生物科技股份有限公司
<120> 帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白的用途
<130> SB-LZ8
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
- 一種組合物在製備用於治療病毒及原生動物感染的醫藥品的用途,其中該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係LZ-8,其中該病毒感染係藉由選自由新城病病毒、家禽里奧病毒(avian reovirus)、豬環狀病毒、馬立克病病毒(Marek's disease virus)、及禽流感病毒所組成群組之病毒,其中該原生動物感染係球蟲病。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該SBP結合基質係選自澱粉、藻酸鹽、支鏈澱粉、糊精樹脂、或直鏈澱粉樹脂。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為每天每公斤體重25μg至每天每公斤體重900μg。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該澱粉結合蛋白(SBP)係由SEQ ID NO:3之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該LZ-8係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。
- 一種組合物在製備用於誘發干擾素-γ生產的口服醫藥品的用途,其中該組合物包含一複合物,該複合物係由一帶有澱粉結合蛋白(SBP)標籤的免疫刺激蛋白及一SBP結合基質所組成,其中該免疫刺激蛋白係LZ-8。
- 如申請專利範圍第6項所述之用途,其中該SBP結合基質係選自澱粉、藻酸鹽、支鏈澱粉、糊精樹脂、或直鏈澱粉樹脂。
- 如申請專利範圍第6項所述之用途,其中該帶有SBP標籤的免疫刺激蛋白的劑量範圍為每天每公斤體重25μg至每天每公斤體重900μg。
- 如申請專利範圍第6項所述之用途,其中該澱粉結合蛋白(SBP)係由SEQ ID NO:3之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第6項所述之用途,其中該LZ-8係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。
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