CN106153798B

CN106153798B - 一种用于分析依鲁替尼及依鲁替尼制剂有关物质的hplc方法以及这些杂质做参比标准的用途

Info

Publication number: CN106153798B
Application number: CN201510194155.8A
Authority: CN
Inventors: 贾慧娟; 何学敏; 王艳鑫; 李衍; 李厚全
Original assignee: Beijing Creatron Institute Of Pharmaceutical Research Co Ltd
Current assignee: Beijing Creatron Institute Of Pharmaceutical Research Co Ltd
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-04-22
Also published as: CN106153798A

Abstract

本发明属于药物合成领域。具体地，本发明涉及依鲁替尼(1‑[(3R)‑3‑[4‑氨基‑3‑(4‑苯氧基苯基)‑1H吡唑并[3，4‑d]嘧啶‑1‑基]‑1‑哌啶基]‑2‑丙烯‑1‑酮)制备过程中出现的杂质及对依鲁替尼制剂进行分析的方法。检测杂质的方法包括如下步骤：(1)将依鲁替尼或含有依鲁替尼的药物溶解在溶剂中以制备样品溶液；(2)将化合物A～H中任何一种或多种的样品溶解在溶剂中以制备参比标准溶液或对照品溶液；(3)对样品溶液和参比标准溶液实施色谱技术；以及(4)通过参照该参比标准溶液中化合物A‑H的一种或多种，测定依鲁替尼或含有依鲁替尼的药物中化合物A～H中的任何一种或多种的存在。

Description

一种用于分析依鲁替尼及依鲁替尼制剂有关物质的HPLC方法以及这些杂质做参比标准的用途

技术领域

本发明属于药物合成领域。具体地，本发明涉及依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮)制备过程中出现的杂质及对依鲁替尼制剂进行分析的方法。

背景技术

Ibrutinib由美国Celera Genomics公司于2007年首先研制，后转让给加州的Pharmacyclics公司开发，2011年强生公司的子公司杨森制药(Jassen)参与合作开发。目前尚无标准的中文译名，因此本申请人在此将其音译为“依鲁替尼”。依鲁替尼的化学名称为：1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮，结构式为：

专利WO201384572A公开了对依鲁替尼的化学纯度进行了HPLC分析。按照该专利实施例8的方法对依鲁替尼粗品(实施例2中制备的未经异丙醇重结晶的)进行分析，所使用的高效液相色谱仪(HPLC)为Shimadzu LC-20A，PDA检测器(购自日本岛津公司)，结果如图1所示，其中图1中的最高峰为依鲁替尼的峰。由图1可知，该专利的分析方法存在如下弊端：

(1)依鲁替尼粗品中含有的杂质(该方法下保留时间约为：19.554min)对依鲁替尼主成分峰有干扰，二者分离度不符合ICH Q3A中对于有关物质方法学验证项下对专属性的要求，即杂质与主成分之间的分离度小于2.0；

(2)该分析方法运行时间较长，单针运行时间为60min；

(3)该方法杂质的计算方法为面积归一化法，由于各杂质结构不同，在拟定的检测波长下，紫外吸收情况是不同的，因此，面积归一化法并不能准确测定出各杂质在最终产品中的真实含量。

(4)并没有对依鲁替尼中的特定杂质进行定性分析。

综上所述，现有技术的检测结果并不能真实反应药物的质量。

发明内容

本发明提供了新的、可替换的方法，用于依鲁替尼和依鲁替尼制剂有关物质的定性、定量分析，并用这些杂质作为参比标准或对照品来进行杂质的定量和定性分析。本发明的另一个目的是提供参比标准或对照品，用于检测在制备依鲁替尼的过程中形成的称为A～H的杂质。

本发明提供的用于分析依鲁替尼或依鲁替尼制剂中有关物质的HPLC方法，其中，流动相包括两种或更多种液体，且液体的相对浓度随预定的梯度而变化。发明人利用8种制备和鉴定结构的杂质(称化合物A～H)用于依鲁替尼或含有依鲁替尼的药物制剂有关物质分析方法的参比标准或对照品。现有技术中尚未披露这些杂质及杂质的结构。

因此，本发明的第一个方面提供化合物A，其具有化学名：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮，并具有以下结构：

第二个方面提供化合物B，其具有化学名：(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮，并具有以下结构：

第三个方面提供化合物C，其具有化学名：(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮，并具有以下结构：

第四个方面提供化合物D，其具有化学名：(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸，并具有以下结构：

第五个方面提供化合物E，其具有化学名：1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物，并具有以下结构：

第六个方面提供化合物F，其具有化学名：1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮，并具有以下结构：

第七个方面提供化合物G，其具有化学名：1-((R)-3-(4-((3-((R-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮，并具有以下结构：

第八个方面提供化合物H，其具有化学名：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮，并具有以下结构：

化合物A～H为依鲁替尼合成过程中的中间体、副产物或降解杂质，适用于作为参比标准或对照品，用于该产品的质量控制。

以上杂质的产生途径如下：

杂质A：本杂质为市售胶囊剂中杂质，应该为原研工艺杂质，在本工艺多批次中从未检出。

杂质B：在中国专利申请号201510165869.6报道的依鲁替尼的合成方法第二步酰胺化反应中，酰胺化发生在依鲁替尼中间体-1(表示为YLTN-1)的两个位置，哌啶环中的氮以及嘧啶环上的氮，产生双酰胺化产物杂质B-1，后者由于热力学作用，发生分子内关环，生成更加稳定的双嘧啶环杂质B。

杂质C：在中国专利申请号201510165869.6报道的依鲁替尼的合成方法第二步酰胺化反应中，起始原料丙烯酸酐中含有少量醋酸酐杂质，与YLTN-1发生酰胺化反应生成杂质C。

杂质D：在中国专利申请号201510165869.6报道的依鲁替尼的合成方法第二步酰胺化反应中，依鲁替尼(YLTN)与副产物丙烯酸在碱的催化下(可能是N，N-二异丙基乙胺、也可能为依鲁替尼自身的含氮杂环)发生Baylis-Hillman反应而产生杂质D。

杂质E、F、G为依鲁替尼活性成分或包含依鲁替尼的药物制剂的强制降解样品中的主要降解杂质，其中杂质E为依鲁替尼或依鲁替尼制剂制备过程中氧化降解的主要产物，杂质F、G为依鲁替尼或依鲁替尼制剂制备过程中的降解产物，也是依鲁替尼碱性条件下强制降解或水解的主要降解产物。

杂质H：在中国专利申请号201510165869.6报道的依鲁替尼的合成方法第二步酰胺化反应中，起始原料丙烯酸酐含有少量丙酸酐杂质，会与中间体-1发生反应生成杂质H：

在一个特别优选的实施方式中，根据本发明的化合物A～H为单体化合物，最优选的是纯的形式，优选纯度高于约95％、优选纯度高于约98％、最优选纯度高于约99％，优选通过HPLC测量。

根据本发明的第九个方面提供一种检测依鲁替尼或含有依鲁替尼的药物剂型的样品纯度的方法，该方法包括测定依鲁替尼样品中含有本发明的化合物A～H中的一种或多种。在本发明的方法中，所述化合物用作杂质的参比标准或对照品。

根据本发明的第十个方面，提供一种用于表征化合物A～H的方法，该方法利用HPLC方法来分析依鲁替尼中的所述杂质A～H。优选该HPLC方法为LC-MS相容的方法。

因此，提供了根据本发明的化合物A～H(一种或多种)在检测依鲁替尼或含有依鲁替尼的药物制剂的样品纯度中作为参比标准或对照品的用途。

另一方面，本发明还提供一种用于检测依鲁替尼样品纯度的色谱方法，所述方法包括：通过利用根据本发明的参比标准或对照品在替换实施方式中利用根据本发明的参比标准或对照品，来测定样品中化合物A～H中的一种或多种的存在。

又一个方面，提供一种通过测定含有依鲁替尼的样品中化合物A～H中任何一种或多种的存在来检测依鲁替尼样品的纯度的色谱方法，所述方法包括：

(1)将依鲁替尼或含有依鲁替尼的制剂样品溶解在溶剂中以制备样品溶液；

(2)将化合物A～H中任何一种或多种的样品溶解在溶剂中以制备参比标准溶液或对照品溶液；

(3)对样品溶液和参比标准溶液实施色谱技术；以及

(4)通过参照该参比标准溶液中存在的已知化合物A-H(一种或多种)的存在，测定样品中化合物A～H中的任何一种或多种的存在。

在一种实施方式中，该色谱方法为液相色谱法，如HPLC、UPLC、LC-MS；优选该色谱法为HPLC法，优选梯度HPLC法。

本发明优选使用的固定相为反相。合适的固定相包括十八烷基硅烷键合硅胶或辛基硅烷键合硅胶。

在本发明的优选实施方式中，提供一种梯度HPLC方法，其中，流动相包括含缓冲溶液(A)和有机溶剂(B)的组合。优选缓冲溶液(A)为含水缓冲液，优选为醋酸盐、甲酸盐、磷酸盐、三氟醋酸、甲酸或它们的混合物的水溶液。更优选的缓冲溶液(A)为醋酸盐，最优选为醋酸铵和醋酸或醋酸铵的水溶液用醋酸调节过pH的水溶液。在特别优选的实施方式中醋酸铵存在的浓度约为0.001M至1.0M，优选0.02M至0.08M，更优选0.02M至0.05M，最优选0.03M。优选有机溶剂(B)为极性质子溶剂，如甲醇、乙醇或异丙醇；或偶极非质子溶剂，如乙腈。优选有机溶剂(B)选自包括甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇或它们的混合物的组中，最优选的为乙腈。

本发明特别优选的流动相包含醋酸铵和醋酸的水溶液(A)和乙腈(B)的组合。

进一步提供根据本发明的梯度HPLC方法，其中流动相包含如下的梯度设计：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	60	40
12	60	40
			22	20	80
27	20	80
			27.01	60	40
35	60	40

进一步优选的实施方式中，HPLC方法中的缓冲溶液(A)醋酸铵和醋酸的水溶液的pH为约3.8～5.8，优选为约4.0～5.5，4.0～5.0，4.3～4.7，最优选为4.3～4.7。

在其它实施方式中，该HPLC分析方法在约20～40℃的温度下进行，优选为25～40℃，30～40℃，最优选为30～40℃。

在其它实施方式中，该HPLC分析方法在约0.4～1.2ml/min的流速下进行，优选为0.5～1.1ml/min，0.6～1.0ml/min，0.7～0.9ml/min，最优选为0.8ml/min。

根据本发明的HPLC方法以单次操作有效地检测并定量包括那些选自以下化合物中的化合物的所有杂质：

化合物A：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮。

化合物B：(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮。

化合物C：(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮。

化合物D：(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸。

化合物E：1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物。

化合物F：1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮。

化合物G：1-((R)-3-(4-((3-((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮。

化合物H：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮。

本发明可用于分析作为活性药物成分(API)的依鲁替尼和/或药物组合物中的依鲁替尼。本发明能够分析的药物组合物包括固体或液体组合物，并可选地包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。固体形式的组合物包括粉剂、片剂、胶囊剂、丸剂以及可分散的颗粒剂等。液体组合物包括溶液或悬浮液，其可通过口服、注射或滴注途径给药。说明书与权利要求书通篇所使用的术语“依鲁替尼”是指依鲁替尼和/或溶剂化物(如水合物)。说明书通篇所使用的术语“杂质”或“有关物质”可意指在制造API或药物组合物中形成的杂质，以及/或者API降解形成的杂质或在储存中的药物组合物或制剂中形成的杂质。

如上所述，现有技术中所报道的HPLC方法，不适合用于分析依鲁替尼及含有依鲁替尼的制剂或药物组合物。

然而，本发明的方法解决了这一问题，并且以单次操作有效地检测并定量、定性分析这种特定合成过程或制剂制备中形成的所有杂质和中间体。本发明的优势在于：披露了依鲁替尼和依鲁替尼制剂中的杂质的具体结构，并运用梯度HPLC法同时将极性杂质和非极性杂质洗脱出来，并进行定性、定量分析。

本发明特别适合于测定和定量样品中化合物A～H中的一种或多种的存在。除非另有描述，否则本文中的术语“杂质”和“化合物”在与化合物A～H相关的范围下，可以互换使用。

本发明的优势还在于，这种方法对于依鲁替尼及含依鲁替尼的制剂中的有关物质的分析具有专属性强，准确度、精密度高、耐用性好等特点。此外，本发明具有高度灵敏度，且允许检测和定量依鲁替尼API或药物组合物中水平量显著低于药监部门和ICH指导原则中规定的可接受限值的有关物质。

此外，本发明的方法可用于检测和定量依鲁替尼样品或药物组合物储存过程中形成的所有降解杂质。通过按照ICH Q1A指南进行强制降解研究来确定该方法，并按照ICHQ2A指南进行验证，该验证覆盖以下项目：专属性、线性与范围、精密度、准确度、检测限、定量限、耐用性及***适应性。

本发明人开发出的新型梯度HPLC方法已定性测定八种杂质A～H。所述方法能够一次性分析按照本实施例制备的依鲁替尼制备工艺中以及市售依鲁替尼及储存过程中产生的副产物、降解杂质等极性差异较大的杂质，因此，本发明人认为梯度设计最为合适。

在实施本发明中，本发明的发明人发现含有十八烷基硅烷键合硅胶或辛基硅烷键合硅胶的固定相最为有利。特别优选的固定相含有Waters COTRECS C18(4.6×150mm，2.7μm)柱。

本发明方法优选包括梯度设计，使得流动相A和B的相对浓度在10～60分钟时间典型地变化为100％A∶0％B至0％A∶100％B的梯度。优选地，经过15至55分钟时间，梯度为100％A∶0％B至0％A∶100％B，更优选地，经过20至50分钟时间，梯度为70％A∶30％B至0％A∶100％B，最优选地，经过约20分钟，梯度为65％A∶35％B至10％A∶90％B或60％A∶40％B至15％A∶85％B或60％A∶40％B至20％A∶80％B。这种梯度法的优势在于，能够将依鲁替尼API或依鲁替尼药物组合物中各种不同极性或极性非常相近的杂质全部分离开，便于准确的定性和定量。

使用的流动相优先选自一种或多种缓冲溶液(A)和一种或多种有机溶剂(B)的组合。

缓冲溶液优先选自包括磷酸盐、醋酸盐、甲酸盐、三氟醋酸、甲酸或醋酸它们的混合物的水溶液组合。

缓冲溶液的浓度可以为0.001M至1.0M，优选浓度为0.02M至0.08M，更优选浓度为0.02M至0.05M，最优选0.03M。特别优选的流动相包含醋酸铵和醋酸的水溶液，或醋酸铵溶液用醋酸调节pH的水溶液(A)和乙腈(B)的组合。

在根据本发明的特别优选的实施方式中，进一步提供一种梯度HPLC的方法，其中流动相包括如下的梯度设计：

本发明还提供的特别优选的HPLC梯度方法，其中，流动相包含醋酸铵和/或醋酸作为缓冲溶液(A)。在另外特别优选的实施方式中，流动相包含乙腈作为有机溶剂(B)，和/或乙腈-甲醇混合溶剂作为有机溶剂(B)。发明人发现当流动相包含醋酸铵和/或醋酸(A)和乙腈(B)时梯度设计尤其有效。

缓冲溶液(A)可含有一种或几种附加溶剂，这些附加溶剂可以是甲醇、乙醇、异丙醇或它们的混合物作为有机溶剂。缓冲溶液(A)中的附加溶剂可以是或不是与有机溶剂(B)相同的溶剂。缓冲溶液(A)中的附加溶剂优选为乙腈。

缓冲溶液(A)的pH为约3.8～5.8，优选为约4.0～5.5，4.0～5.0，4.3～4.7，最优选为4.3～4.7。

本发明的HPLC方法在约20～40℃的温度下进行，优选为25～40℃，30～40℃，最优选为30～40℃。

该分析方法在约0.4～1.2ml/min的流速下进行，优选为0.5～1.1ml/min，0.6～1.0ml/min，0.7～0.9ml/min，最优选为0.8ml/min。

本发明的另一方面提供一种参比标准溶液。该溶液包含溶解于合适溶剂(如乙腈)中的一种或多种化合物A～H。所述参比标准溶液可用于测定在利用根据本发明的色谱技术进行分析的样品中作为杂质的任何化合物A～H的存在。

根据本发明的另一方面，提供一种参比标准溶液，其中，已知量的一种或多种化合物A～H溶解于合适的溶剂(如乙腈)中。所述参比标准溶液可用于测定在利用根据本发明的色谱技术进行分析的样品中作为杂质的任何化合物A～H的定性和定量。所述分析的方法对于技术人员的重要和方便是显而易见的。

本发明人已广泛验证本发明的方法，验证结果表明本方法的专属性强、准确度、精密度和灵敏度高，耐用性好。

附图说明：

图1为按照WO201384572A实施例8公开的方法对依鲁替尼粗品(实施例2中制备的未经异丙醇重结晶的依鲁替尼)进行HPLC分析图谱。

图2：中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺的¹H-NMR；

图3：中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺的高分辨质谱；

图4：依鲁替尼：1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮的¹H-NMR；

图5：依鲁替尼：1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮的高分辨质谱。

图6：杂质A：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮的¹H-NMR；

图7：杂质A：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮的高分辨质谱；

图8：杂质B：(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮的¹H-NMR；

图9：杂质B：(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮的高分辨质谱；

图10：杂质C：(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮的¹H-NMR；

图11：杂质C：(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮的高分辨质谱。

图12：杂质D：(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸的¹H-NMR；

图13：杂质D：(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸的高分辨质谱；

图14：杂质H：((R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮的¹H-NMR；

图15：杂质H：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮的高分辨质谱；

图16：杂质E：1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物的¹H-NMR。

图17：杂质E：1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物的高分辨质谱。

图18：杂质F：1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮的¹H-NMR。

图19：杂质F：1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮的的高分辨质谱。

图20：杂质G：1-((R)-3-(4-((3-((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮的¹H-NMR。

图21：杂质G：1-((R)-3-(4-((3-((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮的高分辨质谱；

图22.加标混合溶液的HPLC谱图。

图23.实施例2制备的依鲁替尼供试品溶液的HPLC谱图。

图24.市售依鲁替尼胶囊供试品溶液的HPLC谱图。

具体实施方式

虽然本发明已对其具体实施方式进行描述，然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围之内。

通过以下实施例对本发明进行阐述，以下实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-胺的合成

向500mL的反应瓶中加入155mL四氢呋喃，搅拌下依次加入3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-D]嘧啶-4-胺(SM1)(5g，1eq)、(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶(SM2)(4.97g，1.5eq)、三苯基膦(13g，3.0eq)。控温25℃条件下，在30分钟内，滴加偶氮二甲酸二异丙酯的四氢呋喃溶液(将10g，3.0eq偶氮二甲酸二异丙酯溶于10mL的四氢呋喃中)。滴加完成后，控温25℃，继续反应5小时(TLC监测：醋酸乙酯∶甲醇＝10∶1)。搅拌下减压蒸馏。控温15℃，向剩余物中滴加30mL浓盐酸，滴加时间30分钟，滴加完成后，控温25℃，继续反应2小时。用二氯甲烷萃取水相三次(每次75mL)，保留水相。用50mL醋酸乙酯萃取一次。剩余水相充分搅拌，控温15℃，滴加约45g 20％的氢氧化钠水溶液，使用pH试纸监测反应液，pH＝5～6(滴加时间约30分钟)得浅黄色固体。将上述固体通过乙醇重结晶两次，得到类白色粉末2.87g，收率：45％。¹H-NMR(400Mz，DMSO-d₆)δ：8.226(s，1H)，7.656～7.634(m，2H)，7.435～7.395(m，2H)，7.185～7.094(m，5H)，4.689～4.635(m，1H)，3.081～3.043(m，1H)，2.957～2.930(m，1H)，2.901～2.873(m，1H)，2.490～2.457(m，1H)，2.125～2.015(m，2H)，1.750～1.717(m，1H)，1.589～1.518(m，1H)(详见图2)；ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝387.19449[M+H]+，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(387.19279)相符。绝对误差为4.41ppm，在高分辨质谱误差范围之内。(详见图3)

实施例2：依鲁替尼的制备

氮气保护下，向100mL三口瓶中依次加入50mL二氯甲烷，中间体-1(5g，1eq)，N，N-二异丙基乙胺(2g，1.2eq)。控温-10℃条件下，开始滴加丙烯酸酐(1.96g，1.2eq)的二氯甲烷溶液，滴加时间30分钟，滴加完成后，溶液由浑浊变澄清，保温-10℃，充分搅拌至原料反应完全(TLC检测，甲醇∶醋酸乙酯∶三乙胺＝1∶5∶0.05)。反应液用200mL 5％柠檬酸水溶液洗涤，去除水相，浓缩蒸除二氯甲烷。向剩余物用异丙醇重结晶三次，得依鲁替尼成品：3.63g。¹H-NMR(400Mz，DMSO-d₆)δ：8.259(s，1H)，7.654～7.674(m，2H)，7.405～7.444(m，2H)，7.109～7.195(m，5H)，6.676～6.743(m，1H)，6.046～6.152(m，1H)，5.570～5.713(m，1H)，4.690～4.716(m，1H)，4.554～4.583(m，0.5H)，4.208(m，1H)，4.052～4.085(m，0.5H)，3.674～3.731(m，0.5H)，3.184～3.214(m，1H)，2.972～3.027(m，0.5H)，2.245～2.282(m，1H)，2.128(m，1H)，1.903～1.937(m，1H)，1.577～1.605(m，1H)(详见图4)ESI-HRMS谱图显示分子离子峰：441.20366[M+H]⁺，依鲁替尼分子离子峰的理论计算值为：441.20335[M+H]⁺，绝对误差为0.71ppm，符合高分辨质谱误差范围，实测值与理论值相符。(详见图5)。

实施例3：杂质A：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮的合成。

氮气保护下，向100mL的三口瓶中加入50ml二氯甲烷，搅拌下依次加入中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-胺(YLTN-1)(1.00g，1eq)，N，N-二异丙基乙胺(0.40g，1.2eq)，降温至-20～-10℃，开始滴加3-氯丙酰氯(1.46g，1eq)，滴加完毕，溶液由浑浊变澄清，继续搅拌20～30分钟，LC-MS检测，原料消失，减压蒸馏，蒸除二氯甲烷至无馏分蒸出，得到粗品用柱层析方法提纯，洗脱比例为：甲醇∶醋酸乙酯＝1∶10，收集洗脱液共400mL，减压蒸馏，蒸除溶剂至无馏分蒸出。得类白色粉末830mg为(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮。¹H-NMR(400Mz，CDCl₃)δ：8.382(d，J＝13.2Hz，1H)，7.660～7.638(m，2H)，7.419～7.380(m，2H)，7.200～7.083(m，5H)，5.751(m，2H)，4.891～4.853(m，1H)，4.842～4.812(m，0.5H)，4.558(m，0.5H)，4.066～4.033(m，0.5H)，3.844～3.833(m，1H)，3.773～3.746(m，0.5H)，3.355(m，0.5H)，3.191(m，0.5H)，2.877～2.843(m，2H)，2.812～2.795(m，1H)，2.434～2.270(m，2H)，2.048～1.955(m，1H)，1.756～1.689(m，1H)。(详见图6)ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝477.17930[MW+H]+，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(476.17275)相符。绝对误差为1.52ppm，在高分辨质谱误差范围之内。(详见图7)。杂质A在HPLC谱图上相对主成分依鲁替尼的相对保留时间(RRT)约为1.06。

实施例4：杂质B：(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮的合成。

氮气保护，向250mL的三口瓶中加入100ml二氯甲烷，搅拌下依次加入中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-胺(YLTN-1)(2.00g，1eq)，N，N-二异丙基乙胺(1.30g，2.0eq)降温至-20℃～-10℃。开始滴加丙烯酸酐(1.33g，2eq)，滴加过程控温-10℃以下；滴毕，继续搅拌20～30分钟，LC-MS检测，有目标产物生成，控温30～40℃，真空度：-0.08MPa，减压蒸馏，蒸除二氯甲烷至无馏分蒸出；得到粗品用柱层析方法提纯，洗脱比例为：甲醇∶醋酸乙酯＝1∶5，收集洗脱液，控温30～40℃，真空度：-0.08MPa，减压蒸馏，蒸除溶剂至无馏分蒸出。得类白色粉末531mg为(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮。¹H-NMR(400Mz，CDCl₃)δ：8.352(m，2H)，7.874(m，2H)，7.367～7.328(m，2H)，7.144～7.050(m，5H)，6.591～6.558(m，1H)，6.335～6.293(m，1H)，5.747～5.658(m，1H)，4.803(m，1H)，4.649～4.622(m，0.5H)，4.300(m，0.5H)，4.333～4.300(m，2H)，4.153(m，0.5H)，4.051～4.019(m，0.5H)，3.751～3.680(m，0.5H)，3.354～3.217(m，1H)，2.902(m，0.5H)，2.789～2.770(m，2H)，2.397～2.223(m，2H)，2.194～2.022(m，1H)，2.005～1.718(m，1H)(详见图8)。ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝495.21580[MW+H]⁺，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(494.20664)相符。绝对误差为3.82ppm，在高分辨质谱误差范围之内(详见图9)。杂质B在HPLC谱图上相对主成分依鲁替尼的相对保留时问(RRT)约为0.97。

实施例5：杂质C：(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮的合成

将中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-胺(YLTN-1)(2.00g，1eq)溶解于二氯甲烷(50ml)中，加入N，N-二异丙基乙基胺(0.80g，2eq)，降温至-10℃，氮气保护，滴加醋酸酐(0.53g，1eq)，加毕，反应30分钟，LC-MS监控，反应完成，将体系减压浓缩至干，剩余物通过硅胶柱层析，洗脱液：醋酸乙酯∶甲醇＝10∶1，得类白色粉末1.38g为(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮。¹H-NMR(400Mz，CDCl₃)δ：8.352(d，J＝16Hz，1H)，7.657～7.623(m，2H)，7.402～7.364(m，2H)，7.187～7.069(m，5H)，5.971(m，2H)，4.849～4.841(m，0.5H)，4.841～4.821(m，1H)，4.574～4.541(m，0.5H)，4.045～4.005(m，0.5H)，3.864～3.831(m，0.5H)，3.744～3.685(m，0.5H)，3.318～3.253(m，0.5H)，3.201～3.141(m，0.5H)，2.802～2.745(m，0.5H)，2.403～2.249(m，2H)，1.962～1.697(m，2H)(详见图10)；ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝429.20416[MW+H]⁺，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(428.19607)相符。绝对误差为1.89ppm，在高分辨质谱误差范围之内(详见图11)。杂质C在HPLC谱图上相对主成分依鲁替尼的相对保留时间(RRT)约为0.96。

实施例6：杂质D：(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸的合成

氮气保护下，将依鲁替尼1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮(2g，1eq)溶解于二氯甲烷(50ml)中，依次加入N，N-二异丙基乙基胺(0.70g，2eq)，丙烯酸(0.98g，3eq)，反应升温至35℃，搅拌36小时，将体系减压浓缩至干，剩余物通过硅胶柱层析，洗脱液：醋酸乙酯∶甲醇＝8∶1，得类白色粉末103mg为(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸，¹H-NMR(400Mz，DMSO-d₆)δ：12.309(br，1H)，8.263(S，1H)，7.687～7.666(m，2H)，7.422～7.461(m，2H)，7.122～7.211(m，5H)，6.009～6.072(m，0.5H)，5.570～5.660(m，0.5H)，4.647～4.772(m，1H)，4.516～4.547(m，0.5H)，4.200-4.232(m，0.5H)，4.069-4.101(m，0.5H)，3.913～3.945(m，0.5H)，3.629-3.655(m，0.5H)，3.129～3.157(m，1H)，2.878(m，0.5H)，2.445-2.513(m，4H)，2.206～2.264(m，1H)，2.085～2.125(m，1H)，1.861～1.936(m，1H)，1.522～1.666(m，1H)(详见图12)；ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝513.22606[MW+H]⁺，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(512.21720)相符。绝对误差为3.09ppm，在高分辨质谱误差范围之内(详见图13)。杂质D在HPLC谱图上相对主成分依鲁替尼的相对保留时间(RRT)约为1.02。

实施例7：杂质H：(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮的合成

氮气保护下，将中间体-1：(R)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-胺(YLTN-1)(2.00g，1eq)溶解二氯甲烷(50mL)中，加入N，N-二异丙基乙基胺(0.80g，2eq)，降温至-10℃，氮气保护，滴加丙酸酐(0.67g，1eq)，加毕，反应30分钟，LC-MS监控，反应完成，将体系减压浓缩至干，剩余物通过硅胶柱层析，洗脱液：醋酸乙酯∶甲醇＝10∶1，得浅粉色粉末1.72g为(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮。¹H-NMR(400Mz，CDCl₃)δ：8.338～8.302(m，2H)，7.658～7.627(m，2H)，7.440～7.400(m，2H)，7.224～7.097(m，5H)，4.881～4.634(m，1H)，4.881～4.826(m，1H)，4.108～3.094(m，1H)，2.762(m，1H)，3.310～3.167(m，1H)，2.452～2.315(m，4H)，1.213～1.157(m，3H)，2.069～1.691(m，2H)(详见图14)；ESI-HRMS谱图显示分子离子峰m/z＝443.25380[MW+H]⁺，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值(442.21172)相符。绝对误差为3.66ppm，在高分辨质谱误差范围之内(详见图15)。杂质H在HPLC谱图上相对主成分依鲁替尼的相对保留时间(RRT)约为1.04。

实施例8：杂质E：1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物的制备

(1)杂质E的制备

取实施例2制备的未经异丙醇三次重结晶的依鲁替尼约5.17g，置500ml反应瓶中，加150ml 80％乙腈-水溶解，再加30％双氧水30ml，室温搅拌过夜，反应结束，向反应液中加入硫代硫酸钠，至无气泡产生，35℃减压浓缩至无液体流出，再加3倍水相体积的醋酸乙酯，萃取，收集有机相，合并，35℃减压浓缩至干，得依鲁替尼杂质E粗品2.65g。LC-MS检测粗品纯度为51.26％，液相色谱上相对于依鲁替尼峰的相对保留时间为0.98，质荷比[MW+H]⁺为457.2。

(2)杂质E粗品的提纯

将2.95g上述制备的杂质E粗品用DMSO溶解成浓度约为150mg/ml的溶液，采用以下制备色谱法进一步纯化：

色谱柱(购自艾杰尔科技)：采用粒径10μm的C18填料，用异丙醇匀浆后装柱(50mm×250mm)；

流动相：水和乙腈

流速：120ml/min；

检测波长：254nm；

进样量：10ml

梯度洗脱，洗脱程序为：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	65	35
10	65	35
			30	45	55
50	45	55
			50.01	20	80

55	20	80
			55.01	65	35
60	65	35

收集保留时间为30～37min的峰所对应的馏分；LC-MS或HPLC检测杂质E的纯度。

35℃减压浓缩所收集的馏分至无液体流出，加入3倍体积的醋酸乙酯萃取，收集有机相，合并，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液30℃减压浓缩至干，得到2.06g浅粉色固体，经HPLC测定，纯度为98.97％，总收率为36.6％。

(3)杂质E的结构鉴定

杂质E的1H-NMR图参见图16，高分辨质谱参见图17。

杂质E的高分辨质谱(ESI源)显示其质荷比[M+H]⁺为457.19930，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值456.19099的绝对误差为2.27ppm，符合高分辨质谱的误差范围。参考式(2)依鲁替尼的结构，结合杂质E的¹H-NMR、¹³C-NMR谱鉴定其结构式如下式E所示。

杂质E高分辨质谱显示其分子量与所提供的分子式是完全相符的；

表1杂质E的核磁共振¹H-NMR、¹³C-NMR解析结果

杂质E的核磁共振氢谱、碳谱所显示的信息能够对所提供的式E化合物分子结构式上氢、碳全部归属。因此，依鲁替尼杂质E与所提供的式E分子结构式是相符的。

实施例9：杂质F：1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮和杂质G：1-((R)-3-(4-((3-((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮的制备。

(1)杂质F和杂质G的制备

在1000ml反应瓶中加入约20g实施例2制备的未经异丙醇三次重结晶的依鲁替尼，加入250ml乙腈和200ml 5M氢氧化钠水溶液，80℃水浴加热反应40min，冷却至室温，加5MHCl中和至中性，35℃减压浓缩至无液体留出，加入5倍水相体积的醋酸乙酯萃取，收集上层有机相，合并，35℃减压浓缩至干，得到依鲁替尼杂质F、G粗品18.72g，LC-MS检测粗品纯度，根据对应MS离子峰，液相色谱上相对依鲁替尼峰的相对保留时间约为0.94(杂质F)和1.15(杂质G)的峰为目标物，其粗品中的含量分别为16.9％(杂质F)和18.4％(杂质G)。

(2)杂质F和杂质G粗品的提纯

将上述制备的18.72g杂质F、G的粗品加DMSO溶解成10ml的溶液，上样；

中压制备柱(购自Agela公司)：Agela XBP C18填料，480g，填料粒径：20～35μm

流动相：水(0.05％TFA)和纯乙腈

流速：40ml/min

检测波长：254nm

上样量：～5g

梯度洗脱，洗脱程序为：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	75	25
5	75	25
			30	65	35
40	65	35
			50	50	50
55	50	50
			55.01	75	25
60	75	25

分别收集所有峰的馏分，LC-MS或HPLC确认目标产物。收集30～33min的馏分(杂质F)和40～44min的馏分(杂质G)，合并相同馏分，分别减压浓缩，至无液体流出，水相中加入3倍体积的醋酸乙酯萃取，收集有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液。减压浓缩至干，分别得依鲁替尼杂质F纯品2.21g和依鲁替尼杂质G二次分离粗品2.57g。经LC-MS或HPLC检测分析，依鲁替尼杂质F的纯度为98.15％，依鲁替尼杂质G二次分离粗品的纯度为85.32％。

(3)杂质G的二次分离

上述制备的2.57g依鲁替尼杂质G二次分离粗品加10ml DMSO溶解

依鲁替尼杂质G二次分离所采用的条件为：

色谱柱：Waters XBridge C8 30mm×100mm，5μm

流动相：水和乙腈

检测波长：254nm

流速：25ml/min

梯度洗脱，洗脱程序如下：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	75	25
5	75	25
			15	35	65
25	35	65
			25.01	75	25
30	75	25

进样体积：每次2ml/次；

收集保留时间26min～30min的馏分，并用LC-MS确认目标物纯度。合并相同馏分、35℃减压浓缩至无乙腈流出，加3倍体积的醋酸乙酯萃取，合并有机相，加无水硫酸钠干燥、过滤，减压浓缩至干，得到依鲁替尼杂质G纯品1.64g，类白色固体粉末，LC-MS检测纯度为95.13％。

(4)杂质F的结构鉴定

杂质F的¹H-NMR图参见图18，高分辨质谱参见图19。

杂质F的高分辨质谱(ESI源)显示其质荷比[M+H]⁺为827.39065，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值826.34520的绝对误差为2.16ppm，符合高分辨质谱的误差范围。样品的高分辨质谱显示其分子量与所提供的分子式是完全相符的。参考依鲁替尼的结构，结合本品的¹H-NMR、¹³C-NMR、H-HCOSY、HMBC、HSQC、DEPT谱鉴定其结构式如下式F所示。

表2为杂质F¹H-NMR、H-HCOSY、及HMBC解析数据

表3杂质F¹³C-NMR、DEPT、HSQC、HMBC数据解析

由样品的¹H-NMR、H-HCOSY、及HMBC谱可知，其结构中氢质子数目与式F化合物的结构相符。由样品的¹³C-NMR、DEPT、HSQC及HMBC谱可知，其结构中的碳数目与式F化合物的结构相符。核磁氢谱、碳谱以及二维谱数据能对结构式上的氢和碳进行合理归属和关联。

(5)杂质G的结构鉴定

杂质G的¹H-NMR图参见图20，高分辨质谱参见图21。

杂质G的高分辨质谱(ESI源)显示其质荷比[M+H]⁺为881.40140，所对应的分子量与提供的结构式理论计算值880.39215的绝对误差为1.43ppm，符合高分辨质谱的误差范围。样品的高分辨质谱显示其分子量与所提供的分子式是完全相符的。结合依鲁替尼的结构，结合本品¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、H-HCOSY、HMBC及HSQC谱鉴定其结构如下式G所示。

表4为杂质G的¹H-NMR、H-HCOSY及HMBC数据及氢归属

表5为杂质G的¹³C-NMR、DEPT、HSQC及HMBC数据及碳归属

根据样品的¹H-NMR谱、结合H-HCOSY、HMBC二维谱可知，其结构中氢质子数目与式G化合物的结构相符。由样品的¹³C-NMR、DEPT、HSQC及HMBC谱可知，其结构中的碳数目与式G化合物的结构相符。

实施例10：依鲁替尼有关物质的HPLC分析

利用杂质外标法(2010年版中国药典)，分析依鲁替尼中有关物质，并用外标法对各杂质进行定量。杂质的定量按照外标法进行计算，具体参见中国药典2010版二部附录VD。用于进行所述分析的方法为根据本发明的梯度HPLC方法。使用的色谱条件如下：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.02M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至4.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：40℃

流速：0.8ml/min

梯度设计如下所述。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	60	40
12	60	40
			22	20	80
27	20	80
			27.01	60	40

35

60

40

样品配制：

制备杂质定位溶液

(1)化合物A～H标准定位溶液：分别取化合物A～H 10mg，精密称定，分别置100ml容量瓶中，加乙腈超声使溶解，并用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为化合物A～H贮备溶液。

(2)加标混合溶液：取上述制备的依鲁替尼原料药100mg，精密称定，置100mg量瓶中，再精密加入化合物A～H贮备溶液各1ml，加80％乙腈-水适量，超声使溶解，再用80％乙腈-水稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含依鲁替尼约1mg、含化合物A～H分别约1μg的混合溶液，作为加标混合溶液。

(3)制备化合物A～H参比标准溶液或对照品溶液：精密量取化合物A～H贮备溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，用80％乙腈-水稀释至刻度，摇匀，制成每1ml约含化合物A～H分别为1μg的溶液，作为化合物A～H的参比标准溶液或对照品溶液。

(4)制备依鲁替尼供试品溶液：取上述制备的依鲁替尼原料药10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加80％乙腈-水适量，超声使溶解，并用80％乙腈-水稀释至刻度，摇匀，既得。依鲁替尼原料药供试品溶液的浓度约为1.0mg/ml。

(5)依鲁替尼胶囊供试品溶液的制备：取依鲁替尼胶囊(Imbruvica购自Pharmacyclics Janssen公司，140mg，批号：L0404951)内容物研细粉末适量(约含依鲁替尼10mg)，精密称定，置10ml容量瓶中，加80％乙腈-水适量，超声使溶解，并用80％乙腈-水稀释至刻度，摇匀，用0.22μm有机针式过滤器过滤，弃去初滤液2ml，取续滤液，作为依鲁替尼胶囊供试品溶液。依鲁替尼胶囊供试品溶液的浓度约为1.0mg/ml。

实施例11：

依鲁替尼的制备同实施例2，样品配制同实施例10，梯度设计同实施例10。

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.08M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至4.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：40℃

流速：0.6ml/min

实施例12：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.08M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至5.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：40℃

流速：0.8ml/min

实施例13：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.02M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至5.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：25℃

流速：1.0ml/min

实施例14：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.05M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至4.5)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：35℃

流速：0.6ml/min

实施例15：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.03M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至5.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：40℃

流速：0.6ml/min

实施例16：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.03M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至4.5)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：35℃

流速：0.8ml/min

实施例17：

色谱条件：

色谱柱：Waters COTRECS C18 4.6×150mm，2.7μm

供试品溶液的浓度：1mg/ml

参比标准溶液各杂质的浓度：1000ppm

流动相：0.03M醋酸铵溶液(A)(醋酸调pH至4.0)，乙腈(B)

检测波长：260nm

稀释剂：80％乙腈-水

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

试验步骤：

(1)在本发明梯度HPLC方法下，在Agilent 1260HPLC仪器(美国Agilent公司)上，按照实施例16的色谱条件，取化合物A～H定位溶液、加标混合溶液、化合物A～H参比溶液、依鲁替尼供试品溶液、依鲁替尼胶囊供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

(2)在本发明梯度HPLC方法下，按照实施例10～17的色谱条件，取加标混合溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

试验结果：

化合物A～H及主成分依鲁替尼在本实施例16中梯度HPLC方法下的定位结果见表1；在本发明实施例10～17的色谱条件下，加标混合溶液中各杂质之间的分离度、各杂质与依鲁替尼峰的相对保留时间见表2。

利用实施例16的色谱条件，按照外标法计算供试品溶液中含有的化合物A～H的含量及总杂质量，结果见表3，加标混合溶液的HPLC谱图、依鲁替尼供试品溶液的HPLC谱图、依鲁替尼胶囊供试品溶液的HPLC谱图分别见图22～图24，图22-24中的最高峰为依鲁替尼的峰。

根据化合物A～H及主成分定位结果及依鲁替尼和依鲁替尼胶囊有关物质的分析结果，依鲁替尼供试品溶液中检出了化合物C(相对保留时间约为0.70)、B(相对保留时间约为0.76)、H(相对保留时间约为1.12)、F(相对保留时间约为1.25)、G(相对保留时间约为1.79)；依鲁替尼胶囊供试品溶液中检出了化合物C、H、F、A(相对保留时间约为1.52)和G。

表1化合物A～H及依鲁替尼在实施例16方法中的定位及各峰之间的分离度

表2实施例10～17条件下各杂质的相对保留时间

表3实施例2制备的依鲁替尼原料药和依鲁替尼胶囊(Imbruvica)中有关物质按照实施例16的色谱条件的检测结果

需要说明的是在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施列及所运用的技术原理，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims

1.检测式I的依鲁替尼或其溶剂化物，或含有依鲁替尼的药物的样品纯度的方法，包括通过色谱法测定样品中的杂质，所述杂质选自化合物A-H中的一种或多种，

其中依鲁替尼为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮，结构如式I所示：

化合物A为(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-3-氯丙基-1-酮，并具有以下结构：

化合物B为(R)-8-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-10-(4-苯氧基苯基)-3，4-二氢吡唑并[4，3-e]嘧啶并[1，2-c]嘧啶-2(8H)-酮，并具有以下结构：

化合物C为(R)-1-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基)-乙酮，并具有以下结构：

化合物D为(R)-4-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-羰基)戊烯-4-酸，并具有以下结构：

化合物E为1-((R)-1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-氧化物，并具有以下结构：

化合物F为1，3-二((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙烷-1-酮，并具有以下结构：

化合物G为1-((R)-3-(4-((3-((R)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-3-氧代丙基)氨)-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)丙基-2-烯-1-酮，并具有以下结构：

化合物H为(R)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-1-基)-哌啶-1-基)-丙基-1-酮，并具有以下结构：

其中所述方法包括如下步骤：

(1)将依鲁替尼或其溶剂化物或含有依鲁替尼的药物溶解在溶剂中以制备样品溶液；

(2)将化合物A～H中任何一种或多种溶解在溶剂中以制备参比标准溶液；

(3)对样品溶液和参比标准溶液实施色谱技术；以及

(4)通过参照该参比标准溶液中化合物A-H的一种或多种，测定依鲁替尼或其溶剂化物或含有依鲁替尼的药物中化合物A～H中的任何一种或多种的存在，其中所述色谱法为梯度HPLC法，在所述梯度HPLC方法中，流动相包括含缓冲溶液A和有机溶剂B的组合，所述缓冲溶液A为用醋酸调节过pH的醋酸铵水溶液，所述有机溶剂B为乙腈，其中所述色谱法使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，

其中梯度HPLC方法中，流动相包含如下的梯度设计：

其中醋酸铵存在的浓度为0.001M至1.0M，缓冲溶液A的pH为3.8～5.8。

2.权利要求1的方法，其中所述溶剂化物为水合物。

3.权利要求1的方法，其中所述梯度HPLC为与LC-MS相容的HPLC方法。

4.权利要求1的方法，其中醋酸铵存在的浓度为0.02M至0.08M。

5.权利要求1的方法，其中醋酸铵存在的浓度为0.02M至0.05M。

6.权利要求1的方法，其中醋酸铵存在的浓度为0.03M。

7.权利要求1的方法，其中缓冲溶液A的pH为4.0～5.5。

8.权利要求1的方法，其中缓冲溶液A的pH为4.0～5.0。

9.权利要求1的方法，其中缓冲溶液A的pH为4.3～4.7。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在20～40℃的温度下进行。

11.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在25～40℃的温度下进行。

12.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在30～40℃的温度下进行。

13.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在0.4～1.2ml/min的流速下进行。

14.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在0.5～1.1ml/min的流速下进行。

15.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在0.6～1.0ml/min的流速下进行。

16.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在0.7～0.9ml/min的流速下进行。

17.权利要求1-9任一项的方法，其中所述HPLC方法在0.8ml/min的流速下进行。

18.权利要求1-9任一项所述的方法，其中包含依鲁替尼的药物为固体形式或液体形式，所述固体形式选自粉剂、片剂、胶囊剂、丸剂以及可分散的颗粒剂，所述液体形式选自溶液或悬浮液。