CN100577806C - 含有草鱼干扰素基因的重组质粒、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有草鱼干扰素基因的重组质粒，该基因具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种工程菌，该菌株INVSC1-pYES2-IFN为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2006年10月19日，保藏号：CGMCC1847。该工程菌能应用于水产动物抗病毒。本发明还公开了一种蛋白质在水产动物抗病毒中的应用，该蛋白质为具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的草鱼干扰素基因所编码。

Description

含有草鱼干扰素基因的重组质粒、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及水产生物技术和水产养殖病害防治技术领域。特别涉及一种利用分子生物学技术，克隆草鱼干扰素基因，构建含有该基因的重组酵母表达质粒，并在酿酒酵母中获得高效表达，利用表达干扰素的酵母工程菌，直接研制成抗病饲料添加剂，应用于水产动物病害防治。

背景技术

随着渔业生产的迅猛发展，水产动物病害日益突出，已成为当前严重影响水产养殖业健康可持续发展的世界性难题，在我国尤其突出。近年来，我国因病害导致的水产养殖业直接经济损失每年超过百亿元，而且逐年攀升。但长期以来，一直缺乏有效的病害防治方法；各种抗生素、杀虫剂滥用，造成养殖环境和水产品严重污染，水产食品安全受到严重威胁，同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害的发生，形成恶性循环。随着我国加入WTO和食品安全法的颁布，对环境和食品安全的标准越来越高，当前一大批抗生素已被明令禁用，水产动物病害防治已面临无药可施的困境，因此研制开发天然、安全、高效的水产动物病害防治药物已迫在眉睫，它对支撑我国水产业健康持续发展，确保我国食物安全，提高国民健康素质，引领我国渔业经济发展和水产科学的创新都非常重要和十分紧迫，具有重大的经济社会意义。

水产动物重要免疫抗病因子的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治、保障水产食品安全的有效途径。然而，由于长期来国内外对水产动物免疫抗病因子的研究比较薄弱，特别是分离鉴定的关键抗病因子非常有限，因此，有关该领域的开发应用研究还几乎是空白。

干扰素(Interferon，IFN)是机体天然免疫中最关键的非特异性免疫因子，是机体受病毒等感染后分泌产生的一种具有抗病毒和免疫调节活性的糖蛋白。然而，目前对其研究和开发应用主要见诸人类医学临床和部分高等动物，如畜禽。作为低等脊椎动物的鱼类干扰素的研究还较少，表现在对其生物学性质和免疫学功能的了解还不多，特别是对其在水产动物病害防治中的开发应用研究还几乎是空白。由于人类(包括高等动物)与鱼类间存在较大的种族特异性差异，已有的人类干扰素制剂不适用于鱼类等水产动物；具体表现在人类干扰素在鱼类中活性低，特别是人类干扰素应用于水产动物有潜在食品安全危害，因此，研制开发水产动物自身的干扰素是一项紧迫的课题。与人类医学干扰素的研制开发要求不同的是，水产动物用干扰素要求使用方便、成本低廉，这样才有实际应用价值。在医学上，可以从人白细胞分离天然干扰素，也可以通过基因工程制备重组干扰素，但由于人类干扰素的使用采用针剂注射等方式，纯度要求高，这样成本就会大大提高；而水产用干扰素由于水产动物水体生活的特殊性，不宜采用逐个个体针剂注射方式，采用饲料添加剂投喂是理想且方便的途径，同时为了降低成本，天然提取方法一般难以实现，因此采用重组表达技术是较为合适的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含有草鱼干扰素基因的重组质粒，以及含有该质粒并能高效表达草鱼干扰素蛋白的酿酒酵母工程菌，该工程菌及草鱼干扰素蛋白能用于水产动物抗病毒及提高免疫抗病能力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种含有草鱼干扰素基因的重组质粒，该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种工程菌，该菌株INVSC1-pYES2-IFN为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2006年10月19日，保藏号：CGMCC1847。

本发明还提供上述工程菌在水产动物抗病毒中的应用。

本发明还提供一种蛋白质在水产动物抗病毒中的应用，该蛋白质为具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的草鱼干扰素基因所编码。

本发明人率先在国内外***开展了草鱼干扰素的研究，先后从草鱼血清和白细胞中分离纯化了干扰素蛋白质，***研究了其组织细胞来源、诱导产生规律、理化性质和免疫调节功能；并克隆了其基因，实现了草鱼干扰素蛋白在酿酒酵母中的高效表达(表达量达到30％)，测定了酵母表达的草鱼干扰素具有与天然干扰素相同的生物学活性，并利用高效表达干扰素的酵母工程菌，通过超声破碎和气流干燥，研制成含草鱼干扰素的酵母粉抗病饲料添加剂，经鱼虾等水产动物病害防治应用试验，取得良好效果，表明草鱼干扰素具有普遍适用于水产动物免疫抗病保护作用，具有重要应用价值，对该抗病因子的开发利用，在国内外尚属首次。

本发明人还率先在草鱼中分离鉴定了鱼类免疫抗病的关键因子干扰素，通过对其生物学性质与功能的***研究，证明鱼类干扰素具有广谱的抗病毒活性，同时对鱼类巨噬细胞和淋巴细胞等具有明显的激活作用，具有显著调节和增强机体免疫水平的功能，是具有重要开发应用价值的水产动物抗病因子。

在现有的技术领域内目前已发展了多种表达***，包括原核和真核表达***，如细菌、酵母、动植物细胞等；通过比较分析，我们发现常用的大肠杆菌和毕赤酵母表达***对鱼类等水产动物有一定毒性，不适合直接作为抗病饲料开发应用，而动植物细胞表达***则需大规模培养，成本高。为此我们采用酿酒酵母***对草鱼干扰素进行开发，以保证其安全无毒性，同时由于酿酒酵母本身可作为饲料，适合于投喂，发酵生产成本低，是水产动物活性因子开发应用的理想***。

酿酒酵母目前主要用于啤酒工业，此外也可作为酵母饲料而用于饲料工业。酵母饲料是指利用酵母菌的新陈代谢和繁殖菌体，经过发酵和干燥等工艺制成的含有菌体和酵母细胞代谢产物的安全、无污染、无残留的优质饲料。利用酿酒酵母表达外源基因具有翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于表达真核生物基因，目前已在乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等药物开发中得以应用，但在鱼类药物开发中的应用很少，利用其表达干扰素，并直接作为抗病饲料的开发应用尚属首次。此外，酿酒酵母应用于生产具有生长繁殖迅速，工艺简单等优点，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本，具有很强的实用性。

本发明的工程菌和蛋白质在水产动物抗病毒中的应用，具体表现为创制成为一种水产动物干扰素抗病制剂，并研制成酵母饲料添加剂形式的应用；目的在于开发利用我国经济鱼类天然免疫抗病因子，保护我国鱼类重要基因资源，替代目前渔业生产中滥用的抗生素、杀虫剂等有害药物，保障食品安全，同时解决水产动物病毒性病害目前尚无有效防治药物这一世界性难题。鱼类干扰素制剂以饲料添加剂形式的应用，能克服以往医学干扰素制剂价格昂贵、以及注射给予药物难以在水产动物养殖中推广应用等缺陷。

上文所述的水产动物免疫抗病制剂，为含草鱼干扰素基因表达质粒酵母工程菌所表达的草鱼干扰素蛋白，或表达草鱼干扰素的酵母工程菌菌粉，干扰素蛋白所占酵母总蛋白的比例为20％～30％。因此该水产动物免疫抗病制剂，具有抗病毒功能和免疫调节生物学功能，在草鱼ZC7901吻端细胞和CP80胚胎细胞株上，具有抑制草鱼出血病病毒(GCHV)活性，其滴度(Log₂CPEI₅₀/0.1ml)达到11.29±0.18以上；一龄草鱼背鳍皮下注射干扰素蛋白(10μg/尾)12小时后，人工感染GCHV(500TCID₅₀)/尾，相对免疫保护率(Relative Percent Survival，RPS)可以达到59.42％；一龄草鱼饲喂含有干扰素的饲料(10mg GcIFN/Kg饲料)，连续饲喂1周，人工感染GCHV(500TCID₅₀)/尾，相对免疫保护率可以达到29.58％；将表达草鱼干扰素的酵母菌粉添加入配合饵料(饵料中干扰素含量为10mg GcIFN/Kg)，饲喂南美白对虾和中国对虾，每天2次，连续饲喂7天，人工感染白斑综合症病毒(WSSV)，相对免疫保护率分别达到11.60％和10.40％；经干扰素处理的巨噬细胞具有显著的增强对酵母菌的吞噬杀菌作用，同时干扰素对外周血和头肾T、B淋巴细胞也有明显的促进增殖转化作用，对养殖鱼类的抗病试验表明，使用含干扰素饲料的实验组草鱼和鲈鱼，成活率均明显提高，免疫保护率分别达到62.39％和48.61％；对养殖虾类的抗病试验表明，使用含干扰素饲料的实验组南美白对虾和中国对虾，成活率明显提高，免疫保护率分别达到30.80％和20.99％，表明IFN能提高鱼虾类的免疫抗病能力。

本发明所提供的水产动物干扰素抗病制剂，其优势主要表现在：(1)用酿酒酵母表达的干扰素是来源于动物本身的一种免疫抗病因子，不仅具有生物学活性，而且安全无毒、价格低廉；(2)酿酒酵母工程菌制备的菌粉可直接作为饲料，适合投喂，克服了水产动物无法注射给药的困难；(3)干扰素蛋白不仅有抗病毒作用，还具有免疫调节功能，可增强水产动物自身的抗病能力；(4)本制剂具有广谱的抗病作用，除草鱼外还可用于鲈鱼、对虾等多种水产动物的病害防治。

本发明的有益效果，具体如下：

本发明率先在国内外分离鉴定了草鱼干扰素免疫因子，通过对该因子生物学性质与功能的***研究，确认干扰素为鱼类关键免疫抗病因子，在此基础上，通过克隆草鱼干扰素基因和构建草鱼干扰素高效表达质粒，实现了该因子在酿酒酵母中的高效表达，利用表达干扰素的酵母工程菌，经适当工艺处理，研制成抗病饲料添加剂，在鱼类和虾类等水产动物病害防治中开展抗病试验，取得良好效果。

鱼类干扰素作为一种重要免疫抗病因子，具有重大开发应用价值，它作为一种替代抗生素和农药的安全、高效、天然水产动物病害防治药物，可以为长期来困扰我国渔业发展的病害防治开辟新途径，对促进我国水产业健康可持续发展，确保食物安全，提高国民健康素质，引领我国渔业经济发展和水产科学的创新具有重要的经济、社会效益。研究成果同时对揭示鱼类免疫***的分子组成及其作用机制、免疫因子分子起源及进化规律具有重要理论意义。

附图说明

图1为本发明一种实施例的重组表达质粒IFN-pYES2的构建。

图2为本发明一种实施例的目的基因的菌落PCR鉴定图。

图3为本发明一种实施例的重组质粒IFN-pYES2经Hind III和Xho I双酶切鉴定图，酶切片断大小约为550bp与预期大小相同。

图4为本发明一种实施例的pYES2-IFN/INVSC1诱导表达的SDS-PAGE分析图；图4中箭头所指为目的蛋白，其分子量为38000Da；第3列为空载体，第4、5、6列分别为诱导14、38、60小时的干扰素蛋白的表达情况，在14h诱导时表达量最高。

图5为本发明一种实施例的GcIFN诱导Mx基因的时间梯度和浓度梯度效应示意图，结果显示，Mx的诱导量随着加入的IFN浓缩液的量的增加而增加；而在加入同样诱导量的前提下，最高诱导峰值出现在加入诱导物后的24小时后，到了36小时开始减退。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例1、草鱼干扰素基因克隆

从草鱼背鳍皮下注射0.5ml poly I:C(购自天津药厂)，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12小时后取头肾10克左右，用TRizol(Gibco BRL，USA)提取总RNA，提取方法按说明书进行。然后用逆转录试剂盒RNAPCR kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa，USA)进行逆转录和PCR扩增。引物序列如表1所示。

扩增产物纯化后(使用PCR产物纯化试剂盒DNA Gel Extraction Kit，V-gene)***T载体(TA克隆试剂盒购自上海生工)。操作步骤均按照说明书所示。连接产物转化大肠杆菌TOP10，筛选阳性重组子进行测序鉴定。转化和鉴定方法按照《分子克隆实验指南》进行。根据鉴定得到的序列设计5’RACE和3’RACE引物(其序列如表1所示)，使用TaKaRa 5’-Full RACE Core Set和TaKaRa 3’-Full RACE Core Set按照说明书所述步骤进行5’RACE和3’RACE扩增，最后进行序列的拚接，得到一条长1191碱基的cDNA序列。用NCBI ORFFinder分析可知开放阅读框ORF长543bp，编码180个氨基酸。其余5’UTR长34bp，3’UTR长614bp。

表1.草鱼干扰素基因PCR扩增所用引物(5’-3’)

IFN ORF扩增引物	IFN-F1IFN-R1	AAGGAAATGGGTGGAAAATATTTGCGATGATGTCCATCCTC
			IFN 3’RACE引物	IFN-3-F33’Adaptorprimer	ACCTTCAGAGGATGGACATGATCTGATCTAGAGGTACCGGATCC
IFN 5’RACE引物	RTA1A2S1S2	(P)-GATGACTGCCTGAGGTGGAAAATATCCTGAGGGAAGGTGTCATTTCCAGGAGCGAGCCATTCGCAAGCAGAGCCGCAAGCAGAGCATTGACCC

实施例2、草鱼干扰素基因序列测定和分析

用NCBI ORF Finder分析实施例1中所得的cDNA序列，可知开放阅读框ORF长543bp，编码180个氨基酸。其余5’UTR长34bp，3’UTR长614bp；用PROSITE database进行潜在功能位点分析以及用信号肽分析软件SignalPprogram(version 3.0)进行信号态分析，得出的结论是其蛋白等电点为9.73，且该基因具有一个长为22各氨基酸的信号肽，预示着，它的成熟肽为159个氨基酸；用Prosite进行位点分析，发现该基因同时具有2个N末端14酰化位点：GqcsAC和GTkvSF；2个蛋白激酶II磷酸化位点：SacE ShkE；一个N末端糖基化位点：NESL；一个蛋白激酶C磷酸化位点：ShK；两个染色体核前导序列：Kkinrhfkilkknlkkk和Kkeysaqaweqirravk；用软件ClastalW将本发明的基因序列与其他八种生物包括人、小鼠、大西洋鲑鱼、鸡、斑马鱼、鲫鱼、红鳍东方豚和鲶鱼的IFN同源基因序列进行多序列比对，结果显示，IFN同源基因的氨基酸序列在不同鱼类的物种中同源性较高。其中，草鱼与斑马鱼和鲫鱼同为鲤科，它们的氨基酸序列存在很高的同源性，达90％以上。

实施例3、草鱼干扰素表达质粒的构建

根据实施例1得到的干扰素基因序列设计表达载体构建引物，序列如下：

上游引物自GcIFN ATG起始，5’端含Hind III酶切位点和Kozak序列ACC

gc-IFN-F3：5’-CCC AAG CTT GGG ACC ATG GAA ACT CAA ATGTGG-3’

下游引物自终止密码字TAA开始，5’端加入Xho I酶切位点

gc-IFN-R3：5’-GGCGAGCTCGCCTTATCGTCTGTTGGCAATGC-3’

按照实施例1中方法进行PCR扩增，将扩增产物用Hind III和Xho I(TAKARA公司)进行双酶切，***到表达载体pYES2中，转化大肠杆菌TOP10，按照《分子克隆实验指南》中的碱裂解法提取重组表达质粒，进行测序鉴定，测序结果证明得到***方向正确的重组表达质粒，含完整的GcIFN基因，长度约560bp，包括长为22个aa的信号肽。基因5’端有Hind III酶切位点，3’端含有Xho I酶切位点。重组质粒的构建方案如附图1所示。

实施例4、表达草鱼干扰素的酿酒酵母工程菌构建、筛选及其诱导表达

4.1、重组质粒电转化酵母细胞

碱裂解法抽提少量质粒，方法参见《分子克隆实验指南》。制备酵母感受态细胞，方法如下：挑取YPD培养基中一单克隆INVSC1于2ml YPD液体培养基中，30℃，250～300rpm振荡培养过夜；取少量SC悬浮液涂SC平板，鉴定表型；取200ul接种至100ml含YPD培养基的三角摇瓶中，30℃，250～300rpm振荡培养过夜至OD600为1.3～1.5；细胞冰浴15min，终止生长；4℃3000rpm5min离心收集细胞，用100ml预冷的无菌水重悬；4℃3000rpm 5min离心收集细胞，用50ml预冷的无菌水重悬；4℃3000rpm 5min离心收集细胞，用4ml预冷的1M山梨醇重悬；4℃2000rpm 5min离心收集细胞，用100ul预冷的1M山梨醇重悬，终体积约为200～300ul，按40ul/管分装，4℃，保存一周；获得酵母感受态细胞后，用电脉冲转化方法将重组质粒转入酿酒酵母，方法如下：将40ul酵母悬浮液与小于5ul质粒DNA混合于预冷的电穿孔管(0.2cm)，轻摇管底，以确保样品与铝管两侧接触，冰浴5min；脉冲参数：V＝1.5kV，25uF，200Ohms，4-5ms；电转化后立刻加1ml预冷的1M山梨醇，用无菌移液管转移至无菌eppendorf管；涂布SC-U培养基中选择培养，每200ul涂布一块平板；将平板至于30℃培养，直至单个菌落出现。

4.2、筛选阳性转化子

用酵母质粒小提试剂盒提取酵母质粒DNA(天为时代，DP112)。将得到的酵母质粒重新转化大肠杆菌TOP10，碱裂解法抽提质粒(方法参见《分子克隆实验指南》)，用PCR和Hind III、Xho I双酶切等方法鉴定阳性转化子，鉴定结果如附图2、3所示。

4.3、重组干扰素的诱导表达

挑单菌落重组子与含2％棉籽糖的15ml SC-U培养基中，30℃振荡培养过夜；取过夜培养物测OD₆₀₀值，由此计算在50ml诱导培养基中所需加入的过夜培养物的数量，诱导培养基初始OD值需达到0.4；按照计算所得的量取过夜培养物，4℃，1,500g离心5min，收集细胞；用1～2ml诱导培养基重悬细胞，接种与50ml诱导培养基，30℃振荡培养；在0、2、4、6、8、10、12小时的时候收集细胞。每个时段取样5ml，分别测OD₆₀₀值；4℃，1500g离心5min，收集细胞；弃上清，用500ul灭菌水重悬细胞；将细胞转移至1.5ml eppendorf管中，最高速离心30sec；弃上清，-80℃保存。

4.4、干扰素蛋白表达的鉴定

用500ul裂解液(BioDev-Tech，DB001-12)重悬细胞，4℃1500g离心5min，收集细胞；弃上清，用裂解液重悬细胞，将OD₆₀₀值调到50-100，加入等体积的玻璃珠(Sigma G-8772)振荡30sec，冰浴30sec，重复4次裂解细胞，然后取部分镜检观察细胞破碎效果；最高速离心10min；吸取上清液转移至另一干净的离心管中；加入SDS-PAGE样品缓冲液至终浓度为1×，煮沸5min；取20ul溶菌液加样，进行SDS-PAGE电泳，经过考马斯亮蓝染色，鉴定出表达蛋白的条带。结果如附图4所示。

实施例5、干扰素蛋白的生物学功能鉴定

5.1干扰素蛋白的提取

采用非变性梯度PAGE(6％～20％)电泳分离干扰素蛋白(方法参见《分子克隆实验指南》)，电极液为0.025mol/L Tris-0.192mol/Lgly(pH8.3)，100V电泳6小时后，切取部分蛋白条带染色，然后根据染色结果切取含有干扰素蛋白质的凝胶条带，装入处理过的透析袋中，加入适量缓冲液，放入电泳洗脱槽中，25mA4℃低温电泳2-3小时，收集干扰素蛋白液，冰冻干燥浓缩，再用高效液相层析(HPLC)纯化，用岛津Shim-Pack DIOL-150凝胶分离柱(柱长25cm，直径0.79cm)，洗脱液为含0.2mol/L Na₂SO₄的10mmol/L PB缓冲液(pH7.2)，流速1mL/min，检测波长280nm，干扰素样品经冰冻干燥浓缩，保存于-20℃，用于活性与功能等测定。使用前用半数细胞病变抑制(CPEI₅₀)法测得其活性为105U/ml，使用时用L-15或TC-199培养液配制成5000U/ml、500U/ml、250U/ml、50U/ml和5U/ml。

5.2诱导Mx表达功能鉴定

Mx蛋白是干扰素信号通路下游发挥抗病毒作用的重要因子，诱导Mx蛋白的表达是鉴定干扰素功能的重要指标。将提取的干扰素蛋白加入到草鱼ZC7901细胞中，分别于12小时、24小时、36小时取样提RNA(方法同实施例1)，用RT-PCR方法鉴定Mx基因的表达(附图5)。

引物序列如下：

上游引物(Mx-F)：5’-ACATGTCTCCAAGCACTTCTT-3’

下游引物(Mx-R)：5’-TATTGACTGTTCTGACCACCG-3

5.3干扰素蛋白的抗病毒活性测定

5.3.1在鱼类细胞水平的抗病毒活性测定

采用半数细胞病变抑制(CPEI₅₀)法进行，草鱼ZC7901和CP80胚胎细胞株，经不同稀释度的干扰素蛋白作用后，分别加入100TCID₅₀草鱼出血病病毒GCHV和草鱼小RNA病毒(GCPV)攻击，以能抑制50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素活性单位，用Log₂CPEI₅₀/0.1ml表示。结果如表2所示。

表2.GcIFN在ZC7901和CP80细胞中的活性测定

*用100TCID₅₀ GCHV(TCID₅₀＝10^5.8/0.1ml)和GCPV(TCID₅₀＝10^5.2/0.1ml)进行感染

**IFN滴度：Log₂CPEI₅₀/0.1ml，(X±SD)，n＝5

5.3.2鱼体水平的抗病毒活性测定

5.3.2.1通过注射途径给予干扰素的抗病试验

一龄草鱼(10～12cm长)，背鳍皮下注射IFN蛋白，0.1ml(10μg)/尾，12小时后人工感染GCHV(500TCID₅₀)/尾，28℃水温饲养2周，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率(Relative Percent Survival，RPS)，RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％，对照组注射空白PBS液。结果如表3所示，IFN通过注射方式，有明显的抗病效果，其注射组的成活率比对照组提高47.68％，免疫保护率达到59.42％。

表3.鱼体注射GcIFN的抗病试验结果

5.3.2.2通过饲喂途径给予干扰素的抗病试验

一龄草鱼饲喂含有干扰素的饲料(每公斤饲料添加GcIFN工程菌粉33mg，干扰素蛋白在酵母中的表达量30％，即10mg GcIFN/Kg饲料)，连续饲喂1周，人工感染GCHV 0.1ml(500TCID₅₀)/尾，28℃水温饲养2周，统计发病死亡率，计算相对免疫保护率。对照组饲喂不含干扰素的正常饲料。结果如表4所示，通过饲喂方式，也有明显的抗病效果，其试验组的成活率比对照组提高23.92％，免疫保护率达到29.58％。

表4.鱼体饲喂含GcIFN饲料的抗病试验结果

5.3.3草鱼干扰素的虾类抗病毒活性试验

采用饵料添加方式进行试验，将表达草鱼干扰素的酵母菌粉添加入配合饵料，饵料中干扰素含量为10mg GcIFN/Kg饵料，实验对虾分别采用中国对虾和南美白对虾。实验分5组，每组100尾，对照组饲喂不含干扰素的正常饵料。每天饲喂2次，连续饲喂7天，然后人工感染白斑综合症病毒(WSSV)。病毒感染采用投喂毒饵的方法进行，每天早晚各一次，连续投喂3天，维持水温20～25℃，1周后统计发病死亡率，计算相对免疫保护率RPS。结果如表5所示，草鱼IFN对两种虾类有明显的免疫抗病效果，试验组的免疫保护率分别达到11.60％和10.40％。

表5.草鱼干扰素对南美白对虾和中国对虾的抗病试验

组别死亡数(尾)	南美白对虾(对照组)	南美白对虾(试验组)	中国对虾(对照组)	中国对虾(试验组)
					试验1组	100	90	100	92
试验2组	100	86	100	89
					试验3组	100	89	100	88
试验4组	100	92	100	90
					试验5组	100	85	100	89
平均	100	88.40	100	89.60

RPS(％)

11.60

10.40

5.4干扰素的免疫调节功能测定

5.4.1草鱼干扰素对巨噬细胞的免疫调节作用

采用34％-51％Percoll密度梯度离心技术分离草鱼头肾巨噬细胞，在L-15培养液(含5％FCS、10％青霉素/链霉素)中27℃培养12小时，PBS清洗，2％台盼兰抽样染色，当活细胞量达98％以上时，加入500U/ml干扰素作用24小时，经PBS清洗3次后分别加入终浓度为10⁵个/ml、10⁴个/ml、10³个/ml和10²个/ml酵母菌，27℃培养0、3和5小时，测定酵母菌的MTT显色反应和巨噬细胞杀菌指数(KI)，同时设不加干扰素处理组作为对照。

结果表明，经干扰素激活后的巨噬细胞对酵母菌的吞噬和杀灭作用需要一个合适的作用时间，同时还需要巨噬细胞与酵母间有一个适当的比例。在105个左右巨噬细胞中接入10⁵或10⁴个酵母，并作用5小时后，所剩余的活酵母量与未经干扰素激活的巨噬细胞相比明显减少，杀菌力极显著地增强(见表6)。

表6.干扰素对草鱼巨噬细胞杀菌力的调节作用

P＜0.01 t检验，与不加GcIFN的对照组比较，括号内为KI值(X±SE，n＝5)

5.4.2干扰素对T、B淋巴细胞转化的调节作用

5.4.2.1干扰素对有丝***原PHA和ConA转化的T淋巴细胞的调节作用

采用ficoll密度梯度离心法分离外周血和头肾白细胞，经干扰素处理后分别加入终浓度为0.64mg/ml PHA和25mg/ml ConA，27℃培养24小时后进行3H-TdR标记(比度20Ci/mmol，浓度1mCi/ml，标记终浓度2μCi/ml)标记细胞，然后用TRI-CARB 2050 CA型液体闪烁仪测定样品的每分钟脉冲数(CPM)。

结果显示，干扰素对PHA和ConA转化外周血和头肾T淋巴细胞有明显的调节作用，表现在低浓度处理时，有显著的促进作用，而高浓度处理时，则有显著的抑制作用。干扰素促进PHA和ConA转化T淋巴细胞的剂量分别为500U/ml和250～500U/ml，抑制T淋巴细胞转化的剂量为5000U/ml，促进或抑制转化的时间均为12小时以上(见表7)。

表7.干扰素对PHA和ConA刺激的T淋巴细胞的调节作用

^＊0.01＜P＜0.05，^＊＊P＜0.01 t检验(X±SE，n＝5)

5.4.2.2干扰素对有丝***原LPS和SPA转化的B淋巴细胞的调节作用

外周血和头肾白细胞经干扰素处理后分别加入终浓度为125mg/ml LPS和250mg/ml SPA，27℃培养24小时后进行³H-TdR标记(比度20Ci/mmol，浓废1mCi/ml，标记终浓度2μCi/ml)标记细胞，然后用TRI-CARB 2050CA型液体闪烁仪测定样品的每分钟脉冲数(CPM)。

结果表明，干扰素调节SPA和LPS转化外周血和头肾B淋巴细胞的规律与调节T淋巴细胞相类似，也表现为低浓度产生促进作用，而高浓度产生抑制作用。产生促进作用的剂量为50～500U/ml，时间为12h以上，而产生抑制作用的剂量为5000U/ml，时间为24小时以上(见表8)。

表8.干扰素对LPS和SPA刺激的B淋巴细胞转化的调节作用

^＊0.01＜P＜0.05，^＊＊P＜0.01  t检验(X±SE，n＝5)

实施例6、表达草鱼干扰素的酵母工程菌的发酵生产与抗病饲料添加剂的研制

工程菌用10L发酵罐进行小规模发酵，挑取单菌落种子工程菌，加入200ml含2％棉籽糖的SC-U培养基中，30℃振荡培养过夜；取培养物测OD₆₀₀值，计算在10L发酵培养基中所需接种的培养物量，按发酵诱导培养基初始OD值需达到0.4的剂量，4℃1500g离心收集细胞，用适量发酵诱导培养基悬浮后，接种入发酵罐中，30℃发酵培养12～14小时。发酵后酵母细胞采用离心法(5000rpm，20min)沉淀收集，15～25kHz超声破碎，25～30℃气流干燥，制成酵母菌粉。取适量菌粉，加入SDS-PAGE样品缓冲液，用SDS-PAGE电泳法分离酵母菌粉中的干扰素蛋白，方法同前。用薄层扫描法测定干扰素在酵母细胞中的相对表达量，按每公斤鱼(虾)人工配合饲料含10mg GcIFN的剂量，添加含GcIFN的酵母工程菌粉(干扰素蛋白在酵母中的表达量一般可达到30％，则在每公斤鱼(虾)人工配合饲料中添加33mg酵母菌粉)。

实施例7、草鱼干扰素在水产养殖生产中的抗病试验

1、对养殖鱼类的抗病试验

试验在6～9月份进行，将养殖草鱼和鲈鱼的网箱分别分成8组，其中5组网箱为试验组，3组为对照组，使用含干扰素的饲料(每公斤饲料添加实施例5中制备的GcIFN工程菌粉33mg，干扰素蛋白在酵母中的表达量30％，10mgGcIFN/Kg饲料)投喂，连续投喂4周，统计自然发病死亡率，计算免疫保护率RPS。结果如表9和10所示，使用含干扰素饲料的实验组，成活率均明显提高，免疫保护率分别达到62.39％和48.61％，表明IFN能明显提高不同鱼类的免疫抗病能力。

表9养殖草鱼抗病试验效果表

表10养殖鲈鱼抗病试验效果表

2、对养殖虾类的抗病试验

试验在6～9月份进行。将养殖南美白对虾和中国对虾的网箱分别分成8组，其中5组网箱为试验组，3组为对照组，使用含干扰素的饵料(每公斤饲料添加实施例5中制备的工程菌粉33mg，干扰素蛋白在酵母中的表达量30％，10mgGcIFN/Kg饲料)投喂，连续投喂4周，统计自然发病死亡率，计算免疫保护率RPS。结果如表11和12所示，使用含干扰素饲料的实验组，成活率均明显提高，免疫保护率分别达到30.80％和20.99％，表明IFN能提高不同虾类的免疫抗病能力。

表11养殖南美白对虾抗病试验效果表

表12养殖中国对虾抗病试验效果表

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

SEQ ID NO.1

cagtgtagaa agctactact acctgaatac aaagatgaaa actcaaatgt ggacgtatat    60

gtttgtaatg tttttaactc tgcagggtca atgctctgct tgcgaatggc tcggccgata    120

caggatgata agcaacgagt ctttgagcct cctgaaggaa atgggtggaa aatatcctga    180

gggtaccaag gtgtcatttc caggacgcct gtacaacatg atagacaatg ccaaggtgga    240

ggaccaggtg aagtttcttg tcctgacctt agatcatatc atccgcctca tggatgccag    300

agagcacatg aattcagtgc agtggaacct acagactgta gagcattttc taactgtcct    360

gaacaggcag tcatctgatc ttaaagaatg tgtggcccga taccagccat cacataagga    420

gtcctacgag aaaaagataa acagacactt caagatttta aagaagaatc taaagaaaaa    480

agaatatagt gctcaagcat gggagcagat ccggagagct gtgaaacatc accttcagag    540

gatggacatc atcgcaagca ttgccaacag acgataagac ataatgacgg atgaatgact    600

tgtgacacat tccatggagt gaagaaaagt taatgtaaac aatgccttaa aagctaaaac    660

tgaatgtaac aaatatttat ttacatgact gtattttatt tcaactagag ttgaaagttt    720

tgcctaatgt ctggtgttgt aatatagagt ttaccttatg tgtttcctat gaaaacttga    780

agtaatctga tcaagcaagc taattatgtt tcttacaaaa acctgagaaa ccttgtattt    840

attttatttt ggtgcaaata ggcctatgtg cctaaactat acccagattt tttgctgaat    900

gtgaaaaaaa tgtttaaaaa aacaagcatg ccatgtattt caagtcatgt atttattaac    960

ggtcaatcaa ttatgttgtg atgcacatgg atatgatgta tgttttgtga ttgtttcaga    1020

tatttattat acttaattta cttcatacat tgttgtgcac aatttttgta tctctgaata    1080

ttttattctt tttatatgta ctgaatgctt gcgataatga tttgctctat ttgcttgcaa    1140

aatatttttg tacttttaaa taagaaattg attgaaaaaa aacaaaaaaa agtcgtgact    1200

gaaaaaacaa                                                           1210

Claims (2)

1、一种工程菌，其特征在于：该菌株INVSC1-pYES2-IFN为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，保藏号：CGMCC1847，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2006年10月19日。

2、如权利要求1所述的工程菌在制备水产动物抗病毒饲料添加剂中的应用。

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